富含二萜酚類(lèi)化合物的見(jiàn)血清提取物及其制備方法和用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種富含二萜酚類(lèi)化合物的見(jiàn)血清提取物及其制備方法和用途，該見(jiàn)血清提取物具有抑制血小板聚集活性和抗腫瘤活性，可用于制備治療或預(yù)防因血小板過(guò)度聚集引起的血栓、心肌梗塞等心腦血管疾病的藥物和治療乳腺癌、直腸癌、宮頸癌的藥物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】富含二萜酚類(lèi)化合物的見(jiàn)血清提取物及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種見(jiàn)血清提取物及其制備方法和用途，特別是涉及一種富含二萜酚類(lèi)化合物的見(jiàn)血清提取物及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]見(jiàn)血清為蘭科植物脈羊耳蘭Liparis nervosa (Thunb.) Lindl.的全草,又稱“立地好”、“黑蘭”、“矮胖兒”，性寒，味苦，涼血止血、清熱解毒。見(jiàn)血清常生長(zhǎng)在山野、溪邊等陰濕處，分布于四川、湖北、臺(tái)灣等地，目前民間用藥材均為野生。
[0003]迄今，國(guó)內(nèi)外對(duì)見(jiàn)血清的藥理作用及臨床報(bào)道較少，主要集中在見(jiàn)血清的止血活性上，還未見(jiàn)有見(jiàn)血清抑制血小板聚集活性、抗腫瘤活性的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一在于提供一種富含二萜酚類(lèi)化合物的見(jiàn)血清提取物的制備方法及該方法制得的見(jiàn)血清提取物。
[0005]本發(fā)明的目的之二在于提供上述見(jiàn)血清提取物在制備治療或預(yù)防因血小板過(guò)度聚集引起的血栓、心肌梗塞疾病藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的之三在于提供上述見(jiàn)血清提取物在制備治療乳腺癌、直腸癌、宮頸癌藥物中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供的一種富含二萜酚類(lèi)化合物的見(jiàn)血清提取物的制備方法包括如下步驟:
[0008](I)將見(jiàn)血清全草干燥后粉碎，然后加入其重量5~15倍的提取溶劑進(jìn)行提取，得提取液，所述提取溶劑為水、甲醇、乙醇中的一種或一種以上；
[0009](2)將提取液過(guò)濾、濃縮、干燥后用適量水進(jìn)行分散，然后依次用石油醚或環(huán)己烷、乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得浸膏；
[0010](3)將步驟(2)得到的浸膏上正相硅膠柱進(jìn)行層析，用石油醚-丙酮梯度洗脫，收集體積比90:1~50:1洗脫部位，減壓回收溶劑；
[0011](4)將步驟(3)得到的洗脫液進(jìn)行反相C18填料脫色，采用含甲醇的水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集60%~80%甲醇水溶液洗脫部分，低溫減壓回收得到提取物。
[0012]進(jìn)一步的，步驟(3)中采用體積比100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、30:1、10:1的石油醚-丙酮進(jìn)行梯度洗脫，收集體積比90:1~50:1洗脫部位。
[0013]進(jìn)一步的，步驟(4)中采用濃度為0%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集60%~80%洗脫部分。
[0014]將步驟(4)得到的60%甲醇洗脫部位進(jìn)行反復(fù)重結(jié)晶可制備得到迷迭香酚和表迷迭香酚，80%甲醇洗脫部位進(jìn)行反復(fù)重結(jié)晶可制備得到鼠尾草酚。
[0015]本發(fā)明提供的一種富含二萜酚類(lèi)化合物的見(jiàn)血清提取物由上述方法制得。
[0016]本發(fā)明還提供了上述見(jiàn)血清提取物在制備治療或預(yù)防由血小板過(guò)度聚集引起的血栓、心肌梗塞疾病藥物中的應(yīng)用、以及在制備治療乳腺癌、直腸癌、宮頸癌藥物中的應(yīng)用。[0017]由于見(jiàn)血清中所含鼠尾草酚、迷迭香酚等活性成分為中低極性化合物，在提取時(shí)，適宜的醇濃度，可以提高見(jiàn)血清中活性成分的回收率，但對(duì)于見(jiàn)血清中活性成分的提取而言，上述提取方法及任意組合都可達(dá)到本發(fā)明所述的提取物。提取時(shí)見(jiàn)血清全草與溶劑的重量比以1:5~15為宜，考慮到提取物中活性成分的穩(wěn)定性，應(yīng)盡量在常壓及溶劑沸點(diǎn)范圍內(nèi)進(jìn)行提取。
[0018]本發(fā)明所提供的富含二萜酚類(lèi)化合物的見(jiàn)血清提取物具有抑制血小板聚集活性和抗腫瘤活性，可用于制備治療或預(yù)防因血小板過(guò)度聚集引起的血栓、心肌梗塞等心腦血管疾病的藥物和治療乳腺癌、直腸癌、宮頸癌的藥物。
[0019]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例1見(jiàn)血清提取物的制備
[0021]將見(jiàn)血清全草干燥后粉碎，然后加入其重量12倍的80%乙醇冷浸提取3次，每次24小時(shí)，得綠褐色濾液，合并濾液，減壓回收乙醇得浸膏，將浸膏加適量水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃?。粚⒁宜嵋阴ゲ课唤嗌险喙枘z柱(200目)，用體積比100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、30:1、10:1的石油醚-丙酮梯度洗脫，收集體積比90:1~50:1洗脫部位，減壓回收溶劑；再將所得浸膏上C18反相柱脫色，采用濃度為0%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集60%~80%洗脫部分，低溫減壓回收得提取物。
[0022]該提取物對(duì)光、氧、熱不穩(wěn)定，極容易被氧化變色，需避光避熱密封保存。采用紫外分光光度法測(cè)定提取物中總酚含量為80%。采用HPLC法(C18柱；流動(dòng)相:0.1%磷酸-60%乙腈；流速:1.0ml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng):230nm)檢測(cè)其中主要成分鼠尾草酚和迷迭香酚的含量之和為37%。
[0023]實(shí)施例2見(jiàn)血清提取物的制備
[0024]將見(jiàn)血清全草干燥后粉碎，然后加入其重量10倍的80%甲醇超聲提取(IOOKHZ) 3次，每次45min，得浸膏，將浸膏加適量水分散后，依次用正己烷、乙酸乙酯萃取；將乙酸乙酯部位浸膏上正相硅膠柱(200目)，用體積比100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、30:1、10:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，收集體積比90:1~60:1洗脫部位，減壓回收溶劑；再將所得浸膏上C18反相柱脫色，采用濃度為0%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集60%~80%洗脫部分，低溫減壓回收得提取物。測(cè)定提取物中總酚含量為83%，鼠尾草酚和迷迭香酚的含量之和為45%。
[0025]實(shí)施例3見(jiàn)血清提取物的制備
[0026]將見(jiàn)血清全草干燥后粉碎，然后加入85%乙醇回流提取3次，每次2h，得到浸膏后用適量水分散，再用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，將所得乙酸乙酯部位浸膏上正相硅膠柱(200 目)，用體積比 100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、30:1、10:1 的石油醚-丙酮梯度洗脫，收集體積比90:1~50:1洗脫部位，減壓回收溶劑；再將所得浸膏上C18反相柱脫色，采用濃度為0%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集60%~80%洗脫部分，低溫減壓回收得到提取物。測(cè)定提取物中總酚含量為85%，鼠尾草酚和迷迭香酚的含量之和為48%。[0027]實(shí)施例4鼠尾草酚、迷迭香酚和表迷迭香酚的制備
[0028]將實(shí)施例3中反相柱60%甲醇洗脫部位進(jìn)行反復(fù)重結(jié)晶可制備得到迷迭香酚和表迷迭香酚，將80%甲醇洗脫部位進(jìn)行反復(fù)重結(jié)晶可制備得到鼠尾草酚。
[0029]實(shí)施例5見(jiàn)血清提取物膠囊劑的制備
[0030]配方:實(shí)施例2所得見(jiàn)血清提取物50g ;糊精25g ;羧甲基纖維素鈉5g ;硬脂酸鎂1g
[0031]按上述重量比取見(jiàn)血清提取物、糊精、羧甲基纖維素鈉和硬脂酸鎂，將其混勻后過(guò)80目篩，用干式制粒機(jī)制粒，用60目篩整粒，灌于膠囊中，即得。
[0032]實(shí)施例6見(jiàn)血清提取物片劑的制備
[0033]配方:實(shí)施例1所得見(jiàn)血清提取物50g ;糊精15g ;羧甲基纖維素鈉5g ;羥丙纖維素IOg ;硬脂酸鎂Ig
[0034]上述重量比取見(jiàn)血清提取物、糊精、羧甲基纖維素鈉、羥丙纖維素和硬脂酸鎂，將其混勻后過(guò)80目篩，用干式制粒機(jī)制粒，用60目篩整粒，壓片，包衣，即得。
[0035]實(shí)施例7MTT法體外檢測(cè)實(shí)施例3見(jiàn)血清提取物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系的增殖抑制活性
[0036](I)所用試劑
[0037]DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗、0.25%Trypsin_lmM EDTA.4Na liquid、DMSO 等。
[0038](2)所用腫瘤細(xì)胞系
[0039]乳腺癌細(xì)胞(MCF7)、大腸癌細(xì)胞(HT29)、黑色素瘤細(xì)胞(WM451)、胃癌細(xì)胞(BGC823)、宮頸癌細(xì)胞(HeLa)。
[0040](3)細(xì)胞培養(yǎng)
[0041]均用含10%滅活的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞于37°C、5%C02中孵育，3天傳代I次。
[0042](4)實(shí)施例3中制備的提取物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的測(cè)定:
[0043]分別收集常規(guī)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，按照3000cell/孔接種96孔板，每種細(xì)胞做6個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h以后，棄去上清，每孔分別加入100μ g/ml,50y g/ml, 10μ g/ml, I μ g/ml 含提取物的 DMEM0.1ml，繼續(xù)培養(yǎng) 72h，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。
[0044]表1見(jiàn)血清提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)
[0045]
Wii乳腺癌細(xì)胞大腸癌細(xì)胞黑色素廇細(xì)胞胃癌細(xì)胞宮頸癌細(xì)胞
(MCF7)(HT29)(WM451)(BGC823)(HeLa)
100 pg/rnl89Λ5?7823832642
50pg/ml52.630.171.274312.8
10 pg/ml54.313.53.65.33.2
I μ^ηα?5.2---
[0046]結(jié)果表明該提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞(MCF7)、大腸癌細(xì)胞(ΗΤ29)、黑色素瘤細(xì)胞(WM451)、胃癌細(xì)胞(BGC823)、宮頸癌細(xì)胞(HeLa)在濃度100 μ g/ml時(shí)均具有顯著抑制作用，抑制率大于50%。
[0047]實(shí)施例8實(shí)施例3見(jiàn)血清提取物抑制血小板聚集活性
[0048]大鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為提取物高、中、低劑量組、塞氯吡啶陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組5個(gè)組，每組10只。各組大鼠灌胃給予相應(yīng)藥物，每日一次，連續(xù)5日。其中空白對(duì)照組給予等量體積生理鹽水灌胃。
[0049]各組大鼠于末次給藥Ih后，按腹腔內(nèi)注射3.5%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血
5.4mL,加入盛有枸櫞酸鈉(3.8%)溶液0.6mL的離心管內(nèi)抗凝。以800rpm離心IOmin,取上層液即為富血小板血衆(zhòng)(PRP);余下部分再以3000rpmin離心IOmin,取上清液即為貧血小板血漿(PPP)。按Born比濁法測(cè)定血小板最大聚集率，分別精密吸取各組PPP和PRP各300 μ L加入測(cè)試杯中，PPP調(diào)透光率到100%，PRP在37°C預(yù)溫槽中預(yù)熱3min后，加入誘導(dǎo)劑ADPlO μ L (終濃度為5 μ mol/L)檢測(cè)5min，記錄濁度改變曲線及其最大聚集率(MAR%)。各組大鼠血小板聚集率見(jiàn)表2。
[0050]表2見(jiàn)血清提取物ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的作用
【權(quán)利要求】
1.一種富含二萜酚類(lèi)化合物的見(jiàn)血清提取物的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將見(jiàn)血清全草干燥后粉碎，然后加入提取溶劑進(jìn)行提取，得提取液，所述提取溶劑為水、甲醇、乙醇中的一種或一種以上； (2)將提取液過(guò)濾、濃縮、干燥后用適量水進(jìn)行分散，然后依次用石油醚或環(huán)己烷、乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得浸膏； (3)將步驟(2)得到的浸膏上正相硅膠柱進(jìn)行層析，用石油醚-丙酮梯度洗脫，收集體積比90:1~50:1洗脫部位，減壓回收溶劑； (4)將步驟(3)得到的浸膏進(jìn)行反相C18填料脫色，采用含甲醇的水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集60%~80%甲醇水溶液洗脫部分，低溫減壓回收得到提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含二萜酚類(lèi)化合物的見(jiàn)血清提取物的制備方法，其特征在于:步驟(3)中采用體積比100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、30:1、10:1的石油醚-丙酮進(jìn)行梯度洗脫，收集體積比90:1~50:1洗脫部位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富集二萜酚的見(jiàn)血清提取物的制備方法，其特征在于:步驟(4)中采用濃度為0%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集60%~80%洗脫部分。
4.一種由權(quán)利要求1、2或3制得的富含二萜酚類(lèi)化合物的見(jiàn)血清提取物。
5.如權(quán)利要求4所述見(jiàn)血清提取物在制備治療和預(yù)防血栓藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求4所述見(jiàn)血清提取物在制備治療乳腺癌、直腸癌、宮頸癌藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103463443SQ201310412661
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】茍小軍, 宋芹, 陳封政, 郭曉強(qiáng), 顏軍, 劉嵬 申請(qǐng)人:成都大學(xué)