表皮生長(zhǎng)因子受體表面抗原的表位及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的表位及其用途。本發(fā)明提供的表位是高度保守的，并且位于與結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(EGF)緊密相關(guān)的結(jié)構(gòu)域中。因此，包含所述表位的疫苗組合物或包含所述表位之抗體的組合物可有效地阻斷由EGF與EGRF結(jié)合所引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并因此可以高度有價(jià)值地用于治療多種疾病例如癌癥。與本發(fā)明的表位結(jié)合的抗體可有效地抑制多種EGFR配體與EGFR的結(jié)合，所述EGFR配體例如不僅包括EGF，還包括TGF-a、AR、BTC、EPR和HB-EGF，并因此不僅可用于治療通過(guò)與EGF結(jié)合引起的EGFR活化導(dǎo)致的多種疾病，還可用于治療通過(guò)與其他EGFR配體結(jié)合引起的EGFR活化導(dǎo)致的多種疾病。
【專利說(shuō)明】表皮生長(zhǎng)因子受體表面抗原的表位及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及表皮生長(zhǎng)因子受體（下文中稱為"EGFR"）上的表位及其用途。根據(jù) 本發(fā)明一個(gè)示例性實(shí)施方案提供的表位是高度保守的，并且位于與結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子（下 文中稱為"EGF"）緊密相關(guān)的結(jié)構(gòu)域中。因此，包含所述表位的疫苗組合物、針對(duì)所述表位 的抗體或者包含所述抗體的組合物可有效阻斷由EGFR與EGF結(jié)合所引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并因 此在治療多種疾病例如癌癥中可以是高度有價(jià)值的并且可用于治療這些疾病。此外，與所 述表位結(jié)合的抗體可有效抑制多種EGFR配體與EGFR的結(jié)合，所述EGFR配體例如不僅包括 EGF，還包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-a(TGF-a)、雙調(diào)蛋白（AR)、P動(dòng)物纖維素（betacellulin，BTC)、 表皮調(diào)節(jié)素（epiregulin，EPR)和肝素結(jié)合的EGF樣生長(zhǎng)因子（heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF)，因此可用于治療由EGFR活化引起的多種疾病。
[0002] 此外，本發(fā)明涉及產(chǎn)生所述表位的特異性抗體的方法。

【背景技術(shù)】
[0003] 治療癌癥的免疫治療方法具有這樣的優(yōu)點(diǎn)，S卩，與手術(shù)、放療或化療相比，提高了 對(duì)患者中的目標(biāo)疾病的特異性，從而增強(qiáng)了抗癌效果并降低了副作用。腫瘤特異性單克隆 抗體已經(jīng)用作治療劑，其通過(guò)靶向根據(jù)多種類型的癌特異性過(guò)表達(dá)的某些蛋白質(zhì)來(lái)獲得抗 癌效果，在腫瘤治療過(guò)程中是非常有用的。
[0004] 表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)是分子量為170kDa的I型膜蛋白，并已知在多種類型 的腫瘤中過(guò)表達(dá)。對(duì)EGFR的研究已經(jīng)持續(xù)了很長(zhǎng)一段時(shí)間，并且當(dāng)前已經(jīng)成功進(jìn)行了細(xì) 胞結(jié)構(gòu)域（Garrett TP等，Cell，2002，110:763-773)和細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域（Stamos J等， J. Biol. Chem.，2002, 277 :46265-46272)的晶體學(xué)（crystallographic)研究。這些研究顯 示了受體及其配體行為的重要信息。EGFR是細(xì)胞表面相關(guān)分子，其通過(guò)在此結(jié)合EGF配體 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-a(TGF-a)來(lái)被活化。與配體結(jié)合后，受體二聚化以使細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激 酶結(jié)構(gòu)域磷酸化。結(jié)果，后續(xù)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活從而誘導(dǎo)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖以及 腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。特別地，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的功能主要依賴于EGFR，所以所述受體由于抑制 EGFR調(diào)控功能的可能性程度而被視為治療的常用標(biāo)靶。
[0005] 例如在某些類型的癌癥中觀察到EGFR的過(guò)表達(dá)，例如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃 癌、腦癌、膀胱癌、頭頸癌、卵巢癌和前列腺癌。當(dāng)使用針對(duì)EGFR的抗體抑制EGFR與EGF的 結(jié)合時(shí)，癌細(xì)胞的生長(zhǎng)可以受到抑制從而治療癌癥，這已經(jīng)通過(guò)使用針對(duì)EGFR的單克隆抗 體在實(shí)驗(yàn)上證明。
[0006] 同時(shí)，雖然已經(jīng)進(jìn)行了嘗試來(lái)闡述EGFR結(jié)合EGF的各個(gè)結(jié)構(gòu)域的位置 (S. Yokoyama等，Cell，2002,110 :775-787)，但是必須進(jìn)一步研究，在使用這樣的EGFR結(jié)構(gòu) 域作為表位的情況下，抗體是否抑制由EGF引起的EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。
[0007] 近年來(lái)，在臨床領(lǐng)域用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的西妥昔單抗（Cetuximab) (C225 抗體，產(chǎn)品名：Erbitux ;ImClone，US)是通過(guò)使小鼠抗體的可變區(qū)與人抗體IgGl恒定區(qū)結(jié) 合而得到的嵌合抗體（具有約30%的小鼠氨基酸序列），并因此在體外抑制由EGF引起的 腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)以及EGFR磷酸化，并且在裸鼠中抑制人腫瘤形成。此外，發(fā)現(xiàn)所述抗體與某 些化療藥劑對(duì)根除異種移植小鼠模型中的人腫瘤有協(xié)同作用。然而，西妥昔單抗存在這樣 的問(wèn)題，即，其在患者（約10% )中導(dǎo)致免疫應(yīng)答，并且僅能用作與化療藥劑的聯(lián)合治療，因 為其在用于獨(dú)立治療時(shí)不具有令人滿意的治療效果。
[0008] 帕木單抗（panitumumab)(產(chǎn)品名：Vectibix ;Amgen Inc. US)是另一種用于治療 性轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌的抗體，其是體外抑制由EGF引起的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和EGFR磷酸化并且抑制 裸鼠中人腫瘤之形成的完全人抗體。此外，發(fā)現(xiàn)所述抗體與某些化療藥劑對(duì)根除異種移植 小鼠模型中的人腫瘤有協(xié)同作用。帕木單抗與西妥昔單抗不同在于其是完全人抗體，具有 10倍于西妥昔單抗的抗原結(jié)合能力，降低了如西妥昔單抗作為IgG2型抗體誘導(dǎo)免疫應(yīng)答 的概率，并且由于IgG2的限制而僅表現(xiàn)出對(duì)由EGFR與EGF結(jié)合引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制效 果，盡管增強(qiáng)了結(jié)合能力以降低副作用和提高效力。因此，據(jù)報(bào)道，帕木單抗具有與西妥昔 單抗相似的總體臨床效果，因?yàn)槠錄](méi)有相關(guān)領(lǐng)域已知的西妥昔單抗的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制效果與 抗體依賴性細(xì)胞毒作用（ADCC，Antibody_Dependent Cell Cytotoxicity)活性之中的ADCC 活性。
[0009] 此外，由Merck Serono和Takeda Pharmaceuticals聯(lián)合開(kāi)發(fā)的馬妥珠單抗 (matuzumab, mAb425)迄今為止在獨(dú)立治療中不具有令人滿意的療效。
[0010] 總之，所有常規(guī)的靶向EGFR的抗體治療劑都未被準(zhǔn)許作為處方用于治療K-ras突 變體結(jié)直腸癌。2009年報(bào)道的數(shù)據(jù)證實(shí)，其中兩個(gè)抗體顯示出治療效果的患者的百分比總 計(jì)約21%，并且所述抗體在其余79%的患者中未示出治療效果。抗體未示出治療效果的患 者組的43% (即，約患者總數(shù)的約30% )具有K-ras突變體，這將該組歸為K-ras突變體 結(jié)直腸癌。常規(guī)的抗體治療劑西妥昔單抗和帕尼單抗僅在約1. 5%的K-ras突變體中示出 治療效果。
[0011] 因此，對(duì)具有能夠通過(guò)更有效地抑制EGFR與EGF結(jié)合來(lái)克服常規(guī)EGFR抗體之問(wèn) 題和限制的區(qū)別和優(yōu)越性的新抗EGFR抗體的需求正在持續(xù)增加。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供氨基酸序列RGDSFTH(SEQ ID N0:2)，或包含該序 列的EGFR上的表位，以及特別是具有氨基酸序列RGDSFTHTP(SEQ ID N0:3)的表位。
[0013] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供產(chǎn)生所述表位、包含所述表位的用于一種或更多種癌 癥疫苗之組合物的方法、使用所述表位產(chǎn)生具有與所述表位特異性結(jié)合之能力的抗體的方 法，以及包含通過(guò)該方法產(chǎn)生之抗體的用于預(yù)防和/或治療癌癥的組合物或治療劑。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述表位或編碼所述表位的多核苷酸序列，以及用于 診斷癌癥的包含所述多核苷酸序列的組合物和試劑盒。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1是以3D方式示出EGFR與GC1118抗體之結(jié)合特征的圖。
[0016] 圖2是以3D方式示出EGFR與EGF之結(jié)合特征的圖。
[0017] 圖3是以3D方式示出當(dāng)GC1118抗體與EGFR重疊時(shí)，GC1118抗體與和EGF結(jié)合 的EGFR的結(jié)合特征的圖。
[0018] 圖4是以3D方式示出EGFR與西妥昔單抗和馬妥珠單抗的結(jié)合特征的圖。
[0019] 圖5是示出合成EGFR變體基因之流程以及轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞之流程的圖。
[0020] 圖6是示出通過(guò)由DNA堿基序列確定的氨基酸序列來(lái)鑒定各個(gè)EGFR突變體被正 確合成的圖。
[0021] 圖7是示出各個(gè)EGFR變體的表達(dá)比率的圖
[0022] 圖8是示出抗體針對(duì)各個(gè)EGFR突變體的結(jié)合能力的圖：(A)GC1118,以及（B)西妥 昔單抗（對(duì)照）。
[0023] 圖9是示出EGFR配體與GC1118的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力的圖：(A)GC1118,以及（B)西妥 昔單抗（對(duì)照）。
[0024] 圖10是示出GC1118對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的抑制活性的圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下文將詳細(xì)描述本發(fā)明。
[0026] 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在EGFR的氨基酸序列中，氨基酸序列RGDSFTH(SEQ ID N0 :2) 或包括該序列的氨基酸序列，特別是由RGDSFTHTP(SEQ ID N0:3)所示的氨基酸序列，主要 作用于與EGF結(jié)合，并且發(fā)現(xiàn)具有該氨基酸序列作為表位的抗體非常有效地抑制EGFR與 EGF的結(jié)合，并因此在通過(guò)阻斷結(jié)合導(dǎo)致的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)治療癌癥中示出優(yōu)異的效果。因此， 本發(fā)明基于這些事實(shí)得以完成。
[0027] 5￡〇10勵(lì)：2所示的氨基酸序列1?05?1'11與5￡〇10勵(lì)：1所示的￡6?1?胞外結(jié)構(gòu) 域之氨基酸序列的第353位氨基酸殘基至第359位氨基酸殘基相對(duì)應(yīng)，并且SEQ ID N0 :3 所示的氨基酸序列RGDSFTHTP與SEQ ID NO :1所示的EGFR胞外結(jié)構(gòu)域的第353位氨基酸 殘基至第361位氨基酸殘基相對(duì)應(yīng)。
[0028] 本發(fā)明提供的氨基酸序列中存在的氨基酸殘基由相關(guān)領(lǐng)域已知的三字母縮寫或 一字母縮寫來(lái)表示。此外，在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"xA"是指SEQ ID N0:1所示的EGFR序列的 第A位氨基酸x，術(shù)語(yǔ)"xAz"意指用z替換第A位氨基酸x。例如，術(shù)語(yǔ)"R353"是指SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的第353位氨基酸殘基是精氨酸（Arg)，術(shù)語(yǔ)"R353G"是指SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的第353位氨基酸殘基精氨酸（Arg)被甘氨酸（Gly)替換。
[0029] 具有SEQIDN0 :2所示的氨基酸序列、包含SEQIDN0 :2之氨基酸序列的氨基酸 序列或SEQIDN0 :3所示的氨基酸序列的表位可與載體組合使用，以維持其本身的3D結(jié)構(gòu) 或提供用作組合物例如癌癥疫苗的效力。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)示例性實(shí)施方案的載體是生物相 容的，并且本文可使用所有類型的載體，只要其能達(dá)到期望的效果即可。在這種情況下，所 述載體可選自肽、血清白蛋白、免疫球蛋白、血藍(lán)蛋白和多糖，但本發(fā)明不限于此。
[0030] 可使用具有SEQIDN0:2所示的氨基酸序列、包含SEQIDN0:2之氨基酸序列 的氨基酸序列或SEQIDN0 :3所示的氨基酸序列的表位本身，或作為與載體組合的復(fù)合 物使用。在這種情況下，所述表位或所述復(fù)合物可用于癌癥疫苗組合物。本文中，所述疫 苗組合物還可包含可藥用佐劑或賦形劑。可使用任何類型的佐劑，只要其在注射進(jìn)身體后 可發(fā)揮增強(qiáng)抗體形成的作用從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的即可。特別地，所述佐劑可為選自鋁鹽 (A1 (0H)3或A1P04)、角鯊烯、山梨聚糖、聚山梨酯80、CpG、脂質(zhì)體、單磷酰脂質(zhì)A(MPL)以及 吡喃葡萄糖基脂質(zhì)A(GLA)中的至少一種，但是本發(fā)明不限于此。
[0031] 本發(fā)明提供的編碼具有SEQ ID NO : 2所示的氨基酸序列、包含SEQ ID NO : 2之氨 基酸序列的氨基酸序列或SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的表位的多核苷酸可以基因癌癥 疫苗本身的形式使用。在這種情況下，所述多核苷酸本身可在沒(méi)有使用遞送系統(tǒng)的情況下 使用，或者可容納在病毒或非病毒遞送系統(tǒng)中遞送進(jìn)身體?？墒褂萌我忸愋偷牟《净蚍遣?毒遞送系統(tǒng)，只要它們?cè)诒绢I(lǐng)域中已知為常規(guī)可用的即可。特別地，所述病毒遞送系統(tǒng)優(yōu)選 包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等，并且本文可使用的非病毒載體包括選自 以下的至少一種：陽(yáng)離子聚合物、非離子聚合物、脂質(zhì)體、脂質(zhì)、磷脂、親水性聚合物、疏水性 聚合物及其復(fù)合物，但本發(fā)明不限于此。
[0032] 本發(fā)明提供了包含編碼具有SEQ ID N0 :2所示的氨基酸序列、包含SEQ ID N0 :2 之氨基酸序列的氨基酸序列或者SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的表位之多核苷酸的重 組載體；包含所述重組載體的宿主細(xì)胞；以及使用根據(jù)本發(fā)明的重組載體或宿主細(xì)胞制備 具有SEQ ID N0:2之氨基酸序列、包含SEQ ID N0:2之氨基酸序列的氨基酸序列或SEQ ID NO :3之氨基酸序列的表位的方法。
[0033] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"重組載體"是指能夠在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)靶蛋白的表達(dá)載 體，即，包含有效連接的必要調(diào)控元件以表達(dá)插入基因的基因構(gòu)建體。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"有 效連接的"意指編碼目的蛋白質(zhì)的核酸序列與核酸表達(dá)控制序列功能性地連接，從而執(zhí)行 一般功能。與重組載體的有效連接可使用本領(lǐng)域公知的基因重組技術(shù)進(jìn)行，并且可通過(guò)使 用本領(lǐng)域公知的酶來(lái)容易地進(jìn)行位點(diǎn)特異性DNA切割和連接。
[0034] 除了表達(dá)控制元件例如啟動(dòng)子、起始密碼子、終止密碼子、多腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng) 子外，適用于本發(fā)明的表達(dá)載體還可包含用于靶向膜或分泌的信號(hào)序列。起始密碼子和終 止密碼子一般被視為編碼免疫原性靶蛋白的核苷酸序列的一部分，因此當(dāng)基因構(gòu)建體施用 到個(gè)體中并且以框內(nèi)插入了編碼序列時(shí)，在個(gè)體中應(yīng)當(dāng)是基本發(fā)揮功能的。常見(jiàn)的啟動(dòng)子 可為組成型的或誘導(dǎo)型的?？墒褂么嬖谟谠思?xì)胞中的Lac啟動(dòng)子、Tac啟動(dòng)子、T3啟動(dòng) 子和17啟動(dòng)子，但不限于此?？墒褂眉?dòng)蛋白啟動(dòng)子與來(lái)源于人血紅蛋白、人肌肉肌 酸和人金屬硫蛋白的啟動(dòng)子，以及來(lái)源于存在于真核細(xì)胞中的猿猴病毒40 (simian virus 40，SV40)、小鼠乳瘤腫瘤病毒（mouse mammary tumor virus, MMTV)、人類免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus，HIV)(例如，來(lái)自 HIV的長(zhǎng)末端重復(fù)序列（long terminal repeat, LTR)啟動(dòng)子）、莫洛尼病毒（Moloney virus)、巨細(xì)胞病毒（CMV)、EB病毒（Epstein bar virus，EBV)以及勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus，RSV)，但不限于此。
[0035] 所述表達(dá)載體可包括選擇標(biāo)記用于選擇包含所述載體的宿主細(xì)胞。所述選擇標(biāo)記 用于選擇被所述載體轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞。本文中，標(biāo)記賦予的可選擇表型（例如藥物耐受、營(yíng)養(yǎng) 缺陷型、對(duì)細(xì)胞毒性試劑的耐受或表面蛋白質(zhì)的表達(dá)）可用作選擇標(biāo)記。因?yàn)橹挥斜磉_(dá)選 擇標(biāo)記的細(xì)胞在經(jīng)選擇試劑處理的環(huán)境中存活，所以可選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。此外，當(dāng)所述載 體是可復(fù)制的表達(dá)載體時(shí)，所述載體可包含復(fù)制起點(diǎn)，即復(fù)制自其起始的特定核酸序列。各 種類型的載體例如質(zhì)粒、病毒和黏?？捎米髦亟M表達(dá)載體?？墒褂萌魏晤愋偷闹亟M載體，沒(méi) 有特定的限制，只要他們可在各種宿主細(xì)胞例如原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中發(fā)揮表達(dá)目的基因 的功能并產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)即可。但是，可優(yōu)選包含具有強(qiáng)活性的啟動(dòng)子并且可大量產(chǎn)生具 有與野生型相似形狀的異源蛋白同時(shí)保持強(qiáng)表達(dá)強(qiáng)度的載體用作重組載體。
[0036] 特別地，可采用表達(dá)宿主/載體的各種組合以表達(dá)根據(jù)本發(fā)明一個(gè)示例性實(shí)施 方案的表位，所述表位具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列、包含SEQ ID NO :2之氨基酸 序列的氨基酸序列或SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。適于真核宿主的表達(dá)載體可包含 表達(dá)調(diào)控序列，包括但不限于來(lái)源于SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、巨細(xì)胞病 毒、慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)調(diào)控序列?？捎糜诩?xì)菌宿主的表達(dá)載體包括得自大腸桿菌 (Escherichia coli)的細(xì)菌質(zhì)粒，例如卩￡1\卩1^￡1\卩1311168(31'1卩1:、卩6￡父21\卩11〇載體、(3〇1￡1、 pCRl、pBR322、pMB9及其衍生物；具有廣宿主范圍的質(zhì)粒，例如RP4、噬菌體DNA--包括多 種X噬菌體衍生物，例如AgtlO、Agtll和匪989;以及另一些DNA噬菌體，例如M13和絲 狀單鏈DNA噬菌體?？捎玫睦ハx(chóng)細(xì)胞的載體是pVL941。
[0037] 將所述重組載體引入宿主細(xì)胞中以形成轉(zhuǎn)化體。合適的宿主細(xì)胞可包括原核生 物，例如大腸桿菌（E. coli)、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)、鏈霉菌屬（Streptomyces sp.)、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.)、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis)或葡萄球 菌屬（Staphylococcus sp.);真菌，例如曲霉屬（Aspergillus sp.);酵母細(xì)胞，例如巴 斯德畢赤酵母（Pichiapastoris)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces sp.)和粗脈胞菌（Neurospora crassa);以及其他低等真核生物 和高等真核細(xì)胞例如昆蟲(chóng)細(xì)胞。此外，所述宿主細(xì)胞可優(yōu)選但不限于來(lái)源于植物和哺乳動(dòng) 物，例如猴腎細(xì)胞7(C0S7:monkey kidney cell)、NS0細(xì)胞、SP2/0、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CH0: Chinese hamster ovary)細(xì)胞、W138、幼倉(cāng)鼠腎（BHK:baby hamster kidney)細(xì)胞、MDCK、 骨髓瘤細(xì)胞系、HuT 78細(xì)胞和HEK293細(xì)胞。CH0細(xì)胞是特別優(yōu)選的。
[0038] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"至宿主細(xì)胞中，涵蓋任何將核酸序列引入生物體、細(xì)胞、 組織或器官的方法，并且如本領(lǐng)域已知，可以使用適于所述宿主細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)進(jìn)行。這 樣的方法包括但不限于例如電穿孔、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣（CaP0 4)沉淀、氯化鈣（CaCl2) 沉淀、使用碳化硅纖維攪拌（

【權(quán)利要求】
1. 表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)的表位，其具有氨基酸序列RGDSFTH(SEQ ID N0:2)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表位，其具有氨基酸序列RGDSFTHTP(SEQ ID N0:3)。
3. 復(fù)合物，其中權(quán)利要求1或2所述的表位與載體結(jié)合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的復(fù)合物，其中所述載體是選自以下的至少一種：肽、血清白蛋 白、免疫球蛋白、血藍(lán)蛋白和多糖。
5. 多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1或2所述的表位。
6. 重組載體，其包含權(quán)利要求5所述的多核苷酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其包含誘導(dǎo)所述表位在微生物細(xì)胞或病毒表面上 表達(dá)的啟動(dòng)子或編碼信號(hào)蛋白的核苷酸序列。
8. 重組微生物或病毒，其被權(quán)利要求6或7所述的重組載體轉(zhuǎn)化。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組微生物或病毒，其選自重組大腸桿菌、重組酵母和重組 噬菌體。
10. 制備具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列、包含SEQ ID NO :2之氨基酸序列的氨基酸 序列或SEQ ID NO :3的氨基酸序列的表位的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求6至9中任一項(xiàng)所 述的重組載體、重組微生物或病毒。
11. 用于治療癌癥的疫苗組合物，其包含權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的表位、包含所 述表位的復(fù)合物或編碼所述表位的多核苷酸。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其還包含在注射進(jìn)身體后提高抗體形成的可 藥用佐劑。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的疫苗組合物，其中所述佐劑是選自以下的至少一種：鋁鹽 (A1 (0H) 3、ALP04)、角鯊烯、山梨聚糖、聚山梨酯80、CpG、脂質(zhì)體、膽固醇、MPL (單磷酰脂質(zhì)A) 和GLA (批喃葡萄糖基脂質(zhì)A)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其中所述多核苷酸包含于可藥用載體中。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的疫苗組合物，其中所述可藥用載體是病毒或非病毒載體。
16. 產(chǎn)生與具有SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3之氨基酸序列的表位特異性結(jié)合的抗體 或其片段的方法，所述方法使用具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列、包含SEQ ID NO :2之氨基 酸序列的氨基酸序列或SEQ ID NO : 3的氨基酸序列的表位；包含所述表位的復(fù)合物；或編 碼所述表位的多核苷酸。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其包括以下步驟： 向動(dòng)物施用具有SEQ ID NO : 2的氨基酸序列、包含SEQ ID NO : 2之氨基酸序列的氨基 酸序列或SEQ ID NO :3的氨基酸序列的表位；包含所述表位的復(fù)合物；或編碼所述表位的 多核苷酸；以及 從所述動(dòng)物中篩選與具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列、包含SEQ ID NO :2之氨基酸序 列的氨基酸序列或SEQ ID NO :3的氨基酸序列的表位特異性結(jié)合的抗體。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其還包括進(jìn)行人源化或去免疫化的步驟。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述人源化包括將由動(dòng)物產(chǎn)生之抗體的CDR序 列移植到人抗體框架區(qū)（FR)中。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其還包括進(jìn)行替換、插入或缺失至少一個(gè)氨基酸以 提高親和力或降低免疫原性的步驟。
22. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其能夠產(chǎn)生具有與人 抗體之氨基酸序列相同的氨基酸序列的抗體。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因小鼠。
24. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其采用展示技術(shù)。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述展示技術(shù)是選自以下的至少一種：噬菌體 展示、細(xì)菌展示和核糖體展示。
26. 根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的方法，其中所述展示采用設(shè)計(jì)成包含來(lái)自人之抗體的 序列的文庫(kù)。
27. 根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)所述的方法，其包括： 通過(guò)使用具有SEQ ID NO : 2的氨基酸序列、包含SEQ ID NO : 2之氨基酸序列的氨基酸 序列或SEQ ID NO :3的氨基酸序列的表位或包含所述表位的復(fù)合物來(lái)篩選與具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列、包含SEQ ID NO :2之氨基酸序列的氨基酸序列或SEQ ID NO :3的氨基 酸序列的表位特異性結(jié)合的抗體。
28. 用于診斷癌癥的組合物，其包含權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的表位、包含所述表 位的復(fù)合物或編碼所述表位的多核苷酸。
29. 用于診斷癌癥的試劑盒，其包含權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的表位、包含所述表 位的復(fù)合物或編碼所述表位的多核苷酸。
【文檔編號(hào)】A61K38/16GK104394879SQ201380022281
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月27日
【發(fā)明者】金世鎬, 洪廣元, 張基奐, 金敏洙, 李美禎, 元鐘和, 許旻奎, 曹炫壽, 俞知鎬 申請(qǐng)人:株式會(huì)社綠十字, 財(cái)團(tuán)法人牧巖生命工學(xué)研究所