用于治療神經(jīng)肌肉障礙的具有改善特性的rna調(diào)節(jié)寡核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種改善的寡核苷酸及其用于治療、改善、預(yù)防、延緩和/或治療人類順式元件重復(fù)體不穩(wěn)定相關(guān)性遺傳神經(jīng)肌肉或神經(jīng)退行性障礙的用途。
【專利說(shuō)明】用于治療神經(jīng)肌肉障礙的具有改善特性的RNA調(diào)節(jié)寡核苷 酸

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及人類遺傳學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及神經(jīng)肌肉障礙（神經(jīng)肌肉性失常，神 經(jīng)肌紊亂，neuromusculardisorder)。本發(fā)明特別地涉及如本文進(jìn)一步定義的具有改善的 增強(qiáng)臨床適用性特性的反義寡核苷酸（AON)的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)肌肉疾病的特征是由肌肉或神經(jīng)病理（肌病和神經(jīng)病變）引起的肌肉功能受 損。神經(jīng)病變的特征是神經(jīng)退行性病變和導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)、痙攣或麻痹問(wèn)題的神經(jīng)控制受損。例子 包括亨廷頓氏病（HD)、多種類型的脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)（spinocerebellarataxia,SCA)、 弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)（Friedreich'sataxia,FA)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（Amyotrophic LateralSclerosis，ALS)和額顳葉癡呆（Frontotemporaldementia，F(xiàn)TD)。神經(jīng)病變的亞 組是由順式元件重復(fù)體（重復(fù)子，重復(fù)，重復(fù)序列，repeat)不穩(wěn)定引起的。例如，HD是由 HTT基因的外顯子1中的三重（CAG)n重復(fù)體擴(kuò)展引起的。這些重復(fù)體的擴(kuò)展導(dǎo)致348kDa 細(xì)胞質(zhì)亨廷頓（huntingtin)蛋白的N-末端的谷氨酰胺伸長(zhǎng)（stretch)的擴(kuò)展。亨廷頓 具有正常形態(tài)的6-29個(gè)谷氨酰胺的氨基酸殘基的特征序列；引起疾病的突變的亨廷頓具 有超過(guò)38個(gè)殘基。突變亨廷頓分子在神經(jīng)元細(xì)胞中的連續(xù)表達(dá)導(dǎo)致較大蛋白質(zhì)沉積物的 形成，這最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，特別是在額葉和基底神經(jīng)節(jié)中（主要在尾狀核中）。該疾病的 嚴(yán)重程度通常與額外殘基的數(shù)目成正比。特異性靶向擴(kuò)展的CAG重復(fù)體的A0N(例如作為 2'-0_甲基硫代磷酸酯RNA的PS57 (CUG) 7;SEQIDNO:lEvers等）可以用來(lái)有效地減少HD 患者源細(xì)胞中的突變亨廷頓轉(zhuǎn)錄物和（毒性）蛋白質(zhì)水平。對(duì)于神經(jīng)病變治療，全身性給 予的A0N需要通過(guò)血腦屏障。因此，需要優(yōu)化寡聚化學(xué)（oligochemistry)以允許和/或表 現(xiàn)出改善的腦遞送。
[0003] 肌病包括以進(jìn)行性無(wú)力以及骨骼、心臟和/或平滑肌退化為特征的遺傳性肌肉 營(yíng)養(yǎng)不良癥（營(yíng)養(yǎng)失調(diào)，dystrophy)。肌病的例子是迪謝納型（Duchenne)肌營(yíng)養(yǎng)不良癥 (DMD)、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良1型（DM1)和強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良2型（DM2)。DM1和DM2b也均 由順式元件重復(fù)體不穩(wěn)定引起；DM1是由DMPK基因的外顯子15的3'非翻譯區(qū)中的三核苷 酸（CTG)n重復(fù)體擴(kuò)展引起的，且DM2是由DM2/ZNF9基因中的四核苷酸（CCTG)n重復(fù)體擴(kuò)展 引起的。此處相同,特異性靶向擴(kuò)展的重復(fù)體的A0N(例如，PS58，（CAG)7，一種用于DM1的 2' -0-甲基硫代磷酸酯RNA(Mulders等））已被證明能夠有效地誘導(dǎo)（毒性）擴(kuò)展的重復(fù) 體轉(zhuǎn)錄物的特異性降解。DMD中基因缺陷與肌肉纖維膜對(duì)小化合物如A0N的透過(guò)性增加有 關(guān)，與此相反，對(duì)于大多數(shù)其他肌病，A0N在肌肉組織中增強(qiáng)的分布和吸收是獲得治療效果 必不可少的。因此，此處也需要優(yōu)化寡聚化學(xué)以允許和/或表現(xiàn)出改善的肌肉遞送。
[0004] 至少部分地影響A0N向靶轉(zhuǎn)錄物遞送的選定化學(xué)的特定特征：給藥途徑、生物穩(wěn) 定性、生物分布、組織內(nèi)分布和細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)（trafficking)。另外，寡核苷酸化學(xué)的進(jìn)一 步優(yōu)化設(shè)想為通過(guò)減少長(zhǎng)度或改善合成和/或純化工序以增強(qiáng)結(jié)合親和性和穩(wěn)定性、增強(qiáng) 活性、提高安全性和/或降低商品成本。多重化學(xué)修飾已經(jīng)成為普遍的和/或?qū)τ谘芯拷?是商用的（例如2' -0-甲基RNA和5-取代的嘧啶和2, 6-二氨基嘌呤），而大多數(shù)其它化 學(xué)修飾仍需要顯著合成的努力來(lái)獲得。特別是如本文中所確定的，使用在嘧啶和嘌呤堿基 上含有修飾的2' -0-甲基硫代磷酸酯RNA已經(jīng)獲得了初步令人鼓舞的結(jié)果。
[0005] 總之，為了增強(qiáng)AON治療本文所例示的人類順式元件重復(fù)體不穩(wěn)定相關(guān)性遺傳障 礙的治療適用性，需要具有進(jìn)一步改善特性的AON。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]宴核苷酸
[0007] 在第一方面，本發(fā)明提供一種包含2'-0_甲基RNA核苷酸殘基的寡核苷酸，其具有 其中至少一個(gè)磷酸酯部分被替代為硫代磷酸酯部分的主鏈并且包含一個(gè)或多個(gè)5-甲基嘧 啶和/或一個(gè)或多個(gè)2, 6-二氨基嘌呤堿基；或者一種由2' -0-甲基RNA核苷酸殘基組成 的寡核苷酸，并且其具有其中所有的磷酸酯部分被替代為硫代磷酸酯部分的主鏈并且包含 一個(gè)或多個(gè)5-甲基啼陡和/或一個(gè)或多個(gè)2, 6-二氨基噪呤堿基，所述寡核苷酸用作用于 治療人類順式元件重復(fù)體不穩(wěn)定相關(guān)性遺傳障礙的藥物。
[0008] 在本發(fā)明的上下文中，"主鏈"用于識(shí)別交替的核糖環(huán)和核苷間 (internucleoside)連鍵的鏈，核苷堿基連接至該鏈。術(shù)語(yǔ)"連鍵"用于兩個(gè)核糖單元之間 的連接（即"核苷間連鍵"），其通常為磷酸酯部分。因此，具有10個(gè)核苷酸的寡核苷酸可 以含有9個(gè)連鍵將10個(gè)核糖單元連接在一起。另外，在該寡核苷酸的一側(cè)或兩側(cè)可以存在 一個(gè)或多個(gè)最后連鍵，其只連接至一個(gè)核苷酸。術(shù)語(yǔ)"連鍵"和"核苷間連鍵"也意指此類 垂飾連鍵（pendantlinkage)。根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的主鏈中的連鍵的至少一個(gè)由連接 兩個(gè)核糖單元的硫代磷酸酯部分組成。因此，存在于RNA中的至少一個(gè)天然存在的3'至5' 磷酸二酯部分被替代為硫代磷酸酯部分。
[0009] 在本發(fā)明的上下文中，在下列表述的每一個(gè)中的"一個(gè)（a) "是指"至少一個(gè)":一個(gè) 2'-0_甲基RNA核苷酸殘基、一個(gè)2'-0_甲基RNA殘基、一個(gè)硫代磷酸酯部分、一個(gè)2'-0_甲 基硫代磷酸酯RNA殘基、一個(gè)5-甲基嘧啶堿基、一個(gè)5-甲基胞嘧啶堿基、一個(gè)5-甲基尿嘧 啶堿基、一個(gè)胸腺嘧啶堿基、一個(gè)2, 6-二氨基嘌呤堿基。
[0010] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸是具有少于37個(gè)核苷酸的寡核苷酸。所述寡核苷 酸可以具有 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35或36個(gè)核苷酸。這樣的寡核苷酸也可被識(shí)別為具有12-36個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
[0011] 相應(yīng)地，具有其中至少一個(gè)磷酸酯部分被替代為硫代磷酸酯部分的主鏈的包含 2'-0_甲基RNA核苷酸殘基的本發(fā)明的寡核苷酸包含少于37個(gè)核苷酸（即，其包含12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35 或 36 個(gè)核苷 酸）和5-甲基嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤堿基。
[0012] 相應(yīng)地，由2' -0-甲基RNA核苷酸殘基組成并且具有其中所有的磷酸酯部分均被 替代為硫酸磷酸酯的主鏈的本發(fā)明的寡核苷酸包含少于34個(gè)核苷酸（即，其包含12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35 或 36 個(gè)核苷 酸）和5-甲基嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤堿基。
[0013] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的寡核苷酸包含2' -0-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸 殘基、或由2' -0-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸殘基組成。此種寡核苷酸包含2' -0-甲基RNA殘基，其通過(guò)硫代磷酸酯連鍵連接至序列中的下一個(gè)核苷酸。該下一個(gè)核苷酸可以但 不一定是另一種2' -0-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸殘基?；蛘?，此種寡核苷酸由2' -0-甲 基硫代磷酸酯RNA核苷酸殘基組成，其中所有的核苷酸均包含2' -0-甲基部分和硫代磷酸 酯部分。優(yōu)選地，此種寡核苷酸由2'-0-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸殘基組成。這種化學(xué) 是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。在整個(gè)本申請(qǐng)中，包含2' -0-甲基RNA殘基和硫代磷酸酯連 鍵的寡核苷酸可以替代為包含2' -0-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸殘基的寡核苷酸或包含 2' -0-甲基硫代磷酸酯RNA殘基的寡核苷酸。在整個(gè)本申請(qǐng)中，由通過(guò)硫代磷酸酯連鍵鏈 接或連接的2' -0-甲基RNA殘基組成的寡核苷酸或由2' -0-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸 殘基組成的寡核苷酸可以替代為由2' -0-甲基硫代磷酸酯RNA組成的寡核苷酸。
[0014] 另外，本發(fā)明的寡核苷酸包含至少一個(gè)堿基修飾，其增加對(duì)祀鏈（strand)的結(jié)合 親和力、增加所述寡核苷酸與其靶標(biāo)所得到的雙鏈體（duplex)的解鏈溫度（溶解溫度， meltingtemperature)、和/或降低免疫刺激作用、和/或增加生物穩(wěn)定性、和/或提高生 物分布和/或組織內(nèi)分布、和/或細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的寡核苷酸 包含5-甲基嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤堿基。5-甲基嘧啶堿基選自5-甲基胞嘧啶和/ 或5-甲基尿嘧啶和/或胸腺嘧啶，其中胸腺嘧啶與5-甲基尿嘧啶是相同的。在本發(fā)明的 寡核苷酸具有兩個(gè)或更多此類堿基修飾時(shí)，所述堿基修飾可以相同，例如所述寡核苷酸中 所有此類修飾的堿基均為5-甲基胞嘧啶，或者所述堿基修飾可以是不同堿基修飾的組合， 例如所述寡核苷酸可以具有一個(gè)或多個(gè)5-甲基胞嘧啶和一個(gè)或多個(gè)5-甲基尿嘧啶。
[0015] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的寡核苷酸（即，包含2' -0-甲基RNA核苷酸 殘基、具有其中至少一個(gè)磷酸酯部分被替代為硫代磷酸酯部分的主鏈并且包含一個(gè)或多個(gè) 5-甲基嘧啶和/或一個(gè)或多個(gè)2, 6-二氨基嘌呤堿基的寡核苷酸；或者由2' -0-甲基RNA 核苷酸殘基組成并且具有其中所有的磷酸酯部分被替代為硫代磷酸酯部分的主鏈并且包 含一個(gè)或多個(gè)5-甲基啼陡和/或一個(gè)或多個(gè)2, 6-二氨基噪呤堿基的寡核苷酸）是這樣 的，其不包含2' -脫氧2' -氟代核苷酸（即2' -脫氧2' -氟代-腺苷、-鳥苷、-尿苷和/ 或-胞苷）。此類包含2' -氟代（2' -F)核苷酸的寡核苷酸已被證明能夠召集（recruit) 白細(xì)胞介素增強(qiáng)子結(jié)合因子2和3 (ILF2/3)并且由此在靶向的前-mRNA中能夠誘導(dǎo)外顯子 跳躍（遺漏，skipping)(RigoF等，W02011/097614)。在本發(fā)明中，所使用的寡核苷酸優(yōu)選 地不能吸收此類因子和/或本發(fā)明的寡核苷酸不與被ILF2/3特異性識(shí)別的RNA形成異源 雙鏈體。本發(fā)明的寡核苷酸的作用機(jī)制被認(rèn)為不同于具有2' -F核苷酸的寡核苷酸的作用 機(jī)制：預(yù)期本發(fā)明的寡核苷酸主要誘導(dǎo)（毒性）擴(kuò)展的重復(fù)體轉(zhuǎn)錄物的特異性降解。
[0016] 在整個(gè)文檔中，'胸腺嘧啶'和'5-甲基尿嘧啶'可以互換使用。類似地，2,6_二氨 基嘌呤與2-氨基腺嘌呤是相同的，且這些術(shù)語(yǔ)在整個(gè)文檔中可以互換使用。
[0017] 本文中所確定的術(shù)語(yǔ)"堿基修飾"或"修飾的堿基"是指RNA中天然存在的堿基（即 啼陡或噪呤堿基）的修飾或指堿基的從頭合成（denovosynthesis)。這種從頭合成的堿 基通過(guò)與現(xiàn)有堿基的比較可以被定性為"修飾的"。
[0018] 包含5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤堿基的本發(fā)明的 寡核苷酸分別是指，所述寡核苷酸的至少一個(gè)胞嘧啶核苷堿基通過(guò)將嘧啶環(huán)的5-位的質(zhì) 子取代為甲基而被修飾（即，5-甲基胞嘧啶）、和/或所述寡核苷酸的至少一個(gè)尿嘧啶核苷 堿基通過(guò)將嘧啶環(huán)的5-位的質(zhì)子取代為甲基而被修飾（即，5-甲基尿嘧啶）、和/或所述 寡核苷酸的至少一個(gè)腺嘌呤核苷堿基通過(guò)將2-位的質(zhì)子取代為氨基而被修飾（S卩，2, 6-二 氨基嘌呤）。在本發(fā)明的上下文中，表述"用甲基取代嘧啶環(huán)的5位上的質(zhì)子"可以替代為 表述"用5-甲基嘧啶取代嘧啶"，所述嘧啶僅指尿嘧啶、僅指胞嘧啶或兩者。同樣地，在本發(fā) 明的上下文中，表述"用氨基取代腺嘌呤的2位上的質(zhì)子"可以替代為表述"用2, 6-二氨基 嘌呤取代腺嘌呤"。如果所述寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多個(gè)胞嘧啶、尿嘧啶和 /或腺嘌呤，則至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多個(gè)胞嘧啶、尿嘧啶和/或腺嘌呤分別以這種 方式被修飾。優(yōu)選地，所有的胞嘧啶、尿嘧啶和/或腺嘌呤均分別以這種方式被修飾或者被 5_甲基胞嘧陡、5-甲基尿嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤替代。不必說(shuō)的是，本發(fā)明可以僅適 用于在它們的序列中分別包含至少一個(gè)胞嘧啶、尿嘧啶或腺嘌呤的寡核苷酸。
[0019]我們發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的寡核苷酸中存在的5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和/或 2, 6-二氨基嘌呤對(duì)至少一個(gè)參數(shù)具有積極影響或改善所述寡核苷酸的至少一個(gè)參數(shù)。在本 上下文中，參數(shù)可以包括：結(jié)合親和力和/或動(dòng)力學(xué)、沉默活性、生物穩(wěn)定性、（組織內(nèi)）分 布、細(xì)胞攝取和/或轉(zhuǎn)運(yùn)、和/或所述寡核苷酸的免疫原性，如下文中說(shuō)明的。
[0020] 結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)取決于AON的熱力學(xué)性質(zhì)。這些至少部分地通過(guò)所述 寡核苷酸的解鏈溫度（Tm;使用例如寡核苷酸屬性計(jì)算器（http://www.unc.edu/? cail/biotool/oligo/index.html或http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/)進(jìn)行計(jì)算，對(duì)于單鏈RNA使用基本Tm和最接近的鄰居模型（neighbor model))和/或寡核苷酸-祀外顯子復(fù)合物的自由能（使用RNA結(jié)構(gòu)第4. 5版或RNAmfold 第3. 5版）來(lái)確定。如是Tm增加，則外顯子跳躍的活性通常會(huì)增加，但是當(dāng)Tm太高時(shí)，預(yù) 期A0N會(huì)變得更不具有序列特異性?？山邮艿腡m和自由能取決于該寡核苷酸的序列。因 此，很難給出這些參數(shù)各自的優(yōu)選范圍。
[0021] 本發(fā)明的寡核苷酸的一種活性是在患者的細(xì)胞中、在患者的組織中和/或在后文 所說(shuō)明的患者中抑制突變體蛋白的形成和/或沉默或減少或降低疾病相關(guān)的或引起疾病 的或含有擴(kuò)展的或不穩(wěn)定數(shù)目的重復(fù)體的突變體轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量。包含或由2'-0_甲基硫代 磷酸酯RNA和5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤堿基組成的本 發(fā)明的寡核苷酸，與包含或由2'-0_甲基硫代磷酸酯RNA組成、但沒(méi)有任何5-甲基胞嘧啶、 沒(méi)有任何5-甲基尿嘧啶且沒(méi)有任何2, 6-二氨基嘌呤堿基的寡核苷酸相比，預(yù)期能夠更加 有效地沉默或減少或降低所述轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量。在效率方面的這種差異可以至少為1%、5%、 10 %U5 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %, 85%、90%、95%、100%。所述減少或降低可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平的Northern印跡或（半-)定 量RT-PCR(優(yōu)選如在實(shí)驗(yàn)部分中所進(jìn)行的）或通過(guò)蛋白質(zhì)水平的Western印跡來(lái)評(píng)估。本 發(fā)明的寡核苷酸可以首先在細(xì)胞體系（如實(shí)施例1中所描述的患者來(lái)源的成纖維細(xì)胞）中 進(jìn)行測(cè)試。
[0022] 生物分布和生物穩(wěn)定性優(yōu)選至少部分地通過(guò)經(jīng)驗(yàn)證的改編自Yu等，2002的 雜交連接測(cè)定來(lái)確定。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用特異性捕獲寡核苷酸探針來(lái)培育血 漿或均質(zhì)組織樣品。分離之后，將DIG-標(biāo)記的寡核苷酸連接至所述復(fù)合物并且隨后 使用抗-DIG抗體連接的過(guò)氧化物酶來(lái)檢測(cè)。使用WINN0NLIN軟件包（模型200, 5. 2 版，Pharsight,Mountainview,CA)來(lái)進(jìn)行非房室藥物動(dòng)力學(xué)分析。隨時(shí)間監(jiān)測(cè)每mL血楽或 mg組織的AON水平（ug)，以評(píng)估曲線下面積（AUC)、峰濃度（C_)、達(dá)到峰濃度的時(shí)間（T_)、 末端半衰期和吸收滯后時(shí)間（tlag)。在實(shí)驗(yàn)部分公開(kāi)了此種優(yōu)選的測(cè)定。
[0023]AON可以通過(guò)活化Toll樣受體（TLR)(包括TLR9和TLR7)而刺激先天免疫應(yīng)答 (Krieg等，1995)。TLR9的活化通常是由于寡脫氧核苷酸（0DN)中存在的非甲基化的CG所 致而發(fā)生的，所述非甲基化的CG模仿通過(guò)TLR9-介導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放而活化先天性免疫系 統(tǒng)的細(xì)菌DNA。但是，認(rèn)為2' -0-甲基修飾顯著地降低此種可能的作用。TLR7已經(jīng)被描述 為識(shí)別RNA中的尿嘧啶重復(fù)體（Diebold等，2006)。
[0024]TLR9和TLR7的活化引起一組協(xié)調(diào)的免疫反應(yīng)，其包括先天免疫（巨噬細(xì)胞、樹(shù)突 狀細(xì)胞〇)C)和NK細(xì)胞）（Krieg等，1995 ;Krieg，2000)。這個(gè)過(guò)程中牽連了多種化學(xué)-和 細(xì)胞因子，例如IP-10、TNFa、IL-6、MCP-1 和IFNa(Wagner, 1999;Popovic等，2006)。炎 性細(xì)胞因子吸引血液中額外的防御細(xì)胞，例如T細(xì)胞和B細(xì)胞。這些細(xì)胞因子的水平可以 通過(guò)體外測(cè)試來(lái)進(jìn)行研究。簡(jiǎn)而言之，使用增加濃度的AON來(lái)培育人類全血，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn) 市售的ELISA試劑盒來(lái)確定細(xì)胞因子的水平。通過(guò)將使用包含至少一個(gè)5-甲基胞嘧啶和/ 或5-甲基尿嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤的寡核苷酸處理的細(xì)胞與使用相應(yīng)不具有5-甲 基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶或2, 6-二氨基嘌呤的寡核苷酸處理的細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)比較測(cè) 定中相應(yīng)細(xì)胞因子的濃度，免疫原性的降低優(yōu)選地對(duì)應(yīng)于上述細(xì)胞因子的至少一種的可檢 測(cè)濃度降低。
[0025] 相應(yīng)地，與相應(yīng)的由2' -0-甲基硫代磷酸酯RNA組成但不具有5-甲基胞嘧啶、不 具有5-甲基尿嘧啶且不具有2, 6-二氨基嘌呤的寡核苷酸相比，本發(fā)明的優(yōu)選的寡核苷酸 具有改善的參數(shù)，例如可接受或降低的免疫原性和/或更好的生物分布和/或可接受的或 改善的RNA結(jié)合動(dòng)力學(xué)和/或熱力學(xué)性質(zhì)。這些參數(shù)的每一個(gè)均可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員 公知的測(cè)定法或優(yōu)選如本文中公開(kāi)的測(cè)定法來(lái)評(píng)估。
[0026]以下定義了本發(fā)明的寡核苷酸的其它化學(xué)和修飾。這些額外的化學(xué)或修飾可以與 已經(jīng)為所述寡核苷酸定義的化學(xué)（即存在的5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和/或2, 6-二 氨基嘌呤）組合存在，并且所述寡核苷酸包含或由2' -0-甲基硫代磷酸酯RNA組成。
[0027] 優(yōu)選的本發(fā)明的寡核苷酸包含或由RNA分子或修飾的RNA分子組成。在優(yōu)選的 實(shí)施方式中，寡核苷酸為單鏈。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，然而可能的是單鏈寡核苷 酸可以形成內(nèi)部雙鏈結(jié)構(gòu)。不過(guò)，在本發(fā)明的上下文中，將這種寡核苷酸仍然命名為單鏈 寡核苷酸。與雙鏈siRNA寡核苷酸相比，單鏈寡核苷酸具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（i)其合成預(yù)期比兩 個(gè)互補(bǔ)的siRNA鏈容易；（ii)能夠增強(qiáng)在細(xì)胞中的攝取、更好的（生理學(xué)）穩(wěn)定性和減少 潛在的一般副作用的化學(xué)修飾的范圍更加寬泛；（iii)siRNA對(duì)于非特異性作用（包括脫靶 (off-target)基因具有更高的潛能）和放大的藥理性（例如，通過(guò)治療方案或劑量來(lái)控制 有效性和選擇性的可能性更低）和（iv)siRNA不太可能在核中發(fā)揮作用且不能指向內(nèi)含 子。
[0028] 除了以上所述的修飾之外，本發(fā)明的寡核苷酸可以包含其它修飾，例如，如下文所 述的不同類型的核酸的核苷酸殘基或核苷酸。不同類型的核酸的核苷殘基可以用來(lái)生成本 發(fā)明的寡核苷酸。相比于基于RNA的寡核苷酸，所述寡核苷酸可以具有至少一個(gè)主鏈修飾 (核苷間連鍵和/或糖修飾）和/或至少一個(gè)堿基修飾。
[0029] 堿基修飾包括修飾版本的天然嘌呤和嘧啶堿基（例如腺嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤、胞 啼陡和胸腺啼陡），例如次黃噪呤（例如肌苷）、乳清酸、2-胍丁胺胞苷（agmatidine)、賴西 丁、假尿嘧啶、2_硫代嘧啶（例如2-硫尿嘧啶2-硫代胸腺嘧啶）、G-鉗及其衍生物、5-取代 的嘧啶（例如5-鹵代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氨基甲基尿嘧啶、5-羥 基甲基尿嘧啶、5-氨基甲基胞嘧啶、5-羥基甲基胞嘧啶、超極T(SuperT) )、7-脫氮鳥嘌呤、 7_脫氮腺嘌呤、7-氮雜-2, 6-二氨基嘌呤、8-氮雜-7-脫氮鳥嘌呤、8-氮雜-7-脫氮腺嘌 呤、8-氮雜-7-脫氮-2, 6-二氨基嘌呤、超級(jí)G(SuperG)、超級(jí)A(SuperA)、和N4-乙基胞嘧 啶、或它們的衍生物；N2-環(huán)戊基鳥嘌呤（cPent-G)、N2-環(huán)戊基-2-氨基嘌呤（cPent-AP)、和 N2-丙基-2-氨基嘌呤（Pr-AP)、或它們的衍生物；和簡(jiǎn)并或通用堿基，如2, 6-二氟甲苯或缺 席喊基（absentbase)如脫喊基位點(diǎn)（例如1_脫氧核糖、1，2_二脫氧核糖、1_脫氧-2_〇-甲 基核糖；或其中環(huán)氧被替代為氮的吡咯烷衍生物（氮雜核糖））。超級(jí)A、超級(jí)G和超級(jí)T的 衍生物的例子可以在美國(guó)專利6, 683, 173(EpochBiosciences)中找到，其通過(guò)引用整體的 并入本文。經(jīng)證明，當(dāng)將cPent-G、cPent-AP和Pr-AP并入到siRNA時(shí)降低了免疫刺激作用 (PeacockH?等）。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的寡核苷酸包含脫堿基位點(diǎn)或脫堿基單體。在本發(fā)明 的上下文中，這樣的單體可被稱為脫堿基位點(diǎn)或脫堿基單體。相比于包含核苷堿基的相 應(yīng)核苷酸殘基，脫堿基單體或脫堿基位點(diǎn)是一種缺少核苷堿基的核苷酸殘基或結(jié)構(gòu)單元 (buildingblock)。在本發(fā)明中，脫堿基單體因此是寡核苷酸的結(jié)構(gòu)單元部分但缺少核苷 堿基。這種脫堿基單體可以存在于或鏈接至或連接至或結(jié)合至寡核苷酸的游離末端。
[0031] 在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的寡核苷酸包含1-10個(gè)或更多個(gè)脫堿基單體。因 此，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)脫堿基單體可以存在于本發(fā)明的寡核苷酸中。
[0032] 脫堿基單體可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的及能夠想到的任何類型，其非限制性的 例子如下所描述：
[0033]

【權(quán)利要求】
1. 一種寡核苷酸，包含2'-0-甲基RNA核苷酸殘基，具有其中至少一個(gè)磷酸酯部分被替 代為硫代磷酸酯部分的主鏈，并且包含一個(gè)或多個(gè)5-甲基嘧啶和/或一個(gè)或多個(gè)2, 6-二 氨基嘌呤堿基，其中所述寡核苷酸能夠雜交至具有作為重復(fù)核苷酸單元的選自由以下各項(xiàng) 組成的列表中的重復(fù)核苷酸單元的重復(fù)元件：(CAG) n、（GCG)n、（CGG)n、（GAA)n、（GCC) n、（CCG) n、（AUUCU)n、（CCUG)n，用作用于預(yù)防、延緩和/或治療人類順式元件重復(fù)體不 穩(wěn)定相關(guān)性遺傳障礙的藥物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，由2' -0-甲基RNA核苷酸殘基組成，具有其中所 有的磷酸酯部分均被替代為硫代磷酸酯部分的主鏈。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸能夠雜交至（CAG)n重復(fù)體，其 中所述寡核苷酸包含重復(fù)核苷酸單元（XYG) m或由重復(fù)核苷酸單元（XYG)m組成，其中m是 4- 12的整數(shù)并且每個(gè)X是C或5-甲基胞嘧啶，并且每個(gè)Y是U或5-甲基尿嘧啶，其中至少 一個(gè)X是5-甲基胞嘧啶和/或至少一個(gè)Y是5-甲基尿嘧啶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的寡核苷酸，其中每個(gè)X是5-甲基胞嘧啶和/或每個(gè)Y是5-甲 基尿嘧啶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的寡核苷酸，其中m是7,優(yōu)選地其中所述寡核苷酸包含重 復(fù)核苷酸單元（XYG)7或由重復(fù)核苷酸單元（XYG) 7組成，其中每個(gè)X是5-甲基胞嘧啶并且 每個(gè)Y是尿嘧啶（SEQ ID N0:2)，或者每個(gè)X是胞嘧啶并且每個(gè)Y是5-甲基尿嘧啶（SEQ ID NO:3)〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的堿基序列包含任何的堿基序 列SEQ ID Ν0:90-118或由任何的堿基序列SEQ ID Ν0:90-118組成。
7. -種寡核苷酸，由2' -0-甲基RNA核苷酸殘基組成，具有其中所有的磷酸酯部分均 被替代為硫代磷酸酯部分的主鏈，所述寡核苷酸具有由SEQ ID N0:90組成的堿基序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含5-甲基胞嘧啶 和/或5-甲基尿嘧啶堿基。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-6或8中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含2, 6-二氨 基嘌呤堿基。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-6或8或9中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中與包含2'-0-甲基RNA 核苷酸殘基并且具有其中至少一個(gè)磷酸酯部分被替代為硫代磷酸酯部分的主鏈但不具有 5- 甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤的相應(yīng)寡核苷酸相比，所述寡 核苷酸具有改善的參數(shù)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1_6、8_10中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的長(zhǎng)度為 12-36個(gè)核苷酸。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸為單鏈寡核苷 酸。
13. -種組合物，包含權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的寡核苷酸。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中其包含可以進(jìn)一步有助于增強(qiáng)所述組合物和 /或所述寡核苷酸靶向和/或遞送至組織和/或細(xì)胞和/或進(jìn)入組織和/或細(xì)胞中的至少 一種賦形劑。
15. -種用于預(yù)防、治療和/或延緩人類順式元件重復(fù)體不穩(wěn)定相關(guān)性遺傳障礙的方 法，通過(guò)向需要其的受試者給予權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所限定的寡核苷酸或者權(quán)利要求 13或14中所限定的組合物。
【文檔編號(hào)】A61P25/00GK104271741SQ201380021505
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月23日
【發(fā)明者】彼得·克里斯蒂安·德菲瑟, 蘇珊·阿列貢達(dá)·瑪麗亞·馬爾德斯 申請(qǐng)人:普羅森薩科技有限公司