專利名稱：雞傳染性支氣管炎n-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雞傳染性支氣管炎納米活苗的制備方法。
背景技術(shù)：
傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染的病毒性疾病，以呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋率下降、腎臟病變等為特征。自1988年以來，在我國大部分地區(qū)相繼流行，發(fā)病率100%，死亡率10% 30%。由于集約化養(yǎng)殖對環(huán)境的污染和不斷出現(xiàn)新的病毒變異毒株，且常常是基因型表現(xiàn)不一和血清型變異交替或同時發(fā)生，組織嗜性也不斷變化，使IBV的免疫防控難度大，免疫失敗的現(xiàn)象時有發(fā)生。這兩種疫病嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。及時進行免疫接種是預(yù)防雞傳染性支氣管炎發(fā)生的重要以及主要措施。目前，對于雞傳染性支氣管炎的預(yù)防免疫接種，最常用的是傳統(tǒng)的滅活苗和弱毒苗。滅活苗起效慢，免疫保護期短，存在滅活不當(dāng)造成疾病傳播，且免疫途徑多為肌注，不能引起有效地粘膜免疫，影響免疫效果。弱毒苗的優(yōu)點在于活病毒感染刺激產(chǎn)生局部免疫，很快起到保護作用，且弱毒苗通常以感染雞胚尿囊液的凍干制品出售，較便宜，容易使用，適于大群體應(yīng)用。另外，粘膜免疫是近年來免疫學(xué)領(lǐng)域的前沿方向和研究熱點。因粘膜免疫系統(tǒng)覆蓋了機體呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道等400m2的粘膜表面，集中了一半以上的淋巴組織以及80%以上免疫細胞，因此在機體的免疫系統(tǒng)中占有非常重要的地位，且在粘膜病原體感染的早期預(yù)防和減輕后續(xù)病損中的作用更為關(guān)鍵。因此誘生高水平粘膜免疫應(yīng)答，在感染早期和初始部位徹底清除病原體，對于預(yù)防感染性疾病的發(fā)生具有十分重要的意義，而能否引起有效的粘膜免 疫反應(yīng)也應(yīng)成為評價疫苗免疫效果的一個重要指標。與滅活苗的肌肉注射的給藥方式相比，弱毒苗的口服或滴鼻的給藥途徑不僅可激發(fā)機體免疫系統(tǒng)在血清中產(chǎn)生抗體，而且能夠刺激機體產(chǎn)生粘膜免疫反應(yīng)；另外，與口服、鼻腔給藥相比，注射給藥方式也存在著不夠方便、組織刺激性、成本高等不足。但是，口服、鼻腔接種弱毒苗，雖然可以引起粘膜系統(tǒng)的免疫反應(yīng)，但也容易在胃腸道中被粘膜纖毛清除和破壞，與粘膜表面的作用時間較短，導(dǎo)致引起的免疫效果較差。因而，為了更好的達到免疫效果，弱毒苗也需要輔以合適的遞送系統(tǒng)。遞送系統(tǒng)的應(yīng)用一方面可以保護抗原免受粘膜系統(tǒng)對抗原結(jié)構(gòu)的破壞，使抗原更好的保有其免疫原性；另一方面，也可改變抗原與粘膜系統(tǒng)受體細胞的作用方式，延長作用時間，增強抗原提呈作用。而這些也是粘膜遞送系統(tǒng)的主要作用。目前，能達成這兩個主要目的的最成功的例子就是以納米粒或微球的方式。用于制備納米?；蛭⑶虻牟牧嫌泻芏喾N，包括，明膠、PLGA、PMA、殼聚糖及其衍生物等。殼聚糖因其無毒、良好的生物相容性和生物可降解性而被廣泛應(yīng)用，但是由于其弱的溶解性的限制(僅溶于pH小于6.5的溶液中，而在堿性和中性條件下溶解能力極差，也就是說在生理pH下，殼聚糖的溶解效果很差)，使其作為納米粒遞送系統(tǒng)的應(yīng)用有一定的局限性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法。本發(fā)明雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法按以下的實驗步驟實現(xiàn):一、取50 400 μ I IBV Η120系病毒液加入無菌去離子水補足至2mL，然后加入到5mL濃度為0.5 2.0mg/mL的過濾除菌后的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶液中，然后在室溫、無菌條件下以攪拌速度為300r/min的條件下攪拌5min,得到混合溶液A ；二、將混合溶液A在室溫、無菌條件下以900r/min 1300r/min速度攪拌Imin后，然后滴加2mL濃度為0.75 1. 75mg/mL的過濾除菌后的N，O-羧甲基殼聚糖溶液；然后在攪拌速度不變的條件下磁力攪拌20min 50min,得到混合溶液B ；三、將混合溶液B于4°C、12000r/min離心20min，去上清，并用溫度為4°C的無菌去離子水洗滌沉淀3遍，收集固相物；四、將固相物加入到4°C的無菌去離子水中，再加入質(zhì)量濃度為5%的蔗糖脫脂乳溶液，真空冷凍干燥24h，得到雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗，即完成雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法；其中步驟一中IBV H120系病毒液為經(jīng)過濃縮純化后的雞傳染性支氣管炎H120系病毒液，病毒含量為IO6 5EID5tlA).1mL;步驟四中4°C的無菌去離子水與質(zhì)量濃度為5%的蔗糖脫脂乳溶液的體積比為1:1。本發(fā)明采用殼聚糖的季銨鹽衍生物——N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖(N-2-HACC)和N，O-羧甲基殼聚糖(CMC)為載體，以雞傳染性支氣管炎弱毒活疫苗為控型藥物，制備雞傳染性支氣管炎活苗納米粒。與傳統(tǒng)疫苗相比，其優(yōu)勢在于穩(wěn)定性強、釋藥時間長；同時，在保證疫苗作用的前提下，減少了給藥劑量，減輕或避免了毒副反應(yīng)，延長了免疫保護期，避免多次反復(fù)給藥，且N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖在pH為I 14時都具有良好的溶解性，載體材料本身無毒并具有一定的抗菌效果，生物相容性好，可生物降解，可通過體內(nèi)的水解或酶解反應(yīng)，最終降解為水和CO2，被機體吸收或排出體外。本試驗制備的雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗可經(jīng)滴鼻和口服途徑提高機體免疫力，延長疫苗在雞體內(nèi)作用時間，減少免疫次數(shù)，同時N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖(N-2-HACC)在pHl 14時均有良好的溶解性，本發(fā)明制備的雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗可用于雞傳染性支氣管炎免疫，經(jīng)滴鼻給藥，IBV-N-2-HACC/CMC-NPs (500羽/瓶)，20倍稀釋，給藥量為每只雞 0.04mL。同時本發(fā)明的制備方法具有以下優(yōu)點:一、本發(fā)明所使用的N-2-HACC和CMC溶液均為過濾除菌后溶液，為后續(xù)的病毒檢測和實際應(yīng)用在源頭上減少了雜菌污染；二、加入一定量病毒液后用無菌水補足2mL,使得不同體積的病毒加入后不影響整個反應(yīng)體系,使條件的摸索更精確；三、N-2-HACC溶液與病毒液的混合速度為300r/min，時間為5min，速度不高是防止病毒在包封前產(chǎn)生損傷(如纖突的脫落)，影響免疫原性；時間長是為了使兩者混合更均勻，從而使制備的納米粒的粒徑更均一；四、混合完成后即升至攪拌速度，并于Imin后勻速緩慢滴加CMC溶液，并給與充分的反應(yīng)時間20_50min，從而形成更多、更均一的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs ;五、用預(yù)冷的(4°C )無菌去離子水洗滌沉淀，是為了防止在洗滌過程中部分病毒從納米粒中釋放，并且低溫的環(huán)境也有益于保持IBV的免疫原性；六、加入5%蔗糖脫脂乳可以更好的保護納米粒，防止其在真空冷凍干燥的過程中受到損傷。


圖1是試驗I制備的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的釋放曲線圖；圖2是試驗I制備的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的透射電鏡圖；圖3是試驗I制備的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的粒徑分布圖；圖4是試驗I制備的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的Zeta電位圖。
具體實施例方式具體實施方式
一:本實施方式雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法按以下的實驗步驟實現(xiàn):一、取50 400 μ I IBV Η120系病毒液加入無菌去離子水補足至2mL，然后加入到5mL濃度為0.5 2.0mg/mL的過濾除菌后的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶液中，然后在室溫、無菌條件下以攪拌速度為300r/min的條件下攪拌5min,得到混合溶液A ；二、將混合溶液A在室溫、無菌條件下以900r/min 1300r/min速度攪拌Imin后，然后滴加2mL濃度為0.75 1.75mg/mL的過濾除菌后的N，O-羧甲基殼聚糖溶液；然后在攪拌速度不變的條件下磁力攪拌20min 50min,得到混合溶液B ；三、將混合溶液B于4°C、12000r/min離心20min，去上清，并用溫度為4°C的無菌去離子水洗滌沉淀3遍，收集固相物；四、將固相物加入到4°C的無菌去離子水中，再加入質(zhì)量濃度為5%的蔗糖脫脂乳溶液，真空冷凍干燥24h，得到雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗，即完成雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法；其中步驟一中IBV H120系病毒液為經(jīng)過濃縮純化后的雞傳染性支氣管炎H120系病毒液，病毒含量為IO6 5EID5tlA).1mL;步驟四中4°C的無菌去離子水與質(zhì)量濃度為5%的蔗糖脫脂乳溶液的體積比為1:1。本實施方式中N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖，來自名稱為“N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖的合成及其負載新城疫減毒活疫苗納米粒的制備方法(申請?zhí)?201110333845.9，申請日:2011年10月28日)”的專利，所述N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖的合成方法按以下步驟實現(xiàn): 一、將50g脫乙酰度為85%的殼聚糖分散在200mL NaOH的異丁醇溶液中，在90 120°C下回流攪拌反應(yīng)lh，去除上清液后沉淀用去離子水洗至中性，然后分散在200mL NaOH的異丁醇溶液中，繼續(xù)回流攪拌反應(yīng)1.5 8h，去除上清液后沉淀用去離子水洗至中性，獲得脫乙酰處理的殼聚糖；二、將2 3g脫乙酰處理的殼聚糖溶于100 150mL體積濃度為I 3%乙酸溶液中，攪拌溶解，真空抽濾，濾去不溶物，獲得殼聚糖溶液，然后在500 1000r/min攪拌條件下逐滴加入濃度為0.1 2mol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)殼聚糖溶液pH值至8 9并有白色沉淀析出，浸泡8h后抽濾，去離子水洗至濾液呈中性，抽干水分，然后向濾餅中加入15 20mL異丙醇，攪拌30min后倒入三口燒瓶，完成殼聚糖的浸泡處理；三、在N2保護條件下，將步驟二中的三口燒瓶升溫至75 85°C，每隔2h逐滴加入2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨的異丙醇溶液，每次滴定時間30min，共滴加三次，反應(yīng)8 14h后將燒瓶冷卻至室溫，加入150 300mL冷藏處理的無水乙醇,浸泡0.5h后抽濾,冷凍干燥24h,完成殼聚糖與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨開環(huán)反應(yīng)，獲得粗制N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖；四、將粗制N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶于去離子水，應(yīng)用3G砂芯漏斗過濾后將濾液在5倍體積冷藏處理的丙酮中沉淀，然后真空抽濾，濾餅分散后冷凍干燥24h，即完成N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖的合成；其中步驟一中NaOH的異丁醇溶液中NaOH的質(zhì)量分數(shù)為15% 40%，異丁醇的量為每克殼聚糖加入10 30mL異丁醇；步驟三中2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨的異丙醇溶液中2，3_環(huán)氧丙基三甲基氯化銨與異丙醇溶液的質(zhì)量體積比為Ig: 2mL;步驟三中2，3_環(huán)氧丙基三甲基氯化銨的總加入量為2 27g;步驟四中粗制N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖與去離子水的質(zhì)量體積比為Ig: 25mL。本具體實施方式
采用殼聚糖的季銨鹽衍生物——N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖(N-2-HACC)和N，O-羧甲基殼聚糖(CMC)為載體，以雞傳染性支氣管炎弱毒活疫苗為控型藥物，制備傳染性支氣管炎納米活苗。與傳統(tǒng)疫苗相比，其優(yōu)勢在于穩(wěn)定性強、釋藥時間長；同時，在保證疫苗作用的前提下，減少了給藥劑量，減輕或避免了毒副反應(yīng)，延長了免疫保護期，避免多次反復(fù)給藥，且N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖在pH為I 14時都具有良好的溶解性，載體材料本身無毒并具有一定的抗菌效果，生物相容性好，可生物降解，可通過體內(nèi)的水解或酶解反應(yīng)，最 終降解為水和CO2，被機體吸收或排出體外。本試驗制備的雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗可經(jīng)滴鼻和口服途徑提高機體免疫力，延長疫苗在雞體內(nèi)作用時間，減少免疫次數(shù)，同時N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖(N-2-HACC)在pHl 14時均有良好的溶解性，本實施方式制備的雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗可用于雞傳染性支氣管炎免疫，經(jīng)滴鼻給藥，IBV-N-2-HACC/CMC-NPs (500羽/瓶)，20倍稀釋，給藥量為每只雞0.04mL。同時本具體實施方式
的制備方法具有以下優(yōu)點:一、本具體實施方式
所使用的N-2-HACC和CMC溶液均為過濾除菌后溶液，為后續(xù)的病毒檢測和實際應(yīng)用在源頭上減少了雜菌污染；二、加入一定量病毒液后用無菌水補足2mL，使得不同體積的病毒加入后不影響整個反應(yīng)體系，使條件的摸索更精確；三、N-2-HACC溶液與病毒液的混合速度為300r/min，時間為5min，速度不高是防止病毒在包封前產(chǎn)生損傷(如纖突的脫落)，影響免疫原性；時間長是為了使兩者混合更均勻，從而使制備的納米粒的粒徑更均一；四、混合完成后即升至攪拌速度，并于Imin后勻速緩慢滴加CMC溶液，并給與充分的反應(yīng)時間20_50min，從而形成更多、更均一的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs ;五、用預(yù)冷的(4°C )無菌去離子水洗滌沉淀，是為了防止在洗滌過程中部分病毒從納米粒中釋放，并且低溫的環(huán)境也有益于保持IBV的免疫原性；六、加入5%蔗糖脫脂乳可以更好的保護納米粒，防止其在真空冷凍干燥的過程中受到損傷。
具體實施方式
二:本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一和步驟二所述的過濾除菌的方法為:在無菌操作臺中通過0.22 μ m的細菌濾器進行過濾。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三:本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟一中所述的取200 μ I病毒液并加入無菌去離子水補足2mL,然后加入到5mL濃度為1.0mg/mL的過濾除菌后的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶液中。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四:本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是步驟二中所述的將混合溶液A在室溫、無菌條件下以1200r/min攪拌Imin后,然后滴加2mL濃度為0.8mg/mL的過濾除菌后的N，0-羧甲基殼聚糖溶液。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式
一至三之一相同。
具體實施方式
五:本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是步驟二中所述的N，O-羧甲基殼聚糖的合成方法按以下步驟實現(xiàn):—、將5g粉末狀殼聚糖置于250mL三口燒瓶中，加入40mL異丙醇并攪拌,浸泡l-12h后加入60mL濃度為10-40mol/L的NaOH溶液，攪勻后浸泡2 24h，得堿化殼聚糖；二、將20g氯乙酸水浴加熱溶于IOmL的異丙醇中，然后均勻分成五份，再依次在攪拌狀態(tài)下加入到堿化 殼聚糖中，每份間隔IOmin加入，然后在40 80°C下反應(yīng)2 8h，制得羧甲基殼聚糖混合物，然后加入20mL蒸餾水，用體積濃度為I %的鹽酸調(diào)pH至7.0，再用布氏漏斗抽濾，濾液中加入4倍量的無水乙醇充分沉淀,過濾,然后依次用體積濃度為95%的乙醇和無水乙醇洗滌，再置于30 60°C下真空干燥6 24h，得精制品，即完成N，O-羧甲基殼聚糖的合成。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
六:本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同的是步驟三中所述的攪拌時間是40min。他步驟和參數(shù)與具體實施方式
一至五之一相同。
具體實施方式
七:本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同的是步驟二中所述的過濾除菌后的羧甲基殼聚糖的滴加速度為0.007mL/s。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式
一至六之一相同。通過以下試驗驗證本發(fā)明的有益效果:試驗1、本試驗雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法，是通過以下步驟進行:一、取200μ1ΙΒν Η120系病毒液并加入無菌去離子水補足2mL，然后加入到5mL濃度為lmg/mL的過濾除菌后的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶液中，然后在室溫、無菌條件下以磁力攪拌器300r/min攪拌5min,得到混合溶液A ；二、將混合溶液A在室溫、無菌條件下以1200r/min攪拌Imin后,然后滴加2mL濃度為0.8mg/mL的過濾除菌后的N，O-羧甲基殼聚糖溶液；然后在攪拌速度不變的條件下磁力攪拌40min，得到混合溶液B ；三、將混合溶液B于4°C、12000r/min離心20min，去上清，并用溫度為4°C的無菌去離子水洗滌沉淀3遍，收集固相物；四、將固相物加入到4°C的無菌去離子水中，然后再加入5%蔗糖脫脂乳溶液，再真空冷凍干燥24h，得到雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗(IBV-N-2-HACC/CMC-NPs)，即完成雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法；其中步驟一中IBV H120系病毒液為經(jīng)過濃縮純化后的雞傳染性支氣管炎H120系病毒液，病毒含量為106_5EID5tlA).1mL ;步驟四中4°C的無菌去離子水與5%蔗糖脫脂乳溶液的體積比為1:1。本試驗的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖采用具體實施方式
一的方法制備，本實驗的N，O-羧甲基殼聚糖采用具體實施方式
五的方法制備本試驗制備所得IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的釋放曲線圖如圖1所示，可見在96h內(nèi)IBV-N-2-HACC/CMC-NPs病毒累積釋放量迅速提高，之后釋放逐漸平穩(wěn)；本試驗制備所得IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的透射電鏡圖如圖2所示，可見納米粒粒徑均勻、大小適宜、形狀圓整規(guī)則、分散性良好等優(yōu)點；本試驗制備的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的粒徑分布圖如圖3所示，可見粒徑分布均勻，尺寸適中，平均粒徑為122.4nm ；本試驗制備所得IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的Zeta電位圖如圖4所示，可見Zeta電位為正值，且電位值 較大為+53.2mV，制備的納米粒體系穩(wěn)定，有利于與細胞的接觸、結(jié)合。
權(quán)利要求
1.雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法，其特征在于雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法按以下的實驗步驟實現(xiàn): 一、取50 400μ I IBV Η120系病毒液加入無菌去離子水補足至2mL,然后加入到5mL濃度為0.5 2.0mg/mL的過濾除菌后的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶液中，然后在室溫、無菌條件下以攪拌速度為300r/min的條件下攪拌5min,得到混合溶液A ； 二、將混合溶液A在室溫、無菌條件下以900r/min 1300r/min速度攪拌Imin后,然后滴加2mL濃度為0.75 1.75mg/mL的過濾除菌后的N，O-羧甲基殼聚糖溶液；然后在攪拌速度不變的條件下磁力攪拌20min 50min,得到混合溶液B ； 三、將混合溶液B于4°C、12000r/min離心20min，去上清，并用溫度為4°C的無菌去離子水洗滌沉淀3遍，收集固相物； 四、將固相物加入到4°C的無菌去離子水中，再加入質(zhì)量濃度為5%的蔗糖脫脂乳溶液，真空冷凍干燥24h，得到雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗，即完成雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法；其 中步驟一中IBV H120系病毒液為經(jīng)過濃縮純化后的雞傳染性支氣管炎H120系病毒液，病毒含量為IO6 5EID5tlA).1mL;步驟四中4°C的無菌去離子水與質(zhì)量濃度為5%的蔗糖脫脂乳溶液的體積比為1:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗，其特征在于步驟一和步驟二所述的過濾除菌的方法為:在無菌操作臺中通過0.22 μ m的細菌濾器進行過濾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗，其特征在于步驟一中所述的取200 μ I病毒液并加入無菌去離子水補足至2mL，然后加入到5mL濃度為1.0mg/mL的過濾除菌后的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶液中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗，其特征在于步驟二中所述的將混合溶液A在室溫、無菌條件下以1200r/min攪拌Imin后,然后滴加2mL濃度為0.8mg/mL的過濾除菌后的N, O-羧甲基殼聚糖溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗，其特征在于步驟二中所述的N，O-羧甲基殼聚糖的合成方法按以下步驟實現(xiàn): 一、將5g粉末狀殼聚糖置于250mL三口燒瓶中，加入40mL異丙醇并攪拌，浸泡l_12h后加入60mL濃度為10-40mol/L的NaOH溶液，攪勻后浸泡2 24h，得堿化殼聚糖； 二、將20g氯乙酸水浴加熱溶于IOmL的異丙醇中，然后均勻分成五份，再依次在攪拌狀態(tài)下加入到堿化殼聚糖中，每份間隔IOmin加入，然后在40 80°C下反應(yīng)2 8h，制得羧甲基殼聚糖混合物，然后加入20mL蒸餾水，用體積濃度為I %的鹽酸調(diào)pH至7.0，再用布氏漏斗抽濾，濾液中加入4倍量的無水乙醇充分沉淀，過濾，然后依次用體積濃度為95%的乙醇和無水乙醇洗滌，再置于30 60°C下真空干燥6 24h，得精制品，即完成N，O-羧甲基殼聚糖的合成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗，其特征在于步驟二中所述的磁力攪拌時間是40min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗，其特征在于步驟二中所述的過濾除菌后的N，O-羧甲基殼聚糖的滴加速度為 0.007m L/s。
全文摘要
雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法，它涉及雞傳染性支氣管炎納米活苗的制備方法。本發(fā)明是要提供雞傳染性支氣管炎N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米活苗的制備方法，方法為一、取病毒液并加入到過濾除菌后的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶液中，攪拌得到混合溶液A；二、向混合溶液A中滴加過濾除菌后的羧甲基殼聚糖溶液得到混合溶液B；三、將混合溶液B離心然后用溫度為4℃的無菌去離子水洗滌沉淀3遍，收集固相物；四、將固相物加入到4℃的無菌去離子水中，然后再加入5％蔗糖脫脂乳溶液，再真空冷凍干燥，即完成。本發(fā)明應(yīng)用于獸藥領(lǐng)域。
文檔編號A61K47/36GK103212068SQ20131017228
公開日2013年7月24日 申請日期2013年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月10日
發(fā)明者趙凱 申請人:黑龍江大學(xué)