白芍總苷作為egfr酪氨酸激酶抑制劑的新用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及白芍總苷作為白芍總苷作為EGFR酪氨酸激酶抑制劑的新用途，白芍總苷中芍藥苷(C23H28O11)的含量不得少于34.6％。與傳統(tǒng)的EGFR酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼相比相比，具安全性高，既可顯著降低EGFR酪氨酸激酶的表達(dá)量又能降低其激活量，價(jià)格低廉，資源豐富等優(yōu)點(diǎn)，為藥物開發(fā)提供一種新的選擇。
【專利說(shuō)明】白芍總苷作為EGFR酪氨酸激酶抑制劑的新用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及白芍總苷作為EGFR酪氨酸激酶抑制劑的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002]白茍總苷(Total Glucosides ofPaeony)是我國(guó)常用的傳統(tǒng)中藥材白茍飲片中提取的總苷物。是茍藥苷(paeoniflorin)、羥基茍藥苷(hydroxy-paeonif1rin)、茍藥花苷(paeonin)、茍藥內(nèi)酯苷(albif1rin)、苯甲酰茍藥苷(benzoylpaeoniflorin)等一系列糖苷類化合物的混合物。白芍總苷具有多種生物學(xué)功能和藥理學(xué)價(jià)值，具有平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗等功效，其資源在國(guó)內(nèi)十分豐富，作為傳統(tǒng)中藥，已經(jīng)在多種中藥復(fù)方中應(yīng)用超過(guò)1500年。白芍總苷于1998年被國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(SFDA)批準(zhǔn)上市作為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床藥物，十余年的應(yīng)用中沒有毒性報(bào)告，安全性高，副作用少。
[0003]表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowth factor receptor, EGFR)是一種跨膜受體膜受體，可將有絲分裂信號(hào)從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)，可有效調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)、細(xì)胞增生、存活、黏附、遷移和分化，細(xì)胞存活及生長(zhǎng)狀況等。EGFR酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在腫瘤細(xì)胞的增殖、損傷修復(fù)、侵襲及新生血管形成等方面起重要作用。在多種惡性腫瘤如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、頭頸部鱗癌、宮頸癌、食管癌、前列腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌等中都有過(guò)度表達(dá)，激活EGFR酪氨酸激酶會(huì)加快腫瘤細(xì)胞繁殖，促進(jìn)腫瘤血管生成，加速腫瘤轉(zhuǎn)移，阻礙腫瘤凋亡。
[0004]目前已知的EGFR酪氨酸激酶抑制劑有可逆EGFR酪氨酸激酶抑制劑，如埃羅替尼，吉非替尼，Lapatinib (GW572016)，PKI66 (CGP59326)，PD158780, PD165557,不可逆 EGFR 酪氨酸激酶抑制劑，如 EKB-596，C1-1033 (PD2183805)。
[0005]長(zhǎng)期以來(lái)，化療是治療腫瘤的主要的治療手段。雖然近年來(lái)新一代化療藥物的應(yīng)用，其療效得到了一定的提高，但是多數(shù)資料表明，化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷同時(shí)出現(xiàn)血液毒性、胃腸道反應(yīng)等副作用，依然是其深入廣泛應(yīng)用的最大障礙。EGFR酪氨酸激酶抑制劑對(duì)癌癥的治療作用引起了人們的關(guān)注，目前已上市的酪氨酸激酶非常昂貴，一般病人難以承受巨大的治療成本而喪失治療機(jī)會(huì)，而且有研究顯示，這類藥物由于成分單一，在給藥后會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的EGFR酪氨酸激酶分子二次突變(獲得性突變)，而產(chǎn)生耐藥性使這類藥物失去治療作用。白芍總苷無(wú)毒，價(jià)廉，資源豐富，目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道白芍總苷作為EGFR酪氨酸激酶抑制劑方面的用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是尋找一種資源豐富，價(jià)廉，安全性高的EGFR酪氨酸激酶抑制劑，為藥物開發(fā)提供一種新的選擇。
[0007]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)特征是:
[0008]1.白芍總苷作為EGFR酪 氨酸激酶抑制劑的新用途。
[0009]2.白芍總苷，含芍藥苷(C23H28O11)不得少于34.6%。[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0011]藥物安全性高，白芍作為傳統(tǒng)中藥，自1998年上市銷售使用以來(lái)，沒有任何毒副作用報(bào)道；療效顯著，調(diào)節(jié)諸多胞內(nèi)重要的細(xì)胞分子的表達(dá)，尤其是對(duì)于EGFR酪氨酸激酶的抑制，使EGFR酪氨酸激酶的表達(dá)量和激活量顯著降低，與傳統(tǒng)的EGFR酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼相比能夠明顯減少EGFR酪氨酸激酶的表達(dá)量。價(jià)格低廉，資源豐富，白芍總苷來(lái)源于我國(guó)常用的傳統(tǒng)中藥材白芍飲片，其資源在國(guó)內(nèi)十分豐富。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為腫瘤細(xì)胞受不同濃度白芍總苷與吉非替尼作用后胞內(nèi)蛋白免疫印跡圖。
[0013]圖2為腫瘤細(xì)胞受不同濃度白芍總苷作用后胞內(nèi)蛋白免疫印跡圖。
[0014]圖3為不同濃度白芍總苷與吉非替尼作用下的腫瘤細(xì)胞存活率曲線。
[0015]圖4為不同濃度白芍總苷作用下腫瘤細(xì)胞狀態(tài)顯微照片。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)闡述。
[0017]實(shí)施例所用的白芍總苷為寧波立華制藥有限公司的白芍總苷膠囊顆粒，使用時(shí)用5mL TBS溶解200mg,用0.22um的濾膜過(guò)濾除菌。
[0018]實(shí)施例1蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)
[0019]取肺癌細(xì)胞A549，H1299，`對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以RPMI1640-5% FBS培養(yǎng)液配制成9 X IO4個(gè)/ mL單細(xì)胞懸液，接種于IOcm培養(yǎng)皿中，每孔10mL，并設(shè)不加樣品的細(xì)胞懸液為陰性對(duì)照。
[0020]將白芍總苷和吉非替尼用培養(yǎng)液配制成所需濃度，用真空泵吸走原有的培養(yǎng)液，將含有不同濃度藥物的培養(yǎng)液加入培養(yǎng)皿中，每皿IOmL ;對(duì)照組加RPMI1640-5% FCS培養(yǎng)液，培養(yǎng)72h。
[0021]72h后，吸取培養(yǎng)清液于試管中，4500轉(zhuǎn)于4°C離心lmin，棄去上清，迅速用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中離心，吸去上層的PBS清液。用預(yù)冷的的PBS沖洗培養(yǎng)皿中貼壁的細(xì)胞一次，水平搖動(dòng)洗滌細(xì)胞，吸掉PBS洗液，并把培養(yǎng)皿置于冰上。每盤細(xì)胞加IOOuL的Radio Immunoprecipitation Assay (RIPA)細(xì)胞裂解液,用干凈的細(xì)胞刮快速將細(xì)胞刮于培養(yǎng)皿的一側(cè)，吸取刮下的細(xì)胞和RIPA裂解液置于離心管中，4°C放置30min使細(xì)胞裂解充分，每隔IOmin渦旋數(shù)秒鐘。用超聲細(xì)胞破碎儀處理細(xì)胞，使其破碎完全，并于4°C離心機(jī)中13000rpm速度離心lOmin。將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到0.5ml的離心管中放于-20°C保存收集的細(xì)胞，離心，吸去上清。以BCATM蛋白質(zhì)試劑盒檢測(cè)各蛋白質(zhì)樣品的濃度，BCA反應(yīng)液按A液和B液1: 50組成，96孔板中每孔加入200uL BCA反應(yīng)液，于暗處反應(yīng)2h后用酶標(biāo)儀于562nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。對(duì)收集的蛋白進(jìn)行含量測(cè)定。
[0022]用還原型6X上樣緩沖液對(duì)蛋白進(jìn)行變性，用水浴鍋于95°C變性lOmin，冷卻后通過(guò)Western Blot試驗(yàn)檢測(cè)蛋白含量。結(jié)果見圖1和圖2。
[0023]如圖1所示，EGFR酪氨酸激酶含量，激活態(tài)EGFR酪氨酸激酶(P-EGFR)含量，下游重要信號(hào)分子激活態(tài)蛋白激酶B(P-AKT，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用)的含量隨白芍總苷濃度的增大而減小，說(shuō)明白芍總苷作用于肺癌細(xì)胞A549，H1299，H1650任何一種細(xì)胞既可以顯著減少EGFR酪氨酸激酶的表達(dá)量又可減少激活量，同時(shí)影響下游重要信號(hào)分子AKT的磷酸化水平，該作用呈濃度依賴性，白芍總苷濃度達(dá)到640ug / ml時(shí)，EGFR酪氨酸激酶的激活幾乎被完全抑制。作為目前臨床上使用較多的EGFR酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼在IOuM時(shí)有相同的抑制P-EGFR的效果，但是吉非替尼作為小分子靶向藥物，只能抑制EGFR酪氨酸激酶特定位點(diǎn)的磷酸化，卻不能減少EGFR酪氨酸激酶的表達(dá)量。
[0024]如圖2所示，在兩種肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中，白芍總苷作用于腫瘤細(xì)胞對(duì)于一些細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)分子有明顯的調(diào)節(jié)作用，且該作用呈濃度依賴性。這些蛋白中大多數(shù)都作為EGFR酪氨酸激酶下游的信號(hào)分子，其表達(dá)水平和激活受EGFR酪氨酸激酶直接或間接地調(diào)控，當(dāng)EGFR酪氨酸激酶受體激活受到抑制，下游信號(hào)蛋白的一系列磷酸化難以進(jìn)行，導(dǎo)致生長(zhǎng)信號(hào)傳導(dǎo)受阻。從圖中可以看出，調(diào)控細(xì)胞周期的蛋白周期素CyclinD / E和周期素依賴蛋白CDK都在白芍總苷的作用下明顯減少，這直接導(dǎo)致ATP不能進(jìn)入核內(nèi)使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤腫瘤抑制蛋白(Rb)磷酸化。Rb作為核內(nèi)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的重要周期節(jié)點(diǎn)蛋白，在非磷酸化狀態(tài)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，磷酸化時(shí)釋放轉(zhuǎn)錄因子，從圖中看出，總Rb的水平在給藥后明顯上升，核內(nèi)非磷酸化狀態(tài)的Rb水平上升，使轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合量上升，從而細(xì)胞增殖周期受阻，使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。EGFR酪氨酸激酶不能激活會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡程序啟動(dòng)，從圖中可以看出，白芍總苷作用后，線粒體上重要的原癌基因蛋白家族中的B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)表達(dá)量減少，促凋亡蛋白(Bax)在藥物作用下沒有明顯的影響，凋亡進(jìn)程中重要標(biāo)志蛋白天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase3)和DNA修復(fù)酶(PARP)在白芍總苷作用后都產(chǎn)生明顯的斷裂，這些斷裂的碎片進(jìn)一步參與到腫瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)程中。這些變化可充分地證明白芍總苷對(duì)EGFR酪氨酸激酶有明顯地抑制作用。
[0025]實(shí)施例2細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)
[0026]取肺癌細(xì)胞A549，H`1299，H1650對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以RPMI1640-5 % FBS培養(yǎng)液將每種細(xì)胞系配制成I X IO4個(gè)/ mL單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔200uL，并設(shè)不加樣品的細(xì)胞懸液為陰性對(duì)照。
[0027]將白芍總苷及吉非替尼用培養(yǎng)液配制成所需濃度，用真空泵吸走原有的培養(yǎng)液，將含有不同濃度的白芍總苷的培養(yǎng)液加入孔中，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)平行孔，每孔200uL ;對(duì)照組加RPMI1640-5% FCS培養(yǎng)液，培養(yǎng)72h。
[0028]72h 后，加 2mg / mL 的 Resazurin 溶液 20uL/ 孔，混勻后在 37°C>5% CO2 及飽和濕度條件下孵育16h。孵育完成后在全波段酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上，以激發(fā)波長(zhǎng)544nm，發(fā)射波長(zhǎng)595nm條件下測(cè)定各孔熒光強(qiáng)度，記錄結(jié)果并計(jì)算白芍總苷對(duì)于腫瘤細(xì)胞的抑制率:抑瘤率=(1-加藥組熒光值/陰性對(duì)照組熒光值)X 100%。結(jié)果見圖3。
[0029]由圖3可知，在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，H1299，H1650中，白芍總苷能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，640ug / mL以上的白芍總苷作用下存活的腫瘤細(xì)胞少于20%，且白芍總苷對(duì)于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性，這與目前臨床上使用較多的EGFR酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼相比有相似的效果，也具有明顯的時(shí)間依賴性和濃度依賴性，這正是因?yàn)榧?xì)胞EGFR酪氨酸激酶信號(hào)通路受白芍總苷和吉非替尼阻斷所導(dǎo)致的。
[0030]實(shí)施例3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
[0031]取肺癌細(xì)胞A549，H1299，H1650對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以RPMI1640-5% FBS培養(yǎng)液配制成9 X IO4個(gè)/ mL單細(xì)胞懸液，接種于IOcm培養(yǎng)皿中，每皿10mL，并設(shè)不加樣品的細(xì)胞懸液為陰性對(duì)照。
[0032]將白芍總苷用培養(yǎng)液配制成所需濃度，用真空泵吸走原有的培養(yǎng)液，將含有不同濃度藥物的培養(yǎng)液加入培養(yǎng)皿中，每皿IOmL ;對(duì)照組加RPMI1640-5% FCS培養(yǎng)液，培養(yǎng)72h。
[0033]取不同組別細(xì)胞培養(yǎng)皿置于顯微鏡下觀察，將顯微鏡調(diào)整為10倍目鏡，10倍物鏡，使用照相軟件對(duì)視野內(nèi)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行拍攝。結(jié)果見圖4。
[0034]圖4顯示，空白對(duì)照組的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈多角形，細(xì)胞飽滿，數(shù)目多，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，隨著白芍總苷給藥濃度加大，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化:細(xì)胞開始皺縮，邊緣出現(xiàn)亮化，即貼壁狀態(tài)受到藥物的影響，細(xì)胞數(shù)明顯減少，這些變化是由于細(xì)胞EGFR酪氨酸激酶信號(hào)通路受白芍總苷 阻斷導(dǎo)致的。
【權(quán)利要求】
1.白芍總苷的新用途，其特征在于作為EGFR酪氨酸激酶抑制劑。
2.如權(quán)利要求1所述的白芍總苷，其特征在于，含芍藥苷(C23H28O11)不得少于34.6%。
【文檔編號(hào)】A61K36/71GK103550313SQ201310535739
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月30日
【發(fā)明者】張麗娟, 唐洋, 崔怡迪, 邱培菊, 蘭瑩 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)