一種與人源tlr2特異性結(jié)合的多肽，其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與人源TLR2特異性結(jié)合的多肽，其制備方法和用途。具體而言，本發(fā)明的多肽其含有SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列，或者含有該序列并在其他位置出現(xiàn)氨基酸替換，缺失或添加，且能與TLR2特異性結(jié)合。本發(fā)明提供了這種多肽序列的制備方法。本發(fā)明提供了這類多肽在制備預(yù)防和治療TLR2相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的TLR2相關(guān)疾病選自自身免疫病、慢性炎性疾病、腫瘤。優(yōu)選的自身免疫病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；優(yōu)選的慢性炎性疾病選自慢性阻塞性肺炎。本發(fā)明還提供了穩(wěn)定表達(dá)TLR2的陽性細(xì)胞HEK293-TLR2/TLR1-luc，HEK293-TLR2/CD14-luc，HEK293-TLR2/TLR6-luc和本發(fā)明的多肽作為載體的應(yīng)用。
【專利說明】一種與人源TLR2特異性結(jié)合的多肽，其制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種能與人toll樣受體2 (TLR2)結(jié)合并且能激活其下游信號通路的 多肽，其制備方法和制藥用途，屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] Toll 樣受體 2 (TLR2)作為模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR) 中一類重要的受體，能特異地識別侵入體內(nèi)的微生物病原相關(guān)模式分子（PAMPs)和體內(nèi)的 危險信號相關(guān)模式分子（PAMPs)，激活固有免疫應(yīng)答，在免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用。TLR2主要 識別微生物細(xì)胞壁的組成成分如細(xì)菌的脂肽，脂蛋白和磷壁酸等。研究發(fā)現(xiàn)在識別受體的 過程中TLR2主要以與⑶14、TLR1或TLR6等輔助性受體形成異源二聚體的形式；當(dāng)特異性 配基與細(xì)胞膜表面的TLR2結(jié)合后，主要通過MyD88信號依賴性通路將信號傳至NF-κ B誘 導(dǎo)激酶（ inducing kinase，NIK)，NIK的活化導(dǎo)致ΝΗ-κΒ激活，XF-κΒ激活后即 可啟動細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α、IFN-y、IL-6等的合成釋放。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)TLR2 表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，多種腫瘤細(xì)胞表面均能檢測TLR2的表達(dá)，并且TLR2表達(dá) 量的高低與腫瘤的惡性程度成正相關(guān)，例如乳腺癌細(xì)胞表面均能檢測到TLR2表達(dá)，而轉(zhuǎn)移 能力高的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231表面TLR2表達(dá)量是低轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細(xì)胞MCF7的十倍。 同時TLR2也參與到其他疾病的發(fā)生發(fā)展，例如TLR2信號通路與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，I型糖尿 病，炎性腸炎，慢性阻塞性肺炎，缺血再灌注損傷，動脈粥樣硬化，紅斑狼瘡等多種自身免疫 病和慢性炎癥密切相關(guān)。激活TLR2信號通路，可以促進(jìn)下游細(xì)胞因子TNFa、IL-6、TGFi3 的釋放，細(xì)胞因子參與以上疾病的進(jìn)程。因此從新藥研發(fā)的角度來看，TLR2可以作為許多 疾病的表面標(biāo)志分子，靶向TLR2進(jìn)行藥物研發(fā)具有很好的前景。
[0003] 噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)是以以噬菌體展示技術(shù)（phage display)為基礎(chǔ)，通過基因 工程手段將外源多肽與噬菌體的次要外殼蛋白P III形成融合蛋白展示于噬菌體顆粒表面， 可保持相對獨(dú)立的空間構(gòu)象和生物活性，而不影響重組噬菌體對宿主菌的感染能力。與其 他基因表達(dá)系統(tǒng)相比較，噬菌體展示技術(shù)的最大特點(diǎn)就是它有效地將被展示多肽或蛋白質(zhì) 和基因偶聯(lián)起來，構(gòu)成一個實(shí)體，因而在得到某種多肽結(jié)構(gòu)的同時也就獲得了它的基因。噬 菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)是一項(xiàng)篩選并獲得與靶抗原特異性結(jié)合肽的強(qiáng)有力、高通量的新技術(shù)， 其篩選過程是一個親和純化（affinity purification)的生物淘選（biopanning)過程，具 體過程是：先將噬菌體肽庫與靶分子相互作用一段時間，洗滌除去非特異結(jié)合噬菌體，將特 異性結(jié)合噬菌體洗脫下來擴(kuò)增，然后再投入下一輪的淘選。繼續(xù)重復(fù)淘選、洗脫、擴(kuò)增，最終 淘選出與靶分子特異結(jié)合的重組噬菌體克隆?，F(xiàn)有噬菌體展示技術(shù)通常是對純化的蛋白進(jìn) 行篩選，得到與該靶蛋白特異性結(jié)合的寡肽或抗體，而對于細(xì)胞表面的受體而言，純化的相 應(yīng)蛋白會在空間結(jié)構(gòu)上發(fā)生改變，篩選出的寡肽或抗體在體內(nèi)的結(jié)合效應(yīng)降低，基于此本 發(fā)明直接利用一對差異表達(dá)某種受體的細(xì)胞作為篩選的抗原，其中以不表達(dá)某種受體的細(xì) 胞作為陰性細(xì)胞，通過陰性篩選去除肽庫中與陰性細(xì)胞表面相結(jié)合的噬菌體，剩余的噬菌 體再與表達(dá)相應(yīng)受體的陽性細(xì)胞相結(jié)合，通過陽性篩選得到與受體相結(jié)合的噬菌體，此方 法即為"體外快速差減篩選（BRASIL) "噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)，最終獲得與相應(yīng)受體特異性結(jié) 合的多肽。
[0004] 多肽D (klaklak)2是一段帶正電并且具有α螺旋結(jié)構(gòu)的14個氨基酸序列，能與 膜電位較高的細(xì)菌等原核微生物細(xì)胞膜相結(jié)合，提高細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，造成細(xì)胞內(nèi)基 質(zhì)外流，對細(xì)菌造成殺傷力；真核生物的細(xì)胞膜電位相比原核生物較低，多肽D (klaklak)2 不能與其結(jié)合，因此降低了對真核生物的毒性；而在真核生物細(xì)胞內(nèi)線粒體的膜結(jié)構(gòu)與原 核生物細(xì)胞膜相似，膜電位較高，因此D (klaklak)2可以與線粒體膜相結(jié)合，破壞線粒體膜 結(jié)構(gòu)，引起線粒體腫脹，造成細(xì)胞色素 C的釋放，進(jìn)而引發(fā)下游caspase家族蛋白合成，使真 核細(xì)胞進(jìn)入線粒體途徑的凋亡。研究報道將多肽D (klaklak) 2其上游連接靶向腫瘤細(xì)胞 的細(xì)胞穿膜肽，將其帶入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，可引發(fā)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行線粒體途徑的凋亡，因此此肽段 具有較高的新藥開發(fā)價值。
[0005] 本發(fā)明中使用的陰性細(xì)胞為細(xì)胞膜表面不表達(dá)TLR2受體的HEK293細(xì)胞系，陽性 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)TLR2及其輔助性受體CD14、TLR1或TLR6的HEK293細(xì)胞 系。同時又將TLR2信號通路的報告基因，即Ν? B熒光素酶報告基因也穩(wěn)定表達(dá)到以上 陰性和陽性細(xì)胞系中，作為驗(yàn)證所篩選出的多肽是否具有激活TLR2信號通路功能的細(xì)胞 平臺。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供了一種多肽，其含有SEQ ID Ν0 :1所不的氨基酸序列。 His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pr〇-Trp〇
[0007] 本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供了一種多肽，含有SEQ ID NO :1所述氨基酸序列并在 其他位置出現(xiàn)氨基酸替換，缺失或添加，且能與TLR2特異性結(jié)合。
[0008] 本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供了上述的多肽的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 4. 1經(jīng)過對陰性細(xì)胞和陽性細(xì)胞進(jìn)行有機(jī)溶劑法差異篩選，獲得能與陽性細(xì)胞選 擇性結(jié)合的重組噬菌體；
[0010] 4. 2噬菌體對陰性細(xì)胞，陽性細(xì)胞以及重組蛋白TLR2結(jié)合能力的測定；
[0011] 4. 3單克隆噬菌體的分離制備；
[0012] 4. 4喔囷體基因組單鏈DNA的提取和犾得募膚序列；
[0013] 4. 5固相多肽合成儀合成獲得寡肽序列；
[0014] 4. 6熒光標(biāo)記的寡肽序列對多種表達(dá)TLR2的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光法 測定。
[0015] 優(yōu)選的陰性細(xì)胞選自不表達(dá)TLR2的HEK293細(xì)胞，優(yōu)選的陽性細(xì)胞選自穩(wěn)定表達(dá) TLR2的HEK293細(xì)胞。所述的有機(jī)溶劑法差異篩選優(yōu)選是經(jīng)過四輪。
[0016] 本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供了上述多肽在制備預(yù)防和治療TLR2相關(guān)疾病的藥物 中的應(yīng)用。本發(fā)明的多肽能和TLR2特異性的結(jié)合，由于TLR2信號通路參與許多自身免疫 病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)及慢性炎癥疾病(例如慢性阻塞性肺炎）的發(fā)生及發(fā)展，激活TLR2 信號通路，促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子釋放可以抑制以上疾病的進(jìn)程，該多肽生物學(xué)功能在于激活 TLR2信號通路和促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子釋放，因此其適應(yīng)癥在于治療以上自身免疫病及慢性炎 癥疾病。所述的預(yù)防和治療TLR2相關(guān)疾病是通過激活TLR2信號通路，促進(jìn)下游細(xì)胞因子 的釋放實(shí)現(xiàn)的。優(yōu)選的TLR2相關(guān)疾病選自自身免疫病、慢性炎性疾病、腫瘤。優(yōu)選的自身 免疫病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；所述的慢性炎性疾病選自慢性阻塞性肺炎。
[0017] 本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供了穩(wěn)定表達(dá)TLR2的陽性細(xì)胞HEK293-TLR2/ TLRl-luc, HEK293-TLR2/CD14-luc, HEK293-TLR2/TLR6-luc。
[0018] 本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供了本發(fā)明的多肽作為載體的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供了一種物質(zhì)，這種物質(zhì)含有本發(fā)明的多肽和其他偶聯(lián) 物。本發(fā)明的多肽作為載體，能將其他偶聯(lián)物帶入表達(dá)TLR2的細(xì)胞。優(yōu)選的其他偶聯(lián)物可 以是各種治療劑，例如選自促進(jìn)凋亡的多肽。本發(fā)明的多肽和促進(jìn)凋亡的多肽偶聯(lián)后能制 備預(yù)防和治療腫瘤，尤其是通過靶向TLR2治療腫瘤。
[0020] 本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供了一種試劑盒，含有權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的多肽。 本發(fā)明的肽段可以偶聯(lián)于檢測的物質(zhì)。
[0021] 術(shù)語及簡稱
[0022] ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
[0023] Western Blot蛋白免疫印跡
[0024] Blascidin殺稻瘟毒素
[0025] Confocal激光免疫共聚焦
[0026] BSA牛血清白蛋白
[0027] FITC異硫氰酸熒光素，一種綠色熒光素。
[0028] DAPI4'，6_ 二脈基 _2_ 苯基卩引哚（4,，6-diamidino_2-phenylindole)，是一種能夠 與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，常用與熒光顯微鏡觀測。
[0029] Vigofect轉(zhuǎn)染試劑的名稱
[0030] Luc突光素酶luciferase的簡稱
[0031] MCF7 -種低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞的簡稱
[0032] MDA-MB-231 -種高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞的簡稱

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1 :構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TLR2及其輔助性受體的陽性細(xì)胞模型。A為Western Blot的 方法驗(yàn)證所構(gòu)建的陽性細(xì)胞系 HEK293-TLR2/CD14, HEK293-TLR2/TLR1，HEK293-TLR2/TLR6 中TLR2，CD14，TLR6的表達(dá)。B為細(xì)胞免疫熒光的方法驗(yàn)證陽性細(xì)胞系HEK293-TLR2/CD14， HEK293-TLR2/TLR1，HEK293-TLR2/TLR6 中 TLR2, CD14, TLR6 的表達(dá)。
[0034] 圖2 :構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TLR2信號通路NF-kB熒光素酶報告基因的細(xì)胞模型 HEK293-TLR2/CD14/luc，HEK293-TLR2/TLRl/luc，HEK293-TLR2/TLR6/luc，圖 2 為以上細(xì)胞 系加入相應(yīng)配基的量效曲線。
[0035] 圖3 :噬菌體ELISA驗(yàn)證所篩選出的噬菌體克隆與陽性細(xì)胞的結(jié)合。其中左圖為 陽性細(xì)胞ELISA的結(jié)果，右圖為TLR2重組蛋白ELISA的結(jié)果。
[0036] 圖4 :流式細(xì)胞術(shù)的方法驗(yàn)證所篩選肽段與陽性細(xì)胞的結(jié)合。從上往下依次為 FITC標(biāo)記的多肽與陰性細(xì)胞HEK293,陽性細(xì)胞HEK293-TLR2/TLR1，低表達(dá)TLR2的MCF7,高 表達(dá)TLR2的MDA-MB-231 (MM231)細(xì)胞的結(jié)合圖。
[0037] 圖5 :細(xì)胞免疫熒光法驗(yàn)所篩選證肽段與表達(dá)TLR2細(xì)胞的結(jié)合。圖5中第一排 為FITC標(biāo)記的多肽F10與陰性細(xì)胞HEK293的結(jié)合圖，第二排為與陽性細(xì)胞HEK293-TLR2/ TLR1的結(jié)合圖。
[0038] 圖6 :Confocal驗(yàn)證所篩選肽段時間依賴性進(jìn)入TLR2表達(dá)量不同的細(xì)胞。圖6第 一排為高表達(dá)TLR2的MDA-MB-231細(xì)胞，第二排為低表達(dá)TLR2的MCF7細(xì)胞。
[0039] 圖7 :熒光素酶活性檢測驗(yàn)證所篩選肽段對TLR2信號通路的激活效應(yīng)。其中 左圖為所篩選肽段對陰性細(xì)胞HEK293-1UC的激活效應(yīng)，右圖為所篩選肽段對陽性細(xì)胞 HEK293-TLR2/TLRl/luc 的激活效應(yīng)。
[0040] 圖8 :ELISA檢測驗(yàn)證所篩選肽段對TLR2信號通路下游細(xì)胞因子的激活效應(yīng)。以 多肽F10為例，其中A圖為陰性細(xì)胞HEK293和陽性細(xì)胞HEK293-TLR2/TLR1細(xì)胞經(jīng)所篩選 肽段刺激后培養(yǎng)基上清中細(xì)胞因子TNF a、IL-6的含量。B圖為MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞 經(jīng)所篩選肽段刺激后培養(yǎng)基上清中細(xì)胞因子TNFα、IL-6、TGFβ的含量。圖中 COn為空白 對照，Pam3為陽性對照Pam3csk4。
[0041] 圖9 :細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)檢測以所篩選肽段為基礎(chǔ)加上多肽D(klaklak)2后對乳腺癌 細(xì)胞MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞的毒性作用。
[0042] 圖10 :流式細(xì)胞術(shù)檢測以所篩選肽段為基礎(chǔ)加上多肽D (klaklak) 2后對乳腺癌細(xì) 胞MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞的促凋亡作用。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 以下通過SEQ ID N0 :1多肽篩選，鑒定及應(yīng)用優(yōu)選實(shí)施例并結(jié)合附圖具體說明本 發(fā)明的各個方面和特征。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，這些實(shí)施例只是用于說明目的，而不 限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍只受權(quán)利要求書的限制。在不背離權(quán)利要求書范圍 的條件下。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明的各個方面進(jìn)行各種修改和改進(jìn)，這些修改和 改進(jìn)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0044] 另外，需要注意的是，除非特別指明，下面實(shí)施例中所用的各種材料和試劑都是本 領(lǐng)域中常用的材料和試劑，可以通過常規(guī)的商業(yè)途徑獲得；所用方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員 公知的常規(guī)方法或按照廠商所建議的條件。
[0045] 實(shí)施例1構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TLR2及其輔助性受體CD14、TLR1或TLR6的陽性細(xì)胞。
[0046] 構(gòu)建方法如下：將TLR2及其輔助性受體CD14、TLR1或TLR6的表達(dá)質(zhì)粒 PUN0-TLR2/CD14，PUN0-TLR2/TLR1, PUN0-TLR2/TLR6 用威格拉斯轉(zhuǎn)染試劑 Vigofect 轉(zhuǎn)染到 HEK293中，轉(zhuǎn)染前24小時，接種適量HEK293細(xì)胞。至轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度以40-60%為宜。轉(zhuǎn) 染前1小時，更換新鮮的完全培養(yǎng)液，置37°C，5%C02培養(yǎng)。取5-8 μ g DNA加入稀釋液中至 總體積為100 μ 1，輕輕混勻，室溫放置。取VigoFect4 μ 1加入稀釋液中至總體積為100 μ 1， 輕輕混勻，室溫放置5分鐘。將稀釋的VigoFect逐滴加入稀釋的DNA溶液中，輕輕混勻，所 得的轉(zhuǎn)染工作液在室溫放置15分鐘。將轉(zhuǎn)染工作液輕輕混勻，逐滴加入5ml培養(yǎng)液中，輕 輕混勻培養(yǎng)液，置37°C，5%C02培養(yǎng)。48小時后，培養(yǎng)基中加入Blascidin抗生素，維持培養(yǎng) 兩到三周，有限稀釋法挑取單個細(xì)胞克隆。Western Blot和細(xì)胞免疫熒光的方法驗(yàn)證TLR2 及其輔助性受體CD14、TLR1或TLR6在HEK293的表達(dá)。所構(gòu)建細(xì)胞系分別為HEK293-TLR2/ TLR1，HEK293-TLR2/TLR6，HEK293-TLR2/CD14,結(jié)果見圖1，顯示所構(gòu)建的細(xì)胞系均成功表達(dá) 了 TLR2, TLR1，CD14 及 TLR6。
[0047] 實(shí)施例2構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TLR2信號通路NF-kB熒光素酶報告基因的細(xì)胞。
[0048] 在實(shí)施例 1 中 HEK293-TLR2/TLR1, HEK293-TLR2/TLR6，
[0049] HEK293-TLR2/CD14細(xì)胞的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染TLR2信號通路NF-kB熒光素酶報告基因 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24小時后培養(yǎng)基中加入抗生素 G418,篩選兩周后挑選單克隆，化學(xué)發(fā)光法驗(yàn)證 TLR2特異性配基對其信號通路的激活作用。所構(gòu)建細(xì)胞系分別為HEK293-TLR2/TLR1/1UC，
[0050] HEK293-TLR2/TLR6/luc，HEK293-TLR2/CD14/luc，分別加入不同濃度的特異性配 基刺激(橫坐標(biāo))，相應(yīng)激活信號通路值用熒光素酶百分比表示，繪制其量效曲線結(jié)果見圖 2 〇
[0051] 實(shí)施例3體外快速差減篩選法（BRASIL)四輪篩選獲得能與陽性細(xì)胞表面TLR2相 結(jié)合的重組噬菌體。
[0052] 1.主要試劑
[0053] 細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基頂DM，進(jìn)口胎牛血清FBS，消化用胰酶均購自美國Gibco公司。
[0054] 有機(jī)溶劑鄰苯二甲酸二甲酯、環(huán)己烷購自北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司，使用配比 為苯二甲酸二甲酯：環(huán)己烷(體積比）=9:1。
[0055] 疊氮鈉 NaN3購自百靈威科技公司。
[0056] 溶液 A 由 1%BSA，MEM 培養(yǎng)基，0· l%NaN3 組成。
[0057] 隨機(jī)7肽M13噬菌體展示文庫試劑盒購自NEB公司。
[0058] 2.篩選方法
[0059] 2. 1先進(jìn)行陰性篩選去除與之相結(jié)合的噬菌體，具體為將陰性細(xì)胞HEK293細(xì)胞 (1 X 108個）重懸到600ul溶液A中，2 X 1013噬菌體肽庫重懸在lml溶液A中，噬菌體及細(xì) 胞混合液加至抗原管中，4°C環(huán)境下旋轉(zhuǎn)過夜。
[0060] 2. 2次日將800ul噬菌體細(xì)胞混懸液加至等體積有機(jī)溶劑相之上，3000轉(zhuǎn)4°C離心 2分鐘，吸取上層水相中的噬菌體，與陽性細(xì)胞HEK293-TLR2/TLR1( 1 X 108個，重懸到600ul 溶液A)混合，4 °C旋轉(zhuǎn)過夜。
[0061] 2. 3次日將1. 5ml噬菌體細(xì)胞混懸液加至等體積有機(jī)溶劑相之上，3000轉(zhuǎn)4°C離心 2分鐘，輕輕棄去上層未結(jié)合的水相噬菌體，將沉淀下的細(xì)胞用200ul溶液A重懸。
[0062] 2. 4用反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，釋放與細(xì)胞表面結(jié)合的噬菌體。
[0063] 2. 5取50ul噬菌體裂解液，用瓊脂疊層法測定釋放出噬菌體的滴度。
[0064] 2. 6擴(kuò)增噬菌體宿主菌ER2738,37°C搖床擴(kuò)增至0D值為0. 5,將釋放出的噬菌體加 至菌液中進(jìn)行感染擴(kuò)增。
[0065] 2. 7擴(kuò)增后的噬菌體再與陰性細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)行下一輪篩選。一共經(jīng)過四輪富集篩 選，每一輪從陽性細(xì)胞表面洗脫下來的噬菌體量與加入噬菌體量的比值逐漸升高，實(shí)現(xiàn)了 特異性的富集，結(jié)果見表1。
[0066]

【權(quán)利要求】
1. 一種多肽，其特征在于，其含有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
2. -種多肽，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述氨基酸序列并在其他位置出現(xiàn)氨基酸 替換，缺失或添加，且能與TLR2特異性結(jié)合。
3. 權(quán)利要求1所述的多肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 4. 1經(jīng)過對陰性細(xì)胞和陽性細(xì)胞進(jìn)行有機(jī)溶劑法差異篩選，獲得能與陽性細(xì)胞選擇性 結(jié)合的重組噬菌體； 4. 2噬菌體對陰性細(xì)胞，陽性細(xì)胞以及重組蛋白TLR2結(jié)合能力的測定； 4. 3單克隆噬菌體的分離制備； 4. 4喔囷體基因組單鏈DNA的提取和犾得募膚序列； 4. 5固相多肽合成儀合成獲得寡肽序列； 4. 6熒光標(biāo)記的寡肽序列對多種表達(dá)TLR2的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光法測定。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的制備方法，，其特征在于，所述的陰性細(xì)胞選自不表達(dá)TLR2的 HEK293細(xì)胞，所述的陽性細(xì)胞選自穩(wěn)定表達(dá)TLR2的HEK293細(xì)胞。
5. 有機(jī)溶劑法差異篩選是經(jīng)過四輪。
6. 權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的多肽在制備預(yù)防和治療TLR2相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的應(yīng)用，其特征在于，所述的預(yù)防和治療TLR2相關(guān)疾病是通過激活 TLR2信號通路，促進(jìn)下游細(xì)胞因子的釋放。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6的應(yīng)用，其特征在于，所述的TLR2相關(guān)疾病選自自身免疫病、慢性炎 性疾病、腫瘤。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的應(yīng)用，其特征在于，所述的自身免疫病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；所述 的慢性炎性疾病選自慢性阻塞性肺炎。
10. 穩(wěn)定表達(dá) TLR2 的陽性細(xì)胞 HEK293-TLR2/TLRl-luc，HEK293-TLR2/CD14-luc， HEK293-TLR2/TLR6-luc。
11. 權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的多肽作為載體的應(yīng)用。
12. -種物質(zhì)，其特征在于，含有權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的多肽和其他偶聯(lián)物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的藥物，其特征在于，所述的其他偶聯(lián)物選自促進(jìn)凋亡的多肽。
14. 權(quán)利要求12的物質(zhì)在制備預(yù)防和治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
15. -種試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的多肽。
【文檔編號】A61K47/48GK104098648SQ201310113133
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月2日
【發(fā)明者】李珂, 呂曉希, 胡卓偉 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所