專利名稱：一種霉菌融合子用于添加中藥制曲的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種中藥制曲技術，特別涉及一種霉菌融合子用于添加到中藥制曲的方法；該方法是利用非對稱滅活技術構建霉菌融合子并將其用于添加到中藥制曲中，得到同時具有糖化酶活力、纖維素酶活力和中藥活性成分的藥曲，屬于輕工生物技術領域。
背景技術：
藥曲是釀造等行業(yè)的糖化發(fā)酵劑，傳統(tǒng)藥曲的制作方法類似于傳統(tǒng)釀酒大曲或釀酒小曲的生產方法。藥曲中的微生物來源于自然接種或原有曲粉傳種，通過微生物的自然發(fā)酵對制曲原料的原有特性會產生一定程度的轉化，而制備成的一類傳統(tǒng)中藥或藥食兩用的曲藥產品[中藥發(fā)酵的概況與關鍵技術.中國藥業(yè).2008,15(17): 15-17.]，但是，通過微生物育種技術獲得高性能純種藥曲未見報道。
常用的微生物育種技術主要有自然分離、誘變篩選、細胞結合、原生質體融合、基因導入以及基因破壞等方法。原生質體融合方法是指通過人為因素使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質體融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過程。對原生質體的融合技術，傳統(tǒng)方法多采用抗藥性標記或營養(yǎng)缺陷標記親本菌株，以便檢出融合子菌株，其工作相當繁瑣且工作量大[以抗生素抗性為選擇標記的毛殼菌種間原生質體融合.華東理工大學學報(自然科學版).2010,36 (I):36-41.J0因此，如能提供一種工藝更簡單、操作方便且易于實現(xiàn)霉菌融合子構建、并能將其用于添加到中藥制曲的方法中，這正是本發(fā)明的任務所在。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的正是為了克服現(xiàn)有技術中所存在的缺陷和不足，而提供一種霉菌融合子用于添加中藥制曲的方法，該方法是利用非對稱滅活技術構建霉菌融合子，再將該霉菌融合子用于添加到中藥制曲中，獲得同時具有糖化酶活力、纖維素酶活力和中藥活性成分的、且具有一定保健功能因子的融合子中藥曲。
本發(fā)明的基本思路是采用非對稱滅活技術，根據(jù)“致死損傷互補”原則，非對稱滅活使原生質體的部分細胞器特異性損傷，單獨培養(yǎng)不能再生，只有損傷部分發(fā)生互補修復才能再生，這就減少了工作量。采用非對稱滅活原生質體融合技術構建霉菌融合子，并將該霉菌融合子添加到中藥制曲中，制備成同時具有糖化酶活力、纖維素酶活力和中藥活性成分的中藥曲。該中藥曲對釀造過程中增強產品保健等功能、提高釀酒原材 料中纖維質利用率具有重大意義。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用由以下技術措施構成的技術方案來實現(xiàn)的。
本發(fā)明提供的一種霉菌融合子用于添加中藥制曲的方法，依次包括以下工藝步驟:
( I)菌絲體的培養(yǎng)及預處理
將兩親本白曲霉(ZZH)與綠色木霉(TV)分別轉接于培養(yǎng)基上，待其生長3(Γ48小時后，用無菌水制成107 109個/ml霉菌孢子菌懸液；在無菌條件下將300 μ L霉菌孢子菌懸液接種于液體培養(yǎng)基中，置于溫度3(T32°C，轉數(shù)為10(Tl20rpm的氣浴搖床中振蕩培養(yǎng)18 24小時，得菌絲球培養(yǎng)液；將菌絲球培養(yǎng)液經無菌擦鏡紙抽濾、無菌水漂洗去除培養(yǎng)基；再用0.9mol/L的氯化鈉滲穩(wěn)劑在4°C離心機中離心洗滌3次，每次5分鐘，即獲得預處理后的濕菌絲體；(2)原生質體的制備①將步驟(I)預處理后的濕菌絲體稱取0.5g置于50ml實驗瓶中，白曲霉按
0.5^1.0g/10ml的量加入復合酶液，于溫度3(T32°C、轉數(shù)8(Tl00rpm恒溫氣浴條件下進行酶解，酶解2 3小時后用無菌擦鏡紙過濾，濾液于250(T3000rpm離心10分鐘，之后用滲穩(wěn)劑離心洗滌3次，每次5分鐘，收集白曲霉(ZZH)原生質體并懸于滲穩(wěn)劑溶液中，得白曲霉原生質體懸浮液；②將步驟(I)預處理后的濕菌絲體稱取0.5g置于50ml實驗瓶中，綠色木霉按
1.(Tl.5g/10ml的量加入復合酶液，于溫度3(T35°C、轉數(shù)8(Tl00rpm恒溫氣浴條件下進行酶解，酶解3飛小時后用無菌擦鏡紙過濾，濾液于250(T3000rpm離心10分鐘，之后用滲穩(wěn)劑離心洗滌3次，每次5分鐘，收集綠色木霉(TV)原生質體并懸于滲穩(wěn)劑溶液中，得綠色木霉原生質體懸浮液；(3)原生質體非對稱滅活:①白曲霉(ZZH)熱滅活取步驟(2)中①白曲霉原生質體懸浮液Iml于EP管中，在6(T65°C恒溫水浴中滅活2(Γ30分鐘，然后立即放入冰浴中完全冷卻；②綠色木霉(TV)紫外滅活取步驟(2)中②綠色木霉原生質體懸浮液5ml置于帶磁力攪拌子的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于磁力攪拌臺上，于紫外燈下照射；(4)融合子構建:將兩親本滅活后的原生質體懸浮液在離心管中等量混合，然后加入配比為3(Γ50%的聚乙二醇，0.0lmol/L的氯化鈣和0.7^0.9mol/L氯化鈉融合劑，混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱中于3(T32°C培養(yǎng)3(Γ40分鐘，取出融合后原生質體懸浮液放入冷凍離心機中，用滲穩(wěn)劑離心洗滌3次，每次5分鐘；將洗滌完成的原生質體重懸于0.7 0.9mol/L的氯化鈉滲穩(wěn)劑中，得到融合后的原生質體；(5)融合子的篩選:①融合子初篩在無菌條件下將融合完成的原生質體懸浮液稀釋后涂布于淀粉再生平板中，于3(T32°C培養(yǎng)Γ3天，中間每隔12小時觀察一次，挑選出透明圈大的融合子菌株用平板劃線分離法純化，再將分離 純化后的融合子菌株接種于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，于3(T32°C培養(yǎng)2 3天，挑選出能夠生長的融合子(Z-TV)；②融合子復篩挑選多株上述初篩的融合子接種于羧甲基纖維素鈉液體培養(yǎng)基上，其中羧甲基纖維素鈉用淀粉取代，無菌條件下于3(T32°C培養(yǎng)2 3天后加入碘液，挑選出淀粉利用情況好的融合子(Z-TV)，再將其接入含有無菌濾紙條的無機鹽液體培養(yǎng)基中，于3(T32°C培養(yǎng)5 8天，再挑選出既能利用淀粉又能降解濾紙條的融合子，進行傳代培養(yǎng)；
( 6 )融合子用于添加中藥制曲:
將步驟(5)中得到傳代穩(wěn)定的融合子(Z-TV)進行擴大培養(yǎng)，再制成濃度為107 108 個/ml的融合子孢子懸浮液；制曲所用中藥粉碎后過40目篩子；制曲大米經除雜、淘洗后蒸煮40分鐘，將其攤涼后接入疒3% (v/w)的融合子孢子懸浮液和添加量為0.5 1% (w/w) 的中藥粉，在無菌條件下使中藥粉和融合子孢子懸浮液均勻分布于蒸米中；將蒸米堆積并加蓋八層紗布，在溫度36 38°C、濕度90 95%的條件下培養(yǎng)36 48小時，期間每隔12小時翻曲一次，再在溫度3(T32°C、濕度90 95%條件下堆積培養(yǎng)24 36小時，培養(yǎng)完成后將中藥曲攤平，在溫度40°C、濕度50%條件下干燥15小時，即制得融合子中藥曲。
上述技術方案中，所述白曲霉中加入的復合酶液為纖維素酶:蝸牛酶按7:3的比例混合溶于0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配成復合酶液，其濃度為10mg/ml ;以0.45 μ m濾膜過濾除菌后放置于4°C冰箱中備用。
上述技術方案中，所述綠色木霉中加入的復合酶液為溶壁酶:蝸牛酶按3:1比例混合溶于0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配成復合酶液，其濃度為20mg/ml ;以0.45 μ m 濾膜過濾除菌后放置于4°C冰箱中備用。
上述技術方案中，所述綠色木霉原生質體懸浮液的紫外滅活，其綠色木霉原生質體懸浮液液面距所用紫外燈垂直距離l(Tl3cm，紫外燈功率15W，其照射時間2 3分鐘。
本發(fā)明中所用的白曲霉，簡寫為ZZH。
本發(fā)明中所用的綠色木霉，簡寫為TV。
本發(fā)明通過非對稱滅活技術構建的霉菌融合子，簡寫為Z-TV。
本發(fā)明具有如下的特點及有益的技術效果:
1、本發(fā)明構建的霉菌融合子菌株同時具有糖化酶活力和纖維素酶活力，將它用于添加到中藥制曲中，不僅可以提高釀造原材料中糖的轉化率；而且制備的中藥曲同時具有糖化酶活力、纖維素酶活力和中藥活性成分。
2、本發(fā)明中霉菌融合子用于制曲后添加中藥材，可以使得到的中藥曲的糖化酶活力、液化酶活力有所提高。
3、使用本發(fā)明的霉菌融合子用于中藥曲釀造等行業(yè)，所制得產品中含有中藥材活性成分，使產品具有對人體健康有益的保健功能。


圖1本發(fā)明白曲霉(ZZH)、融合子(Z-TV)、綠色木霉(TV)分解淀粉對比情況；
圖2本發(fā)明白曲霉(ZZH)、融合子(Z-TV)、綠色木霉(TV)降解濾紙條對比情況。
具體實施方式
下面通過具體實 施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，有必要在此指出的是本發(fā)明實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，而不應理解為是對本發(fā)明保護范圍的任何限制， 該領域的技術熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內容對本發(fā)明作出一些非本質的改進和調難iF.0
實施例1
本實施例1中，所用培養(yǎng)基為PDA茄子瓶培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基為PDA液體培養(yǎng)基錐形瓶；實驗瓶為三角瓶；所用中藥為枸杞；本發(fā)明的實施例1根據(jù)上述所述工藝步驟進行，具體操作步驟依次如下:( I)菌絲體的培養(yǎng)及預處理:將兩親本白曲霉(ZZH)與綠色木霉(TV)分別轉接于PDA茄子瓶培養(yǎng)基上，待生長30小時后，用無菌水制成IO7個/ml霉菌孢子菌懸液；在無菌條件下將300 μ L霉菌孢子菌懸液接種于50ml PDA液體培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，置于溫度30°C、轉數(shù)IOOrpm氣浴搖床中振蕩培養(yǎng)18小時得菌絲球培養(yǎng)液；將菌絲球培養(yǎng)液經四層無菌擦鏡紙抽濾，無菌水漂洗3次去除培養(yǎng)基,再用0.9mol/L的氯化鈉滲穩(wěn)劑在4°C、3000rpm的冷凍離心機中離心洗漆3次，每次5分鐘，得預處理后濕菌絲體；(2)原生質體的制備:①將步驟(I)預處理后的濕菌絲體稱取0.5g置于已滅菌的50ml三角瓶中，白曲霉(ZZH)按0.5g/10ml的量加入纖維素酶:蝸牛酶按7:3混合溶于0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成的復合酶液中，復合酶液濃度為10mg/ml，以0.45 μ m濾膜過濾除菌后放置于4°C冰箱備用，再于30°C、轉數(shù)為SOrpm恒溫氣浴條件下進行酶解；酶解2小時后用4層無菌擦鏡紙過濾，濾液于2500rpm離心機中離心10分鐘，之后用滲穩(wěn)劑離心洗滌3次，每次5分鐘，收集白曲霉(ZZH)原生質體并懸于滲穩(wěn)劑溶液中，得白曲霉原生質體懸浮液；②將步驟(I)預處理后的濕菌絲體稱取0.5g置于已滅菌的50ml三角瓶中，綠色木霉(TV)按1.0g/10ml的量加入溶壁酶:蝸牛酶按3:1混合于0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成的復合酶液中，其濃度20mg/ml，以0.45 μ m濾膜過濾除菌后放置于4°C冰箱備用，于溫度30°C，轉數(shù)SOrpm恒溫氣浴條件下進行酶解；酶解3小時后用4層無菌擦鏡紙過濾，濾液于2500rpm離心10 分鐘，再用滲穩(wěn)劑離心洗滌3次，每次5分鐘，收集綠色木霉(TV)原生質體并懸于滲穩(wěn)劑溶液中，即得綠色木霉原生質體懸浮液；(3)原生質體的非對稱滅活:①白曲霉(ZZH)熱滅活取步驟(2)中白曲霉原生質體懸浮液Iml于2ml EP管中，在60°C恒溫水浴中滅活20分鐘，然后立即放入冰浴中冷卻；②綠色木霉(TV)紫外滅活取步驟(2)中綠色木霉原生質體懸浮液5ml移入直徑5cm的培養(yǎng)皿中，將帶磁力攪拌子的培養(yǎng)皿置于磁力攪拌臺上，于紫外燈下照射，綠色木霉原生質體懸浮液面距紫外燈垂直距離10cm，紫外燈功率15W，其照射時間2分鐘；(4)融合子構建:將兩親本滅活后的原生質體懸浮液在離心管中等量混合，然后加入配比為30%的聚乙二醇，0.0lmol/L的氯化鈣和0.7mol/L氯化鈉的融合劑，混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱中30 V培養(yǎng)40分鐘，取出融合后原生質體懸浮液放入冷凍離心機中，于4 °C冷凍離心機中4000rpm離心5分鐘，之后用滲穩(wěn)劑離心洗滌3次，每次5分鐘；將洗滌完成的原生質體重懸于0.7mol/L的氯化鈉滲穩(wěn)劑中，得到融合后的原生質體；(5)融合子的篩選:①融合子初篩
將融合完成后的懸浮液稀釋為IO4后涂布于淀粉再生平板中，30°C培養(yǎng)3天，中間每隔12小時觀察一次，挑選出透明圈大的融合子菌株用平板劃線分離法純化；再將分離純化后的融合子菌株用無菌牙簽垂直點種于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)3天，挑出能夠生長的融合子(Z-TV)；
②融合子復篩
挑選多株上述初篩的融合子，挑出的融合子接種于羧甲基纖維素鈉液體培養(yǎng)基， 其中羧甲基纖維素鈉用淀粉取代，無菌條件下30°C培養(yǎng)3天后加入碘液，觀察其中淀粉的利用情況；挑出淀粉利用情況較好的融合子，再將其接入無機鹽液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入無菌濾紙條，30°C培養(yǎng)8天觀察其對濾紙條的降解情況，挑選出既能利用淀粉又能降解濾紙條的融合子(Z-TV)。
表I是白曲霉(ZZH)、融合子(Z-TV)、綠色木霉(TV)分解淀粉的情況對比，通過顏色比對，表I中融合子(Z-TV)分解淀粉能力居于白曲霉(ZZH)和綠色木霉(TV)之間，為紫紅藍色。說明融合子(Z-TV)具有白曲霉(ZZH)降解淀粉的能力；圖2是白曲霉(ZZH)、融合子(Z-TV)、綠色木霉(TV)降解濾紙條所示圖，從圖2中可以看出，融合子(Z-TV)具有綠色木霉(TV)降解濾紙條的特性，說明融合子同時具有白曲霉產糖化酶和綠色木霉產纖維素酶的能力。
表I白曲霉(ZZH)、融合子(Z-TV)和綠色木霉(TV)分解淀粉對比
權利要求
1. 一種霉菌融合子的構建及其用于添加到中藥制曲的方法，其特征在于依次包括以下工藝步驟(1)菌絲體的培養(yǎng)及預處理將兩親本白曲霉與綠色木霉分別轉接于培養(yǎng)基上，待其生長3(Γ48小時后，用無菌水制成107 109個/ml霉菌孢子菌懸液；在無菌條件下將300 μ L霉菌孢子菌懸液接種于液體培養(yǎng)基中，于溫度3(T32°C，轉數(shù)10(Tl20rpm的氣浴搖床中振蕩培養(yǎng)18 24小時，得菌絲球培養(yǎng)液；將菌絲球培養(yǎng)液經無菌擦鏡紙抽濾、無菌水漂洗去除培養(yǎng)基；再用O. 9mol/L的氯化鈉滲穩(wěn)劑在離心機中離心洗滌3次，每次5分鐘，即得預處理后的濕菌絲體；(2)原生質體的制備①將步驟(I)預處理后的濕菌絲體稱取O.5g置于50ml實驗瓶中，白曲霉按·0.5^1. 0g/10ml的量加入復合酶液，于溫度3(T32°C、轉數(shù)8(Tl00rpm恒溫氣浴條件下進行酶解，酶解2 3小時后用無菌擦鏡紙過濾，濾液于250(T3000rpm離心10分鐘，之后用滲穩(wěn)劑離心洗滌3次，每次5分鐘，收集白曲霉原生質體并懸于滲穩(wěn)劑溶液中，得白曲霉原生質體懸浮液；②將步驟(I)預處理后的濕菌絲體稱取O.5g置于50ml實驗瓶中，綠色木霉按·1.(Tl. 5g/10ml的量加入復合酶液，于溫度3(T35°C、轉數(shù)8(Tl00rpm恒溫氣浴條件下進行酶解，酶解3飛小時后用無菌擦鏡紙過濾，濾液于250(T3000rpm離心10分鐘，之后用滲穩(wěn)劑離心洗滌3次，每次5分鐘，收集綠色木霉原生質體并懸于滲穩(wěn)劑溶液中，得綠色木霉原生質體懸浮液；(3)原生質體非對稱滅活①白曲霉熱滅活取步驟(2)中①白曲霉原生質體懸浮液Iml于EP管中，在6(T65°C恒溫水浴中滅活 2(Γ30分鐘，然后立即放入冰浴中完全冷卻；②綠色木霉紫外滅活取步驟(2)中②綠色木霉原生質體懸浮液5ml置于帶磁力攪拌子的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于磁力攪拌臺上，于紫外燈下照射；(4)融合子構建將兩親本滅活后的原生質體懸浮液在離心管中等量混合，然后加入配比為3(Γ50%的聚乙二醇，O. 01mol/L的氯化鈣和O. ·7^0. 9mol/L氯化鈉融合劑，混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱中于3(T32°C培養(yǎng)3(Γ40分鐘，取出融合后原生質體懸浮液放入冷凍離心機中，用滲穩(wěn)劑離心洗滌3次，每次5分鐘；將洗滌完成的原生質體重懸于O. 7 O. 9mol/L的氯化鈉滲穩(wěn)劑中，得到融合后的原生質體；(5)融合子的篩選①融合子初篩將融合完成后的懸浮液稀釋后涂布于淀粉再生平板中，于3(T32°C培養(yǎng)f 3天，中間每隔12小時觀察一次，挑選出透明圈大的融合子菌株用平板劃線分離法純化，再將分離純化后的融合子菌株接種于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，于3(T32°C培養(yǎng)2 3天，挑選出能夠生長的融合子；②融合子復篩挑選多株上述初篩的融合子接種于羧甲基纖維素鈉液體培養(yǎng)基上，其中羧甲基纖維素鈉用淀粉取代，無菌條件下于3(T32°C培養(yǎng)2 3天后加入碘液，挑選出淀粉利用情況好的融合子，再將其接入無機鹽液體培養(yǎng)基中，加入無菌濾紙條，于3(T32°C培養(yǎng)51天，再挑選出既能利用淀粉又能降解濾紙條的融合子，進行傳代培養(yǎng)； (6)融合子用于添加中藥制曲 將步驟(5)中得到傳代穩(wěn)定的融合子進行擴大培養(yǎng)，再制成濃度為IO7IO8個/ml的融合子孢子懸浮液；制曲所用中藥粉碎后過40目篩子；制曲大米經除雜、淘洗后蒸煮40分鐘，將其攤涼后接入疒3% (v/w)融合子孢子懸浮液和添加量為0.5 1% (w/w)的中藥粉，在無菌條件下使中藥粉和融合子孢子懸浮液均勻分布于蒸米中；將蒸米堆積并加蓋八層紗布，在溫度36 38°C、濕度90 95%的條件下培養(yǎng)36 48小時，期間每隔12小時翻曲一次，再在溫度3(T32°C、濕度90 95%條件下堆積培養(yǎng)24 36小時，培養(yǎng)完成后將中藥曲攤平，在溫度40°C、濕度50%條件下干燥15小時，即制得融合子中藥曲。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于所述白曲霉中加入的復合酶液為纖維素酶蝸牛酶按7:3的比例混合溶于O. 02mol/L磷酸鹽緩沖液中，配制成復合酶液，其濃度為10mg/ml ;以O. 45 μ m濾膜過濾除菌后置于4°C冰箱中備用。
3.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于所述綠色木霉中加入的復合酶液為溶菌酶蝸牛酶按3:1比例混合于O. 02mol/L磷酸鹽緩沖液中，配制成復合酶液，其濃度為20mg/ml ;以O. 45 μ m濾膜過濾除菌后置于4°C冰箱中備用。
4.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于所述綠色木霉原生質體懸浮液的紫外滅活，其綠色木霉原生質體懸浮液液面距所用紫外燈垂直距離l(Tl3cm，紫外燈功率15W，其照射時間2 3分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種霉菌融合子構建及其用于添加中藥制曲的方法，屬于輕工生物技術領域。該方法是利用白曲霉產糖化酶和綠色木霉產纖維素酶能力的差異，利用非對稱滅活親本及原生質體融合方式，使雙親本原生質體融合得融合子，將該融合子用于添加中藥制曲，得到同時具有糖化酶活力、纖維素酶活力和中藥活性成分的中曲藥。該方法包括菌絲體的培養(yǎng)與預處理、原生質體的制備、原生質體非對稱滅活、融合子構建、融合子篩選、中藥制曲等工藝步驟。本發(fā)明方法操作簡單，過程易于實現(xiàn)，得到的融合子中藥曲對后續(xù)的釀造原材料中纖維素成分的利用及產品保健功能的獲得具有重要的意義。
文檔編號A61K36/00GK103251656SQ20131017997
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月15日 優(yōu)先權日2013年5月15日
發(fā)明者張文學, 劉躍紅, 吳正云, 李麗, 鐘霞, 羅芳 申請人:四川大學