一種竹節(jié)參皂苷及其制備方法與它的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及竹節(jié)參提取物及其制備方法與它的用途。本發(fā)明的方法包括竹節(jié)參原料液的制備、泡沫分離裝置的組建、泡沫分離等步驟。本發(fā)明利用高脂飼料造模技術(shù)在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)竹節(jié)參提取物的用途和效果進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明竹節(jié)參提取物具有良好的護(hù)肝降脂活性，能夠明顯抑制肝纖維化的發(fā)生，對(duì)肝纖維化具有良好的治療作用。
【專利說明】一種竹節(jié)參皂苷及其制備方法與它的用途
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明屬于具體的中藥應(yīng)用領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種竹節(jié)參皂苷，還涉及所述竹節(jié)參皂苷的制備方法，還涉及所述竹節(jié)參皂苷的用途。
【【背景技術(shù)】】
[0002]肝纖維化是嚴(yán)重威脅人類健康的重要疾病之一，迄今沒有滿意的治療方法。它是由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過度沉淀的病理過程，許多慢性肝臟疾病均可引起肝纖維化。肝纖維化的主要特征在于肝竇毛細(xì)血管化與肝小葉內(nèi)以及匯管區(qū)纖維化，各種慢性肝損傷均可以導(dǎo)致肝臟細(xì)胞外基質(zhì)成分過度增生與異常沉積，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)或(和)功能異常的病理變化，并最終導(dǎo)致肝纖維化。肝纖維化是纖維增生和纖維分解不平衡的結(jié)果，纖維增生是機(jī)體對(duì)于損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，各種病因所致反復(fù)或持續(xù)的慢性肝實(shí)質(zhì)炎癥，壞死可導(dǎo)致肝臟持續(xù)不斷的纖維增生而形成肝纖維化。中藥治療慢性肝炎肝纖維化，在實(shí)驗(yàn)和臨床研究中，顯示出一定療效，具有很大發(fā)展?jié)摿Α?br> [0003]肝纖維化動(dòng)物模型應(yīng)用較多的是四氯化碳(CC14)致肝纖維化模型，但在誘導(dǎo)模型產(chǎn)生時(shí)肝毒性較強(qiáng)，動(dòng)物致死率較高；豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化與人類肝纖維化的形成有一定相似之處，但異種血清后期注射容易導(dǎo)致動(dòng)物的死亡；高脂飼料誘導(dǎo)的脂肪性肝纖維化單獨(dú)應(yīng)用時(shí)周期較長。聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)和異種血清腹腔注射建立起了小鼠的肝纖維化模型，既縮短了模型用時(shí)周期也避免了動(dòng)物的死亡，該模型更好模擬臨床主要病因產(chǎn)生的肝纖維化過程，可以為肝纖維化機(jī)制的研究以及臨床各類護(hù)肝藥物的篩選提供依據(jù)。
[0004]竹節(jié)參為多年生草本植物，莖高30-60cm，主根肉質(zhì)，呈竹鞭狀；掌狀復(fù)葉，3-4片輪生莖頂，葉柄長7_15cm,小葉呈卵圓形至長卵圓形，通常5片，長5_12cm,寬2-4.5cm,兩側(cè)的稍偏斜，邊緣呈細(xì)鋸齒或重鋸齒，兩面沿脈上疏被剛毛，先端漸尖至長漸尖，稀為尾狀漸尖，基部闊楔形至近圓形。開花順·序從邊緣向中央，傘形花序單個(gè)頂生萼邊緣有5齒；花瓣5 ;雄蕊5 ;下位子房，2-5室，離生花柱2-5 ;環(huán)狀肉質(zhì)花盤。竹節(jié)參的花期和果期一般在5一 8月，開花30d后果實(shí)成熟，紅色，頂端常為黑色，，呈漿果狀，核果球形。種子2-3粒，堅(jiān)硬，腎形，種皮乳白色。竹節(jié)參生長于蔭蔽度較大的山坡溝邊、陰濕地帶或巖石溝澗旁，分布于湖北、云南、貴州、四川等地，常用于補(bǔ)虛強(qiáng)壯、散瘀止血、消腫止痛、祛痰止咳。其具有如下功效，1.抗炎、抗病毒作用:竹節(jié)參可減輕蛋清、甲醛或右旋糖酐等多種化學(xué)性致炎物質(zhì)引起的大鼠炎癥反應(yīng)；對(duì)大鼠皮下埋藏棉球引起的肉芽腫形成也有明顯的抑制作用；在佐劑型關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠模型中，可通過抑制炎癥因子TNF-α.1L-1 β等的分泌對(duì)抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；對(duì)弗氏完全佐劑所致大鼠足腫脹和角叉菜膠所致小鼠足腫脹和二甲苯、巴豆油所致的小鼠耳腫脹和具有明顯抑制作用。2.抗氧化作用:竹節(jié)參可通過降低血清或組織中丙二醛的含量，升高血液或組織中的谷胱甘肽，超氧化物歧化酶活性提高機(jī)體清除自由基和增強(qiáng)機(jī)體抗氧化作用，對(duì)四氯化碳、酒精引起的小鼠急性肝損傷和冠脈結(jié)扎致大鼠心肌缺血、梗死起到保護(hù)作用；通過顯著提高LDH的活性，使局灶性腦缺血大鼠和大鼠的神經(jīng)癥狀得到改善。3.降血脂作用:竹節(jié)參降血脂和抑制肥胖的作用可能是通過抗脂質(zhì)過氧化作用和抑制胰脂肪酶的活性延遲腸道對(duì)脂肪的吸收，因而常用作傳統(tǒng)的降血脂的替代藥品
[0005]現(xiàn)有技術(shù)并未提到竹節(jié)參提取物對(duì)于肝纖維化這一特定的病理過程具有抑制作用，竹節(jié)參提取物是否具有治療肝纖維化的作用，現(xiàn)有技術(shù)亦未見報(bào)道。本發(fā)明應(yīng)用竹節(jié)參提取物治療肝纖維化，取得了良好的治療效果。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006][發(fā)明所要解決的技術(shù)問題]
[0007]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種竹節(jié)參皂苷
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種竹節(jié)參皂苷的制備方法。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述竹節(jié)參皂苷用于治療肝纖維化的用途。
[0010][技術(shù)方案]
[0011]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明所述的治療肝纖維化的制備方法包括如下步驟:
[0012]A.竹節(jié)參原料液的制備
[0013]將竹節(jié)參原料粉碎，按照竹節(jié)參與乙醇水溶液的重量比1:5~20，將粉碎竹節(jié)參浸泡在乙醇水溶液中，浸泡2~5h，再加熱回流提取2~5次，每次1~4h，合并提取液，得到待處理的原料液，向原料液中加入 適量NaCl，使原料液中NaCl濃度達(dá)到0.005mol -1~1~0.025mol.ΙΛ最后向原料液中加 入HC1或NaOH調(diào)節(jié)PH至3~6 ;
[0014]所述的竹節(jié)參原料是目前我國市場上銷售的竹節(jié)參中藥材，例如湖北省恩施州宣恩椿木營竹節(jié)參種植基地種植的竹節(jié)參。通常，竹節(jié)參中藥材需要進(jìn)行常規(guī)挑選、清洗、干燥等預(yù)處理后，再使用在中藥材加工【技術(shù)領(lǐng)域】中通常使用的粉碎機(jī)對(duì)干燥竹節(jié)參的進(jìn)行粉碎，粉碎的竹節(jié)參再用標(biāo)準(zhǔn)篩進(jìn)行篩分，收集20-40目竹節(jié)參粉作為本發(fā)明方法的處理原料。
[0015]根據(jù)本發(fā)明，用水提取竹節(jié)參的作用在于將竹節(jié)參的水溶性有效成分主要為皂苷、多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)等提取出來。在后續(xù)操作中，由于竹節(jié)參皂苷是一種優(yōu)良的天然表面活性成分，在強(qiáng)烈攪拌或鼓氣時(shí)就能產(chǎn)生穩(wěn)定的泡沫，而多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)成分發(fā)泡能力較弱，因而利用泡沫分離裝置可將提取物中皂苷與雜質(zhì)成分分離，從而實(shí)現(xiàn)皂苷成分的提取與純化。
[0016]在本發(fā)明中，1重量份竹節(jié)參使用5~20倍量乙醇水溶液提取竹節(jié)參粉，如果使用少于5倍量乙醇水溶液提取竹節(jié)參，會(huì)使提取物中皂苷、多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)含量過高，在后續(xù)的泡沫分離的過程中，在皂苷發(fā)泡分離的同時(shí)，多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)等其他物質(zhì)競爭吸附作用也加強(qiáng)，泡沫帶出的雜質(zhì)較多， 使皂苷的純度降低。如果使用大于20倍量乙醇水溶液提取竹節(jié)參，則皂苷濃度過低，泡沫穩(wěn)定性下降，吸附到氣液界面的皂苷減少，使皂苷回收率降低；因此，使用5~20倍量乙醇水溶液提取竹節(jié)參是合適的，優(yōu)選地為8~16倍量，更優(yōu)選地是8~12倍量。
[0017]在本發(fā)明中，粉碎的竹節(jié)參需要提前加入乙醇水溶液中浸泡2~5h，使竹節(jié)參潤濕，更易提取，更優(yōu)選地是4h。
[0018]在水提取竹節(jié)參時(shí)，加熱回流提取2~5次，每次1~4h較合適，更優(yōu)選地是加熱回流提取3次,每次2h。
[0019]用水提取竹節(jié)參所使用的設(shè)備是目前市場上普遍銷售的圓底燒瓶，例如由蜀牛玻璃儀器公司以商品名圓底燒瓶銷售的產(chǎn)品。
[0020]用水提取竹節(jié)參所使用的加熱回流提取設(shè)備是目前市場上銷售的加熱套，例如由鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司以商品名銷售的電熱套產(chǎn)品。
[0021]在用乙醇水溶液提取后的原料液中，需要加入NaCl，使原料液中NaCl濃度達(dá)到
0.005mol *L-1~0.025mol -L-1,因?yàn)楹线m的離子濃度能夠降低臨界膠束濃度，促進(jìn)表面活性劑形成膠束，增加皂苷的起泡性。如果NaCl濃度低于0.005mol噸_1，則濃度太低，起不到促進(jìn)發(fā)泡的作用；如果NaCl濃度高于0.025mol.L_l，則離子濃度太高，過高的離子濃度不但起不到促進(jìn)發(fā)泡的作用，反而會(huì)起到消泡作用。因此選擇NaCl濃度為0.005mol *L-1~
0.025mol.L-1 是合適的，更優(yōu)選地是 0.013mol.L-1 ~0.016mol.L-1。
[0022]在本發(fā)明中，最后需要向原料液中加入HC1或NaOH調(diào)節(jié)pH至3~6，因?yàn)橹窆?jié)參皂苷主要為五環(huán)三萜類齊墩果烷型皂苷，主要為酸性皂苷，當(dāng)pH值大于6時(shí)，酸性皂苷生成鈉鹽，表面活性大大降低，從而使皂苷的回收率降低；當(dāng)pH值小于3時(shí)，藥液起泡性增強(qiáng)，回收率增加，但純度降低，因而pH為3~6是合適的，更優(yōu)選地是pH為4.5~5.5。
[0023]B.泡沫分離裝置的組建
[0024]組建的泡沫分離裝置有空氣壓縮機(jī)1、玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)2、氣體分布器3、鼓泡區(qū)4、泡沫區(qū)5、收集彎管6、泡沫收集器7七部分組成；空氣壓縮機(jī)1的壓縮空氣通過玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)2計(jì)量后送到氣體分布器3下部`，所述的壓縮空氣通過氣體分布器3，均勻分配到鼓泡區(qū)4形成泡沫，這些泡沫上升到泡沫區(qū)5，再經(jīng)收集彎管6送到泡沫收集器7，最后收集在樣品容器8中，具體結(jié)構(gòu)參見附圖6。
[0025]本裝置所使用的空氣壓縮機(jī)為常用的微型空氣壓縮機(jī)，例如由北京成萌偉業(yè)科技有限公司生產(chǎn)的KY-1V型空氣壓縮機(jī)。
[0026]本裝置所使用的玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)也為常用的微型轉(zhuǎn)子流量計(jì)，例如由常州宏峰熱工儀器有限公司生產(chǎn)的LZB-4DK型玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)。
[0027]本裝置所用的氣體分布器為自制裝置，是按照3根/cm2的標(biāo)準(zhǔn)在橡膠板上插入不同直徑不同的毛細(xì)管。
[0028]本裝置所標(biāo)示的鼓泡區(qū)及泡沫區(qū)均為常見的玻璃色譜柱，例如由蜀牛玻璃儀器公司銷售的色譜柱。
[0029]本裝置所標(biāo)示的收集彎管為常用的玻璃儀器75度蒸餾彎頭，例如上海禾汽化工科技有限公司生產(chǎn)的蒸餾彎頭75度
[0030]本裝置所標(biāo)示的泡沫收集器為常用的玻璃儀器玻璃棒、漏斗及1000ml燒杯組合而成的，例如由蜀牛玻璃儀器公司銷售的玻璃制品。
[0031]C.泡沫分離
[0032]將步驟A得到的含NaCl的原料液加入在步驟B組建的泡沫分離裝置的鼓泡區(qū)中，使所述的原料液在鼓泡區(qū)的直徑高度比達(dá)到1:5~15，然后從塔底以流速200~700mL.mirT1通入空氣，并調(diào)節(jié)氣體分布器使氣泡直徑維持在0.1~1.5mm,連續(xù)鼓氣1~6小時(shí)，富集得到的泡沫通過收集彎管排入泡沫收集器，所述的泡沫進(jìn)入泡沫收集器中會(huì)發(fā)生液化，收集泡沫收集器中的液體，減壓濃縮，真空干燥，即得所述的竹節(jié)參皂苷。[0033]在本發(fā)明中，將所述的原料液加入在步驟B組建的泡沫分離裝置的鼓泡區(qū)，使所述原料液的直徑高度比達(dá)到1:5~15較為合適，若直徑高度比小于1:5，則液面高度太低，泡沫區(qū)太高，部分泡沫在泡沫區(qū)上升過程中易發(fā)生破裂，影響泡沫回收率。若直徑高度比大于1:15，則液面太高，泡沫上升距離過短，造成皂苷純度降低；更優(yōu)選地是直徑高度比為1:9 ~10。
[0034]在本發(fā)明中，空氣流速為200~700mL.min-1比較合適，因?yàn)槿艨諝饬魉傩∮?00mL.min-1，則空氣流速太慢，泡沫生成太慢，浪費(fèi)時(shí)間，增加能耗；若空氣流速大于700mL.min-1,則空氣流速太快,生成泡沫較快,但夾帶液量大,所含雜質(zhì)較多；更優(yōu)選地是空氣流速為400~500mL.min-1 ?
[0035]在本發(fā)明中，氣泡直徑需要維持在0.1~1.5_。因?yàn)槿魵馀菪∮?.1_，氣泡過小，夾帶雜質(zhì)太多，會(huì)降低阜苷的純度比。若氣泡大于1.5mm,氣泡過大，則生成泡沫較不穩(wěn)定，回收率大大下降。更優(yōu)選地是氣泡直徑為0.2~0.6mm。
[0036]在本發(fā)明中,泡沫分離阜苷需要連續(xù)鼓氣1~6小時(shí)。若鼓氣時(shí)間低于1小時(shí),則鼓氣時(shí)間太短，皂苷分離不完全，造成皂苷回收率過低；若鼓氣時(shí)間大于6小時(shí)，則鼓氣時(shí)間太長，在鼓氣的后期，皂苷已經(jīng)基本分離完成，雜質(zhì)含量顯著增加，并浪費(fèi)能耗與時(shí)間，因而選擇鼓氣1~6小時(shí)較為合適。更優(yōu)選地是鼓起時(shí)間為2~4h。
[0037]泡沫分離是一項(xiàng)利用物質(zhì)在氣泡表面上吸附性質(zhì)的差異進(jìn)行分離的技術(shù)，主要用于含表面活性物質(zhì)的中藥皂苷類成分的分離，具有操作簡單、能耗低、分離效率高、無有機(jī)溶劑污染等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明在實(shí)施泡沫分離時(shí)，所采用的最佳提取工藝為:氣體流速為400mL.min—1，pH5.5，氣泡直徑0.4~0.5mm,原料液溫度65°C，，電解質(zhì)NaCl摩爾濃度
0.015mol.L — 1，進(jìn)料質(zhì)量濃度約為0.17mg.mL—1，進(jìn)料體積為600m。此時(shí)，總皂苷富集比
2.1，純度比2.6，回收率98.33%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明泡沫分離法分離竹節(jié)參總皂苷方法穩(wěn)定可靠，產(chǎn)品收率高，可獲得穩(wěn)定的竹節(jié)參皂苷成分(附圖1圖譜)。
[0038]在泡沫收集器中收集的液體需要在壓力0.001~0.01MPa下進(jìn)行減壓濃縮，在壓力0.01~0.1MPa與溫度30~50°C的條件下真空干燥，
[0039]本發(fā)明還涉及采用所述制備方法得到的竹節(jié)參皂苷。
[0040]本發(fā)明還涉及所述的竹節(jié)參皂苷在制備用于治療肝纖維化的藥物中的用途。
[0041]根據(jù)本發(fā)明，所述的肝纖維化是高脂飲食誘導(dǎo)的肝纖維化。
[0042]所得到的竹節(jié)參皂苷進(jìn)行了 HPLC-UV指紋圖譜的研究，其HPLC分析條件如下:
[0043]色譜柱:YMC-packODS-AQ柱(250 X 4.6mm，粒徑 5 μ m);
[0044]流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%KH2P04 (Β)；
[0045]柱溫:30°C；
[0046]洗脫方式:梯度洗脫(0~5min, 5~5%A ；5~20min, 5~30%A ；20~30min, 30~30%A ；30 ~50min, 30 ~85%A ；50 ~60min, 85 ~85%A)；
[0047]檢測(cè)波長:203nm;進(jìn)樣量:10 μ 1 ;流速:1.0ml.min-1 ?
[0048]所得HPLC-UV圖譜見附圖1，從圖中我們可以看出，在保留時(shí)間為23.138min出現(xiàn)一個(gè)較大色譜峰，在36.343min-37.903min共出現(xiàn)四個(gè)較大的色譜峰,我們對(duì)以上五個(gè)色譜峰進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，我們把五個(gè)色譜峰的成分按照從前到后的順序定義為化合物1、化合物2、化合物3、化合物4及化合物5，鑒定結(jié)果如下:[0049]化合物1:白色粉末，1H-NMR(600MHz, C5D5N) δ 6.44(1Η, d, J=7.2Hz, Rha-H-l)，5.57(1H，brs, H-24)，5.23(1H, d, J=6.5Hz, Glc-H-l)，5.15 (1H，J=7.7Hz, Glc-H-l)，
2.01 (3H, s’ H-21)，1.75 (3H, d, J=6.2Hz, H_6)，1.60 (6H, s’ H—26，H_27)，1.58，1.35，1.18，
0.97.0.95(each3H，s，5XCH3)。根據(jù)化合物1的1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)，鑒定為人參皂苷
Re ο
[0050]化合物2:白色粉末，ES1-MSm/z:955[M_H]-。lH-NMR(600MHz，C5D5N) δ 6.34 (1Η,d, J=7.8Hz, Glc-H-l),5.42 (1H, brs, H_12)，5.41 (1H, s’Glc-H-l), 5.02(1H, d, J=6.6Hz,GlcA-H-1) ,3.28 (1H, dd, J=ll.4,4.2Hz, H_3)，3.18 (1H, dd, J=13.2,2.4Hz, H-18)，1.28，
1.26，1.11，1.09，0.91，0.88，0.83 (each3H, s, 7XCH3)。13C_NMR(C5D5N，150MHz)。根據(jù)化合物1的1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)，鑒定為竹節(jié)參皂苷V。
[0051]化合物3:白色粉末，ES1-MSm/z:925[M_H]-。lH-NMR(600MHz，C5D5N) δ 6.33 (1Η,d, J=8.4Hz, Glc-H-l )，5.42 (1H, brs, H_12)，5.28 (1H, d, J=6.0Hz, xyl—H—l )，4.99 (1H，d, J=3.0Hz, GlcA-H-1),3.29 (1H, brd, J=8.4Hz, H_3)，3.20(1H，brd, J=10.8Hz, H-18),
1.29 (6H, s,2XCH3), 1.10,1.10,0.92,0.89,0.85 (each3H, s，5XCH3)。13C_NMR(C5D5N，150MHz)。根據(jù)化合物2的1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)，鑒定為p js_2。
[0052]化合物4:白色粉末，ES1-MSm/z:925[M_H]-。lH-NMR(600MHz，C5D5N) δ 6.33 (1Η,d, J=8.4Hz, Glc-H-l),6.17 (1H, brs,1H, Araf-H-1)，5.42 (1H, s, H_12)，5.02(1H, d,J=3.6Hz，GlcA-H-l)，3.33 (1H, dd, J=10.8,3.6Hz，H_3)，3.19 (1H，dd，J=13.8,3.6Hz，H_18)，
·1.29 (6H, s,2XCH3), 1.09,0.98,0.92,0.89,0.83 (each3H, s，5 X CH3)，13C-NMR (C5D5N，150MHz)。根據(jù)化合物3的ES1-MS、1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)，鑒定為竹節(jié)參皂苷IV。
[0053]化合物5:白色粉末，ES1-MSm/z:793[M_H]-。lH-NMR(600MHz，C5D5N) δ 6.34 (1Η,d, J=7.8Hz, Glc-H-l), 5.42 (1H, brs, H_12)，5.04 (1H, d, J=7.8Hz, GlcA-H-l)，3.37 (1H,brd, J=9.9Hz，H-3)，3.19 (1H, dd, J=10.2,2.4Hz，H_18)，1.31，1.28，1.06，1.00,0.91,0.89，
0.83 (each3H，s，7XCH3)。13C-NMR(C5D5N, 150MHz) ? 根據(jù)化合物 4 的 1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)，鑒定為竹節(jié)參皂苷IV a。
[0054]因此，通過本發(fā)明，得到所述竹節(jié)參皂苷的五種主要成分為人參皂苷Re、竹節(jié)參皂苷V、pjs-2、竹節(jié)參皂苷IV及竹節(jié)參皂苷IV a，人參皂苷Re為達(dá)瑪烷型皂苷，后四種皂苷均為齊墩果烷型皂苷，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，竹節(jié)參皂苷兼有達(dá)瑪烷型皂苷及齊墩果烷型皂苷，且以齊墩果烷型皂苷為主。因此，本發(fā)明的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符，本方法可實(shí)現(xiàn)竹節(jié)參總皂苷的分離。
[0055][有益效果]
[0056]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明利用高脂飼料造模技術(shù)在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)本發(fā)明竹節(jié)參提取物的用途和效果進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明竹節(jié)參提取物具有良好的護(hù)肝降脂活性，能夠明顯抑制肝纖維化的發(fā)生，對(duì)肝纖維化具有良好的治療作用。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0057]圖1是竹節(jié)參提取物的HPLC-UV圖譜。
[0058]圖2是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟的大體觀察圖；
[0059]圖中:A:正常對(duì)照組，B:模型組，C:竹節(jié)參皂苷低劑量組，D:竹節(jié)參皂苷高劑量組。
[0060]圖3是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟的HE染色觀察圖；
[0061]圖中:A:正常對(duì)照組，B:模型組，C:竹節(jié)參皂苷低劑量組，D:竹節(jié)參皂苷高劑量組。
[0062]圖4是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟的Masson染色觀察圖；
[0063]圖中:A:正常對(duì)照組，B:模型組，C:竹節(jié)參皂苷低劑量組，D:竹節(jié)參皂苷高劑量組。
[0064]圖5是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織纖維化相關(guān)基因mRNA檢測(cè)。
[0065]圖中:正常對(duì)照組、模型組、竹節(jié)參皂苷低劑量組(100mg/kg)和竹節(jié)參皂苷高劑量組(300mg/kg )的肝組織勻漿，RT-PCR測(cè)定纖維化相關(guān)基因。與模型組相比，*p〈0.05，#p〈0.001.[0066]圖6是泡沫分離裝置結(jié)構(gòu)示意圖；
[0067]圖中:1-空氣壓縮機(jī)、2-玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)、3-氣體分布器、4-鼓泡區(qū)、5-泡沫區(qū)、6-收集彎管、7-泡沫收集器、8-樣品容器。
【【具體實(shí)施方式】】
[0068]以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明，
[0069]實(shí)施例1:竹節(jié)參提取物的制備
[0070]該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下:`
[0071]A.竹節(jié)參原料液的制備
[0072]將竹節(jié)參原料粉碎至20目，按照竹節(jié)參與體積分?jǐn)?shù)62%乙醇水溶液的重量比1:12，將粉碎竹節(jié)參浸泡在乙醇水溶液中浸泡3h，再加熱回流提取4次，每次lh，合并提取液，得到待處理的原料液，向所述的原料液中加入適量NaCl，使原料液中NaCl濃度達(dá)到
0.01Omol.ΙΛ最后向原料液中加入HC1或NaOH調(diào)節(jié)PH至5 ;
[0073]B.泡沫分離裝置的組建
[0074]泡沫分離裝置由空氣壓縮機(jī)1、玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)2、氣體分布器3、鼓泡區(qū)4、泡沫區(qū)
5、收集彎管6與泡沫收集器7七部分組成，它的結(jié)構(gòu)見附圖6 ；
[0075]C.泡沫分離
[0076]將步驟A得到的含NaCl的原料液加入在步驟B組建的泡沫分離裝置的鼓泡區(qū)中，使所述的原料液在鼓泡區(qū)的直徑高度比達(dá)到1:12，然后從塔底以流速500mL.mirT1通入空氣，并調(diào)節(jié)氣體分布器使氣泡直徑維持在0.6_，連續(xù)鼓氣2小時(shí)，富集得到的泡沫通過收集彎管排入泡沫收集器，所述的泡沫在泡沫收集器中會(huì)發(fā)生液化，收集泡沫收集器中的液體，在壓力0.00IMPa下進(jìn)行減壓濃縮，在壓力0.01MPa與溫度30°C的條件下進(jìn)行真空干燥，即得到竹節(jié)參皂苷提取物。
[0077]采用香草醛-高氯酸法測(cè)定了所得到竹節(jié)參皂苷提取物的竹節(jié)參皂苷含量，由其含量計(jì)算得到竹節(jié)參總皂苷得率與純度。
[0078]具體測(cè)定步驟如下:
[0079]A供試品溶液的制備:分別移取原料液、分離所得的泡沫液10mL，用水飽和正丁醇萃取4次，每次10mL，合并正丁醇萃取液，用正丁醇飽和水20mL洗滌，合并正丁醇萃取液，揮干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，并加至刻度。
[0080]B對(duì)照品溶液的制備:精密稱取人參皂苷Re對(duì)照品10.4mg,置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。
[0081]C檢測(cè)波長的確定:精密吸取A40ul和B50ul，分別置于10ml試管中，依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，搖勻，60°C水浴加熱15min，取出，冷卻，加冰醋酸稀釋至刻度，搖勻，用空白試劑在波長400~700nm處掃描，確定波長在552nm為待測(cè)波長。
[0082]D標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密吸取對(duì)照品溶液100、120、180、200、240yL置10mL具塞試管中，揮干溶劑后，分別加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.2mL,高氯酸0.8mL,加塞，搖勻，于60°C水浴加熱15min，取出，置冰水浴中冷卻3min，分別加入冰乙酸5mL，搖勻，靜置8min后，在552nm處測(cè)吸光度值。以測(cè)定樣品質(zhì)量對(duì)吸光度進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線:A=0.0025X-0.0418，R2=0.9993。
[0083]E測(cè)定方法:精密移取供試品溶液0.5mL或lmL置10mL具塞試管中，揮干溶劑，分別按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法操作，于552nm處測(cè)定吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線給出樣品溶液相當(dāng)于人參皂苷Re對(duì)照品溶液的濃度，根據(jù)回歸方程，計(jì)算樣品中皂苷的含量。并根據(jù)皂苷含量計(jì)算得率及皂苷純度。
[0084]本實(shí)施例的竹節(jié)參總皂苷得率為92.9%，純度為95.0%。
[0085]實(shí)施例2:竹節(jié)參提取物的制備
[0086]該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下: [0087]A.竹節(jié)參原料液的制備
[0088]將竹節(jié)參原料粉碎至30目，按照竹節(jié)參與體積分?jǐn)?shù)66%乙醇水溶液的重量比1:8，將粉碎竹節(jié)參浸泡在乙醇水溶液中，浸泡4h，再加熱回流提取2次，每次4h，合并提取液，得到待處理的原料液，向所述的原料液中加入適量NaCl，使原料液中NaCl濃度達(dá)到
0.018mol.ΙΛ最后向所述原料液中加入HC1或NaOH調(diào)節(jié)PH至3 ;
[0089]B.泡沫分離裝置的組建
[0090]本實(shí)施例泡沫分離裝置結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1的相同。
[0091]C.泡沫分離
[0092]將步驟A得到的含NaCl的原料液加入在步驟B組建的泡沫分離裝置的鼓泡區(qū)中，使所述的原料液在鼓泡區(qū)的直徑高度比達(dá)到1:15，然后從塔底以流速200mL.mirT1通入空氣，并調(diào)節(jié)氣體分布器使氣泡直徑維持在0.1_，連續(xù)鼓氣4小時(shí)，富集得到的泡沫通過收集彎管排入泡沫收集器，所述的泡沫在泡沫收集器中會(huì)發(fā)生液化，收集泡沫收集器中的液體，在壓力0.04MPa下進(jìn)行減壓濃縮，在壓力0.04MPa與溫度36°C的條件下進(jìn)行真空干燥，即得所述的竹節(jié)參皂苷提取物。
[0093]按照與實(shí)施例1同樣方法測(cè)定得到，本實(shí)施例的竹節(jié)參總皂苷得率為96.7%，純度為 69.9%。
[0094]實(shí)施例3:竹節(jié)參提取物的制備
[0095]該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下:
[0096]A.竹節(jié)參原料液的制備
[0097]將竹節(jié)參原料粉碎至40目，按照竹節(jié)參與體積分?jǐn)?shù)70%乙醇水溶液的重量比1:5，將粉碎竹節(jié)參浸泡在乙醇水溶液中，浸泡2h，再加熱回流提取5次，每次2h，合并提取液，得到待處理的原料液，向原料液中加入適量NaCl，使原料液中NaCl濃度達(dá)到
0.025mol.ΙΛ最后向原料液中加入HC1或NaOH調(diào)節(jié)PH至4 ;
[0098]B.泡沫分離裝置的組建
[0099]本實(shí)施例泡沫分離裝置結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1的相同。
[0100]C.泡沫分離
[0101]將步驟A得到的含NaCl的原料液加入在步驟B組建的泡沫分離裝置的鼓泡區(qū)中，使所述的原料液在鼓泡區(qū)的直徑高度比達(dá)到1:5，然后從塔底以流速400mL.mirT1通入空氣，并調(diào)節(jié)氣體分布器使氣泡直徑維持在1.0_，連續(xù)鼓氣6小時(shí)，富集得到的泡沫通過收集彎管排入泡沫收集器，所述的泡沫在泡沫收集器中會(huì)發(fā)生液化，收集泡沫收集器中的液體，在壓力0.06MPa下進(jìn)行減壓濃縮，在壓力0.06MPa與溫度44°C的條件下進(jìn)行真空干燥，即得所述的竹節(jié)參皂苷。
[0102]按照與實(shí)施例1同樣方法測(cè)定得到，本實(shí)施例的竹節(jié)參總皂苷得率為89.4%，純度為 91.4%。
[0103]實(shí)施例4:竹節(jié)參提取物的制備
[0104]該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下:
[0105]A.竹節(jié)參原料液的制備
[0106]將竹節(jié)參原料粉碎至30目，按照竹節(jié)參與體積分?jǐn)?shù)75%乙醇水溶液的重量比1:20，將粉碎竹節(jié)參浸泡在乙醇水溶液中，浸泡5h，再加熱回流提取3次，每次3h，合并提取液，得到待處理的原料液·，向原料液中加入適量NaCl，使原料液中NaCl濃度達(dá)到
0.005mol.ΙΛ最后向原料液中加入HC1或NaOH調(diào)節(jié)PH至6 ;
[0107]B.泡沫分離裝置的組建
[0108]本實(shí)施例泡沫分離裝置結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1的相同。
[0109]C.泡沫分離
[0110]將步驟A得到的含NaCl的原料液加入在步驟B組建的泡沫分離裝置的鼓泡區(qū)中，使所述的原料液在鼓泡區(qū)的直徑高度比達(dá)到1:8，然后從塔底以流速700mL.mirT1通入空氣，并調(diào)節(jié)氣體分布器使氣泡直徑維持在1.5_，連續(xù)鼓氣1小時(shí)，富集得到的泡沫通過收集彎管排入泡沫收集器，所述的泡沫在泡沫收集器中會(huì)發(fā)生液化，收集泡沫收集器中的液體，在壓力0.01MPa下進(jìn)行減壓濃縮，在壓力0.1MPa與溫度50°C的條件下進(jìn)行真空干燥，即得所述的竹節(jié)參皂苷。
[0111]按照與實(shí)施例1同樣方法測(cè)定得到，本實(shí)施例的竹節(jié)參總皂苷得率為91.1%，純度為 93.1%。
[0112]試驗(yàn)實(shí)施例1:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0113]2.1原材料來源
[0114]BABL/C小鼠，雌雄各半，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF級(jí))。
[0115]試劑:膽固醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；豬油、白砂糖，湖北宜昌市北山超市；豬血購自宜昌市屠宰場。將購買的新鮮豬血置于37°C半小時(shí)后4°C存放1小時(shí)后，取上清離心2000rpm, 5min,重復(fù)3次,取上清過濾除菌收集放置于_80°C備用。
[0116]藥物:竹節(jié)參總皂苷，采自湖北恩施州GAP基地的竹節(jié)參，由三峽大學(xué)三級(jí)藥理實(shí)驗(yàn)室鑒定和提取制備，具體制備方法如實(shí)施例1所示。[0117]2.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法:取雌雄各半BABL/C小鼠48只，4~6周齡，隨機(jī)分成四組，每組12只，即正常對(duì)照組，模型對(duì)照組和竹節(jié)參總皂苷低、高劑量組。除正常對(duì)照組給與普通飼料外，其余各組均給與高脂飼料(豬油(16%)、膽固醇(1%)、白砂糖(4%)、普通飼料(79%)，將以上成分混勻后壓制成條狀烘干備用)，于第5周同時(shí)腹腔注射0.2mL/只的血清，每周一次，共3周進(jìn)行造模，同時(shí)竹節(jié)參總阜苷低、高劑量組分別給與100mg/kg、300mg/kg的竹節(jié)參總皂苷灌胃，持續(xù)10W。觀察上述各組小鼠造模前后體重變化、行為和形態(tài)變化。按常規(guī)將上述各組小鼠分別用乙醚麻醉后眼球取血，常規(guī)分離血清，測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、等生化指標(biāo)；分離肝臟，肉眼觀察各組小鼠肝纖維化的程度，取相同部位肝組織置于4%中性多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE和Masson染色，光鏡下觀察肝組織炎癥及肝纖維化情況；取同樣大小的肝組織，提取RNA，RT-PCR測(cè)定肝組織中膠原蛋白I型la (COLL), a-SNA，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(--ΜΡ)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78的mRNA表達(dá)情況。
[0118]2.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0119]2.3.1動(dòng)物活體動(dòng)物觀察
[0120]1)正常對(duì)照組小鼠飲食，活動(dòng)正常，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)有光澤；模型組小鼠毛發(fā)凌舌L無光澤，活動(dòng)減少并精神萎靡；竹節(jié)參總皂苷低、高劑量組總體狀況明顯好于模型對(duì)照組。
[0121]2)與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠體重顯著增加，竹節(jié)參總皂苷低、高劑量組總體狀況明顯好于模型對(duì)照組。
[0122]2.3.2肝臟大體觀察:
[0123]正常對(duì)照組小鼠肝臟顏色鮮亮，表`面光滑，質(zhì)地柔軟而富有彈性；模型對(duì)照組小鼠肝臟顏色呈土黃色，表面被突起于肝表面的顆粒所覆蓋，肝纖維化癥狀明顯；竹節(jié)參總皂苷低、高劑量組明顯較模型組對(duì)照組小鼠肝臟有所改善，表面光滑。
[0124]2.4病理學(xué)觀察:
[0125]正常對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞正常，核結(jié)構(gòu)清晰，肝竇正常；模型對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞普遍出現(xiàn)明顯的脂肪變性、壞死，匯管區(qū)纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤，說明肝纖維化造模成功；竹節(jié)參總皂苷低、高劑量組明顯較模型組對(duì)照組小鼠肝臟有所改善，可明顯遏制纖維的生成。
[0126]2.5Masson 染色觀察:
[0127]與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠肝臟多處出現(xiàn)膠原纖維的產(chǎn)生；與模型對(duì)照組相比，竹節(jié)參總皂苷低、高劑量組明顯抑制膠原纖維的產(chǎn)生。
[0128]2.6血清生化指標(biāo)測(cè)定
[0129]與正常組相比，模型對(duì)照組小鼠血清中ALT (谷丙轉(zhuǎn)氨酶)、AST (谷草轉(zhuǎn)氨酶)、LDL(低密度低蛋白)、甘油三酯(TG)、血清膽酸(TBA)明顯升高，而HDL (高密度脂蛋白)含量明顯降低，反映模型成功建立；與模型對(duì)照組相比，不同劑量的竹節(jié)參皂苷治組均明顯逆轉(zhuǎn)這些生化指標(biāo)，提示竹節(jié)參皂苷具有良好的護(hù)肝降脂活性。
[0130]表1:肝臟生化指標(biāo)測(cè)定
[0131]
【權(quán)利要求】
1.一種竹節(jié)參皂苷的制備方法，其特征在于該制備方法包括如下步驟:A.竹節(jié)參原料液的制備將竹節(jié)參原料粉碎，按照竹節(jié)參與乙醇水溶液的重量比1:5~20，將粉碎竹節(jié)參浸泡在乙醇水溶液中，浸泡2~5h，再加熱回流提取2~5次，每次1~4h，合并提取液，得到待處理的原料液，向原料液中加入適量NaCl，使原料液中NaCl濃度達(dá)到0.005mol.L-1~.0.025mol.L-1最后向原料液中加入HC1或NaOH調(diào)節(jié)PH至3~6 ;B.泡沫分離裝置的組建泡沫分離裝置由空氣壓縮機(jī)(1)、玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)(2)、氣體分布器(3)、鼓泡區(qū)(4)、泡沫區(qū)(5)、收集彎管(6)與泡沫收集器(7)七部分組成，空氣壓縮機(jī)(1)的壓縮空氣通過玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)(2)計(jì)量后送到氣體分布器(3)下部，所述的壓縮空氣通過氣體分布器(3)均勻分配到鼓泡區(qū)(4)中形成泡沫，這些泡沫上升到泡沫區(qū)(5)，再經(jīng)收集彎管(6)送到泡沫收集器(7)中，最后收集在樣品容器(8)中；C.泡沫分尚將步驟A得到的含NaCl的原料液加入在步驟B組建的泡沫分離裝置的鼓泡區(qū)中，使所述的原料液在鼓泡區(qū)的直徑高度比達(dá)到1:5~15，然后從塔底以流速200~700mL.mirT1通入空氣，并調(diào)節(jié)氣體分布器使氣泡直徑維持在0.1~1.5mm,連續(xù)鼓氣1~6小時(shí)，富集得到的泡沫通過收集彎管排入泡沫收集器，所述的泡沫在泡沫收集器中會(huì)發(fā)生液化，收集泡沫收集器中的液體，減壓濃縮，真空干燥，即得所述的竹節(jié)參皂苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟A中，所述竹節(jié)參粉碎粒度是20-40 目。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟A中，竹節(jié)參與乙醇水溶液的重量比是1:8~12。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟A中，所述的乙醇水溶液是體積分?jǐn)?shù)62~75%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的減壓濃縮是在壓力0.001~.0.01MPa下進(jìn)行濃縮。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟C中，所述的干燥是在壓力.0.01~0.1MPa與溫度30~50°C的條件下進(jìn)行干燥。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述制備方法得到的竹節(jié)參皂苷。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的竹節(jié)參皂苷在制備用于治療肝纖維化的藥物中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8所述的竹節(jié)參皂苷在制備用于治療肝纖維化的藥物中的用途，其特征在于其中所述的肝纖維化是高脂飲食誘導(dǎo)的肝纖維化。
【文檔編號(hào)】A61K36/258GK103655654SQ201310680111
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】袁丁, 張長城, 劉朝奇, 王婷, 孫志偉, 周志勇, 崔倩倩, 萬靜枝, 何毓敏 申請(qǐng)人:三峽大學(xué)