專(zhuān)利名稱(chēng)：用源自hiv-tat的多肽片段穩(wěn)定的肉毒桿菌毒素的組合物及其局部施用和透皮遞送的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的肉毒桿菌毒素組合物，其可以局部施用以用于多 種治療、美容和/或化妝目的，并且其用源自HIV-TAT的多肽片段穩(wěn)定。
背景技術(shù)：
皮膚保護(hù)身體器官免受外部環(huán)境的威脅，并起保持體溫的恒溫器 作用。其由幾個(gè)不同的層組成，每層都具有特定的功能。主要的層包 括表皮、真皮和皮下組織。表皮是覆蓋真皮的上皮細(xì)胞的分化層，真 皮由結(jié)締組織組成。表皮和真皮都受皮下組織的進(jìn)一步支持，皮下組 織是脂肪組織的內(nèi)層。
表皮，皮膚的最上層，僅僅為0. 1至1. 5毫米厚(Inlander, Skin， New York, NY: People's Medical Society, 1—7 (1998))。其由角質(zhì) 形成細(xì)胞組成，根據(jù)它們的的分化狀態(tài)，其被分成幾層?？梢赃M(jìn)一步 將表皮分成角質(zhì)層和有活力的表皮，該有活力的表皮由granular melphigian和基細(xì)胞組成。角質(zhì)層是吸濕性的，需要至少10%重量的 水分以保持其彈性和柔軟性。吸濕性部分歸于角蛋白的持水能力。當(dāng) 角質(zhì)層喪失其柔軟性和彈性時(shí)，其變得粗糙且脆，產(chǎn)生干燥皮膚。
真皮，其緊位于表皮之下，為1.5至4毫米厚。其是皮膚的三個(gè) 層中最厚的。另外，真皮還具有大部分皮膚結(jié)構(gòu)，包括汗腺和脂腺(其 通過(guò)皮膚中稱(chēng)為毛孔或痤瘡的孔分泌物質(zhì))、毛嚢、神經(jīng)末梢和血管及淋巴管(Inlander, Skin， New York, NY: People's Medical Society, 1-7 (1998))。然而，真皮的主要組分是膠原和彈性蛋白。
皮下組織是皮膚的最深層。其起用于身體熱量保存的絕緣體和用 于器官保護(hù)的減震器作用(Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, 1-7 (1998))。另外，皮下組織也貯藏用于能量?jī)?chǔ) 備的脂肪。皮膚的pH通常為5至6之間。該酸性是由于存在來(lái)自于皮 脂腺分泌物的兩性氨基酸、乳酸和脂肪酸。術(shù)語(yǔ)"酸外膜(acid mantle)"指在皮膚的大多數(shù)區(qū)域存在水溶性物質(zhì)。皮膚的緩沖能力部 分由于儲(chǔ)存在皮膚角質(zhì)層中的這些分泌物。
皺紋，年齡的指示特征之一，可能是由皮膚受環(huán)境損害而蓄積的 生物化學(xué)、組織學(xué)和生理學(xué)變化引起(Benedetto, International Journal of Dermatology, 38:641-655 (1999))。另外，存在可能引 起面部皺紋的皺褶、皺紋和皺痕(creases)的其他第二因子(Stegman 等人，The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery 第2版，St. Louis編著，M0: Mosby Year Book: 5-15 (1990))。這 些第二因子包括重力的持續(xù)牽拉、皮膚上經(jīng)常和持續(xù)的位置壓力(例 如，在睡眠期間)和由于面部肌肉收縮引起的反復(fù)面部運(yùn)動(dòng)(Stegman 等人.，The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 第 2版，St. Louis 編著，M0: Mosby Year Book: 5-15 (1990))。
為了可能緩和某些老化體征，已經(jīng)使用了不同的技術(shù)。這些技術(shù) 從包含a羥酸和視黃醇的面部增濕劑到外科手術(shù)方法和注射神經(jīng)毒 素。例如，在1986年，Jean和Alastair Carruthers, —對(duì)由眼整 形外科醫(yī)生和皮膚科醫(yī)生組成的夫妻團(tuán)隊(duì)，研究了一種使用A型肉毒 桿菌毒素治療眉間區(qū)域與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的皺紋的方法(Schantz和Scott， In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150 (1981))。在1992年，Carruthers'使用A 型肉毒桿菌毒素來(lái)治療皺紋引起該方法最初/^布(Schantz和Scott， In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum, New York:Academic Press, 143-150 (1981))。直到1994年，同一團(tuán)隊(duì)報(bào)道了 對(duì)于面部的其它運(yùn)動(dòng)相關(guān)的皺?quán)l(xiāng)丈的經(jīng)驗(yàn)(Scott， Ophthalmol, 87: 1044-1049 (1980))。這依次引起使用A型肉毒桿菌毒素進(jìn)行化妝處理 的時(shí)代的誕生。
有趣地，據(jù)認(rèn)為A型肉毒桿菌毒素是人類(lèi)所知最致命的天然生物 劑。肉毒桿菌(C. botulinuffl)的孢子可在土壤中找到，并可在不正 確地殺菌和密封的食物容器中生長(zhǎng)。攝入該細(xì)菌可導(dǎo)致肉毒中毒，其 可能是致命的。肉毒桿菌毒素通過(guò)阻止乙酰膽堿穿過(guò)神經(jīng)肌肉接點(diǎn)的 突觸傳遞或釋放而導(dǎo)致產(chǎn)生肌肉麻瘠，并且其被認(rèn)為也以其它方式起 作用。其作用主要是阻斷通常引起肌肉痙攣或收縮的信號(hào)，導(dǎo)致麻痹。 然而，已經(jīng)將肉毒桿菌毒素的肌肉-麻痹效應(yīng)用于治療功效。已經(jīng)使用 控制施用肉毒桿菌毒素來(lái)提供肌肉麻痹以治療病癥，例如以骨骼肌活 動(dòng)過(guò)度為特征的神經(jīng)肌肉失調(diào)。已經(jīng)用肉毒桿菌毒素治療的病癥包括 偏側(cè)面肌痙攣、成年人發(fā)病的痙攣性斜頸、肛裂、眼瞼痙攣、大腦性 癱瘓、頸張力障礙、偏頭痛、斜視、顳下頜關(guān)節(jié)障礙和各種類(lèi)型的肌 痛性痙攣和肌痙攣。近來(lái)，在治療和化妝性面部應(yīng)用中已經(jīng)利用肉毒
桿菌毒素的肌肉-麻痹效應(yīng)，所述應(yīng)用例如治療皺紋、皺眉線(xiàn)(frown lines)及其它面部肌肉痙攣或收縮的后果。
除了 A型肉毒桿菌毒素之外，存在七種其它的血清學(xué)不同形式的 肉毒桿菌毒素，其也由革蘭氏陽(yáng)性菌肉毒桿菌產(chǎn)生。在這八種血清學(xué) 不同類(lèi)型的肉毒桿菌毒素中，可引起麻痹的七種被稱(chēng)為肉毒桿菌毒素 血清型A、 B、 C (也稱(chēng)為d) 、 D、 E、 F和G。這些中的每種以用特定 類(lèi)型的抗體中和為特征。肉毒桿菌毒素蛋白分子的分子量，對(duì)于所有 七種這些活性肉毒桿菌毒素血清型，為約150kD。不同血清型的肉毒 桿菌毒素在動(dòng)物種類(lèi)方面不同，它們影響它們引起的麻痹的嚴(yán)重性和 持續(xù)時(shí)間。例如，已經(jīng)確定A型肉毒桿菌毒素的功效為B型肉毒桿菌 毒素的500倍以上，如通過(guò)在大鼠中產(chǎn)生的麻痹速率所測(cè)定。另外， 已經(jīng)確定B型肉毒桿菌毒素在靈長(zhǎng)類(lèi)中以480 U/kg的劑量是無(wú)毒的， 為A型的靈長(zhǎng)類(lèi)LDs。的約12倍。由于肉毒桿菌毒素的分子尺寸和分子當(dāng)由肉毒桿菌細(xì)菌釋放時(shí)，肉毒桿菌毒素為毒素復(fù)合物的組分，
所述毒素復(fù)合物包含約150kD的肉毒桿菌毒素蛋白分子和締合的非毒 素蛋白。這些內(nèi)源性的非毒素蛋白被認(rèn)為包括血凝素蛋白家族和非血 凝素蛋白家族。所述非毒素蛋白被認(rèn)為穩(wěn)定毒素復(fù)合物中的肉毒桿菌 毒素分子和保護(hù)它防止變性，例如，當(dāng)毒素復(fù)合物被攝取時(shí)被消化酸 變性。因此，所述毒素復(fù)合物的非毒素蛋白保護(hù)肉毒桿菌毒素的活性 和增加全身穿透，特別是當(dāng)經(jīng)由胃腸道施用所述毒素復(fù)合物時(shí)。更特 別地，據(jù)認(rèn)為某些非毒素蛋白特異性增加穿透胃腸上皮細(xì)胞，而其它 非毒素蛋白穩(wěn)定血液中的肉毒桿菌毒素分子。另外，非毒素蛋白在毒 素復(fù)合物中的存在通常引起毒素復(fù)合物具有比單純的肉毒桿菌毒素分 子更大的分子量，所述單純的肉毒桿菌毒素分子的分子量為約150 kD, 如之前指出的。例如，肉毒桿菌細(xì)菌可以產(chǎn)生A型肉毒桿菌毒素復(fù)合 物，其具有約900 kD、 500 kD或300 kD的分子量。有趣地，B型和C 型肉毒桿菌毒素顯然產(chǎn)生僅為700 kD或500 kD的復(fù)合物。D型肉毒 桿菌毒素產(chǎn)生300 kD和500 kD兩種復(fù)合物。E型和F型肉毒桿菌毒 素產(chǎn)生僅僅為約300 kD的復(fù)合物。
為了向肉毒桿菌毒素提供另外的穩(wěn)定性，通常通過(guò)在制備期間將 毒素復(fù)合物與外源性穩(wěn)定劑(例如明膠、多糖或最常見(jiàn)的另外的白蛋白) 組合來(lái)穩(wěn)定它們。所述穩(wěn)定劑在不同的環(huán)境中起結(jié)合和穩(wěn)定毒素復(fù)合 物的作用，所述環(huán)境包括與制備、運(yùn)輸、貯藏和給藥相關(guān)的那些。
通常，通過(guò)仔細(xì)地控制包含肉毒桿菌毒素復(fù)合物和白蛋白的組合 物的注射，給患者施用肉毒桿菌毒素，但是存在與該方法相關(guān)的一些 問(wèn)題。例如，因?yàn)樽⑸涞亩舅貜?fù)合物包含非毒素蛋白和白蛋白，這二 者穩(wěn)定肉毒桿菌毒素，且增加所述毒素復(fù)合物的分子量，所以該毒素 復(fù)合物在體內(nèi)具有長(zhǎng)半衰期，不易擴(kuò)散進(jìn)入組織，可能在患者中引起 不想要的抗原應(yīng)答。而且，因?yàn)樗龇嵌舅氐鞍缀桶椎鞍追€(wěn)定血液中 的肉毒桿菌毒素，所以必須仔細(xì)地進(jìn)行注射，以便他們不會(huì)將大量毒 素釋放到患者的血流中，導(dǎo)致致命的全身中毒。因此，通常必須由深入了解人體解剖學(xué)的受過(guò)高級(jí)訓(xùn)練的醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)人員精確地注射。
鑒于前述討論的所有問(wèn)題，非常期望提供一種不使用白蛋白的穩(wěn) 定肉毒桿菌毒素的方法。另外，也非常希望這樣的方法能降低肉毒桿 菌毒素的抗原性和血液穩(wěn)定性，同時(shí)增加肉毒桿菌毒素復(fù)合物在體內(nèi) 的擴(kuò)散速率，從而使得肉毒桿菌毒素更安全地用于各種治療、美容和/ 或化妝目的。還期望提供一種給藥方法，其不會(huì)決定性地依賴(lài)醫(yī)學(xué)專(zhuān) 業(yè)人士精確地注射肉毒桿菌毒素，以便實(shí)現(xiàn)毒素的安全施用。
發(fā)明概述
本發(fā)明的一個(gè)方面是認(rèn)識(shí)到，HIV-TAT的某些多肽片段、或源自 HIV-TAT片段的多肽片段可以添加到肉毒桿菌毒素復(fù)合物、尤其是減 少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物中，以穩(wěn)定它們。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方 案中，所述多肽片段具有與HIV-TAT的氨基酸殘基49-57 (RKKRRQRRR， SEQ ID NO. l)相對(duì)應(yīng)的序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽 片段具有與HIV-TAT的氨基酸殘基49-57的反向序列(RRRQRRKO，下 文稱(chēng)作SEQ ID NO. 2)相對(duì)應(yīng)的序列。另外，本發(fā)明也涉及在功能上 等價(jià)的SEQ ID NO l和2序列的多肽類(lèi)似物，例如其中已經(jīng)進(jìn)行保守 置換的情況。如在本申請(qǐng)中使用的，術(shù)語(yǔ)"HIV-TAT片段衍生物"包 含由SEQ ID NO, 2定義的反向的HIV-TAT多肽、以及其中已經(jīng)進(jìn)行保 守置換的SEQ ID NO 1或2的任何多肽類(lèi)似物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是認(rèn)識(shí)到，從肉毒桿菌細(xì)菌獲得的肉毒桿菌 毒素復(fù)合物中的內(nèi)源性非毒素蛋白(即無(wú)毒的血凝素和非血凝素蛋白) 會(huì)不希望地增加所述毒素復(fù)合物的穩(wěn)定性和毒性，同時(shí)不希望地降低 所述毒素?cái)U(kuò)散穿過(guò)皮膚上皮的能力。本發(fā)明進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，當(dāng)在常規(guī) 制備期間將外源性穩(wěn)定劑例如白蛋白結(jié)合到肉毒桿菌毒素時(shí)，會(huì)加強(qiáng) 這些作用。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是，提供肉毒桿菌毒素復(fù)合物， 其中血凝素、非毒素非血凝素和/或外源性白蛋白的量與常規(guī)市售可 得的肉毒桿菌毒素(例如B0T0X⑧或MYOBLOC⑧)相比選擇性地且獨(dú)立地 減少。這樣的肉毒桿菌毒素復(fù)合物下文稱(chēng)作"減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物"。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種組合物，其包含用具有與SEQ ID NO. 1或2相對(duì)應(yīng)的序列的多肽穩(wěn)定的肉毒桿菌毒素復(fù)合物(或減 少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物)。所述組合物任選地可包含加入的外源性穩(wěn) 定劑，例如白蛋白。
本文使用的術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定"是指HIV-TAT片段(例如，SEQIDNO. 1) 或HIV-TAT片段衍生物(例如，SEQ ID NO. 2)防止肉毒桿菌毒素變性 和保持毒素活性的能力，這可以通過(guò)SMPtide測(cè)定或Digital Abduction Scoring (DAS)測(cè)定來(lái)測(cè)量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明 的肉毒桿菌毒素組合物被充分穩(wěn)定，以在加工和患者給藥步驟中保留 基本上所有的生物學(xué)活性，所述步驟包括、但不限于，填充、凍干、 儲(chǔ)存和遞送重構(gòu)。
本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的方法，其中將本發(fā)明的穩(wěn)定 的肉毒桿菌復(fù)合物或穩(wěn)定的減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物施用給患者。 在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定的肉毒桿菌復(fù)合物或穩(wěn)定的減少的 肉毒桿菌毒素復(fù)合物以有效量局部地施用于需要這種處理的受試者或 患者的(優(yōu)選)皮膚。所述生物學(xué)效應(yīng)可以包括，例如，肌肉麻痹、 減少分泌過(guò)多或出汗、治療神經(jīng)性疼痛或偏頭痛、減少肌肉痙攣、預(yù) 防或減少痤瘡、減少或增加免疫應(yīng)答、減少皺紋或預(yù)防或治療各種其 它病癥。在其它實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定的肉毒桿菌毒素復(fù)合物或穩(wěn)定 的減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物通過(guò)腸胃外注射例如皮下注射來(lái)施用。
本發(fā)明還提供了試劑盒，其用于制備包含肉毒桿菌毒素復(fù)合物 (或減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物)和具有根據(jù)SEQ ID NO. 1或2的序列 的多肽的制劑，或可用于產(chǎn)生這種制劑的預(yù)混物。還提供了試劑盒， 其包含用于向受試者順次施用肉毒桿菌毒素復(fù)合物(或減少的肉毒桿 菌毒素復(fù)合物)和粘附分子的工具。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及新的組合物，其包含肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物，如本文所述，它們通過(guò)添加多肽而被穩(wěn)定，所述
多肽是HIV-TAT片段或HIV-TAT片段衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 所述起穩(wěn)定作用的多肽具有根據(jù)SEQ ID N0 1或2的序列，或可以通 過(guò)保守置換而與那些序列相關(guān)聯(lián)。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的 穩(wěn)定的肉毒桿菌毒素組合物能夠穿過(guò)皮膚上皮運(yùn)輸或遞送肉毒桿菌毒 素(也稱(chēng)作"透皮遞送，，)，且具有提高的穿透性、減少的抗原性和血 液穩(wěn)定性。如本文所述，本發(fā)明的組合物可以用作向受試者提供肉毒 桿菌毒素的局部施用劑，用于各種治療、美容和/或化妝目的。本發(fā) 明的組合物還具有比肉毒桿菌毒素的其它組合物和遞送方法更高的安 全特征。
本文使用的術(shù)語(yǔ)"肉毒桿菌毒素"指任一種已知類(lèi)型的肉毒桿菌 毒素(即，約150kD的肉毒桿菌毒素蛋白分子)，無(wú)論是由細(xì)菌生成的 還是通過(guò)重組技術(shù)生成的，和可能隨后發(fā)現(xiàn)的任何這樣的類(lèi)型，包括 新發(fā)現(xiàn)的血清型和工程改造的變體或融合蛋白。如上所述，目前已經(jīng) 表征了七種免疫上不同的肉毒桿菌神經(jīng)毒素，即肉毒桿菌神經(jīng)毒素血 清型A、 B、 C、 D、 E、 F和G,其各自以用特定類(lèi)型的抗體中和為特征。 所述肉毒桿菌毒素血清型為市售可得的，例如，得自 Sigma-Aldrich(St. Louis, M0)和Metabiologics, Inc. (Madison, Wiscons in)和其它來(lái)源。不同血清型的肉毒桿菌毒素隨動(dòng)物種類(lèi)而不 同，影響它們引起的麻痹的嚴(yán)重性和持續(xù)時(shí)間。至少兩種肉毒桿菌毒 素，A型和B型，是以用于治療某些病癥的制劑市售可得的。例如，A 型包含在具有商標(biāo)B0T0X⑧的Allergan制劑中和具有商標(biāo)DYSPORT 的Ipsen制劑中，B型包含在具有商標(biāo)MY0BL0C⑧的Elan制劑中。
在本發(fā)明的組合物中使用的術(shù)語(yǔ)"肉毒桿菌毒素"可以可選地指 肉毒桿菌毒素衍生物，即，具有肉毒桿菌毒素活性但相對(duì)于天然存在 的或重組的天然肉毒桿菌毒素在任何部分或任何鏈上包含有一個(gè)或多 個(gè)化學(xué)或功能改變的化合物。例如，所述肉毒桿菌毒素可以是修飾的 神經(jīng)毒素，即與天然的相比具有至少一個(gè)氨基酸被刪除、修飾或替換
的神經(jīng)毒素，或者所述修飾的神經(jīng)毒素可以是重組生成的神經(jīng)毒素或其衍生物或片段。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，肉毒桿菌
毒素衍生物是具有序列GDSCSVEAETAGK (SEQ ID NO. 3)的多肽。該序 列與A型肉毒桿菌毒素分子負(fù)責(zé)所述毒素在人體中的生物學(xué)活性的部
分相對(duì)應(yīng)。肉毒桿菌毒素也可以是已經(jīng)以一種方式修飾的毒素，所述 方式例如增加其性質(zhì)或減少不想要的副作用，但仍然保持希望的肉毒 桿菌毒素活性。所述肉毒桿菌毒素可以來(lái)自由細(xì)菌生成的任一種肉毒 桿菌毒素復(fù)合物，如上所述?？蛇x地，本發(fā)明所用的肉毒桿菌毒素可 以是使用重組或合成化學(xué)技術(shù)制備的毒素，例如重組肽、融合蛋白、 或雜種神經(jīng)毒素，例如從不同肉毒桿菌毒素血清型的亞基或域制備 (例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利6, 444, 209)。所述肉毒桿菌毒素也可以是整個(gè) 分子的一部分，其已經(jīng)顯示具有必需的肉毒桿菌毒素活性，并且在這 種情況下，可以單獨(dú)使用或作為組合或綴合分子例如融合蛋白的一部 分使用?；蛘撸鋈舛緱U菌毒素可以是肉毒桿菌毒素前體的形式， 其本身可以是無(wú)毒的，例如無(wú)毒的鋅蛋白酶，在蛋白酶剪切后其變成
有毒的。
本文使用的術(shù)語(yǔ)"肉毒桿菌毒素復(fù)合物"或"毒素復(fù)合物"是指 肉毒桿菌毒素(例如，屬于肉毒桿菌毒素血清型A-G的任一種的約150 kD肉毒桿菌毒素蛋白分子或SEQ ID NO. 3的肉毒桿菌毒素片段)連同 結(jié)合的內(nèi)源性非毒素蛋白(即，由肉毒桿菌細(xì)菌生成的血凝素蛋白和 非毒素非血凝素蛋白)一起。然而，應(yīng)當(dāng)注意，所述肉毒桿菌毒素復(fù) 合物不必作為一種單一毒素復(fù)合物來(lái)源于肉毒桿菌細(xì)菌。例如，可以 首先重組制備肉毒桿菌毒素或修飾的肉毒桿菌毒素，然后將其與非毒 素蛋白混合。重組的肉毒桿菌毒素還可以是購(gòu)買(mǎi)的(例如，購(gòu)自L(fǎng)ist Biological Laboratories, Campbell, CA)，然后將其與非毒素蛋白 混合。
本發(fā)明還涉及"減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物，，，其中所述肉毒桿 菌毒素復(fù)合物(包括含有肉毒桿菌毒素衍生物、例如SEQ ID NO. 3中 的多肽序列的那些)具有與在由肉毒桿菌細(xì)菌生成的肉毒桿菌毒素復(fù) 合物中天然發(fā)現(xiàn)的數(shù)量相比減少量的非毒素蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用任何常規(guī)蛋白分離方法，從來(lái)源于肉毒桿菌細(xì)菌的肉毒桿菌 毒素復(fù)合物中提取一部分血凝素蛋白或非毒素非血凝素蛋白，從而制 備減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物。例如，減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物可
以通過(guò)將其暴露在pH 7.3下的紅細(xì)胞以分離肉毒桿菌毒素復(fù)合物來(lái) 產(chǎn)生(例如參見(jiàn)EP 1514556 Al，其通過(guò)引用并入本文)?？梢允褂?HPLC、透析、柱、離心及其它方法來(lái)從蛋白中提取蛋白。或者，當(dāng)通 過(guò)混合合成產(chǎn)生的肉毒桿菌毒素與非毒素蛋白來(lái)產(chǎn)生減少的肉毒桿菌 毒素復(fù)合物時(shí)，人們可僅僅向該混合物中加入比天然存在的肉毒桿菌 毒素復(fù)合物中所含的更少的血凝素或非毒素非血凝素蛋白。根據(jù)本發(fā) 明，可以獨(dú)立地以任何量減少在減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物中的任何 非毒素蛋白(例如血凝素蛋白或非毒素非血凝素蛋白或兩者)。在某些 示例性的實(shí)施方案中， 一種或多種非毒素蛋白相對(duì)于在肉毒桿菌毒素 復(fù)合物中通常發(fā)現(xiàn)的量減少了至少約0.5%、 1%、 3%、 5%、 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%或90%。 MY0BL0C含有5000 U 的B型肉毒桿菌毒素/ml和0. 05%的人血清白蛋白、0. 01 M 丁二酸鈉 和0. 1 M氯化鈉。DYSPORT含有500 U的A型肉毒桿菌毒素-血凝素復(fù) 合物與125 meg的白蛋白和2. 4 mg的乳糖。在一個(gè)特別感興趣的實(shí)施 方案中，從所述肉毒桿菌毒素復(fù)合物中除去了基本上所有通常在來(lái)源 于肉毒桿菌細(xì)菌的肉毒桿菌毒素復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)的非毒素蛋白(例 如>95%的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白)。此外，盡管在某些情 況下可以以相同的數(shù)量減少內(nèi)源性非毒素蛋白的量，本發(fā)明還涉及以 不同的量減少每種內(nèi)源性非毒素蛋白，和減少至少 一種內(nèi)源性非毒素 蛋白，但不減少其它的。
除了 (或代替)減少使肉毒桿菌毒素復(fù)合物不穩(wěn)定的內(nèi)源性非毒素 蛋白的量之外，本發(fā)明還涉及減少通常在制備期間加入的外源性穩(wěn)定 劑的量。這種外源性穩(wěn)定劑的一個(gè)實(shí)例是白蛋白，其在制備肉毒桿菌 毒素復(fù)合物期間通常加入的量等于在天然存在的肉毒桿菌毒素復(fù)合物 的內(nèi)源性非毒素、非血凝素組分中發(fā)現(xiàn)的白蛋白量的1000倍。根據(jù)本 發(fā)明，加入的外源性白蛋白的量可以是少于常規(guī)千倍過(guò)量的外源性白
12蛋白的任何量。在本發(fā)明的某些示例性的實(shí)施方案中，加入僅僅約
500x、 400x、 300x、 200x、 100x、 50x、 10x、 5x、 lx、 0.5x、 0.lx或 0. Olx在天然存在的肉毒桿菌毒素復(fù)合物中的白蛋白的量。在一個(gè)實(shí) 施方案中，不向本發(fā)明的組合物加入作為穩(wěn)定劑的外源性白蛋白。在 其它實(shí)施方案中，將除了 (或代替)白蛋白之外的外源性穩(wěn)定劑加入本 發(fā)明的治療用局部組合物中。例如，本發(fā)明涉及的其它穩(wěn)定劑包括乳 糖、明膠和多糖。
盡管所述穩(wěn)定的肉毒桿菌毒素復(fù)合物或穩(wěn)定的減少的肉毒桿菌毒 素復(fù)合物可以從任一種肉毒桿菌毒素血清型(即，類(lèi)型A-G)得到或衍 生，但在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，它們從A型血清型肉毒桿菌毒素
得到或衍生。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肉毒桿菌毒素組合物通過(guò)添加非 天然多肽來(lái)穩(wěn)定，所述非天然多肽是HIV-TAT片段(例如，SEQIDNO. l)或源自.HIV-TAT片段(例如，SEQ ID. NO 2,它是SEQ ID NO. l多 肽的反向序列)。HIV-TAT片段或其衍生物可以與肉毒桿菌毒素分子 共價(jià)地或非共價(jià)地結(jié)合，以穩(wěn)定肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減少的肉毒桿 菌毒素復(fù)合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，HIV-TAT片段或其衍生物 與肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減少的肉毒桿菌復(fù)合物物理地結(jié)合，從而非 共價(jià)地使它們穩(wěn)定。HIV-TAT片段或其衍生物的相對(duì)量取決于希望的 穩(wěn)定程度。例如，當(dāng)起穩(wěn)定作用的HIV-TAT片段或其衍生物與SEQ ID NO. l或2的多肽相對(duì)應(yīng)時(shí)，起穩(wěn)定作用的肽的有用的濃度范圍是約 0. 1 ng-約1. 0 mg/單位的肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減少的肉毒桿菌毒素 復(fù)合物。更優(yōu)選地，SEQ ID NO. 1或2的起穩(wěn)定作用的肽的范圍可以 是約0. 1 mg - 0. 5 mg/單位的肉毒桿菌毒素。
可選地，使用本領(lǐng)域已知的連接化學(xué)，可以將起穩(wěn)定作用的 HIV-TAT片段或其衍生物共價(jià)連接至肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減少的肉 毒桿菌毒素復(fù)合物中的肉毒桿菌毒素分子。作為實(shí)例，通過(guò)偶聯(lián)劑或 綴合劑，可以實(shí)現(xiàn)2個(gè)組分的偶聯(lián)?？梢允褂枚喾N分子間交聯(lián)劑(參 見(jiàn)，例如，Means, G. E.和Feeney， R. E. ， Chemical Modificationof Proteins, Holden-Day， 1974， pp. 39-43)。這些試劑是，例如， J-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二疏)丙酸酯(SPDP)或N， N'-(l，3-亞苯 基)二馬來(lái)酰亞胺(二者都是對(duì)巰基高度特異性的，并形成不可逆連 接)；N， N'-亞乙基-二-(碘代乙酰胺)或具有6至11個(gè)碳亞甲基橋的 其它此類(lèi)試劑(它們對(duì)巰基是相對(duì)特異性的)；和1,5-二氟-2，4-二硝 基苯(它與氨基和酪氨酸基團(tuán)形成不可逆連接)。可用于該目的的其它 交聯(lián)劑包括p，p'二氟-m，m'-二硝基二苯基砜(它與氨基和和酚基形 成不可逆的交聯(lián))；二亞胺代己二酸二曱酯(它是氨基特異性的)； 苯酚-1，4-二磺酰氯(它主要與氨基反應(yīng))；六亞曱基二異氰酸酯或 二異硫代氰酸酯，或偶氮苯-對(duì)二異氰酸酯(它主要與氨基反應(yīng))；戊 二醛(它與幾種不同的側(cè)鏈反應(yīng))和disdiazobenzidine (它主要與酪 氨酸和組氨酸反應(yīng))。
交聯(lián)劑可以是同雙功能的，即具有2個(gè)經(jīng)歷相同反應(yīng)的官能團(tuán)。 優(yōu)選的同雙功能交聯(lián)劑是雙馬來(lái)酰亞胺基己烷("BMH" )。 BMH含有 2個(gè)馬來(lái)酰亞胺官能團(tuán)，它們?cè)跍睾蜅l件(pH 6. 5-7. 7)下與含有巰基 的化合物特異性地反應(yīng)，所述2個(gè)馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)由烴鏈連接。因 此，BMH可以用于不可逆地交聯(lián)含有半胱氨酸殘基的多肽。
交聯(lián)劑也可以是異雙功能的。異雙功能交聯(lián)劑具有2個(gè)不同的官 能團(tuán)，例如胺反應(yīng)性基團(tuán)和巰基反應(yīng)性基團(tuán)，它們分別交聯(lián)具有游離 胺基和巰基的2種蛋白。異雙功能交聯(lián)劑的實(shí)例是琥珀酰亞胺基 4-(N-馬來(lái)酰亞胺基曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯("SMCC")，間馬來(lái)酰 亞胺基苯曱?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯("MBS")，和琥珀酰亞胺 4-(對(duì)馬來(lái)酰亞胺基苯基)丁酸酯("SMPB" )， MBS的延伸的鏈類(lèi)似 物。這些交聯(lián)物的琥珀酰亞胺基與伯胺反應(yīng)，巰基反應(yīng)性馬來(lái)酰亞胺 與半胱氨酸殘基的巰基形成共價(jià)鍵。
交聯(lián)劑在水中的溶解度通常較低。可以將親水基團(tuán)例如磺酸酯基 團(tuán)添加到交聯(lián)劑上，以提高它的水溶解度?；腔?MBS和磺基-SMCC是 為水溶解度而改良的交聯(lián)劑的實(shí)例。
許多交聯(lián)劑產(chǎn)生在細(xì)胞條件下基本上不可切割的綴合物。但是，
14有些交聯(lián)劑含有在細(xì)胞條件下可切割的共價(jià)鍵，例如二疏化物，例
如，二硫雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)("DSP" )。 Traut氏試劑和N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯("SPDP")是眾所周知的 可切割的交聯(lián)物。可切割的交聯(lián)劑的應(yīng)用，允許在遞送進(jìn)粑區(qū)域后將 起穩(wěn)定作用的HIV-TAT片段或其衍生物與肉毒桿菌毒素分子分離。直 接的二硫鍵也可能是有用的。
有些新的交聯(lián)劑例如n-y-馬來(lái)酰亞胺基丁酰氧基-琥珀酰亞胺 酯("GMBS")和磺基-GMBS具有降低的免疫原性。在本發(fā)明的一些實(shí) 施方案中，這樣的降低的免疫原性可能是有利的。
許多交聯(lián)劑，包括上面討論的那些，可商業(yè)上得到。關(guān)于它們的 使用的詳細(xì)說(shuō)明，可以容易地從商業(yè)供應(yīng)商得到。關(guān)于蛋白交聯(lián)和綴 合物制備的一般參考文獻(xiàn)是S. S. Wong， Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991)。
化學(xué)交聯(lián)可以包括間隔臂的應(yīng)用。間隔臂提供分子內(nèi)柔性或調(diào)節(jié) 綴合的部分之間的分子內(nèi)距離，從而可以輔助保持生物學(xué)活性。間隔 臂可以是包含間隔氨基酸的多肽部分形式，可選地，間隔臂可以是交 聯(lián)劑的一部分，例如在"長(zhǎng)鏈SPDP" (Pierce Chem. Co. ， Rockford， Ill.， cat. No. 21651 H)中的間隔臂。
除了通過(guò)化學(xué)連接來(lái)生產(chǎn)穩(wěn)定的肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減少的肉 毒桿菌毒素復(fù)合物以外，本發(fā)明也涉及使用基因融合技術(shù)來(lái)生產(chǎn)這些 穩(wěn)定的毒素復(fù)合物。例如，使用眾所周知的基因工程技術(shù)，可以將編 碼融合的肉毒桿菌毒素/HIV-TAT片段或肉毒桿菌毒素/HIV-TAT片段 衍生物的核酸序列植入細(xì)胞，使細(xì)胞表達(dá)所述穩(wěn)定的毒素復(fù)合物。
在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將HIV-TAT片段或HIV-TAT 片段衍生物共價(jià)連接到肉毒桿菌毒素分子或其衍生物的末端，形成線(xiàn) 性分子。在這樣的實(shí)施方案中，經(jīng)常有利地在肉毒桿菌毒素(或其衍 生物)和HIV-TAT片段或HIV-TAT片段衍生物之間使用甘氨酸間隔物。 例如，當(dāng)肉毒桿菌毒素衍生物是根據(jù)SEQ IDN0. 3的多肽時(shí)，所述穩(wěn) 定的肉毒桿菌毒素可以具有形式RRRQRRKKR-GG-GDSCSVEAETAGK (SEQID NO. 4)。當(dāng)希望向毒素分子添加超過(guò)一個(gè)的起穩(wěn)定作用的多肽時(shí)， 所述穩(wěn)定的肉毒桿菌毒素可以具有形式RRRQRRKKR-GG-毒素氨基酸 -GG-RRRQRRKKR。但是，應(yīng)當(dāng)注意到，本發(fā)明也涉及HIV-TAT片段或 其衍生物的重復(fù)單元(例如，RRRQRRKKR RRRQRRKKR)用于穩(wěn)定的應(yīng) 用，無(wú)論是通過(guò)共價(jià)還是非共價(jià)連接。
穩(wěn)定肉毒桿菌毒素分子所需的起穩(wěn)定作用的多肽鏈(無(wú)論它們是 HIV-TAT片段還是其衍生物)的數(shù)目取決于多種因素，例如具體的目 標(biāo)血清型，和考慮的肉毒桿菌毒素或肉毒桿菌毒素片段或衍生物的大 小和化學(xué)組成。例如，當(dāng)使用肉毒桿菌毒素衍生物且其是相對(duì)較小的
多肽(例如，根據(jù)SEQ ID NO. 3的多肽)時(shí)，需要共價(jià)連接更少的起穩(wěn) 定作用的多肽鏈， 一個(gè)共價(jià)連接的起穩(wěn)定作用的多肽鏈(例如，SEQ ID NO l或2的多肽，或其衍生物)可能足夠某些應(yīng)用。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選地是用于需要特別治療的受試者或患者(即 人類(lèi)或其它哺乳動(dòng)物)的皮膚或上皮的產(chǎn)品形式。術(shù)語(yǔ)"需要"包括 藥物或健康相關(guān)的需要，例如治療涉及不希望的面部肌肉痙攣的病 癥，及化妝和主觀(guān)需要，例如，改變或改善面部組織的外觀(guān)。通常， 本發(fā)明的組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方式來(lái)施用，其非限制性 實(shí)例包括腸胃外注射(例如，皮下注射)，局部施用于皮膚上，或通過(guò) 位于皮下或皮上的貼劑。
SEQ ID NO. 1的HIV-TAT片段以前被認(rèn)為促進(jìn)不同"貨物分子" 的細(xì)胞內(nèi)遞送(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利No. 5, 804,604)。因而，當(dāng)已 經(jīng)用SEQ ID NO. 1的HIV-TAT片段穩(wěn)定的肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減少 的肉毒桿菌毒素復(fù)合物接觸患者組織時(shí)(例如，在局部給藥過(guò)程中)， 會(huì)發(fā)生肉毒桿菌毒素的增強(qiáng)的細(xì)胞穿透。另外，具有序列SEQ ID NO. 2的HIV-TAT衍生的多肽也促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)穿透以及跨膜穿透。因此，當(dāng) 已經(jīng)用SEQ ID NO. 2的多肽穩(wěn)定的肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減少的肉毒 桿菌毒素復(fù)合物接觸患者組織時(shí)，會(huì)發(fā)生肉毒桿菌毒素的增強(qiáng)的細(xì)胞 內(nèi)和/或跨膜運(yùn)輸。
通常，本發(fā)明的組合物通過(guò)混合所述穩(wěn)定的肉毒桿菌毒素復(fù)合物或穩(wěn)定的減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物與一種或多種附加的藥學(xué)可接受 的栽體或者賦形劑來(lái)制備。在它們的最簡(jiǎn)單的形式中，它們可包含單 一的水性藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑，例如緩沖鹽水。當(dāng)要注射施用 本發(fā)明的組合物時(shí)，這樣的實(shí)施方案是特別優(yōu)選的。然而，當(dāng)要局部 施用本發(fā)明的組合物時(shí)，它們可包含在局部藥用或化妝用組合物中常 見(jiàn)的其它成分，即，皮膚用或藥學(xué)可接受的載體、媒介物或介質(zhì)，即 與它們所要施用的組織相容的載體、媒介物或介質(zhì)。本文使用的術(shù)語(yǔ) "皮膚用或藥學(xué)可接受的"指如此描述的適于與這些組織接觸使用或 用于患者而沒(méi)有異常毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、變態(tài)反應(yīng)等的組分 或成分。視情況而定，本發(fā)明的組合物可包括通常在本領(lǐng)域，特別是 在化妝和皮膚病學(xué)中考慮使用的任何成分。
關(guān)于它們的形式，本發(fā)明的組合物可包括溶液劑、乳劑(包括微乳 劑)、混懸液、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、散劑或其它用于施用到皮膚及
的組合物除了包含肉毒桿菌毒素和HIV-TAT片段或其衍生物之外，可 包含通常在這樣的產(chǎn)品中使用的其它成分，例如抗微生物劑、增濕劑 和水化劑、滲透劑、防腐劑、乳化劑、天然油或合成油、溶劑、表面 活性劑、清潔劑、膠凝劑、潤(rùn)膚劑、抗氧化劑、芳香劑、填充劑、增 稠劑、蠟、去味劑、染料、著色劑、散劑、粘度調(diào)節(jié)劑和水，且任選 地包括麻醉藥、抗癢活性劑、植物提取物、調(diào)節(jié)劑、染黑或光亮劑、 閃光劑(glitter)、濕潤(rùn)劑、云母、礦物質(zhì)、多酚、硅酮或其衍生物、 防曬劑(sunblocks)、維生素和phytoraedicinals。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以是控釋或緩釋組合物的形式，其中所述 穩(wěn)定的肉毒桿菌毒素復(fù)合物或穩(wěn)定的減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物被封 裝或者另外包含在物質(zhì)內(nèi)，使得它們以受控的方式隨著時(shí)間推移釋放 在皮膚上?？梢詫⑺霭舛緱U菌毒素和HIV-TAT片段或其衍生物 的組合物包含在基質(zhì)、脂質(zhì)體、嚢泡、微膠嚢、微球等之內(nèi)，或者包 含在固體顆粒物質(zhì)之內(nèi)，所有這些選擇和/或構(gòu)建的物質(zhì)能釋放所述穩(wěn) 定的肉毒桿菌毒素一段時(shí)間?？梢砸援a(chǎn)生麻痹、產(chǎn)生松弛、緩解收縮、預(yù)防或緩解痙攣、減少 腺排出或其它預(yù)期效果的有效量，將肉毒桿菌毒素遞送至皮膚下的肌 肉或皮膚內(nèi)的腺結(jié)構(gòu)。相對(duì)于可注射的或可植入的物質(zhì)，用這種方式 局部遞送肉毒桿菌毒素可以提供減少的劑量、降低的毒性和得到用于 預(yù)期效果的更精確的劑量最佳化。
施用本發(fā)明的組合物以便施用有效量的肉毒桿菌毒素。本文使用 的術(shù)語(yǔ)"有效量"指如上定義的肉毒桿菌毒素的量，其足夠產(chǎn)生希望 的肌肉麻痹或其它生物學(xué)或美容效應(yīng)，但無(wú)疑是安全量，即，能避免 嚴(yán)重副作用的足夠低的量。預(yù)期效果包括松弛某些肌肉，其目的是例 如減少細(xì)紋線(xiàn)和/或皺紋的出現(xiàn)，特別是在臉上，或者以其它方式調(diào) 整面部外觀(guān)例如增寬眼睛、提升嘴角或使從上唇散開(kāi)的紋線(xiàn)平滑或一 般性緩解肌緊張。最后提及的功效， 一般性緩解肌緊張可以在面部或 其它地方實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的組合物可包含用作單劑量治療的適當(dāng)有效量 的肉毒桿菌毒素，或者可以是更濃縮的，用于在給藥部位稀釋或者用 于多種應(yīng)用。所述穩(wěn)定的肉毒桿菌毒素復(fù)合物或穩(wěn)定的減少的肉毒桿 菌毒素復(fù)合物可以透皮施用給受試者，以治療病癥例如不想要的面部 肌肉或其它肌痙攣、多汗、痤瘡或其中想要緩解肌肉疼痛或痙攣的體 內(nèi)其它地方的病癥。局部施用肉毒桿菌毒素，用于透皮遞送至肌肉或 其它皮膚相關(guān)結(jié)構(gòu)。可以施用至例如腿、肩部、背部(包括腰部)、腋 下、掌心、足部、頸、腹股溝、手背或足背、肘、上肢、膝、大腿、 臀、軀干、骨盆或其中希望施用肉毒桿菌毒素的身體的任何其它部 分。
也可以施用肉毒桿菌毒素以治療其它的病癥，包括但不限于治療 神經(jīng)性疼痛、預(yù)防或減輕偏頭痛或其它的頭痛、預(yù)防或減輕痤瘡、預(yù) 防或減輕張力障礙或張力障礙收縮(無(wú)論是主觀(guān)的或臨床的)、預(yù)防或 減輕與主觀(guān)或臨床上的多汗相關(guān)的癥狀、減少分泌過(guò)多或出汗、減少 或增加免疫應(yīng)答、或治療已經(jīng)建議或執(zhí)行通過(guò)注射施用肉毒桿菌毒素 的其它病癥。
最優(yōu)選地，由醫(yī)師或其它衛(wèi)生保健專(zhuān)業(yè)人員或在其指導(dǎo)下施用所述組合物。它們可以按單一的治療或在隨時(shí)間的 一 系列周期性治療中 施用。為了透皮遞送肉毒桿菌毒素用于上述的目的，局部施用如上所 述的組合物至其中希望該作用的部位的皮膚。因?yàn)槠湫再|(zhì)，最優(yōu)選應(yīng) 當(dāng)以一定的施用速率和施用頻率慎重地施用 一定量的所施用的肉毒桿 菌毒素，所述速率和頻率將產(chǎn)生希望的結(jié)果而不會(huì)引起任何不良的或 不希望的結(jié)果。因此，例如，本發(fā)明的局部組合物應(yīng)當(dāng)以如下速率施
用從約1 U至約20， 000 U，優(yōu)選從約1 U至約2, 000 U的肉毒桿菌 毒素/ci^的皮膚表面。例如，在這些范圍內(nèi)的較高劑量可以?xún)?yōu)選地與 控釋物質(zhì)組合，或在除去之前在皮膚上停留較短的時(shí)間。
本發(fā)明還包括用于遞送如上所述的包含肉毒桿菌毒素的組合物透 過(guò)皮膚的透皮遞送裝置。這樣的裝置可以象皮膚貼劑一樣結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單， 或者可以是更復(fù)雜的裝置，其包括用于施用和監(jiān)測(cè)組合物施用的工 具，和任選的用于從一個(gè)或多個(gè)方面監(jiān)測(cè)受試者病癥包括監(jiān)測(cè)受試者 對(duì)正在施用的物質(zhì)的反應(yīng)的工具。
本發(fā)明的組合物適用于pH為約4. 5至約6. 3的生理環(huán)境，因此， 其可具有這樣的pH。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以貯藏在室溫下或者冷凍 條件下。
應(yīng)當(dāng)理解，本文描述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅僅是用于闡述的目的， 根據(jù)它們的各種改良和變化將容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員提出，并且這 些改良和變化包括在本申請(qǐng)的精神和范圍及附加的權(quán)利要求的范圍 內(nèi)。將所有本文引用的出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)以其全文通過(guò)引用并
入本文用于所有的目的。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定肉毒桿菌毒素的方法，所述方法包括，提供肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物；提供一種多肽，其為HIV-TAT片段或HIV-TAT片段衍生物，和將所述肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物與所述多肽組合。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減 少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物共價(jià)連接至所述多肽。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減少的 肉毒桿菌毒素復(fù)合物被所述多肽非共價(jià)地穩(wěn)定。
4. 權(quán)利要求l的方法，其中所述HIV-TAT片段具有根據(jù)SEQ IDNO. 1的序列。
5. 權(quán)利要求l的方法，其中所述HIV-TAT片段具有根據(jù)SEQ ID NO. 2的序列。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中所述肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減少的 肉毒桿菌毒素復(fù)合物包含具有根據(jù)SEQ ID NO. 3的序列的多肽。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中所述減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物包 含與直接從肉毒桿菌中提取的肉毒桿菌毒素復(fù)合物中天然存在的量相 比減少量的血凝素蛋白或非毒素、非血凝素蛋白或兩者。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減 少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物含有白蛋白作為外源性穩(wěn)定劑。
9. 權(quán)利要求6的方法，其中所述白蛋白的存在量等于在天然存 在的肉毒桿菌毒素復(fù)合物中的白蛋白的量的約500、 400、 300、 200、 100、 50、 10、 5、 1、 0.5、 0. l或O. Ol倍。
10. 權(quán)利要求l的方法，其中所述肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減少的 肉毒桿菌毒素復(fù)合物包含選自下述的肉毒桿菌毒素肉毒桿菌毒素衍 生物、重組的肉毒桿菌毒素、修飾的肉毒桿菌毒素、A型肉毒桿菌毒 素、B型肉毒桿菌毒素、C型肉毒桿菌毒素、D型肉毒桿菌毒素、E型肉毒桿菌毒素、F型肉毒桿菌毒素和G型肉毒桿菌毒素。
11. 一種穩(wěn)定的肉毒桿菌毒素組合物，其中所述穩(wěn)定的肉毒桿菌 毒素包含肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合物；和 具有根據(jù)SEQIDNO. 2的序列的多肽。
12. 根據(jù)權(quán)利要求8的穩(wěn)定的肉毒桿菌毒素組合物，其中所述多 肽非共價(jià)地結(jié)合所述肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合 物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求8的穩(wěn)定的肉毒桿菌毒素組合物，其中所述多 肽共價(jià)地連接所述肉毒桿菌毒素復(fù)合物或減少的肉毒桿菌毒素復(fù)合 物。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用HIV-TAT片段或HIV-TAT片段的衍生物穩(wěn)定的新的肉毒桿菌毒素組合物。該組合物可以用于多種治療、美容和/或化妝目的。本發(fā)明還提供了使用HIV-TAT片段或HIV-TAT片段的衍生物穩(wěn)定肉毒桿菌毒素的方法。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101616682SQ200780048690
公開(kāi)日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2007年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者J·H·李, J·M·瓦烏戈 申請(qǐng)人:雷文斯治療公司