專利名稱：一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用高分子材料領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于聚乙二醇-聚賴氨酸的兩親性嵌段共聚物自組裝的雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
癌癥(Cancer),亦稱惡性腫瘤(Malignant neoplasm),由控制細(xì)胞生長增殖機(jī)制失常而引起的疾病。癌細(xì)胞除了生長失控外，還會局部侵入周遭正常組織甚至經(jīng)由體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到身體其他部分，嚴(yán)重威脅著人類的健康?；瘜W(xué)治療是癌癥治療中最常用的一種方法，但是通過小分子藥物直接遞送方式面臨諸多問題，如小分子藥物半衰期短，為了達(dá)到治療效果需要頻繁給藥，而小分子藥物在體內(nèi)分布無特異性靶向，對于正常組織的毒副作用大等，更重要的是化療對于癌癥患者無力挽救的原因之一是患者體內(nèi)癌細(xì)胞對于小分子藥物產(chǎn)生了耐藥性，導(dǎo)致治療效果大打折扣。針對直接給藥方式存在的嚴(yán)重不足，藥物載體成為熱點(diǎn)被廣泛研究。其中備受關(guān)注的一類載體是由兩親性共聚物自組裝而成的納米粒子，這種納米粒子中以膠束和囊泡居多。在自組裝成膠束的過程中，兩親性聚合物的疏水鏈段形成膠束的內(nèi)核，親水鏈段形成膠束的外殼，形成核殼結(jié)構(gòu)；而在自組裝成囊泡的過程中，兩親性聚合物纏繞成膜圍成一個中空的親水的內(nèi)腔結(jié)構(gòu)。膠束的疏水內(nèi)核可以負(fù)載疏水藥物，囊泡的親水內(nèi)腔中可以負(fù)載親水藥物，疏水膜中可以負(fù)載疏水藥物，在載體的包裹下可降低藥物在傳遞的過程中的毒副作用。兩親性聚合物形成的納米粒子的親水性外殼可有效提高疏水性藥物的水溶性，大大提聞生物利用度。聚乙二醇PEG是一種親水性聚合物，具有優(yōu)異的生物相容性、非免疫原性以及與血液成分相互作用小等優(yōu)點(diǎn)，在聚合物和藥物結(jié)合的領(lǐng)域里受到高度關(guān)注，是最常用的納米粒子表面修飾聚合物。經(jīng)過PEG修飾后的納米粒子，可逃離網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的吞噬，提高體內(nèi)長循環(huán)作用，并通過EPR作用富集于腫瘤部位。基于聚多肽的聚合物較傳統(tǒng)合成高分子具有很多優(yōu)勢，良好的生物相容性以及可組裝成穩(wěn)定的有序的構(gòu)象。合成的基于多肽的聚合物自組裝為膠束或者囊泡等納米粒子在藥物和基因傳遞應(yīng)用中有潛在的作用。針對化療過程中的耐藥問題，用納米粒子作為藥物載體包裹藥物來逃避耐藥細(xì)胞的識別過程，漸漸成為逆轉(zhuǎn)耐藥行為的方法之一。普通的兩親性聚合物自組裝形成的納米粒子并不能識別腫瘤部位與正常部位，也不能區(qū)分細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外的環(huán)境，因此研究能在腫瘤細(xì)脆內(nèi)釋放藥物的具有敏感性的智能型聚合物納米粒子作為藥物載體具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種基于聚乙二醇-聚賴氨酸的兩親性嵌段共聚物自組裝的雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑及其制備方法，在一定程度上逆轉(zhuǎn) 了化學(xué)治療過程中產(chǎn)生的耐藥性。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑，該載體制劑為具有疏水雙分子膜及親水內(nèi)腔的中空的納米球體狀囊泡；由雙敏感兩親性嵌段共聚物利用溶劑交換法通過疏水作用自組裝形成。所述的疏水雙分子膜負(fù)載疏水藥物，所述的親水內(nèi)腔負(fù)載親水藥物。所述的雙敏感兩親性嵌段共聚物由還原敏感的二硫鍵及pH敏感的碳氮雙鍵橋連親水性聚乙二醇和疏水性芐氧羰基保護(hù)的聚賴氨酸而成；所述的還原敏感為谷胱甘肽(GSH)敏感。還原敏感由二硫鍵實現(xiàn)，pH敏感由碳氮雙鍵實現(xiàn)。所述的載體制劑的劑型為凍干粉針劑，所述的載體制劑的粒徑范圍為100-500納米。一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑的制備方法，包括以下步驟:(I) ε-節(jié)氧羰基保護(hù)賴氨酸(Z-Lys NCA)的制備；將三光氣溶于無水四氫呋喃中，然后在氬氣保護(hù)下逐滴加入到賴氨酸單體的無水四氫呋喃懸濁液中，攪拌加熱到50°C，待溶液澄清時停止反應(yīng)并自然冷卻，用體積比為5: I的正己烷/四氫呋喃重結(jié)晶2 3次，抽濾，常溫真空干燥，得到Z-Lys NCA粉末；(2)聚賴氨酸(以PzLLn表示，其中η彡I)的制備:將乙胺鹽酸鹽和Z-Lys NCA溶于無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氬氣保護(hù)下進(jìn)行開環(huán)聚合反應(yīng)，先冰浴下反應(yīng)5h，然后常溫下繼續(xù)反應(yīng)72h，透析，凍干得到含η個鏈節(jié)的聚賴氨酸，其中η > 1，η值越大，鏈節(jié)越長，也即兩親性聚合物中的疏水鏈段越長；(3)含二硫鍵的端 羧基聚賴氨酸(PzLLn-SS-COOH)的制備:將二硫代二丙酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl)及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫下攪拌24h，得到反應(yīng)液，將溶解在無水N，N- 二甲基甲酰胺中的聚賴氨酸逐滴滴入上述反應(yīng)液中，常溫攪拌反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后，透析，凍干得到含二硫鍵的端羧基聚賴氨酸(PzLLn-SS-COOH)粉末；(4)含二硫鍵的端氨基聚賴氨酸(PzLLn-SS-NH2)的制備:將含二硫鍵的端羧基聚賴氨酸(PzLLn-SS-COOH)、1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽及N-羥基琥珀酰亞胺溶于無水N，N- 二甲基甲酰胺中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫攪拌24h，得到反應(yīng)液，然后將上述反應(yīng)液逐滴滴入過量的乙二胺的無水N，N-二甲基甲酰胺溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫攪拌48h，反應(yīng)結(jié)束后，透析，凍干得到含二硫鍵的端氨基聚賴氨酸(PzLLn-SS-NH2)粉末；(5)雙敏感兩親性嵌段共聚物(PzLLn-SS-NC-mPEG)的制備:將含二硫鍵的端氨基聚賴氮酸(PzLLn-SS-NH2)粉末和甲氧基聚乙二醇醛(mPEG-CHO)溶于無水N，N-二甲基甲酰胺中，抽真空通氮?dú)猓叵聰嚢璺磻?yīng)24h，透析，凍干得到含二硫鍵和碳氮雙鍵的雙敏感兩親性嵌段共聚物(PzLLn-SS-NCiiPEG)；(6)用四氫呋喃及去離子水溶解雙敏感兩親性嵌段共聚物(PzLLn-SS-NC-mPEG)，得到雙敏感兩親性嵌段共聚物(PzLLn-SS-NC-mPEG)油水混合液；用四氫呋喃溶解疏水藥物，得到疏水藥物油溶液；用去離子水溶解親水藥物，得到親水藥物水溶液；將疏水藥物油溶液與親水藥物水溶液分別加入到雙敏感兩親性嵌段共聚物(PzLLn-SS-NC-mPEG)油水混合液中，攪拌5 8h，并移入透析袋進(jìn)行避光透析，多次換水除去四氫呋喃及未載入的親水藥物或疏水藥物，透析結(jié)束后，凍干形成藥物載體粉末制劑，即為雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑。步驟(I)中所述的賴氨酸單體為芐氧羰基保護(hù)的賴氨酸。步驟⑵中所述的乙胺鹽酸鹽和芐氧羰基保護(hù)賴氨酸的摩爾比為1: (5 15)；步驟(3)中所述的聚賴氨酸、二硫代二丙酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽及N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1: 8: (10 12): (10 12);步驟(4)中所述的含二硫鍵的端羧基聚賴氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺及乙二胺的摩爾比為1: (1.2 1.5): (1.2
1.5): 8 ；步驟(5)中所述的含二硫鍵的端氨基聚賴氨酸和甲氧基聚乙二醇醛的摩爾比為I: 1.2 ；步驟￠)中所述的雙敏感兩親性嵌段共聚物、疏水藥物及親水藥物的重量份之比為(3 10): (3 10): (3 10);所述的雙敏感兩親性嵌段共聚物油水混合液中，雙敏感兩親性嵌段共聚物、四氫呋喃及去離子水的重量份之比為(3 10): (3 10): (9 30);所述的疏水藥物油溶液中，疏水藥物與四氫呋喃的重量份之比為(3 10): (I 3);所述的親水藥物水溶液中，親水藥物與去離子水的重量份之比為(3 10): (I 3)。步驟⑵、步驟(3)及步驟⑷中所述的透析均在規(guī)格為MWCOlKDa的透析袋內(nèi)進(jìn)行；步驟(5)及步驟￠)中所述的 透析在規(guī)格為MWC03.5Kda的透析袋內(nèi)進(jìn)行。其中，MwCO即留在透析袋內(nèi)的生物大分子的最小分子量，Kda表示分子量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。步驟(5)中所述的甲氧基聚乙二醇醛的分子量為2000。步驟￠)中所述的親水藥物選自阿霉素鹽酸鹽或吉西他濱鹽酸鹽，疏水藥物選自甲氨蝶呤、紫杉醇或喜樹堿。本發(fā)明通過端氨基小分子引發(fā)Z-Lys NCA的開環(huán)聚合制備可控鏈節(jié)的聚賴氨酸，然后利用還原敏感的二硫鍵和pH敏感的碳氮雙鍵將親水段聚乙二醇連接到聚合物分子鏈末端，具體為利用胱；胺引入還原敏感的_■硫鍵，通過希夫喊反應(yīng)引入pH敏感的碳?xì)怆p鍵，形成兩親性的嵌段共聚物。利用這種共聚物采用溶劑交換法自組裝制備中空親水內(nèi)腔包裹親水藥物、疏水膜層負(fù)載疏水藥的納米粒子，這種納米藥物載體進(jìn)入細(xì)胞后，能利用腫瘤細(xì)胞內(nèi)的還原性環(huán)境和酸性環(huán)境促使其選擇性崩解，從而實現(xiàn)藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的靶向釋放。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供一種基于聚乙二醇-聚賴氨酸具有雙重生物響應(yīng)性的可崩解式多功能納米藥物載體制劑及其制備方法，采用溶劑交換法自組裝形成具有中空親水內(nèi)腔及疏水膜層的囊泡結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)既可負(fù)載親水藥物又可負(fù)載疏水藥物；引入具有還原敏感的二硫鍵和PH敏感的碳氮雙鍵，可有效利用腫瘤細(xì)胞中的還原環(huán)境及酸性環(huán)境使得載體崩解釋放藥物實現(xiàn)靶向釋藥，提高藥物生物利用度；選用高分子PEG以及合成多肽，制備得到的載體制劑具有高度的穩(wěn)定性、良好的生物相容性；此外，將藥物包裹在納米粒子內(nèi)還可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)化療中的耐藥性。


圖1為實施例3中雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑水溶液的動態(tài)力學(xué)光散射圖(粒徑及分布)；圖2為實施例3中雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑的透射電鏡圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實施例1兩親性嵌段共聚物的制備(1)Z-Lys NCA的制備:將3g, 23mmol節(jié)氧羰基保護(hù)的賴氨酸懸浮于50mL無水四氫呋喃(THF)中，將2.7g,9mmol的三光氣溶于20mL無水THF并在氬氣保護(hù)下逐滴加入上述懸濁液中，攪拌加熱到50°C。待溶液澄清時停止反應(yīng)并自然冷卻，用正己烷/四氫呋喃(5: Ι,ν: v)重結(jié)晶2 3次，抽濾，常溫真空干燥，得到產(chǎn)物Z-LysNCA粉末；(2) PzLL5的制備:將2mmol的乙胺鹽酸鹽和IOmmol的Z-Lys NCA溶于20mL無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氬氣保護(hù)下進(jìn)行開環(huán)聚合反應(yīng)，先冰浴下反應(yīng)5h，然后常溫下繼續(xù)反應(yīng)72h，將反應(yīng)溶液移入透析袋(MWCOlKDa)透析，凍干得到聚賴氨酸PzLL5 ;(3)PzLL5-SS-COOH 的制備:將 16mmol 二硫代二丙酸，12mmoll-(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC -HC1)，12mmol N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，溶于IOmL無水DMF,在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫下攪拌24h。將2mmol PzLL5溶解在15mL的無水DMF中，并逐滴滴入上述反應(yīng)液中，常溫攪拌反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后，透析(MWCOlKDa)，凍干得到PzLL5-SS-COOH粉末； (4) PzLL5-SS-NH2 的制備:將 lmmol PzLL5-SS-COOH, 1.2mmol EDC.HCl，1.2mmolNHS溶于15mL無水DMF，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫攪拌24h。然后將上述反應(yīng)液逐滴滴入8mmol乙二胺的無水DMF溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫攪拌48h。反應(yīng)結(jié)束后，透析(MWCOlKDa)，凍干得到PzLL-SS-NH2粉末；(5) PzLL5-SS-NC-mPEG 的制備:將 0.5mmol PzLL5-SS-NH2 和 0.6mmol 甲氧基聚乙二醇醛mPEG-CHO，溶于無水IOmL DMF中，抽真空通氮?dú)?，常溫下攪拌反?yīng)24h，透析(MWC03.5KDa)，凍干得到含二硫鍵和碳氮雙鍵的PzLL5-SS-NC_mPEG嵌段共聚物。實施例2兩親性嵌段共聚物的制備(1)Z-Lys NCA的制備:將3g, 23mmol節(jié)氧羰基保護(hù)的賴氨酸懸浮于50mL無水四氫呋喃(THF)中，將2.7g,9mmol的三光氣溶于20mL無水THF并在氬氣保護(hù)下逐滴加入上述懸濁液中，攪拌加熱到50°C。待溶液澄清時停止反應(yīng)并自然冷卻，用正己烷/四氫呋喃(5: Ι,ν: v)重結(jié)晶2 3次，抽濾，常溫真空干燥，得到產(chǎn)物Z-LysNCA粉末；(2) PzLL10的制備:將2mmol的乙胺鹽酸鹽和20mmol的Z-Lys NCA溶于20mL無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氬氣保護(hù)下進(jìn)行開環(huán)聚合反應(yīng)，先冰浴下反應(yīng)5h，然后常溫下繼續(xù)反應(yīng)72h，將反應(yīng)溶液移入透析袋(MWCOlKDa)透析，凍干得到聚賴氨酸PzLLltl ;(3)PzLL10-SS-COOH 的制備:將 16mmol 二硫代二丙酸，12mmoll-(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC -HC1)，12mmol N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，溶于IOmL無水DMF,在氮?dú)獗?護(hù)下常溫下攪拌24h。將2mmol PzLL10溶解在30mL的無水DMF中，并逐滴滴入上述反應(yīng)液中，常溫攪拌反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后，透析(MWCOlKDa)，凍干得到PzLL1(l-SS-C00H粉末；(4) PzLL10-SS-NH2 的制備:將 lmmol PzLL10-SS-COOH, 1.2mmol EDC.HCl，1.2mmolNHS溶于30mL無水DMF，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫攪拌24h。然后將上述反應(yīng)液逐滴滴入8mmol乙二胺的無水DMF溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫攪拌48h。反應(yīng)結(jié)束后，透析(MWCOlKDa)，凍干得到 PzLLic1-SS-NH2 粉末；(5) PzLL10-SS-NC-mPEG 的制備:將 0.5mmol PzLL10-SS-NH2 和 0.6mmol 甲氧基聚乙二醇醛mPEG-CHO，溶于無水20mL DMF中，抽真空通氮?dú)猓叵聰嚢璺磻?yīng)24h，透析(MWC03.5KDa)，凍干得到含二硫鍵和碳氮雙鍵的PzLL1(l-SS-NC-mPEG嵌段共聚物。實施例3具有雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑的制備稱取3 10份PzLL5-SS-NC-mPEG嵌段共聚物溶于3 10份THF中，使用蠕動泵向上述溶液中逐滴滴入9 30份去離子水，稱取3 10份甲氨蝶呤溶解在I 3份THF中，稱取3 10份阿霉素鹽酸鹽溶解在I 3份去離子水中，分別加入上述聚合物的水油混合溶液中，攪拌5 8h，然后將上述制備溶液液移入透析袋(MWC03.5KDa)進(jìn)行避光透析，多次換水除去有機(jī)溶劑及未載入藥物，透析結(jié)束后，凍干形成藥物載體粉末制劑。制備的雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑水溶液的動態(tài)力學(xué)光散射圖(粒徑及分布)如圖1所示，雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑的透射電鏡圖如圖2所示。實施例4具有雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑的制備稱取3 10份PzLL1(l-SS-NC-mPEG嵌段共聚物溶于3 10份THF中，使用蠕動泵向上述溶液中逐滴滴入9 30份去`離子水，稱取3 10份喜樹堿溶解在I 3份THF中，稱取3 10份吉西他濱鹽酸鹽溶解在I 3份去離子水中，分別加入上述聚合物的水油混合溶液中，攪拌5 8h，然后將上述制備溶液液移入透析袋(MWC03.5KDa)進(jìn)行避光透析，多次換水除去有機(jī)溶劑及未載入藥物，透析結(jié)束后，凍干形成藥物載體粉末制劑。實施例5一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑，該載體制劑為具有疏水雙分子膜及親水內(nèi)腔的中空的納米球體狀囊泡；由雙敏感兩親性嵌段共聚物利用溶劑交換法通過疏水作用自組裝形成。疏水雙分子膜負(fù)載疏水藥物，親水內(nèi)腔負(fù)載親水藥物。雙敏感兩親性嵌段共聚物由還原敏感的二硫鍵及PH敏感的碳氮雙鍵橋連親水性聚乙二醇和疏水性芐氧羰基保護(hù)的聚賴氨酸而成；還原敏感為谷胱甘肽(GSH)敏感。還原敏感由二硫鍵實現(xiàn)，pH敏感由碳氮雙鍵實現(xiàn)。載體制劑的劑型為凍干粉針劑，載體制劑的粒徑范圍為100-500納米。—種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑的制備方法，包括以下步驟:(I)Z-Lys NCA的制備:將三光氣(雙(三氯甲基)碳酸酯)溶于無水四氫呋喃(THF)中，然后在氬氣保護(hù)下逐滴加入到賴氨酸單體的無水四氫呋喃懸濁液中，攪拌加熱到50°C，待溶液澄清時停止反應(yīng)并自然冷卻，用體積比為5: I的正己烷/四氫呋喃重結(jié)晶2次，抽濾，常溫真空干燥，得到Z-Lys NCA粉末，其中，賴氨酸單體為芐氧羰基保護(hù)的賴氨酸；(2) Z-Lys NCA的開環(huán)聚合:將乙胺鹽酸鹽和Z-Lys NCA按摩爾比為1: 5溶于無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氬氣保護(hù)下進(jìn)行開環(huán)聚合反應(yīng)，先冰浴下反應(yīng)5h，然后常溫下繼續(xù)反應(yīng)72h，透析，凍干得到PzLLn ；(3) PzLLn-SS-COOH的制備:將二硫代二丙酸、1-(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC -HC1)及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫下攪拌24h，得到反應(yīng)液，將溶解在無水N，N- 二甲基甲酰胺中的聚賴氨酸逐滴滴入上述反應(yīng)液中，常溫攪拌反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后，透析，凍干得到PzLLn-SS-COOH粉末，其中，聚賴氨酸、二硫代二丙酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽及N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1: 8: 10: 10; (4)PzLLn-SS-NH2 的制備:將 PzLLn-SS-C00H、1-(3- 二甲氛基丙基)_3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽及N-羥基琥珀酰亞胺溶于無水N，N- 二甲基甲酰胺中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫攪拌24h，得到反應(yīng)液，然后將上述反應(yīng)液逐滴滴入過量的乙二胺的無水N，N-二甲基甲酰胺溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫攪拌48h，反應(yīng)結(jié)束后，透析，凍干得到PzLLn-SS-NH2粉末，其中，PzLLn-SS-COOH, 1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺及乙二胺的摩爾比為1: 1.2: 1.2: 8 ;(5) PzLLn-SS-NC-mPEG的制備:將PzLLn-SS-NH2粉末和甲氧基聚乙二醇醛(mPEG-CHO)溶于無水N，N- 二甲基甲酰胺中，其中，PzLLn-SS-NH2和甲氧基聚乙二醇醛的摩爾比為1: 1.2，抽真空通氮?dú)猓叵聰嚢璺磻?yīng)24h，透析，凍干得到含二硫鍵和碳氮雙鍵的PzLLn-SS-NC-mPEG嵌段共聚物；(6)用四氫呋喃及去離子水溶解PzLLn-SS-NC-mPEG，得到PzLLn-SS-NC_mPEG油水混合液；用四氫呋喃溶解疏水藥物甲氨蝶呤，得到疏水藥物油溶液；用去離子水溶解親水藥物阿霉素鹽酸鹽，得到親水藥物水溶液；將疏水藥物油溶液與親水藥物水溶液分別加入到PZLLn-SS-NC-mPEG油水混合液中，攪拌5 8h，并移入透析袋進(jìn)行避光透析，多次換水除去四氫呋喃及未載入的親水藥物或疏水藥物，透析結(jié)束后，凍干形成藥物載體粉末制劑，即為雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑；其中，PzLLn-SS-NC-mPEG、疏水藥物及親水藥物的重量份之比為3: 3: 3 ;PzLLn-SS-NC-mPEG油水混合液中，PzLLn-SS-NC-mPEG、四氫呋喃及去離子水的重量份之比·為3: 3: 9 ;疏水藥物油溶液中，疏水藥物與四氫呋喃的重量份之比為3: I ;親水藥物水溶液中，親水藥物與去離子水的重量份之比為3: I。其中，步驟⑵、步驟(3)及步驟(4)中透析均在規(guī)格為MWCOlKDa的透析袋內(nèi)進(jìn)行；步驟(5)及步驟￠)中透析在規(guī)格為MWC03.5Kda的透析袋內(nèi)進(jìn)行。其中，MwCO即留在透析袋內(nèi)的生物大分子的最小分子量，Kda表示分子量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。步驟(5)中甲氧基聚乙二醇醒的分子量為2000。實施例6一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑，該載體制劑為具有疏水雙分子膜及親水內(nèi)腔的中空的納米球體狀囊泡；由雙敏感兩親性嵌段共聚物利用溶劑交換法通過疏水作用自組裝形成。疏水雙分子膜負(fù)載疏水藥物，親水內(nèi)腔負(fù)載親水藥物。雙敏感兩親性嵌段共聚物由還原敏感的二硫鍵及PH敏感的碳氮雙鍵橋連親水性聚乙二醇和疏水性芐氧羰基保護(hù)的聚賴氨酸而成；還原敏感為谷胱甘肽(GSH)敏感。還原敏感由二硫鍵實現(xiàn)，pH敏感由碳氮雙鍵實現(xiàn)。載體制劑的劑型為凍干粉針劑，載體制劑的粒徑范圍為100-500納米。一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑的制備方法，包括以下步驟:(I)Z-Lys NCA的制備:將三光氣(雙(三氯甲基)碳酸酯)溶于無水四氫呋喃(THF)中，然后在氬氣保護(hù)下逐滴加入到賴氨酸單體的無水四氫呋喃懸濁液中，攪拌加熱到50°C，待溶液澄清時停止反應(yīng)并自然冷卻，用體積比為5: I的正己烷/四氫呋喃重結(jié)晶3次，抽濾，常溫真空干燥，得到Z-Lys NCA粉末，其中，賴氨酸單體為芐氧羰基保護(hù)的賴氨酸；(2)Z-Lys NCA的開環(huán)聚合:將乙胺鹽酸鹽和Z-Lys NCA按摩爾比為1: 15溶于無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氬氣保護(hù)下進(jìn)行開環(huán)聚合反應(yīng)，先冰浴下反應(yīng)5h，然后常溫下繼續(xù)反應(yīng)72h，透析，凍干得到PzLLn ；(3) PzLLn-SS-COOH的制備:將二硫代二丙酸、1-(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC -HC1)及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫下攪拌24h，得到反應(yīng)液，將溶解在無水N，N- 二甲基甲酰胺中的聚賴氨酸逐滴滴入上述反應(yīng)液中，常溫攪拌反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后，透析，凍干得到PzLLn-SS-COOH粉末，其中，聚賴氨酸、二硫代二丙酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽及N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1: 8: 12: 12;(4)PzLLn-SS-NH2 的制備:將 PzLLn-SS-C00H、1-(3- 二甲氛基丙基)_3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽及N-羥基琥珀酰亞胺溶于無水N，N- 二甲基甲酰胺中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫攪拌24h，得到反應(yīng)液，然后將上述反應(yīng)液逐滴滴入過量的乙二胺的無水N，N-二甲基甲酰胺溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫攪拌48h，反應(yīng)結(jié)束后，透析，凍干得到PzLLn-SS-NH2粉末，其中，PzLLn-SS-COOH, 1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺及乙二胺的摩爾比為1: 1.5: 1.5: 8 ;
(5) PzLLn-SS-NC-mPEG的制備:將PzLLn-SS-NH2粉末和甲氧基聚乙二醇醛(mPEG-CHO)溶于無水N，N- 二甲基甲酰胺中，其中，PzLLn-SS-NH2和甲氧基聚乙二醇醛的摩爾比為1: 1.2，抽真空通氮?dú)?，常溫下攪拌反?yīng)24h，透析，凍干得到含二硫鍵和碳氮雙鍵的PzLLn-SS-NC-mPEG嵌段共聚物；(6)用四氫呋喃及去離子水溶解PzLLn-SS-NC-mPEG，得到PzLLn-SS-NC_mPEG油水混合液；用四氫呋喃溶解疏水藥物紫杉醇，得到疏水藥物油溶液；用去離子水溶解親水藥物吉西他濱鹽酸鹽，得到親水藥物水溶液；將疏水藥物油溶液與親水藥物水溶液分別加入到PZLLn-SS-NC-mPEG油水混合液中，攪拌5 8h，并移入透析袋進(jìn)行避光透析，多次換水除去四氫呋喃及未載入的親水藥物或疏水藥物，透析結(jié)束后，凍干形成藥物載體粉末制劑，即為雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑；其中，PzLLn-SS-NC-mPEG、疏水藥物及親水藥物的重量份之比為10: 3: 10 ;PzLLn-SS-NC-mPEG油水混合液中，PzLLn-SS-NC-mPEG、四氫呋喃及去離子水的重量份之比為10: 3: 30 ;疏水藥物油溶液中，疏水藥物與四氫呋喃的重量份之比為10: 3 ;親水藥物水溶液中，親水藥物與去離子水的重量份之比為10: 3。其中，步驟⑵、步驟(3)及步驟(4)中透析均在規(guī)格為MWCOlKDa的透析袋內(nèi)進(jìn)行；步驟(5)及步驟￠)中透析在規(guī)格為MWC03.5Kda的透析袋內(nèi)進(jìn)行。其中，MwCO即留在透析袋內(nèi)的生物大分子的最小分子量，Kda表示分子量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。步驟(5)中甲氧基聚乙二醇醒的分子量為2000。實施例7一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑，該載體制劑為具有疏水雙分子膜及親水內(nèi)腔的中空的納米球體狀囊泡；由雙敏感兩親性嵌段共聚物利用溶劑交換法通過疏水作用自組裝形成。疏水雙分子膜負(fù)載疏水藥物，親水內(nèi)腔負(fù)載親水藥物。雙敏感兩親性嵌段共聚物由還原敏感的二硫鍵及PH敏感的碳氮雙鍵橋連親水性聚乙二醇和疏水性芐氧羰基保護(hù)的聚賴氨酸而成；還原敏感為谷胱甘肽(GSH)敏感。還原敏感由二硫鍵實現(xiàn)，pH敏感由碳氮雙鍵實現(xiàn)。載體制劑的劑型為凍干粉針劑，載體制劑的粒徑范圍為100-500納米。一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑的制備方法，包括以下步驟:(I)Z-Lys NCA的制備:將三光氣(雙(三氯甲基)碳酸酯)溶于無水四氫呋喃(THF)中，然后在氬氣保護(hù)下逐滴加入到賴氨酸單體的無水四氫呋喃懸濁液中，攪拌加熱到50°C，待溶液澄清時停止反應(yīng)并自然冷卻，用體積比為5: I的正己烷/四氫呋喃重結(jié)晶2 3次，抽濾，常溫真空干燥，得到Z-Lys NCA粉末，其中，賴氨酸單體為芐氧羰基保護(hù)的賴氨酸；

(2)Z-Lys NCA的開環(huán)聚合:將乙胺鹽酸鹽和Z-Lys NCA按摩爾比為1: 10溶于無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氬氣保護(hù)下進(jìn)行開環(huán)聚合反應(yīng)，先冰浴下反應(yīng)5h，然后常溫下繼續(xù)反應(yīng)72h，透析，凍干得到PzLLn ；(3) PzLLn-SS-COOH的制備:將二硫代二丙酸、1-(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC -HC1)及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫下攪拌24h，得到反應(yīng)液，將溶解在無水N，N- 二甲基甲酰胺中的聚賴氨酸逐滴滴入上述反應(yīng)液中，常溫攪拌反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后，透析，凍干得到PzLLn-SS-COOH粉末，其中，聚賴氨酸、二硫代二丙酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽及N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1: 8: 11: 11 ; (4)PzLLn-SS-NH2 的制備:將 PzLLn-SS-C00H、1-(3- 二甲氛基丙基)_3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽及N-羥基琥珀酰亞胺溶于無水N，N- 二甲基甲酰胺中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫攪拌24h，得到反應(yīng)液，然后將上述反應(yīng)液逐滴滴入過量的乙二胺的無水N，N-二甲基甲酰胺溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫攪拌48h，反應(yīng)結(jié)束后，透析，凍干得到PzLLn-SS-NH2粉末，其中，PzLLn-SS-COOH, 1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺及乙二胺的摩爾比為1: 1.3: 1.3: 8 ;(5) PzLLn-SS-NC-mPEG的制備:將PzLLn-SS-NH2粉末和甲氧基聚乙二醇醛(mPEG-CHO)溶于無水N，N- 二甲基甲酰胺中，其中，PzLLn-SS-NH2和甲氧基聚乙二醇醛的摩爾比為1: 1.2，抽真空通氮?dú)猓叵聰嚢璺磻?yīng)24h，透析，凍干得到含二硫鍵和碳氮雙鍵的PzLLn-SS-NC-mPEG嵌段共聚物；(6)用四氫呋喃及去離子水溶解PzLLn-SS-NC-mPEG，得到PzLLn-SS-NC_mPEG油水混合液；用四氫呋喃溶解疏水藥物喜樹堿，得到疏水藥物油溶液；用去離子水溶解親水藥物吉西他濱鹽酸鹽，得到親水藥物水溶液；將疏水藥物油溶液與親水藥物水溶液分別加入到PZLLn-SS-NC-mPEG油水混合液中，攪拌5 8h，并移入透析袋進(jìn)行避光透析，多次換水除去四氫呋喃及未載入的親水藥物或疏水藥物，透析結(jié)束后，凍干形成藥物載體粉末制劑，即為雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑；其中，PzLLn-SS-NC-mPEG、疏水藥物及親水藥物的重量份之比為3: 10: 3 ;PzLLn-SS-NC-mPEG油水混合液中，PzLLn-SS-NC-mPEG、四氫呋喃及去離子水的重量份之比為3: 10: 20 ;疏水藥物油溶液中，疏水藥物與四氫呋喃的重量份之比為5: 2 ;親水藥物水溶液中，親水藥物與去離子水的重量份之比為5: 2。其中，步驟⑵、步驟(3)及步驟(4)中透析均在規(guī)格為MWCOlKDa的透析袋內(nèi)進(jìn)行；步驟(5)及步驟￠)中透析在規(guī)格為MWC03.5Kda的透析袋內(nèi)進(jìn)行。其中，MwCO即留在透析袋內(nèi)的生物大分子的最小分子量，Kda表示分子量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。步驟(5)中甲氧基聚乙二醇醒的分 子量為2000。
權(quán)利要求
1.一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑，其特征在于，該載體制劑為具有疏水雙分子膜及親水內(nèi)腔的中空的納米球體狀囊泡；由雙敏感兩親性嵌段共聚物利用溶劑交換法通過疏水作用自組裝形成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑，其特征在于，所述的疏水雙分子膜負(fù)載疏水藥物，所述的親水內(nèi)腔負(fù)載親水藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑，其特征在于，所述的雙敏感兩親性嵌段共聚物由還原敏感的二硫鍵及PH敏感的碳氮雙鍵橋連親水性聚乙二醇和疏水性芐氧羰基保護(hù)的聚賴氨酸而成；所述的還原敏感為谷胱甘肽敏感。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑，其特征在于，所述的載體制劑的劑型為凍干粉針劑，所述的載體制劑的粒徑范圍為100-500納米。
5.—種如權(quán)利要求I 4任一所述的雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)ε -節(jié)氧羰基保護(hù)賴氨酸的制備將三光氣溶于無水四氫呋喃中，然后在IS氣保護(hù)下逐滴加入到賴氨酸單體的無水四氫呋喃懸濁液中，攪拌加熱到50°C，待溶液澄清時停止反應(yīng)并自然冷卻，用體積比為5 I的正己烷/四氫呋喃重結(jié)晶2 3次，抽濾，常溫真空干燥，得到ε-芐氧羰基保護(hù)賴氨酸粉末； (2)聚賴氨酸的制備將乙胺鹽酸鹽和ε-芐氧羰基保護(hù)賴氨酸溶于無水N，N-二甲基甲酰胺中，在氬氣保護(hù)下進(jìn)行開環(huán)聚合反應(yīng)，先冰浴下反應(yīng)5h，然后常溫下繼續(xù)反應(yīng)72h，透析，凍干得到含η個鏈節(jié)的聚賴氨酸，其中η > I ; (3)含二硫鍵的端羧基聚賴氨酸的制備將二硫代二丙酸、I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽及N-羥基琥珀酰亞胺溶于無水N，N- 二甲基甲酰胺中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫下攪拌24h，得到反應(yīng)液，將溶解在無水N，N-二甲基甲酰胺中的聚賴氨酸逐滴滴入上述反應(yīng)液中，常溫攪拌反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后，透析，凍干得到含二硫鍵的端羧基聚賴氨酸粉末； (4)含二硫鍵的端氨基聚賴氨酸的制備將含二硫鍵的端羧基聚賴氨酸、I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽及N-羥基琥珀酰亞胺溶于無水N，N-二甲基甲酰胺中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫攪拌24h，得到反應(yīng)液，然后將上述反應(yīng)液逐滴滴入過量的乙二胺的無水N, N- 二甲基甲酰胺溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫攪拌48h，反應(yīng)結(jié)束后，透析，凍干得到含二硫鍵的端氨基聚賴氨酸粉末； (5)雙敏感兩親性嵌段共聚物的制備將含二硫鍵的端氨基聚賴氨酸粉末和甲氧基聚乙二醇醛溶于無水N，N- 二甲基甲酰胺中，抽真空通氮?dú)?，常溫下攪拌反?yīng)24h，透析，凍干得到含二硫鍵和碳氮雙鍵的雙敏感兩親性嵌段共聚物； (6)用四氫呋喃及去離子水溶解雙敏感兩親性嵌段共聚物，得到雙敏感兩親性嵌段共聚物油水混合液；用四氫呋喃溶解疏水藥物，得到疏水藥物油溶液；用去離子水溶解親水藥物，得到親水藥物水溶液；將疏水藥物油溶液與親水藥物水溶液分別加入到雙敏感兩親性嵌段共聚物油水混合液中，攪拌5 8h，并移入透析袋進(jìn)行避光透析，多次換水除去四氫呋喃及未載入的親水藥物或疏水藥物，透析結(jié)束后，凍干形成藥物載體粉末制劑，即為雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑的制備方法，其特征在于，步驟(I)中所述的賴氨酸單體為芐氧羰基保護(hù)的賴氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的乙胺鹽酸鹽和芐氧羰基保護(hù)賴氨酸的摩爾比為I : (5 15)； 步驟(3)中所述的聚賴氨酸、二硫代二丙酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽及N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為I : 8 (10 12) (10 12); 步驟(4)中所述的含二硫鍵的端羧基聚賴氨酸、I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺及乙二胺的摩爾比為I : (I. 2 I. 5) (I. 2 I. 5) 8； 步驟(5)中所述的含二硫鍵的端氨基聚賴氨酸和甲氧基聚乙二醇醛的摩爾比為1 1. 2 ； 步驟￠)中所述的雙敏感兩親性嵌段共聚物、疏水藥物及親水藥物的重量份之比為(3 10) (3 10) (3 10);所述的雙敏感兩親性嵌段共聚物油水混合液中，雙敏感兩親性嵌段共聚物、四氫呋喃及去離子水的重量份之比為(3 10) (3 10) (9 30);所述的疏水藥物油溶液中，疏水藥物與四氫呋喃的重量份之比為(3 10) (I 3);所述的親水藥物水溶液中，親水藥物與去離子水的重量份之比為(3 10) (I 3)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑的制備方法，其特征在于，步驟(2)、步驟(3)及步驟(4)中所述的透析均在規(guī)格為MWCOlKDa的透析袋內(nèi)進(jìn)行；步驟(5)及步驟￠)中所述的透析在規(guī)格為MWC03. 5Kda的透析袋內(nèi)進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑的制備方法，其特征在于，步驟(5)中所述的甲氧基聚乙二醇醛的分子量為2000。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑的制備方法，其特征在于，步驟￠)中所述的親水藥物選自阿霉素鹽酸鹽或吉西他濱鹽酸鹽，疏水藥物選自甲氨蝶呤、紫杉醇或喜樹堿。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙敏感可崩解式納米囊泡藥物載體制劑及其制備方法，該載體制劑為具有疏水雙分子膜及親水內(nèi)腔的中空的納米球體狀囊泡；疏水雙分子膜負(fù)載疏水藥物，親水內(nèi)腔負(fù)載親水藥物；該載體制劑由雙敏感兩親性嵌段共聚物利用溶劑交換法通過疏水作用自組裝形成，其中，雙敏感兩親性嵌段共聚物由還原敏感的二硫鍵及pH敏感的碳氮雙鍵橋連親水性聚乙二醇和疏水性芐氧羰基保護(hù)的聚賴氨酸而成；載體制劑可有效利用腫瘤細(xì)胞中的還原環(huán)境及酸性環(huán)境使得載體制劑崩解釋放藥物實現(xiàn)靶向釋藥，提高藥物生物利用度。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有高度的穩(wěn)定性、良好的生物相容性，還可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)化療中的耐藥性。
文檔編號A61K47/34GK103251561SQ20131018023
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月15日
發(fā)明者任天斌, 吳畏, 李永勇, 馬俊平, 朱海燕, 宋健 申請人:同濟(jì)大學(xué)