專利名稱：表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬制藥領(lǐng)域，涉及一種表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
癌癥是嚴(yán)重危害人類身體健康的頭號殺手之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年有1000萬癌癥患者，而死于癌癥的人數(shù)約600萬，占全球死亡人數(shù)的12% ;在我國，每年新增癌癥患者180萬，死亡140萬，平均每3分鐘就有1.3人死于癌癥，而且癌癥的發(fā)病率呈急劇上升趨勢?；熓侵委煱┌Y的重要方法之一，表柔比星是臨床上常用的一種廣譜抗腫瘤化療藥物，它是阿霉素的衍生物，其進(jìn)入體內(nèi)后能迅速透入腫瘤組織與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合、抑制核酸合成和有絲分裂，在S期和G2期有強(qiáng)大的細(xì)胞毒效應(yīng)，被廣泛用于乳腺癌、皮膚癌、卵巢癌、肺癌等的治療。而在實(shí)際的治療過程中，雖然表柔比星對腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷力，但它為細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥，對正常細(xì)胞也有較大殺傷力，在獲得治療效果的同時(shí)，不可避免地產(chǎn)生了嚴(yán)重的毒副作用，因此尋找表柔比星穩(wěn)定的載藥方式，使藥物只在腫瘤部位發(fā)生作用還有待進(jìn)一步研究。超順磁性氧化鐵納米粒(SuperparamagneticIron Oxide Nanoparticles,SP10N)為近年來國內(nèi)外靶向藥物和醫(yī)用納米材料領(lǐng)域研究的最新研究成果，它是指具有磁響應(yīng)性的納米級粒子，其直徑一般小于30 nm，它比細(xì)胞、病毒、蛋白質(zhì)、基因等的大小更小或者接近，這樣有利于它們之間發(fā)生相互作用，生物分子在其表面的覆蓋也更容易達(dá)到。SPION能在外加磁場作用下定向運(yùn)動(dòng),可以實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的定向富集，同時(shí)在交變磁場作用下，可以產(chǎn)生熱效應(yīng)，從而可以更好地控制藥物的靶向釋放，另外大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)證明SPION具有良好的生物兼容性，基于上述特點(diǎn)，SPION已成為最具有開發(fā)前景的給藥載體。綜上，如果能將表柔比星嫁接到超順磁性氧化鐵納米粒表面，就可以通過外磁場將表柔比星直接輸送到腫瘤發(fā)生部位，實(shí)現(xiàn)表`柔比星在腫瘤發(fā)生部位的定向富集，達(dá)到靶向治療的目的。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒，由以下重量配比的原料組成:
二氯化鐵(FeCl2 4H20):8 15%
三氯化鐵(FeCl3 6H20):25 35%
偏硅酸鈉(Na2SiO3 9H20):25 35%
碳二亞胺:2 7%
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl):1 5%
氮羥基琥珀酰亞胺(NHS):1 5%
表柔比星(Epirubicin, EPI):20 30%。
優(yōu)選的，一種表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒，由以下重量配比的原料組成:
二氯化鐵(FeCl2 4H20):10%
三氯化鐵(FeCl3 6H20):27%
偏硅酸鈉(Na2SiO3 9H20):28%
碳二亞胺:5%
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl):2%
氮羥基琥珀酰亞胺(NHS):2%
表柔比星(Epirubicin, EPI):26%。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒的制備方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn):
(1)按照上述重量配比分別稱取二氯化鐵(FeC12*4H20)、三氯化鐵(FeC13*6H20)和偏硅酸鈉(Na2Si03*9H20)，溶解在500ml純化水中，用10%的鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.5 2.0后轉(zhuǎn)入聚四氟乙烯內(nèi)襯高壓反應(yīng)釜中；
(2)在上述反應(yīng)釜中逐滴加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的氨水，至反應(yīng)液pH值為9 10，在反應(yīng)過程中持續(xù)通入氮?dú)?，控制溫度?5°C，并維持機(jī)械攪拌，維持反應(yīng)4-6小時(shí)，室溫離心3分鐘，8000rpm，分離沉淀物；
(3)步驟(2)所得的沉淀物，依次用純化水、75%乙醇(v/v)分別洗滌三遍后分散在pH為5.0的硼酸緩沖液，而后 在硼酸緩沖液中加入5mg碳二亞胺進(jìn)行烷化反應(yīng)，得超順磁性氧化鐵納米粒(SPION)溶液；
(4)在步驟(3)所得的超順磁性氧化鐵納米粒(SPION)溶液中，依次加入表柔比星、EDOHCl、NHS進(jìn)行酰胺化交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間48小時(shí)，反應(yīng)溫度25°C，離心，8000rpm，分離沉淀物并用截留分子量3000道爾頓的滲透膜透析法純化反應(yīng)產(chǎn)物，最終得到棕紅色混懸液，真空干燥后，得到表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒(Ep1-SPION)。本發(fā)明根據(jù)超順磁性納米粒在外加磁場的作用下定向富集的特性，實(shí)現(xiàn)表柔比星在腫瘤發(fā)生部位的定向富集的一種表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒及其制備方法。所制得的表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒(EP1-SP10N)具有良好的導(dǎo)電性和導(dǎo)磁性，在外加磁場的作用下能定向到達(dá)腫瘤病變部位，而不損傷正常的組織細(xì)胞，對腫瘤具有靶向治療的應(yīng)用價(jià)值；同時(shí)，本法制備原料簡單便宜、易于獲取，制備方法簡單，采用本法制得的表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒(EP1-SP10N)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，適合于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。


圖1是本發(fā)明所制得的EP1-SP10N在透射電鏡下的形態(tài)及粒徑大小。圖2是本發(fā)明所制得的EP1-SP10N在激光粒度分布儀中測定的粒徑大小分布圖。圖3是本發(fā)明所制得的EP1-SP10N和SPION的磁滯回線。圖4是本發(fā)明所制得的EP1-SP10N和SPION在200 800nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見吸收光譜掃描的圖譜。圖5是本發(fā)明所制得的EP1-SP10N和SPION在在4000 400cm 1范圍進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜掃描的圖譜。圖6是本發(fā)明所制得的EP1-SP10N和SPION在光學(xué)顯微鏡下觀察對WM266黑色素瘤細(xì)胞形態(tài)的影響。圖7是采用CCK8溶液檢測相同藥物濃度的EPI和EP1-SP10N對麗266黑色素瘤細(xì)胞存活率的結(jié)果。具體實(shí)施方法
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明所述的表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒及其制備方法進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例一:表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒及其制備方法
表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒(EP1-SP10N)由如下重量配比的原料制得:
二氯化鐵(FeCl2 4H20):10mg ；
三氯化鐵(FeCl3 6H20):27mg ；
偏硅酸鈉(Na2SiO3 9H20):28mg ；
碳二亞胺:5mg ；
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳 二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl):2mg ;
氮羥基琥珀酰亞胺(NHS):2mg ；
表柔比星(EPI):26mg ；
上述EP1-SP10N的制備方法依次包括下列步驟:
(1)按照上述重量配比分別稱取IOmg二氯化鐵(FeC12*4H20)、27mg三氯化鐵(FeC13*6H20)和28mg偏硅酸鈉(Na2Si03*9H20)溶解在500ml純化水中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.5 2.0后轉(zhuǎn)入聚四氟乙烯內(nèi)襯高壓反應(yīng)爸中；
(2)在上述反應(yīng)釜中逐滴加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的氨水，至反應(yīng)液pH值為9-10，在反應(yīng)過程中持續(xù)通入氮?dú)?，控制溫度?5°C，并維持機(jī)械攪拌，維持反應(yīng)4-6小時(shí)，離心，SOOOrpm分離沉淀物；
(3)步驟(2)所得的沉淀物，依次用純化水、75%乙醇分別洗滌三遍后分散在pH為5.0的硼酸緩沖液，而后在硼酸溶液中加入5mg碳二亞胺進(jìn)行烷化反應(yīng)(反應(yīng)條件)，即得超順磁性氧化鐵納米粒(SPION)溶液；
(4)在步驟(3)所得的超順磁性氧化鐵納米粒(SPION)溶液中，依次加入26mg表柔比星、2mg EDOHCl、2mg NHS進(jìn)行酰胺化交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間48小時(shí)，反應(yīng)溫度25°C，離心，SOOOrpm，分離沉淀物并用滲透膜截留分子量3000道爾頓的反應(yīng)產(chǎn)物，最終得到棕紅色Ep1-SPION混懸液，真空干燥后，得到表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒(Ep1-SPION)。實(shí)施例二:表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒的形態(tài)及粒徑測定
用透射電鏡專用的200目銅網(wǎng)支撐膜蘸取適量實(shí)施例一中所制得的Ep1-SPION混懸液，常溫干燥后置JEM-1200EX型透射電鏡下觀察納米粒的大小及形狀，結(jié)果參見圖1:Ep1-SPION納米粒的粒徑為8 10nm，顆粒規(guī)則，呈近似圓球形，分散性較好，未見有明顯團(tuán)聚現(xiàn)象發(fā)生；另取適量(約0.5ml)納米粒混懸液，超聲分散處理后稀釋至3 5倍，用Zetasizer Nano S90高靈敏納米粒度分析儀測定納米粒的粒徑大小及Zeta電位,測定結(jié)果參見圖2:EP1-SPION粒徑主要分布在28.lnm，呈正態(tài)分布，多分散系數(shù)0.181，表明制備得到的Ep1-SPION粒子大小均勻性良好。在pH為5.0的硼酸緩沖液中Zeta電位28.4mV,具有利于穩(wěn)定的荷電性質(zhì)。采用激光散射采用動(dòng)態(tài)激光散射法測得是水合動(dòng)力半徑，由于SPION經(jīng)表面修飾后具有較好的親水性，所以測得的結(jié)果要比TEM實(shí)際測得的粒徑大了 2 3倍。實(shí)施例三:表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒的磁力學(xué)性質(zhì)測定
取適量實(shí)施例一中所制得的Ep1-SPION混懸液(約lml)，采用Lake Shore 7303型振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)測試SPION磁性納米粒的磁性，計(jì)算其飽和磁化強(qiáng)度，測定溫度為300K，外磁場從 5000 5000 kA nT1,記錄磁滯的變化情況，以外加磁場的強(qiáng)度H (單位:kA nT1)為橫坐標(biāo)，以質(zhì)量磁化強(qiáng)度(單位:emu g_0為縱坐標(biāo)，繪制對應(yīng)的磁滯回線，結(jié)果參見圖3 =Ep1-SPION和SPION的磁滯回線均經(jīng)過原點(diǎn)，且以原點(diǎn)成中心對稱，證明了 Ep1-SPION和SPION的矯頑力幾乎為零，具有較好的超順磁性，未嫁接藥物SPION與嫁接表柔比星Ep1-SPION均具有較高的磁化強(qiáng)度，其飽和磁化強(qiáng)度分別為79.7和77.8emu/g，這個(gè)結(jié)果也表明SPION的超順磁的大小主要取決于Fe2O3的晶核大小，表面嫁接藥物對SPION的磁性性質(zhì)幾乎沒有影響。實(shí)施例四:表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒的結(jié)構(gòu)測定
為了驗(yàn)證表柔比星是否有效地嫁接于SPION表面，將所得Ep1-SPION混懸液及真空干燥后的磁流體粉末分別進(jìn)行紫外-可見光譜和紅外光譜測定，測定過程依次為:
(I)取用硼酸鹽緩沖液分散的EP1-SP10N、表柔比星及SPION適量，稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛?，?00 800nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見吸收光譜掃描并記錄圖譜，結(jié)果參見圖4，SPION在200 800nm無明顯吸收峰，表柔比星的吸收峰在488nm，嫁接藥物后的Ep1-SPION在521nm出現(xiàn)一個(gè)明顯的吸收峰，嫁接后出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，這主要由于藥物與SPION上的伯胺基共價(jià)鍵結(jié)合后其發(fā)光基團(tuán)共軛性質(zhì)發(fā)生改變有關(guān)。(2)取真空干燥的EP1-SP10N、表柔比星及SPION粉末適量，分散于溴化鉀的小片中，在4000 400cm 1范圍進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜掃描并記錄圖譜，結(jié)果參見圖5，SPION的紅外光譜中在2924CHT1附近出現(xiàn)的寬而強(qiáng)的吸收峰為羧基中O-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，表明了 SPION表面羧基修飾 的成功，2368CHT1的吸收表明S1-H鍵的伸縮振動(dòng)信號，605 cnT1出現(xiàn)了屬于鐵氧化物的品格振動(dòng)吸收峰信號，這些SPION的特征吸收峰在復(fù)合顆粒中也可明顯觀測到；在表柔比星的紅外光譜中，1690 cnT1左右信號代表共軛羰基的伸縮振動(dòng)，1622cm—1左右信號代表伯氨基的面內(nèi)彎曲振動(dòng)，1284cm^U202cm^\978cm^信號代表了苯環(huán)的面內(nèi)彎曲振動(dòng)，這些為表柔比星的特征峰，在復(fù)合顆粒的紅外譜中也可以明顯觀測到。綜上Ep1-SPION的紅外光譜是SPION和Epi的紅外譜的復(fù)合，可以判斷表柔比星成功嫁接到在SPION納米粒表面。實(shí)施例四:表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒對WM266黑色素瘤細(xì)胞的影響
1.儀器與試劑
高糖DMEM培養(yǎng)基、FBS、NEAA購自Invitrogen公司；小牛血清購自杭州四季青公司；二甲基亞砜(DMS0)、胰蛋白酶(trypsin)均購自Sigma公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(3111型)、層流超凈工作臺(1851型)為Thermo Electron公司；熒光倒置顯微鏡(DMIL型)為Nikon公司；普通光學(xué)顯微鏡(PM-10AD)為Olympus公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶為Corning公司；高速離心機(jī)(TDL-5)為上海安亭科學(xué)儀器廠；細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒(CCK8)為上海生工工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。WM266黑色素瘤細(xì)胞(來源這樣寫可以嗎？其實(shí)是同學(xué)帶回來的)為德國慕尼黑大學(xué)贈(zèng)送。
2.實(shí)驗(yàn)方法
采用常規(guī)方法復(fù)蘇WM266黑色素瘤細(xì)胞后，倒掉培養(yǎng)基，用PBS液沖洗細(xì)胞3次，加2mL EDTA和胰蛋白酶混合液(0.25%(w/v)胰蛋白酶-0.53 mmol/L EDTA)，消化至細(xì)胞分散，通常為5 15 min(為避免細(xì)胞團(tuán)塊形成，在消化時(shí)避免搖動(dòng)培養(yǎng)瓶；細(xì)胞若難以分散可放在37 °〇孵箱消化)；加6 8 mL完全培養(yǎng)基，吸出細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，800 1000 rpm離心5 min ;棄去上清液，用培養(yǎng)液混勻細(xì)胞，接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。放置于5% C02，37 V條件下培養(yǎng)，I 2天更換培養(yǎng)液或傳代。麗266細(xì)胞以每孔5 X 104個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板中。在37 °C、5% C02條件下培養(yǎng)24 h，棄去上清液，用PBS洗滌2遍，加入藥物濃度分別為5父10-6，5\10-7，5父10-8，5 X IO-9和5X 10_10 mol/L的EPI溶液和EP1-SP10N溶液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，
(I)光學(xué)顯微鏡下觀察EP1-SP10N的藥效；(2)每孔分別加入20 ULCCK8溶液，于37 °C，5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)I h。單細(xì)胞孔作為陰性對照組，培養(yǎng)基溶液孔作為空白對照，酶標(biāo)儀450 nm波長測定各孔吸光度，根據(jù)計(jì)算細(xì)胞存活率。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
參見圖6、圖7，WM266黑色素瘤細(xì)胞用5 (IO^6 mol/L EPI和EP1-SP10N處理24 h后，光學(xué)顯微鏡觀察其對細(xì)胞存活率的影響。從圖6的結(jié)果可以看出，單加SPION對麗266細(xì)胞生長基本沒有影響；加入EPI和EP1-SP10N后，能顯著抑制細(xì)胞生長并表現(xiàn)出細(xì)胞殺傷作用。結(jié)果提示當(dāng)EPI藥物接在SPION上時(shí)，并不影響其抑制腫瘤細(xì)胞生長藥效的發(fā)揮。圖7是CCK8檢測比較相同藥物濃度時(shí)EPI和EP1-SP10N藥效，結(jié)果顯示EPI和EP1-SP10N殺傷腫瘤細(xì)胞效果隨著濃度增加而增強(qiáng)。綜上所述僅為 本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用來限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。即凡依照本發(fā)明申請專利范圍的內(nèi)容所做的等效變化及修飾，皆應(yīng)屬于本發(fā)明的技術(shù)范疇。
權(quán)利要求
1.一種表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒，其特征在于，由以下重量配比的原料組成: 二氯化鐵:8 15% 三氯化鐵:25 35% 偏硅酸鈉:25 35% 碳二亞胺:2 7% 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽:1 5% 氮羥基琥珀酰亞胺:1 5% 表柔比星:20 30%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒，其特征在于，由以下重量配比的原料組成: 二氯化鐵:10% 三氯化鐵:27% 偏硅酸鈉:28% 碳二亞胺:5% 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽:2% 氮羥基琥珀酰亞胺:2% 表柔比星:26%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒的制備方法，其特征在于通過以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)分別稱取二氯化鐵、三氯化鐵和偏硅酸鈉，溶解在500ml純化水中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.5 2.0后轉(zhuǎn)入聚四氟乙烯內(nèi)襯高壓反應(yīng)釜中； (2)在上述反應(yīng)釜中逐滴加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的氨水，至反應(yīng)液pH值為9 10，在反應(yīng)過程中持續(xù)通入氮?dú)猓刂茰囟葹?0°C，并維持機(jī)械攪拌，維持反應(yīng)4-6小時(shí)，室溫離心3分鐘，8000rpm，分離沉淀物； (3)取步驟(2)所得的沉淀物，依次用純化水、體積比75%乙醇溶液分別洗滌三遍后分散在pH為5.0的硼酸緩沖液，而后在硼酸溶液中加入5mg碳二亞胺進(jìn)行烷化反應(yīng)，即得超順磁性氧化鐵納米粒溶液； (4)在步驟(3)所得的超順磁性氧化鐵納米粒溶液中，依次加入表柔比星、EDOHCUPNHS進(jìn)行酰胺化交聯(lián)反應(yīng)， 反應(yīng)時(shí)間48小時(shí)，反應(yīng)溫度25°C，8000rpm離心，分離沉淀物并用截留分子量3000道爾頓的滲透膜透析法純化反應(yīng)產(chǎn)物，最終得到棕紅色混懸液，真空干燥后，得到表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒。
全文摘要
本發(fā)明提供一種表柔比星超順磁性氧化鐵納米粒，由二氯化鐵、三氯化鐵、偏硅酸鈉、碳二亞胺、EDC HCl、氮羥基琥珀酰亞胺和表柔比星組成，以Fe3+、Fe2+、SiO32-為主要原料，通過化學(xué)共沉淀法制備SPION；并利用SPION表面存在羥基與硅烷偶聯(lián)劑發(fā)生硅烷反應(yīng)，引入活性基團(tuán)伯羰基；再利用胺基與羰基之間的親核反應(yīng)，將EPI嫁接至納米粒得到目標(biāo)產(chǎn)物Epi-SPION。本發(fā)明所制得的EPI-SPION具有良好的導(dǎo)電性和導(dǎo)磁性，在外加磁場的作用下能定向到達(dá)腫瘤病變部位，而不損傷正常的組織細(xì)胞，對腫瘤具有靶向治療的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號A61P35/00GK103181900SQ20131010798
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月30日
發(fā)明者盧曉陽, 饒躍峰, 洪東升 申請人:浙江大學(xué)