表沒食子兒茶素沒食子酸酯在制備抗白癜風(fēng)藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechingallate，EGCG）在制備防治白癜風(fēng)的藥物中的應(yīng)用，EGCG能有效抑制CD8+T細(xì)胞活化增殖從而降低CD8+T細(xì)胞對黑素細(xì)胞的特異性殺傷達(dá)到治療效果。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：表沒食子兒茶素沒食子酸酯為天然從綠茶中的提取物，能大量生產(chǎn)，基本無毒副作用，其能夠特異性阻斷CD8+T細(xì)胞針對自體黑素細(xì)胞的免疫損傷，高效地治療白癜風(fēng)，為新藥篩選提供了基礎(chǔ)。
【專利說明】表沒食子兒茶素沒食子酸酯在制備抗白癜風(fēng)藥物中的應(yīng)用(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechingallate, EGCG)在制備防治白癜風(fēng)的藥物中的應(yīng)用。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]白癜風(fēng)是一種色素缺失性皮膚病，在世界人群中的發(fā)病率高達(dá)0.5~2%。其臨床表現(xiàn)為局部或泛發(fā)性皮膚色素脫失。面頸部等暴露部位的白斑給患者造成了毀容性損害，嚴(yán)重的影響患者的身心健康。目前研究認(rèn)為，該病是一種自身免疫性疾病，CD8+T毒性淋巴細(xì)胞對黑素細(xì)胞的特異性殺傷是造成表皮黑素細(xì)胞缺失的直接原因。它的病因包括遺傳和環(huán)境等多因素，但到目前為止確切的發(fā)病原因還不清楚，且目前對于該病缺乏根治的藥物，治療相當(dāng)困難。臨床上常用的治療白癜風(fēng)的外用藥物主要包括激素類和一些光敏類藥物，但長期使用激素類藥物會(huì)造成皮膚萎縮，而光敏性藥物如補(bǔ)骨脂會(huì)導(dǎo)致皮膚起泡等副作用，且療效有限。
[0003]為了克服已有治療白癜風(fēng)藥物副作用強(qiáng)的缺點(diǎn)，同時(shí)提高治療效果，本發(fā)明根據(jù)白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制提供一種能有效抑制CD8+T細(xì)胞活化增殖從而降低CD8+T細(xì)胞對黑素細(xì)胞的特異性殺傷達(dá)到治療效果的純天然新藥表沒食子兒茶素沒食子酸酯。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(結(jié)構(gòu)式見圖1)是綠茶中的一種成份，具有抗氧化、抗癌、抗突變等活性，目前還未有表沒食子兒茶素沒食子酸酯抑制CD8+T細(xì)胞活化增殖和治療白癜風(fēng)的報(bào)道。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是提供表沒食子兒茶素沒食子酸酯的新用途，即表沒食子兒茶素沒食子酸酯在制備防治白癜風(fēng)的藥物中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0006]表沒食子兒茶素沒食子酸酯在制備防治白癜風(fēng)的藥物中的應(yīng)用。
[0007]具體的，所述表沒食子兒茶素沒食子酸酯用于制備抑制CD8+T細(xì)胞活化增殖的藥物。
[0008]所述藥物可按常規(guī)方法，制成下列之一的劑型:擦劑、洗劑、噴劑。
[0009]優(yōu)選的，所述藥物中表沒食子兒茶素沒食子酸酯濃度為2~5%。
[0010]目前，對CD8+T細(xì)胞特異性殺傷黑素細(xì)胞在白癜風(fēng)發(fā)病中的作用已得到學(xué)術(shù)界的認(rèn)同，因此具有抑制CD8+T細(xì)胞活化增殖，以及抑制CD8+T細(xì)胞皮膚歸巢的藥物將能有效提高治療白癜風(fēng)的效果。由于CD8+T細(xì)胞在活化初期需要活性氧(ROS)作為信號(hào)介質(zhì)，抑制CD8+T細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生有可能抑制CD8+T細(xì)胞的活化及后續(xù)的生物學(xué)功能。本發(fā)明從表沒食子兒茶素沒食子酸酯的強(qiáng)抗氧化能力入手，探討其對CD8+T細(xì)胞的免疫抑制作用。
[0011]首先建立小鼠CD8+T細(xì)胞的體外活化增殖模型，證實(shí)表沒食子兒茶素沒食子酸酯對CD8+T細(xì)胞的活化增殖具有顯著地抑制作用，且抑制作用與濃度呈正相關(guān)，體外達(dá)到最大抑制效果的最低藥物濃度為10ug/ml。[0012]同時(shí)，在小鼠白癜風(fēng)動(dòng)物模型上證實(shí)表沒食子兒茶素沒食子酸酯有效抑制CD8+T細(xì)胞在莫諾本宗脫色斑周圍的聚集，降低莫諾苯宗誘導(dǎo)的白癜風(fēng)出現(xiàn)的時(shí)間，比例和面積，其最小有效作用藥物濃度為2%。
[0013]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:表沒食子兒茶素沒食子酸酯為天然從綠茶中的提取物，能大量生產(chǎn)，基本無毒副作用，其能夠特異性阻斷CD8+T細(xì)胞針對自體黑素細(xì)胞的免疫損傷，聞效地治療白癒風(fēng)，為新藥篩選提供了基礎(chǔ)。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為表沒食子兒茶素沒食子酸酯分子結(jié)構(gòu)式；
[0015]圖2為MTS方法檢測小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞的體外增殖；X坐標(biāo)為表沒食子兒茶素沒食子酸酯濃度，Y坐標(biāo)為CD8+T細(xì)胞相對增殖率；
[0016]圖3為不同條件下莫諾苯宗誘導(dǎo)的小鼠白癜風(fēng)出現(xiàn)情況;A為單純用莫諾苯宗處理組，莫諾苯宗涂藥處用圓圈標(biāo)出，非涂藥部位白斑用箭頭標(biāo)出出為莫諾苯宗加表沒食子兒茶素沒食子酸酯治療組。
[0017]圖4為不同條件下莫諾苯宗誘導(dǎo)的小鼠非用藥部位脫色斑面積比較；II1、IV、V分別為1%、2%和3%沒食子兒茶素沒食子酸酯治療組。
[0018]圖5為不同條件下小鼠莫諾苯宗用藥部位周圍CD8+T細(xì)胞浸潤情況比較。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例對 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0020]實(shí)施例1:
[0021]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:
[0022]C57BL/6小鼠，雌性，6~8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；
[0023]實(shí)驗(yàn)藥品:
[0024]表沒食子兒茶素沒食子酸酯:美國Sigma公司，用水溶解；
[0025]胎牛血清:美國Life Technologies公司；
[0026]IL-2:美國 Life Technologies 公司；
[0027]PBS:美國 Life Technologies 公司；
[0028]RMP1-1640培養(yǎng)基:吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；
[0029]紅細(xì)胞裂解液:美國Life Technologies公司；
[0030]CD8+T細(xì)胞分離試劑盒:德國Miltenyl公司；
[0031]CD3、CD28 單抗:美國 eBioscience 公司；
[0032]MTS細(xì)胞活性檢測試劑盒:Promega公司；
[0033]CO2培養(yǎng)箱:美國Thermo公司；
[0034]Spectramaxl9O 酶標(biāo)儀:美國 Molecular Devices 公司；
[0035]細(xì)胞培養(yǎng)板:美國corning公司；
[0036]實(shí)驗(yàn)步驟:[0037]( I)小鼠脾臟單細(xì)胞懸液制備
[0038]頸髓脫臼處死小鼠，無菌分離小鼠脾臟，置于盛有適量無菌PBS平皿中，用注射器將脾臟碾碎，制成單細(xì)胞懸液，室溫1600rpm離心5分鐘，棄上清加入3倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液，混勻后裂解30秒，再用PBS洗3次，棄上清。
[0039](2)⑶8+T淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)
[0040]參照德國美天旎生物技術(shù)有限公司小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞分離說明書操作。每I X IO7小鼠脾臟單細(xì)胞用40ul分離緩沖液(含PBS pH7.2，0.5%胎牛血清和2mM EDTA)重懸,加入IOul CD8+T細(xì)胞Biotin-Antibody Cocktail后于4度孵育10分鐘,再加入30ul分離緩沖液和20ul Ant1-Biotin MicroBeads，4度孵育15分鐘，加入2ml分離緩沖液，1600rpml0min離心,棄上清。用500ul分離緩沖液重懸細(xì)胞,通過磁力分選柱分離出⑶8+T細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
[0041](3)⑶8+T細(xì)胞增殖及藥物干預(yù)
[0042]384孔板預(yù)先用5ug/ml⑶3抗體4度包被過夜，PBS洗三次，每孔中加入3X104CD8+T細(xì)胞，lug/ml CD28抗體，30U/ml IL-2及不同濃度的表沒食子兒茶素沒食子酸酯，總體積50ul。每組做3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48小時(shí)后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔補(bǔ)加200ul RPM1-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加入20ulMTS溶液，37度孵育4小時(shí)，用酶標(biāo)儀在490nm波長處檢測A值。以未用CD3/CD28抗體激活的細(xì)胞作為陰性對照，單純用CD3/CD28抗體激活的細(xì)胞作為陽性對照，結(jié)果見圖2。
[0043]淋巴細(xì)胞相對增殖率(％) =A樣品_A陰性對照)/ (A陽性對照_A陰性對照)]X 100%。
[0044]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0045]由圖可見，表沒食子兒茶素沒食子酸酯從lug/ml開始對⑶3/⑶28抗體對⑶8+T細(xì)胞的活化增殖出現(xiàn)抑制，在10ug/`ml時(shí)的抑制作用達(dá)到100%。
[0046]實(shí)施例2:
[0047]一、試劑及材料:
[0048]C57BL/6小鼠，雌性，體質(zhì)量(15±2)g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；
[0049]乳膏用水包油基質(zhì):十八醇50g,硬脂酸100g,白凡士林50g,液體石臘50g,十二燒基硫酸鈉2.5g,吐溫20g,甘油50g,三乙醇胺5g,蒸懼水加至1000g。
[0050]表沒食子兒茶素沒食子酸酯:美國Sigma公司，由杭州市第三人民醫(yī)院制劑室制備成1，2，3% (w/w)濃度乳膏，基質(zhì)為上述水包油基質(zhì)；
[0051]莫諾苯宗:美國Sigma公司，由杭州市第三人民醫(yī)院制劑室制備成40% (w/w)濃度乳骨，基質(zhì)為上述水包油基質(zhì)；
[0052]兔抗鼠CD8單克隆抗體:ZSGB-BIO公司；
[0053]FITC標(biāo)記羊抗兔二抗:ZSGB-B10公司；
[0054]皮膚共聚焦激光掃描顯微鏡(reflectance confocal microscopy, RCM),美國Lucid 公司，VIVASC0PE1500 型，波長 830nm，最大輸出 16.0mw ；
[0055]免疫突光共聚焦激光掃描顯微鏡(confocallaser scanning microscopy,CLSM):日本 OLYMPUS 公司，F(xiàn)luo View FV1000 型。
[0056]二、實(shí)驗(yàn)步驟
[0057](I)動(dòng)物分組及處理[0058]C57BL/6小鼠50只，隨機(jī)分為5個(gè)組，每組10只，脫去小鼠背部黑色毛2cmX 2cm，用刮勺稍用力涂藥直至吸收。I陰性對照組每天下午涂抹凡士林乳膏50mg—次；II模型組每天下午涂抹40%莫諾苯宗乳膏50mg —次；III，IV和V組為外用治療組，每天早上涂抹1%，2%或3%濃度表沒食子兒茶素沒食子酸酯乳膏50mg —次加下午涂抹40%莫諾苯宗乳膏50mg一次；各組小鼠用藥50天，停藥后連續(xù)15天肉眼觀察小鼠毛發(fā)顏色和脫色面積變化，圖3為停藥15天后模型組和治療組中典型的毛發(fā)脫色情況照片。
[0059](2)毛發(fā)脫色評(píng)估
[0060]每日肉眼觀察毛發(fā)脫色，并測量脫色面積，停藥15天后各實(shí)驗(yàn)組非用藥部位脫色的結(jié)果見圖4 ；
[0061](3)組織病理
[0062]用藥部位及其周圍的皮膚組織蠟塊在切片機(jī)上切為厚度為4μπι的薄片，掛片烤干后，切片常規(guī)脫蠟、水化，蒸餾水沖洗2minX3次，PBS浸泡5min。石蠟切片置于微波爐中95°C微波抗原熱修復(fù)30min，蒸餾水沖洗2minX 2次，PBS沖洗2minX 2次。切片用10%正常山羊血清封閉，室溫孵育30min，傾去血清。加兔⑶8單克隆抗體，4°C過夜。PBS沖洗，5minX3次，滴加FITC標(biāo)記羊抗兔二抗，室溫反應(yīng)2h。PBS沖洗，5minX3次，90%甘油封片。用FluoView FV1000型激光共聚焦顯微鏡檢測⑶8 + T細(xì)胞染色，采用單一綠色熒光通道觀察，在488nm波長以上掃描觀察。觀察并由計(jì)算機(jī)自帶掃描分析軟件測定，每張切片選取5個(gè)視野(200X )計(jì)算單位面積⑶8+T細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。圖5顯示的是外用藥物最后一天各實(shí)驗(yàn)組小鼠在用藥部位脫色斑周圍CD8熒光標(biāo)記強(qiáng)度的比較。
[0063](4)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法
[0064]數(shù)據(jù)測定結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(? + 5 )表示，t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Ρ〈0.05為
有顯著性差異。
[0065]三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0066]1.脫色的發(fā)生率和時(shí)間:
[0067]II模型組、II1- V外用治療組在莫諾苯宗用藥部位均有出現(xiàn)脫色，出現(xiàn)脫色的時(shí)間平均分別為19，19，21.6和29.3天。各組中有部分小鼠在莫諾苯宗非用藥部位出現(xiàn)脫色斑，這種非用藥部位脫色斑與人白癜風(fēng)相似(參見圖3)。各組非用藥部位脫色的發(fā)生率分別為50%、50%、40%、20%。表沒食子兒茶素沒食子酸酯對非用藥部位出現(xiàn)脫色的時(shí)間有重要的影響。模型組非用藥部位出現(xiàn)脫色斑平均時(shí)間實(shí)驗(yàn)28天，II1- V外用治療組在非用藥部位平均分別為28、31和36天出現(xiàn)脫色。結(jié)果表明:1%表沒食子兒茶素沒食子酸酯對非用藥部位脫色斑出現(xiàn)的比例無顯著影響，2%及3%表沒食子兒茶素沒食子酸酯有一定的療效，使得非用藥部位出現(xiàn)脫色斑的發(fā)生率下降。同時(shí)，2%及3%表沒食子兒茶素沒食子酸酯治療組在非用藥部位出現(xiàn)脫色的時(shí)間也得到延遲。
[0068]2.脫色面積和穩(wěn)定性:
[0069]莫諾苯宗模型組小鼠非用藥部位的脫色面積平均為4.91cm2，II1-V外用治療組小鼠非用藥部位的脫色面積分別平均為4.77cm2,4.17cm2和3.56cm2 (參見圖4)。2%及3%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯治療顯著縮小小鼠非藥物部位出現(xiàn)的脫色斑面積。
[0070]3.⑶8+T細(xì)胞浸潤的數(shù)量差異:
[0071]免疫熒光顯示莫諾苯宗用藥部位脫色斑周圍存在CD8+T細(xì)胞浸潤(參見圖5)。陰性對照組免疫熒光切片在綠色的背景下有極少量CD8陽性細(xì)胞，其定量值(60.159±2.073)。模型組CD8+T細(xì)胞浸潤明顯，其定量值(291.637±9.169),111- V組在綠色背景中可見少量的高亮CD8+T細(xì)胞，其定量(276.149±12.415)，(198.328±14.517)，(157.728±14.192)，與模型組比較P〈0.05，差異顯著。因此表沒食子兒茶素沒食子酸酯能通過顯著抑制CD8+T細(xì)胞的浸潤，從而抑制莫諾苯宗誘導(dǎo)的白癜風(fēng)。
【權(quán)利要求】
1.表沒食子兒茶素沒食子酸酯在制備防治白癜風(fēng)的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述表沒食子兒茶素沒食子酸酯用于制備抑制CD8+T細(xì)胞活化增殖的藥物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物制成下列之一的劑型:擦劑、洗劑、噴劑。
4.如權(quán)利要求 3所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物中表沒食子兒茶素沒食子酸酯濃度為2~5% ο
【文檔編號(hào)】A61P17/00GK103505452SQ201310405395
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】許愛娥 申請人:許愛娥, 王遂泉