金粉蕨素的提取制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種金粉蕨素的提取制備方法，及其在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。所述金粉蕨素是按如下方法制備的：以通經(jīng)草為原料，用10%-80%乙醇提取，通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂、硅膠等色譜純化得到。本發(fā)明所提供的金粉蕨素對(duì)制備治療艾滋病藥物具有重要意義。
【專利說(shuō)明】金粉蕨素的提取制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種金粉蕨素的提取制備方法及其在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合征，英文名稱Acquired Immune DeficiencySyndrome, AIDS。是人類因?yàn)楦腥救祟惷庖呷毕莶《?Human Immunodeficiency Virus,HIV)后導(dǎo)致免疫缺陷，并發(fā)一系列機(jī)會(huì)性感染及腫瘤，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡的綜合征。目前，艾滋病已成為嚴(yán)重威脅世界人民健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。1983年，人類首次發(fā)現(xiàn)HIV。目前，艾滋病已經(jīng)從一種致死性疾病變?yōu)橐环N可控的慢性病。HIV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬中的人類慢病毒組，分為I型和2型。目前世界范圍內(nèi)主要流行HIV-1。HIV-1為直徑約10(Tl20nm球形顆粒，由核心和包 膜兩部分組成。核心包括兩條單股RNA鏈、核心結(jié)構(gòu)蛋白和病毒復(fù)制所必須的酶類，含有逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶。HIV-1是一種變異性很強(qiáng)的病毒，不規(guī)范的抗病毒治療是導(dǎo)致病毒耐藥的重要原因。HIV-2主要存在于西非，目前在美國(guó)、歐洲、南非、印度等地均有發(fā)現(xiàn)。HIV-2的超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞嗜性與HIV-1相似，其核苷酸和氨基酸序列與HIV-1相比明顯不同。
[0003]WHO報(bào)告2010年全世界存活HIV攜帶者及艾滋病患者共3400萬(wàn)，新感染270萬(wàn)，全年死亡180萬(wàn)人。每天有超過(guò)7000人新發(fā)感染，全世界各地區(qū)均有流行，但97%以上在中、低收入國(guó)家，尤以非洲為重。專家估計(jì)，全球流行重災(zāi)區(qū)可能會(huì)從非洲移向亞洲。中國(guó)⑶C估計(jì)，截止至2011年底，我國(guó)存活HIV攜帶者及艾滋病患者約78萬(wàn)人，全年新發(fā)感染者
4.8萬(wàn)人，死亡2.8萬(wàn)人。疫情已覆蓋全國(guó)所有省、自治區(qū)、直轄市，目前我國(guó)面臨艾滋病發(fā)病和死亡的高峰期，且已由吸毒、暗娼等高危人群開(kāi)始向一般人群擴(kuò)散。
[0004]世界各國(guó)的醫(yī)藥學(xué)家均致力于研究與探索抗艾滋病新藥，不斷有新的藥品試用或問(wèn)世?？拱滩∷幬镏饕幸韵聨最?核苷類逆轉(zhuǎn)錄抑制劑，如疊氮胸苷(AZT，齊多夫定)、拉米夫定等；非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，如地拉韋定，奈韋拉等；蛋白酶抑制劑，如沙奎那韋、利托那韋、噴噪那韋等；整合酶抑制劑，如齊多夫定單核昔酸等；侵入抑制藥，如T20等。疊氮胸苷是1987年在臨床最先使用的抗HIV藥物，單一或二聯(lián)治療HIV感染，由于這種治療通常在6個(gè)月內(nèi)即出現(xiàn)明顯的耐藥性，而且對(duì)機(jī)體的免疫重建不佳，因而很少取得療效。齊多夫定、拉米夫定為雙脫氧核苷類，主要治療AIDS及其相關(guān)綜合征，減少機(jī)會(huì)性感染，但仍無(wú)法根治AIDS，且大多數(shù)有嚴(yán)重不良反應(yīng)，需長(zhǎng)期或終身用藥。沙奎那韋、利托那韋和吲哚那韋與核苷類聯(lián)用可有效抑制HIV復(fù)制，并減少不良反應(yīng)。
[0005]此外，免疫調(diào)節(jié)藥物，如干擾素、白細(xì)胞介素2和丙種球蛋白等，都具有抗病毒、抗細(xì)菌感染和增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)的作用。其中白細(xì)胞介素2還可使患者淋巴細(xì)胞數(shù)增加，改善人體免疫功能。
[0006]目前，艾滋病治療有美國(guó)先進(jìn)的進(jìn)入細(xì)胞抑制劑T20治療，T20是一種肽類，不能口服，只能注射，價(jià)格昂貴。每位患者每年的治療費(fèi)用都在20000美元以上，藥價(jià)的昂貴使得絕大多數(shù)艾滋病患者都無(wú)法得到有效治療。
[0007]中醫(yī)中藥是一個(gè)偉大的寶庫(kù)，繼承和發(fā)揚(yáng)祖國(guó)幾千年的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，挖掘醫(yī)學(xué)寶庫(kù)，利用現(xiàn)代的分離分析手段，篩選出有效治療艾滋病的中藥提取物或有效成分，開(kāi)發(fā)出治療艾滋病的有效藥物。目前已報(bào)道的從中藥中提取的有效部位和成分有松塔多糖、香菇多糖、人參皂苷、天花粉蛋白、喜樹(shù)堿、罌粟堿等。 [0008]通經(jīng)草系中國(guó)蕨科植物銀粉背蕨Aleuritopteris argentea (Gmel.) Fee的干燥全草。秋季采收，除去雜質(zhì)曬干。收載于1998年《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)蒙藥分冊(cè)》。其性平，味微苦，具有明目、愈傷、止血、活血調(diào)經(jīng)、止咳、利濕、解毒消腫等功效，可用于目赤、視力減退、胸傷、骨傷、肺癆咳嗽、吐血。為我國(guó)藏蒙等少數(shù)民族地區(qū)的常用藥物。但有關(guān)通經(jīng)草的基礎(chǔ)研究尚十分有限，使該藥材的后續(xù)推廣和應(yīng)用受到限制?，F(xiàn)代研究表明，通經(jīng)草含有粉背蕨酸(alepterolic acid),鹿糖(sucrose)和黃酮類化合物,其他化學(xué)成分不詳；藥理作用研究表明，通經(jīng)草黃酮是一種天然有效的自由基清除劑通經(jīng)草黃酮對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基、過(guò)氧化氫具有很強(qiáng)的清除作用，其EC5tl分別為0.0099,0.0060和0.0190mg/mL，且呈濃度依賴關(guān)系，其他藥理作用未見(jiàn)報(bào)道。
[0009]專利申請(qǐng)?zhí)枮镃N96102241.8的專利公開(kāi)了一種治療肝膽結(jié)石和抗復(fù)發(fā)的特效藥物組方，其中含有通經(jīng)草。專利申請(qǐng)?zhí)枮镃N200310110176.4的專利申請(qǐng)公開(kāi)了公開(kāi)了一種治療鼻竇炎的藥物組方，其中含有通經(jīng)草。專利申請(qǐng)?zhí)枮镃N200310110531.8的專利公開(kāi)了一種用于治療再生障礙性貧血的中草藥劑，其由回生草、神仙草、通經(jīng)草等近20種中草藥經(jīng)水熬煮加白酒配制而成。專利申請(qǐng)?zhí)枮镃N97107327.9的專利公開(kāi)了一種治療婦女痛經(jīng)的中草藥，配方的組成包括:通經(jīng)草、蒼術(shù)、雞內(nèi)金等。專利申請(qǐng)?zhí)枮镃N201210440734.2的專利公開(kāi)了一種治療兒童急性良性肌炎的藥物，其原料配方和重量配比為:通經(jīng)草6~10份，絲瓜絡(luò)8~15份，走馬風(fēng)8~15份等。專利申請(qǐng)?zhí)枮镃N201210462718.3的專利公開(kāi)了一種治療乳房疾病的藥物，其特征在于組分和重量配比是:通經(jīng)草1:燈籠草2:白術(shù)1.5
坐寸ο
[0010]上述文獻(xiàn)及專利等，尚未見(jiàn)從通經(jīng)草中提取制備金粉蕨素及用于制備治療艾滋病藥物的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的在于公開(kāi)一種金粉蕨素的提取制備方法及其在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
本發(fā)明所用原料通經(jīng)草為中國(guó)蕨科植物銀粉背蕨(Aleuritopteris argentea(Gmel.)Fee)的干燥全草。
[0013]本發(fā)明通經(jīng)草提取物是按如下方法制備得到:
(1)通經(jīng)草，用濃度10%-80%乙醇作為溶劑，在30°C-90°C提取，提取次數(shù)為1_3次，每次提取時(shí)間為1-4小時(shí)，每次溶劑用量為通經(jīng)草重量的6-15倍；濾過(guò)，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得通經(jīng)草提取物A ；
(2)將步驟(1)得到的通經(jīng)草提取物A加10-20倍量水溶解，濾過(guò)，得藥液A，藥液A通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱，用水洗脫，再用濃度50%-70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集不同乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物；
(3)將步驟(2)得到的通經(jīng)草提取物再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷-甲醇(100:1-3:1)梯度洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同流份，收集三氯甲烷-甲醇(10:1)梯度洗脫液，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，得到金粉蕨素。
[0014]金粉蕨素的化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)均大于98%。
[0015]金粉蕨素:C27H32O13, M564，白色針狀結(jié)晶(甲醇)，mp.279_280°C ;乙醇溶液中υνλ.:213，286，330nm ；IR:3420, 3360，1655，1647，1632，1574，1500，994，978。EIMS:564.447, 418.400 (Μ-鼠李糖)，368，354，256 (Μ-鼠李糖-葡萄糖)，238，179，153，152，I29, 104, 85, 77, 71.55 ； 1HNMR(DMS0-d6, δ ): 12.459 (s)，7.548 (d,7.6),7.548 (d，7.6)，
7.412(t,7.6),7.412 (t,7.6),7.364 (t,7.6),6.731 (d, 1.6),6.672 (d, 1.6),6.377(s)，5.696 (d,7.6),5.40 (dd, 12.8),2.8,3.20 (dd, 17.2, 12.8),2.888 (dd, 17.2, 12.8)；13CNMR(DMS0-d6，δ ):196.52 (s), 166.22 (s), 164.43 (s), 163.32 (s),79.40 (d),43.45(t)，97.85 (d)，96.23 (d), 104.35 (s), 139.24 (s), 126.75 (d), 129.07 (d), 128.98 (d),
129.07(d), 126.75 (d),99.40 (d),77.80 (d),79.07 (d),74.01 (d),78.75 (d),62.03(t), 102.36 (d),72.31 (d),72.68 (d),71.10 (d),69.81 (d), 18.78 (q)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道的金粉蕨素(onychin) —致；TLC檢查，Rf值與金粉蕨素標(biāo)準(zhǔn)品相同。
[0016]優(yōu)選的本發(fā)明通經(jīng)草提取物制備方法:
(1)通經(jīng)草，用濃度60%乙醇作為溶劑，在70°C提取，提取次數(shù)為2次，每次提取時(shí)間為2小時(shí)，每次溶劑用量為通經(jīng)草重量的12倍；濾過(guò)，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得通經(jīng)草提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的通經(jīng)草提取物A加15倍量水溶解，濾過(guò)，得藥液A，藥液A通過(guò)HPD600大孔吸附樹(shù)脂，用水洗脫，再用濃度70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集70%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物；
(3)將步驟(2)得到的通經(jīng)草提取物再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷-甲醇(100:1-3:1)梯度洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同流份，收集三氯甲烷-甲醇(10:1)梯度洗脫液，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，得到金粉蕨素。
[0017]金粉蕨素的化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)均大于98%。
[0018]金粉蕨素:C27H32O13, M564，白色針狀結(jié)晶(甲醇)，mp.279_280°C ;乙醇溶液中υνλ.:213，286，330nm ；IR:3420, 3360，1655，1647，1632，1574，1500，994，978。EIMS:564.447, 418.400 (Μ-鼠李糖)，368，354，256 (Μ-鼠李糖-葡萄糖)，238，179，153，152，I29, 104, 85, 77, 71.55 ； 1HNMR(DMS0-d6, δ ): 12.459 (s)，7.548 (d,7.6),7.548 (d，7.6)，
7.412(t,7.6),7.412 (t,`7.6),7.364 (t,7.6),6.731 (d, 1.6),6.672 (d, 1.6),6.377(s)，5.696 (d，7.6),5.40 (dd, 12.8),2.8,3.20 (dd, 17.2, 12.8),2.888 (dd, 17.2, 12.8)；13CNMR(DMS0-d6，δ ):196.52 (s), 166.22 (s), 164.43 (s), 163.32 (s),79.40 (d),43.45(t)，97.85 (d)，96.23 (d), 104.35 (s), 139.24 (s), 126.75 (d), 129.07 (d), 128.98 (d),
129.07(d), 126.75 (d),99.40 (d),77.80 (d),79.07 (d),74.01 (d),78.75 (d),62.03(t), 102.36 (d),72.31 (d),72.68 (d),71.10 (d),69.81 (d), 18.78 (q)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道的金粉蕨素(onychin) —致；TLC檢查，Rf值與金粉蕨素標(biāo)準(zhǔn)品相同。
[0019]本發(fā)明的通經(jīng)草提取物，其制備方法特征在于:所采用的大孔吸附樹(shù)脂為DM130大孔吸附樹(shù)脂、DlOl大孔吸附樹(shù)脂、HPD600大孔吸附樹(shù)脂。
[0020]本發(fā)明的通經(jīng)草提取物，可以通過(guò)加入藥劑學(xué)允許的各種輔料，制成藥劑學(xué)上的各種口服劑型。
[0021]本發(fā)明首次探索研究以中國(guó)蕨科植物銀粉背蕨(Aleuritopteris argentea(Gmel.)Fee)的干燥全草為原料提取制備金粉蕨素，并用于治療艾滋病。本實(shí)驗(yàn)研究表明，本發(fā)明方法制備的金粉蕨素，在MAGI細(xì)胞中對(duì)HIV-1 IIIB毒株有明顯抑制作用，濃度為50 μ g/ml時(shí)，抑制率90%以上；在階4細(xì)胞中對(duì)HIV-1 IIIB毒株有明顯的抑制作用，濃度為100 μ g/ml時(shí)，抑制率95%以上。
[0022]本發(fā)明的金粉蕨素與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成治療艾滋病藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例對(duì)金粉蕨素的提取制備方法及其在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用做進(jìn)一步說(shuō)明，但不限于本發(fā)明。
[0024]實(shí)施例1:通經(jīng)草提取物及金粉蕨素的制備
以中國(guó)蕨科植物銀粉背蕨(Aleuritopteris argentea (Gmel.) Fee)的干燥全草為原料，采用如下步驟方法制備:
(1)通經(jīng)草10kg，用濃度60%乙醇作為溶劑，在70°C提取，提取次數(shù)為2次，每次提取時(shí)間為2小時(shí)，每次溶劑用量為`通經(jīng)草重量的12倍；濾過(guò)，合并提取液，回收乙醇,濃縮,干燥，得通經(jīng)草提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的通經(jīng)草提取物A加15倍量水溶解，濾過(guò)，得藥液A，藥液A通過(guò)HPD600大孔吸附樹(shù)脂柱，用水洗脫，再用濃度70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集70%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物；
(3)將步驟(2)得到的通經(jīng)草提取物再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷-甲醇(100:1-3:1)梯度洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同流份，收集三氯甲烷-甲醇(10:1)梯度洗脫液，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，得到金粉蕨素。
[0025]化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證:
金粉蕨素=C27H32O13, M564，白色針狀結(jié)晶(甲醇)，mp.279-280 °C ;乙醇溶液中υνλ.:213，286，330nm ；IR:3420, 3360，1655，1647，1632，1574，1500，994，978。EIMS:564.447, 418.400 (Μ-鼠李糖)，368，354，256 (Μ-鼠李糖-葡萄糖)，238，179，153，152，I29, 104, 85, 77, 71.55 ； 1HNMR(DMS0-d6, δ ): 12.459 (s)，7.548 (d,7.6),7.548 (d，7.6)，
7.412(t,7.6),7.412 (t,7.6),7.364 (t,7.6),6.731 (d, 1.6),6.672 (d, 1.6),6.377(s)，5.696 (d，7.6),5.40 (dd, 12.8),2.8,3.20 (dd, 17.2, 12.8),2.888 (dd, 17.2, 12.8)；13CNMR(DMS0-d6，δ ):196.52 (s), 166.22 (s), 164.43 (s), 163.32 (s),79.40 (d),43.45(t)，97.85 (d)，96.23 (d), 104.35 (s), 139.24 (s), 126.75 (d), 129.07 (d), 128.98 (d),
129.07(d), 126.75 (d),99.40 (d),77.80 (d),79.07 (d),74.01 (d),78.75 (d),62.03(t), 102.36 (d),72.31 (d),72.68 (d),71.10 (d),69.81 (d), 18.78 (q)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道的金粉蕨素(onychin) —致；TLC檢查，Rf值與金粉蕨素標(biāo)準(zhǔn)品相同。[0026]金粉蕨素純度經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)為99.7%。
[0027]實(shí)施例2:通經(jīng)草提取物及金粉蕨素的制備
以中國(guó)蕨科植物銀粉背蕨(Aleuritopteris argentea (Gmel.) Fee)的干燥全草為原料，采用如下步驟方法制備:
(1)通經(jīng)草10kg，用濃度10%乙醇作為溶劑，在90°C提取，提取次數(shù)為I次，每次提取時(shí)間為4小時(shí)，每次溶劑用量為通經(jīng)草重量的15倍；濾過(guò)，合并提取液，回收乙醇,濃縮,干燥，得通經(jīng)草提取物A ;
(2)將步驟(1)得到的通經(jīng)草提取物A加10倍量水溶解，濾過(guò)，得藥液A，藥液A通過(guò)DM130大孔吸附樹(shù)脂柱，用水洗脫，再用濃度50%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物；
(3)將步驟(2)得到的通經(jīng)草提取物再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷-甲醇梯度洗脫(100:1-3:1 )，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同流份，收集三氯甲烷-甲醇(10:1)梯度洗脫液，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，得到金粉蕨素。
[0028]化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證:
金粉蕨素=C27H32O13, M564，白色針狀結(jié)晶(甲醇)，mp.279-280 °C ;乙醇溶液中υνλ.:213，286，330nm ；IR:3420, 3360，1655，1647，1632，1574，1500，994，978。EIMS:564.447, 418.400 (Μ-鼠李糖)，368，354，256 (Μ-鼠李糖-葡萄糖)，238，179，153，152，I29, 104, 85, 77, 71.55 ； 1HNMR(DMS0-d6, δ ): 12.459 (s)，7.548 (d,7.6),7.548 (d，7.6)，
7.412(t,7.6),7.412 (t,7.6),7.364 (t,7.6),6.731 (d, 1.6),6.672 (d, 1.6),6.377(s)，5.696 (d，7.6),5.40 (dd, 12.8),2.8,3.20 (dd, 17.2, 12.8),2.888 (dd, 17.2, 12.8)；13CNMR(DMS0-d6，δ ):196.52 (s), `166.22 (s), 164.43 (s), 163.32 (s),79.40 (d),43.45(t)，97.85 (d)，96.23 (d), 104.35 (s), 139.24 (s), 126.75 (d), 129.07 (d), 128.98 (d),
129.07(d), 126.75 (d),99.40 (d),77.80 (d),79.07 (d),74.01 (d),78.75 (d),62.03(t), 102.36 (d),72.31 (d),72.68 (d),71.10 (d),69.81 (d), 18.78 (q)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道的金粉蕨素(onychin) —致；TLC檢查，Rf值與金粉蕨素標(biāo)準(zhǔn)品相同。
[0029]金粉蕨素純度經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)均大于98.8%。
[0030]實(shí)施例3:通經(jīng)草提取物及金粉蕨素的制備
以中國(guó)蕨科植物銀粉背蕨(Aleuritopteris argentea (Gmel.) Fee)的干燥全草為原料，采用如下步驟方法制備:
(1)通經(jīng)草，用濃度80%乙醇作為溶劑，在30°C提取，提取次數(shù)為3次，每次提取時(shí)間為I小時(shí)，每次溶劑用量為通經(jīng)草重量的6倍；濾過(guò)，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得通經(jīng)草提取物A ；
(2)將步驟(1)得到的通經(jīng)草提取物A加20倍量水溶解，濾過(guò)，得藥液A，藥液A通過(guò)DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱，用水洗脫，再用濃度70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集70%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物；
(3)將步驟(2)得到的通經(jīng)草提取物再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷-甲醇(100:1-3:1)梯度洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同流份，收集三氯甲烷-甲醇(10:1)梯度洗脫液，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，得到金粉蕨素。
[0031]化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等波譜手段確證:金粉蕨素=C27H32O13, M564，白色針狀結(jié)晶(甲醇)，mp.279-280 °C ;乙醇溶液中υνλ.:213，286，330nm ；IR:3420, 3360，1655，1647，1632，1574，1500，994，978。EIMS:564.447, 418.400 (Μ-鼠李糖)，368，354，256 (Μ-鼠李糖-葡萄糖)，238，179，153，152，I29, 104, 85, 77, 71.55 ； 1HNMR(DMS0-d6, δ ): 12.459 (s)，7.548 (d,7.6),7.548 (d，7.6)，
7.412(t,7.6),7.412 (t,7.6),7.364 (t,7.6),6.731 (d, 1.6),6.672 (d, 1.6),6.377(s)，5.696 (d,7.6),5.40 (dd, 12.8),2.8,3.20 (dd, 17.2, 12.8),2.888 (dd, 17.2, 12.8)；13CNMR(DMS0-d6，δ ):196.52 (s), 166.22 (s), 164.43 (s), 163.32 (s),79.40 (d),43.45(t)，97.85 (d)，96.23 (d), 104.35 (s), 139.24 (s), 126.75 (d), 129.07 (d), 128.98 (d),
129.07(d), 126.75 (d),99.40 (d),77.80 (d),79.07 (d),74.01 (d),78.75 (d),62.03(t), 102.36 (d),72.31 (d),72.68 (d),71.10 (d),69.81 (d), 18.78 (q)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道的金粉蕨素(onychin) —致；TLC檢查，Rf值與金粉蕨素標(biāo)準(zhǔn)品相同。
[0032]金粉蕨素純度經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)均大于99.5%。
[0033]實(shí)驗(yàn)例I金粉蕨素抗HIV-1活性試驗(yàn)
1、材料
細(xì)胞:MT_4 細(xì)胞、MAGI test (Multinuclear Activation of GalactosidaseIndicator)又稱 Single Life Cycle,所用細(xì)胞為 Hela-QM-LTR-β-gal。北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院培養(yǎng)保存；
毒株北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院培養(yǎng)保存；
藥物:本發(fā)明實(shí)施例1所得金粉蕨素。
[0034]2、金粉蕨素在MT4細(xì)胞中抗HIV-1B活性試驗(yàn)
離心收集500萬(wàn)MT-4細(xì)胞，加入Iml含10000 TCID50 HIV-1 IIIB的RPMI 1640培養(yǎng)液，37°C、5% C02孵箱中孵育2小時(shí)。1500rpm離心后，RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌一次，離心，加入IOml RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，96孔板每孔加入100 u I細(xì)胞病毒懸液(含5 X IO4細(xì)胞/孔)。選用藥物最高濃度為50 μ g/ml，5倍比稀釋4個(gè)濃度，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，每孔IOOul (藥物終濃度減半)。同時(shí)設(shè)立病毒對(duì)照組(只加病毒，不加藥物)、細(xì)胞對(duì)照組(不加病毒，不加藥物)。于37°C、5% C02孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)5天，期間，第3天更換藥液。逐日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)與形態(tài)變化。細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，病毒對(duì)照組于培養(yǎng)后第3-4天出現(xiàn)合胞體。培養(yǎng)第5天，收獲培養(yǎng)上清，以測(cè)定p24抗原的方法，檢測(cè)培養(yǎng)上清p24抗原含量，以示病毒的增殖情況。將給藥組與病毒對(duì)照組進(jìn)行比較，以下列公式計(jì)算藥物的抑制率:
抑制率=(病毒對(duì)照組p24含量一給藥組p24含量)+病毒對(duì)照組p24含量以P24抗原檢測(cè)法測(cè)定藥物對(duì)HIV-1 IIIB毒株的抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表1。以藥物濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以對(duì)病毒的抑制率為縱坐標(biāo)繪制曲線，利用直線回歸方法計(jì)算回歸任線，計(jì)算各樣品對(duì)HIV-1 IIIB毒株的50%抑制病毒濃度(IC5tl)。
[0035]表1金粉蕨素在MT4細(xì)胞中對(duì)HIV-1 IIIB毒株的抑制作用
【權(quán)利要求】
1.金粉蕨素的提取制備方法及其在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，所述金粉蕨素是按如下方法制備得到: 以中國(guó)蕨科植物銀粉背蕨(Aleuritopteris argentea (Gmel.) Fee)的干燥全草為原料，采用如下步驟方法制備: (1)通經(jīng)草，用濃度10%-80%乙醇作為溶劑，在30°C_90°C提取，提取次數(shù)為1_3次，每次提取時(shí)間為1-4小時(shí)，每次溶劑用量為通經(jīng)草重量的6-15倍；濾過(guò)，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得通經(jīng)草提取物A ； (2)將步驟(1)得到的通經(jīng)草提取物A加10-20倍量水溶解，濾過(guò)，得藥液A，藥液A通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂，用水洗脫，再用濃度50%-70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物； (3)將步驟(2)得到的通經(jīng)草提取物再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷-甲醇(100:1-3:1)梯度洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同流份，收集三氯甲烷-甲醇(10:1)梯度洗脫液，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，得到金粉蕨素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，所述金粉蕨素是按如下方法制備得到: 以中國(guó)蕨科植物銀粉背蕨(Aleuritopteris argentea (Gmel.) Fee)的干燥全草為原料，采用如下步驟方法制備: (1)通經(jīng)草，用濃度60%乙醇作為溶劑，在70°C提取，提取次數(shù)為2次，每次提取時(shí)間為2小時(shí)，每次溶劑用量為通經(jīng)草重量的12倍；濾過(guò)，合并提取液，回收乙醇，濃縮，干燥，得通經(jīng)草提取物A ； (2)將步驟(1)得到的通經(jīng)草提取物A加15倍量水溶解，濾過(guò)，得藥液A，藥液A通過(guò)HPD600大孔吸附樹(shù)脂，用水洗脫，再用濃度70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集70%濃度乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得通經(jīng)草提取物。
4.(3)將步驟(2)得到的通經(jīng)草提取物再經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以三氯甲烷-甲醇(100:1-3:1)梯度洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同流份，收集三氯甲烷-甲醇(10:1)梯度洗脫液，靜置析晶，抽濾，甲醇重結(jié)晶，得到金粉蕨素。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通經(jīng)草提取物的制備方法，其特征在于:其所采用的大孔吸附樹(shù)脂為DM130大孔吸附樹(shù)脂、DlOl大孔吸附樹(shù)脂、HPD600大孔吸附樹(shù)脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1，所述的金粉蕨素與化學(xué)藥或中藥或天然藥物組成的治療艾滋病藥物。
【文檔編號(hào)】A61P31/18GK103588834SQ201310525386
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】孔倩倩 申請(qǐng)人:濟(jì)南星懿醫(yī)藥技術(shù)有限公司