表面展示sars雙價(jià)抗原的重組桿狀病毒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表面展示SARS雙價(jià)抗原的重組桿狀病毒及其制備方法和應(yīng)用，該病毒是由重組蛋白SP-N-TM和SP-RBD-TM的編碼基因插入到供體質(zhì)粒并通過轉(zhuǎn)座與穿梭載體Bacmid的基因組進(jìn)行同源重組，獲得重組桿狀病毒基因組DNA，然后將該基因組DNA轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)包裝得到的重組桿狀病毒；其中重組蛋白SP-N-TM是由SARS病毒的N蛋白的N-端連接GP64的信號(hào)肽SP，C-端連接GP64的跨膜域TM構(gòu)成；SP-RBD-TM是由SARS病毒的RBD蛋白的N-端連接SP，C-端連接TM構(gòu)成。該重組桿狀病毒將SARS病毒的N蛋白及RBD蛋白基因在病毒衣殼表面展示，具有良好的免疫原性。
【專利說明】表面展示SARS雙價(jià)抗原的重組桿狀病毒及其制備方法和 應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種表面展示SARS雙價(jià)抗原的重組桿 狀病毒及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 嚴(yán)重急性呼吸綜合征（Severe Acute Respiratory Syndromes)，又稱傳染性非典 型肺炎，簡(jiǎn)稱SARS，是一種因感染SARS冠狀病毒引起的新的呼吸系統(tǒng)傳染性疾病。主要通 過近距離空氣飛沫傳播，以發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛、乏力、干咳少痰等為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重 者可出現(xiàn)呼吸窘迫。本病具有較強(qiáng)的傳染性，在家庭和醫(yī)院有顯著的聚集現(xiàn)象。首發(fā)病例， 也是全球首例，于2002年11月出現(xiàn)在廣東佛山，并迅速形成流行態(tài)勢(shì)。2002年11月至 2003年8月5日，29個(gè)國家報(bào)告臨床診斷病例共8422例，死亡916例。報(bào)告病例的平均死 亡率為9. 3%。該病毒很可能來源于動(dòng)物，由于外界環(huán)境的改變和病毒適應(yīng)性的增加而跨越 種系屏障傳染給人類，并實(shí)現(xiàn)了人與人之間的傳播。
[0003] 雖然SARS已被控制，但SARS病毒不大可能在短期內(nèi)被"消滅"或自動(dòng)消失，SARS 在人群中再次出現(xiàn)的可能性很大。再次發(fā)生SARS疫情的時(shí)間，主要與病毒侵襲人體的時(shí)間 有關(guān)，不一定表現(xiàn)為冬春高發(fā)。動(dòng)物攜帶病毒的季節(jié)性分布、人接觸感染動(dòng)物的機(jī)會(huì)等都將 影響再次發(fā)生疫情的時(shí)間。動(dòng)物仍然是病毒的可能來源，人群對(duì)SARS病毒仍然普遍易感， 其疫苗仍是目前的研究重點(diǎn)。
[0004] 目前SARS疫苗包括治療性疫苗、滅活疫苗、DNA疫苗、多表位疫苗等，已有一定進(jìn) 展，但也存在相應(yīng)的問題，具體見下表。
[0005] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 一種表面展示SARS雙價(jià)抗原的重組桿狀病毒，其特征在于，該病毒是由重組蛋白 SP-N-TM和SP-RBD-TM的編碼基因插入到供體質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)座與穿梭載體Bacmid的基因組 進(jìn)行同源重組，獲得重組桿狀病毒基因組DNA，然后將重組桿狀病毒基因組DNA轉(zhuǎn)染家蠶細(xì) 胞，在家蠶細(xì)胞內(nèi)包裝得到所述的表面展示SARS抗原N基因和RBD基因的重組桿狀病毒； 其中，所述重組蛋白SP-N-TM是由SARS病毒的N蛋白的N-端連接桿狀病毒囊膜蛋白 GP64的信號(hào)肽SP，C-端連接桿狀病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM構(gòu)成； 所述重組蛋白SP-RBD-TM是由SARS病毒的RBD蛋白的N-端連接桿狀病毒囊膜蛋白 GP64的信號(hào)肽SP，C-端連接桿狀病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM構(gòu)成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面展示SARS雙價(jià)抗原的重組桿狀病毒，其特征在于，所述 供體質(zhì)粒為pFastBacDual，重組蛋白SP-N-TM的編碼基因插入到供體質(zhì)粒pFastBacDual的 pl〇啟動(dòng)子下，重組蛋白SP- RBD -TM的編碼基因插入到供體質(zhì)粒pFastBacDual的pPolh 啟動(dòng)子下，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒后再與穿梭載體Bacmid的基因組進(jìn)行同源重組。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的表面展示SARS雙價(jià)抗原的重組桿狀病毒，其特征在于，所述 重組蛋白SP-N-TM的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；所述重組蛋白SP-RBD-TM的氨基酸 序列如SEQ ID N0:2所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的表面展示SARS雙價(jià)抗原的重組桿狀病毒，其特征在于，所述 重組蛋白SP-N-TM的編碼基因核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述重組蛋白SP-RBD-TM 的編碼基因核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的表面展示SARS雙價(jià)抗原的重組桿狀病毒，其特征在于，所述 家蠶細(xì)胞為家蠶BmN細(xì)胞。
6. 權(quán)利要求2飛任一所述的表面展示SARS雙價(jià)抗原的重組桿狀病毒的制備方法，其特 征在于，步驟如下： (1) PCR擴(kuò)增獲得桿狀病毒囊膜蛋白GP64信號(hào)肽SP的編碼基因、SARS病毒的N蛋白 的編碼基因、SARS病毒的RBD蛋白的編碼基因和桿狀病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的編 碼基因； (2) 通過重疊 PCR擴(kuò)增的方法獲得由SP的編碼基因、N蛋白的編碼基因和 TM的編碼基因依次連接的重組基因 SP-N-TM，且在其5'和3'端分別引入 和幻7/7 I酶切位點(diǎn)；重疊 PCR獲得由SP的編碼基因、RBD蛋白的編碼基因和TM 的編碼基因依次連接的重組基因 SP-RBD-TM，且在其5'和3'端分別引入及麗7 I和I酶切位點(diǎn)；將重組基因 SP-N-TM連接到載體pFastBacDual的p 10啟動(dòng)子下， SP-RBD-TM連接到載體pFastBacDual的pploh啟動(dòng)子下，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒； (3) 重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含桿狀病毒穿梭載體Bacmid的大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞， 進(jìn)行同源重組，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)平板上進(jìn)行藍(lán) 白斑篩選，避光培養(yǎng)4(T48h后挑取白斑，白斑繼續(xù)培養(yǎng)24?48h后抽提重組桿狀病毒基因組 DNA進(jìn)行PCR鑒定； (4) 取步驟（3)鑒定正確的重組桿狀病毒基因組DNA通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞， 發(fā)病后獲得一代病毒懸液，提取病毒基因組再次進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的即為表面展示 SARS雙價(jià)抗原的重組桿狀病毒； 所述PCR鑒定使用兩組引物，分別為SEQIDN0:5、SEQIDN0:7和SEQIDN0 :12構(gòu)成 的引物組，以及SEQIDN0:6、SEQIDN0:13和SEQIDN0:18構(gòu)成的引物組。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的表面展示SARS雙價(jià)抗原的重組桿狀病毒的制備方法，其特征 在于，步驟（1)中擴(kuò)增桿狀病毒囊膜蛋白GP64信號(hào)肽SP的編碼基因使用的引物核苷酸序 列如SEQ ID NO: 7?8所示；擴(kuò)增SARS病毒N蛋白的編碼基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID Ν0:9~10所示；擴(kuò)增桿狀病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的編碼基因使用的引物核苷酸 序列如SEQ ID NO: 11?12所示。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的表面展示SARS雙價(jià)抗原的重組桿狀病毒的制備方法，其特 征在于，步驟（1)中擴(kuò)增桿狀病毒囊膜蛋白GP64信號(hào)肽SP的編碼基因使用的引物核苷酸 序列如SEQ ID NO: 13~14所示；擴(kuò)增SARS病毒RBD蛋白的編碼基因使用的引物核苷酸序列 如SEQ ID NO: 15?16所示；擴(kuò)增桿狀病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的編碼基因使用的引 物核苷酸序列如SEQ ID NO: 17?18所示。
9. 權(quán)利要求1飛任一所述的表面展示SARS雙價(jià)抗原的重組桿狀病毒在制備SARS疫苗 中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK104293740SQ201310301800
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月18日
【發(fā)明者】張耀洲, 閆晶晶, 舒特俊, 陳劍清, 蓋其靜, 趙紅玉 申請(qǐng)人:特菲(天津)生物醫(yī)藥科技有限公司