一種海藻酸－透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種海藻酸－透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架及其制備方法。所述制備方法包括：用生理鹽水或生理緩沖液分別將海藻酸或其衍生物和透明質(zhì)酸或其衍生物配成溶液，將上述兩種溶液中的任意一種與所需載負(fù)的細(xì)胞混合后，再與剩下的另外一種溶液混合，室溫平衡一段時(shí)間后即得海藻酸－透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架。本發(fā)明制備的海藻酸－透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架有效延長(zhǎng)了海藻酸和透明質(zhì)酸在體內(nèi)的降解時(shí)間，通過(guò)適度的分子交聯(lián)大大提高了支架的力學(xué)性能、組織填充/支撐性能，具有良好的安全性、有效性。本發(fā)明提供的海藻酸－透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架的制備方法不涉及有機(jī)試劑，反應(yīng)體系簡(jiǎn)單溫和，臨床應(yīng)用安全性好。
【專利說(shuō)明】一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種原位組織工程細(xì)胞支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞移植或細(xì)胞治療已逐漸成為臨床治療的研究熱點(diǎn)。將自體或異體細(xì)胞植入病變組織以替代或部分恢復(fù)肌體功能，但對(duì)正常細(xì)胞或組織無(wú)任何副作用，是細(xì)胞移植區(qū)別于常規(guī)治療方法的優(yōu)勢(shì)。已有許多研究對(duì)于細(xì)胞移植進(jìn)行了廣泛探討，而且胰島細(xì)胞移植術(shù)治療糖尿病業(yè)已在臨床取得了很好效果，也有報(bào)道認(rèn)為干細(xì)胞移植對(duì)于腫瘤、神經(jīng)疾病等傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)難以解決的臨床難題具有突破性進(jìn)展。迄今，細(xì)胞移植或細(xì)胞治療已經(jīng)作為最有潛力的臨床新技術(shù)，探討用于解決多種臨床難題。
[0003]業(yè)已證實(shí)，單純將細(xì)胞移植到所需部位后，細(xì)胞在位性不強(qiáng)，易分散到其他部位而大大減少在標(biāo)靶部位的有效數(shù)量，不僅造成了種子細(xì)胞的浪費(fèi)而且減弱了治療效果，可控性較差。此外，注入機(jī)體內(nèi)的外源性移植細(xì)胞由于難以獲得良好的微環(huán)境，活性大大降低同時(shí)死亡率提高，也減弱了細(xì)胞治療的效果。將細(xì)胞負(fù)載到支架材料上再植入目標(biāo)部位，則可以提高細(xì)胞的在位性并為細(xì)胞提供生長(zhǎng)支架增加其存活率。將細(xì)胞與支架復(fù)合物用于細(xì)胞移植主要包括兩種方法:(I)體外組織工程法，即將細(xì)胞在體外接種到支架材料上，生長(zhǎng)一段時(shí)間后用于體內(nèi)移植。該方法的缺點(diǎn)是周期較長(zhǎng)，而且支架材料多為片狀、膜狀、海綿狀或其他固態(tài)立體形態(tài)，因此植入手術(shù)窗較大，在一定程度上增加了手術(shù)創(chuàng)傷。(2)體內(nèi)原位組織工程法，即將細(xì)胞與支架材料直接復(fù)合或混合，植入目標(biāo)部位后，可在體內(nèi)原位形成細(xì)胞-支架復(fù)合物，該方法所用的支架材料多為可注射的水凝膠，屬于微創(chuàng)手術(shù)，創(chuàng)面小，而且可與手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)聯(lián)用用于介入手術(shù)治療。目前，用于體內(nèi)原位組織工程支架的材料已有許多研究報(bào)道，如透明質(zhì)酸、膠原蛋白、纖維蛋白膠、殼聚糖、海藻酸、PLGA、羥基磷灰石、硫酸鈣等，雖然可顯著改善移植細(xì)胞`的在位性和存活率，但也存在尚需改進(jìn)的不足，如天然材料的組織支撐性不足和降解過(guò)快、高分子材料和無(wú)機(jī)材料的組織相容性欠佳等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種可注射型的原位組織工程支架，該支架可用于載負(fù)細(xì)胞植入特定組織部位進(jìn)行原位再生修復(fù)，尤其適用于軟組織的再生修復(fù)。
[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架的制備方法，包括以下步驟:
[0006]用生理鹽水或生理緩沖液分別將海藻酸或其衍生物和透明質(zhì)酸或其衍生物配成溶液，得到含海藻酸或其衍生物的溶液和含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液，將上述兩種溶液與所需載負(fù)的細(xì)胞混合后，室溫平衡一段時(shí)間后即得海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架。[0007]所述生理鹽水或生理緩沖液為無(wú)菌無(wú)熱原的生理鹽水或生理緩沖液。
[0008]所述所需載負(fù)的細(xì)胞包括生物體所有組織的細(xì)胞；優(yōu)選軟組織細(xì)胞；
[0009]所述混合的具體過(guò)程為:將上述兩種溶液中的任意一種與所需載負(fù)的細(xì)胞，灌裝入注射器中；將剩下的另外一種溶液灌裝入另外一只注射器中；將上述兩種溶液通過(guò)三通注射器混合。
[0010]所述注射器為無(wú)菌注射器。 [0011]所述含海藻酸或其衍生物的溶液中，海藻酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5-5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 5.0% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為
3.0- 5.0% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.0%、4.0%或5.0% ；
[0012]所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液中，透明質(zhì)酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5 — 5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 3.5% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為2 — 3.5% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.5%、2.5%或2.0% ；
[0013]所述質(zhì)量以克單位計(jì)算，所述體積以毫升單位計(jì)算。
[0014]所述含海藻酸或其衍生物的溶液與所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液的體積比為1:4一4:I ;優(yōu)選的，體積比為1:3—3:I ;再優(yōu)選的，體積比為1:3—2:I ;最優(yōu)選的，體積比為 1:3、1:2 或 2:1。
[0015]所述室溫平衡的時(shí)間為I 一 50min ;優(yōu)選的，室溫平衡的時(shí)間為l_20min ;再優(yōu)選的，室溫平衡的時(shí)間為3-5min ;最優(yōu)選的,室溫平衡的時(shí)間為3min、4min或5min。
[0016]所述室溫具體為20°C -25°C。
[0017]所述海藻酸或其衍生物重均分子量為5 — 25萬(wàn)Da ;優(yōu)選的，重均分子量為12 —15萬(wàn)Da ;最優(yōu)選的，重均分子量為15KD或12KD ;
[0018]所述透明質(zhì)酸或其衍生物重均分子量為100 - 300萬(wàn)Da ;優(yōu)選的，重均分子量為150 - 250萬(wàn)Da ;最優(yōu)選的，重均分子量為200萬(wàn)Da。
[0019]所述海藻酸或其衍生物的Μ/G比例為0.65、醛基化度為0.5 ;所述透明質(zhì)酸或其衍生物醛基化度為0.5。
[0020]所述海藻酸或其衍生物包括海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸銨、海藻酸鈣或氧化醛基化海藻酸鈉中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合；
[0021]所述透明質(zhì)酸或其衍生物包括透明質(zhì)酸鈉、氧化醛基化透明質(zhì)酸鈉或硫化透明質(zhì)酸鈉中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合。
[0022]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述任一所述方法制備得到的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架。
[0023]本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供海藻酸或其衍生物，和透明質(zhì)酸或其衍生物在制備原位組織工程細(xì)胞支架中的應(yīng)用；
[0024]海藻酸或其衍生物，和透明質(zhì)酸或其衍生物作為支架材料在制備原位組織工程中細(xì)胞支架中的應(yīng)用。
[0025]所述應(yīng)用中，所述海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架為一次性使用的無(wú)菌
女口
廣叩ο
[0026]所述應(yīng)用中，所述海藻酸或其衍生物重均分子量為5 — 25萬(wàn)Da ;優(yōu)選的，重均分子量為12 — 15萬(wàn)Da ;最優(yōu)選的，重均分子量為15KD或12KD ；[0027]所述應(yīng)用中，所述透明質(zhì)酸或其衍生物重均分子量為100 - 300萬(wàn)Da ;優(yōu)選的，重均分子量為150 - 250萬(wàn)Da ;最優(yōu)選的，重均分子量為200萬(wàn)Da。
[0028]所述應(yīng)用中，所述海藻酸或其衍生物的Μ/G比例為0.65、醛基化度為0.5 ;所述透明質(zhì)酸或其衍生物醛基化度為0.5。
[0029]所述應(yīng)用中，所述海藻酸或其衍生物包括海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸銨、海藻酸鈣或氧化醛基化海藻酸鈉中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合；
[0030]所述透明質(zhì)酸或其衍生物包括透明質(zhì)酸鈉、氧化醛基化透明質(zhì)酸鈉或硫化透明質(zhì)酸中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合。
[0031]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供用于制備原位組織工程中細(xì)胞支架的材料，包含海藻酸或其衍生物，和透明質(zhì)酸或其衍生物。
[0032]所述含海藻酸或其衍生物的溶液中，海藻酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5-5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 5.0% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為
3.0- 5.0% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.0%、4.0%或5.0% ；
[0033]所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液中，透明質(zhì)酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5 — 5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 3.5% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為2 — 3.5% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.5%、2.5%或2.0% ；
[0034]所述質(zhì)量以克單位計(jì)算，所述體積以毫升單位計(jì)算。
[0035]所述溶液的溶劑為生理鹽水或生理緩沖液；所述生理鹽水或生理緩沖液為無(wú)菌無(wú)熱原的生理鹽水或生理緩沖液。
[0036]所述材料中，所述海藻`酸或其衍生物重均分子量為5 — 25萬(wàn)Da ;優(yōu)選的，重均分子量為12 — 15萬(wàn)Da ;最優(yōu)選的，重均分子量為15KD或12KD ；
[0037]所述材料中，所述透明質(zhì)酸或其衍生物重均分子量為100 - 300萬(wàn)Da ;優(yōu)選的，重均分子量為150 - 250萬(wàn)Da ;最優(yōu)選的，重均分子量為200萬(wàn)Da。
[0038]所述材料中，所述海藻酸或其衍生物的Μ/G比例為0.65、醛基化度為0.5 ;所述透明質(zhì)酸或其衍生物醛基化度為0.5。
[0039]所述材料中，所述海藻酸或其衍生物包括海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸銨、海藻酸鈣或氧化醛基化海藻酸鈉中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合；
[0040]所述材料中，所述透明質(zhì)酸或其衍生物包括透明質(zhì)酸鈉、氧化醛基化透明質(zhì)酸鈉或硫化透明質(zhì)酸中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合。
[0041 ] 所述材料還包括說(shuō)明書，所述說(shuō)明書中記載有如下內(nèi)容:
[0042]使用前，用生理鹽水或生理緩沖液分別將海藻酸或其衍生物和透明質(zhì)酸或其衍生物配成溶液，得到含海藻酸或其衍生物的溶液和含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液，將上述兩種溶液與所需載負(fù)的細(xì)胞混合后，室溫平衡一段時(shí)間后即得海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架；
[0043]所述含海藻酸或其衍生物的溶液中，海藻酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5-5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 5.0% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為
3.0- 5.0% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.0%、4.0%或5.0% ；
[0044]所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液中，透明質(zhì)酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5 — 5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 3.5% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為2 — 3.5% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.5%、2.5%或2.0% ；
[0045]所述質(zhì)量以克單位計(jì)算，所述體積以毫升單位計(jì)算；
[0046]所述生理鹽水或生理緩沖液為無(wú)菌無(wú)熱原的生理鹽水或生理緩沖液； [0047]所述所需載負(fù)的細(xì)胞包括生物體所有組織的細(xì)胞；優(yōu)選軟組織細(xì)胞；再優(yōu)選軟骨組織的細(xì)胞；最優(yōu)選成骨細(xì)胞MC3T3-E1或心肌細(xì)胞H9C2 ；
[0048]所述混合的具體過(guò)程為:將上述兩種溶液中的任意一種與所需載負(fù)的細(xì)胞，灌裝入注射器中；將剩下的另外一種溶液灌裝入另外一只注射器中；將上述兩種溶液通過(guò)三通注射器混合；
[0049]所述注射器為無(wú)菌注射器；
[0050]所述含海藻酸或其衍生物的溶液與所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液的體積比為1:4一4:I ;優(yōu)選的，體積比為1:3—3:I ;再優(yōu)選的，體積比為1:3—2:I ;最優(yōu)選的，體積比為 1:3、1:2 或 2:1 ；
[0051]所述室溫平衡的時(shí)間為I — 50min ;優(yōu)選的，室溫平衡的時(shí)間為l_20min ;再優(yōu)選的，室溫平衡的時(shí)間為3-5min ;最優(yōu)選的,室溫平衡的時(shí)間為3min、4min或5min ；
[0052]所述室溫具體為20°C -25°C。
[0053]本發(fā)明采用海藻酸基生物材料和透明質(zhì)酸基生物材料制備一種可注射型的原位組織工程細(xì)胞支架。海藻酸和透明質(zhì)酸已作為生物醫(yī)用材料廣泛用于多個(gè)臨床科室，具有良好的安全性和有效性。本發(fā)明制備的支架不僅兼具上述兩種材料的良好生物學(xué)性能，與多種細(xì)胞、組織具有良好相容性，而且通過(guò)適度的交聯(lián)大大提高了支架的力學(xué)性能、組織填充/支撐性能，延長(zhǎng)了其在體內(nèi)的降解時(shí)間。
[0054]將本發(fā)明制備的原位組織工程細(xì)胞支架注入標(biāo)靶部位，可原位形成具有良好力學(xué)性能和空間結(jié)構(gòu)的凝膠支架，該支架載負(fù)細(xì)胞到所需部位，原位形成細(xì)胞-支架復(fù)合物對(duì)組織進(jìn)行再生修復(fù)，不僅可實(shí)現(xiàn)微創(chuàng)方式的細(xì)胞移植，而且可有效改善移植細(xì)胞的在位性，維持細(xì)胞活性，有效支撐或填充組織，促進(jìn)組織修復(fù)；該支架可載負(fù)多種細(xì)胞用于不同組織尤其是軟組織包括軟骨的修復(fù)。
[0055]本發(fā)明提供的一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架的制備方法不涉及有機(jī)試劑或有機(jī)化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)體系溫和，條件可控，僅通過(guò)海藻酸和透明質(zhì)酸衍生化產(chǎn)生的交聯(lián)基團(tuán)進(jìn)行相互作用，避免了交聯(lián)劑毒性風(fēng)險(xiǎn)，不存在毒性交聯(lián)劑或助劑等殘留問題，大大提高了臨床應(yīng)用的安全性。
[0056]本發(fā)明提供的一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架的制備工藝簡(jiǎn)單可控，大幅度降低了制備過(guò)程中風(fēng)險(xiǎn)管理的難度，工藝重復(fù)性好，具有良好的產(chǎn)品轉(zhuǎn)化可行性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0057]圖1為實(shí)施例1制備的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程支架與成骨細(xì)胞MC3T3-E1的相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0058]圖2為實(shí)施例1制備的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程支架與心肌細(xì)胞H9C2的相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。【具體實(shí)施方式】
[0059]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0060]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0061]下述實(shí)施例中的固體液體百分比為質(zhì)量體積百分比，其中，質(zhì)量單位以克(g)計(jì)，體積單位以毫升(ml)計(jì)；下述實(shí)施例中的液體與液體的比值為體積比。
[0062]下述實(shí)施例中的成骨細(xì)胞MC3T3-E1和心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。
[0063]實(shí)施例1、一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架的制備
[0064]采用海藻酸鈉和氧化醛基化透明質(zhì)酸為原料，制備步驟如下:
[0065]I)溶液的配制
[0066]溶液I的配制:稱取海藻酸鈉粉末適量，以生理鹽水配制成4% (w/v)的溶液；所述的海藻酸鈉重均分子量約為15萬(wàn)Da，Μ/G比例約為0.65。
[0067]溶液2的配制:稱取氧化醛基化透明質(zhì)酸粉末適量，以生理鹽水配制成3.5% (w/v)的溶液；所述的氧化醛基化透明質(zhì)酸重均分子量約為200萬(wàn)Da，醛基化度約為0.5。
[0068]2)使用前的配制
[0069]將所需載負(fù)的細(xì)胞共IO6個(gè)與0.5ml上述溶液I混合，灌裝入無(wú)菌注射器中；將上述溶液2灌裝入另外一只注射器中。
[0070]將上述溶液I和溶液2以體積比2:1比例通過(guò)三通注射器混合，室溫平衡3min，可形成所需的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架與待載負(fù)的細(xì)胞的混合液。
[0071]實(shí)施例2、一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架的制備
[0072]采用氧化醛基化海藻酸鈉和透明質(zhì)酸鈉為原料，制備步驟如下:
[0073]I)溶液的配制
[0074]溶液I的配制:稱取氧化醛基化海藻酸鈉粉末適量，以生理鹽水配制成4% (w/v)的溶液；所述的海藻酸鈉重均分子量約為15萬(wàn)Da，Μ/G比例約為0.65，醛基化度約為0.5。
[0075]溶液2的配制:稱取透明質(zhì)酸鈉粉末適量，以生理鹽水配制成3.5% (w/v)的溶液；所述的透明質(zhì)酸鈉重均分子量約為200萬(wàn)Da。
[0076]2)使用前的配制
[0077]將所需載負(fù)的細(xì)胞與上述溶液I混合，灌裝入無(wú)菌注射器中；將上述溶液2灌裝入另外一只注射器中。
[0078]將上述溶液I和溶液2以體積比1:3比例通過(guò)三通注射器混合，室溫平衡5min，可形成所需的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架與待載負(fù)的細(xì)胞的混合液。
[0079]實(shí)施例3、一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架的制備
[0080]采用氧化醛基化海藻酸鈉和透明質(zhì)酸鈉為原料(原料的重均分子量與實(shí)施例2相同)，制備步驟同實(shí)施例2，不同的是:
[0081]溶液I的濃度為3.0% (w/v);溶液2的濃度為2.5% (w/v)；
[0082]將溶液I和溶液2以體積比1:2比例通過(guò)三通注射器混合，室溫平衡4min，可形成所需的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架與待載負(fù)的細(xì)胞的混合液。
[0083]實(shí)施例4、一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架的制備
[0084]采用海藻酸鈉和氧化醛基化透明質(zhì)酸為原料，制備步驟如下:[0085]I)溶液的配制
[0086]溶液I的配制:稱取海藻酸鈉粉末適量，以生理鹽水配制成5% (w/v)的溶液；所述的海藻酸鈉重均分子量約為12萬(wàn)Da，M/G比例約為0.65。
[0087]溶液2的配制:稱取氧化醛基化透明質(zhì)酸粉末適量，以生理鹽水配制成2.0% (w/ v)的溶液；所述的氧化醛基化透明質(zhì)酸重均分子量約為200萬(wàn)Da，醛基化度約為0.5。
[0088]2)使用前的配制
[0089]將所需載負(fù)的細(xì)胞與上述溶液I混合，灌裝入無(wú)菌注射器中；將上述溶液2灌裝入另外一只注射器中。
[0090]將上述溶液I和溶液2以體積比2:1比例通過(guò)三通注射器混合，室溫平衡5min， 可形成所需的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架與待載負(fù)的細(xì)胞的混合液。
[0091]實(shí)施例5、實(shí)施例1制備的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架的細(xì)胞相容性和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
[0092]按照實(shí)施例1所述的使用前的配制方法，將成骨細(xì)胞MC3T3-E1、心肌細(xì)胞H9C2分別海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架混合。根據(jù)GB/T16886.5-2003規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)細(xì)胞增殖率，評(píng)價(jià)該支架對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響，結(jié)果見圖1和圖2。圖1和圖2中， 實(shí)驗(yàn)組使用的細(xì)胞支架是按照實(shí)施例1所述的使用前的配制方法配制的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架；對(duì)照組采用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)。
[0093]圖1-2結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，OD值不小于對(duì)照組的80%，說(shuō)明實(shí)施例1 制備的支架與成骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞有良好的相容性，并能在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞增殖，證實(shí)該支架作為原位組織工程支架具有良好的細(xì)胞相容性，無(wú)細(xì)胞毒性，安全性良好。`
【權(quán)利要求】
1.一種海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架的制備方法，包括以下步驟: 用生理鹽水或生理緩沖液分別將海藻酸或其衍生物和透明質(zhì)酸或其衍生物配成溶液，得到含海藻酸或其衍生物的溶液和含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液，將上述兩種溶液與所需載負(fù)的細(xì)胞混合后，室溫平衡一段時(shí)間后即得海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述含海藻酸或其衍生物的溶液中，海藻酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5 -5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 5.0% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.0 —5.0% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.0^^4.0%或5.0% ； 所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液中，透明質(zhì)酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5 - 5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 3.5% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為2-3.5% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.5%、2.5%或2.0%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述含海藻酸或其衍生物的溶液與所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液的體積比為1:4一4:1 ;優(yōu)選的，體積比為1:3—3:1 ;再優(yōu)選的，體積比為1:3 — 2:1 ;最優(yōu)選的，體積比為1:3、1:2或2:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于: 所述海藻酸或其衍生物重均分子量為5 — 25萬(wàn)Da ;優(yōu)選的，重均分子量為12 — 15萬(wàn)Da ;最優(yōu)選的，重均分子量為15KD或12KD ； 所述透明質(zhì)酸或其衍生物重均分子量為100 - 300萬(wàn)Da ;優(yōu)選的，重均分子量為150 —250萬(wàn)Da ;最優(yōu)選的，重均分子量為200萬(wàn)Da。`
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法,其特征在于: 所述海藻酸或其衍生物包括海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸銨、海藻酸鈣或氧化醛基化海藻酸鈉中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合； 所述透明質(zhì)酸或其衍生物包括透明質(zhì)酸鈉、氧化醛基化透明質(zhì)酸鈉或硫化透明質(zhì)酸鈉中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合。
6.權(quán)利要求1-6任一所述方法制備得到的海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架。
7.海藻酸或其衍生物，和透明質(zhì)酸或其衍生物在制備原位組織工程細(xì)胞支架中的應(yīng)用； 或，海藻酸或其衍生物，和透明質(zhì)酸或其衍生物作為支架材料在制備原位組織工程中細(xì)胞支架中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述海藻酸或其衍生物包括海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸銨、海藻酸鈣或氧化醛基化海藻酸鈉中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合； 所述透明質(zhì)酸或其衍生物包括透明質(zhì)酸鈉、氧化醛基化透明質(zhì)酸鈉或硫化透明質(zhì)酸中的任意一種物質(zhì)或兩種以上物質(zhì)的任意組合。
9.用于制備原位組織工程中細(xì)胞支架的材料，包含海藻酸或其衍生物，和透明質(zhì)酸或其衍生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的材料，其特征在于: 所述材料還包括說(shuō)明書，所述說(shuō)明書中記載有如下內(nèi)容: 使用前，用生理鹽水或生理緩沖液分別將海藻酸或其衍生物和透明質(zhì)酸或其衍生物配成溶液，得到含海藻酸或其衍生物的溶液和含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液，將上述兩種溶液與所需載負(fù)的細(xì)胞混合后，室溫平衡一段時(shí)間后即得海藻酸一透明質(zhì)酸原位組織工程細(xì)胞支架； 所述含海藻酸或其衍生物的溶液中，海藻酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為0.5 -`5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 5.0% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.0 —`5.0% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.0^^4.0%或5.0% ； 所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液中，透明質(zhì)酸或其衍生物的質(zhì)量體積百分濃度為`0.5 - 5.0% ;優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為1.5 — 3.5% ;再優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為2-3.5% ;最優(yōu)選的，質(zhì)量體積百分濃度為3.5%、2.5%或2.0% ； 所述生理鹽水或生理緩沖液為無(wú)菌無(wú)熱原的生理鹽水或生理緩沖液； 所述所需載負(fù)的細(xì)胞包括生物體所有組織的細(xì)胞；優(yōu)選軟組織細(xì)胞；再優(yōu)選軟骨組織的細(xì)胞；最優(yōu)選成骨細(xì)胞MC3T3-E1或心肌細(xì)胞H9C2 ； 所述混合的具體過(guò)程為:將上述兩種溶液中的任意一種與所需載負(fù)的細(xì)胞，灌裝入注射器中；將剩下的另外一種溶液灌裝入另外一只注射器中；將上述兩種溶液通過(guò)三通注射器混合； 所述含海藻酸或其衍生物的溶液與所述含透明質(zhì)酸或其衍生物的溶液的體積比為1:4一4:I ;優(yōu)選的，體積比為1:3 —3:I ;再優(yōu)選的，體積比為1:3 —2:I ;最優(yōu)選的，體積比為`1:3、1:2 或 2:1 ； 所述室溫平衡的時(shí)間為 I 一 50min ;優(yōu)選的，室溫平衡的時(shí)間為l_20min ;再優(yōu)選的，室溫平衡的時(shí)間為3-5min ;最優(yōu)選的,室溫平衡的時(shí)間為3min、4min或5min。
【文檔編號(hào)】A61L27/42GK103550830SQ201310481647
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】位曉娟, 奚廷斐, 顧其勝, 鄭玉峰 申請(qǐng)人:北京大學(xué)