專利名稱：抗hiv劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合甘露糖的蛋白質(zhì)(MANNOSE BINDING PROTEIN，以下簡稱為“MBP”)的新用途，特別涉及MBP在由人免疫缺陷病毒(HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS，以下簡稱為“HIV”)引起的感染癥的治療時采用的抗HIV劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
MBP是被稱為結(jié)合甘露聚糖的蛋白質(zhì)、結(jié)合甘露聚糖的外源凝集素、結(jié)合甘露糖的外源凝集素等的物質(zhì)，是分子內(nèi)部具有膠原樣結(jié)構(gòu)及鈣要求性的糖識別區(qū)域的C型外源凝集素，即屬于膠原凝集素的物質(zhì)[Kozutsumi，Y.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，95，pp.658-664(1980)]。
參考圖4，MBP一般從其N末端側(cè)至C末端側(cè)(圖4的左端至右端)由N末端區(qū)域(富半胱氨酸區(qū)域)、膠原樣區(qū)域、頸區(qū)域及糖識別區(qū)域(CRD)這4個區(qū)域構(gòu)成。通過頸區(qū)域及膠原樣區(qū)域中的螺旋形結(jié)構(gòu)，每根約30kDa～約33kDa的3根多肽發(fā)生分子間結(jié)合，形成1個約90kDa～約99kDa的亞單位結(jié)構(gòu)(3倍體)。然后，2～6個該亞單位結(jié)構(gòu)又結(jié)合成花束樣，形成同型低聚物。
從關(guān)于MBP的目前為止的基礎(chǔ)研究看，對于進入生物體內(nèi)的微生物，MBP與該微生物表面的糖鏈結(jié)合，使補體系活化，暗示其與微生物感染的初期防御有關(guān)[Holmskov，U.等，Immunol.Today，15，pp.67-74(1994)及Turner，M.W.等，Immunol.Today，17，pp.532-540(1996)]。此外，目前有MBP缺少者容易引發(fā)感染癥[Summerfield，J.A.等，Lancet，345，pp.886-889(1995)]、動脈硬化性動脈粥樣硬化患者中MBP缺少者居多[Madsen，H.O.等.，Lancet，352，pp.959-960(1998)]、MBP基因變異易引發(fā)重癥瘧疾[Luty，A.J.等，J.Infect.Dis.，178，pp.1221-1224(1998)]，MBP基因變異使囊性纖維癥中的肺感染癥加重[Garred，P.等，J.Clin.Invest.，104，pp.431-437(1999)]等報道。
此外，作為對MBP的治療藥物用途的探討，有給MBP缺少者服用MBP，使補體依賴性的調(diào)理活性正常化，從而改善易感染性的報道[Valdimarsson，H.等，Scand.J.Immunol.，48，pp.116-123(1998)]。此外，有給囊性纖維癥患者服用MBP，使患者的臨床癥狀穩(wěn)定化的報道[Garred，P.等，Pediatr.Pulmonol.，33(3)，pp.201-207(2002)]。
但是，HIV感染者的數(shù)目在世界范圍內(nèi)每年都在持續(xù)增長，大多數(shù)發(fā)生在發(fā)展中國家，這些國家中，后天免疫缺陷綜合征(AIDS)患者急劇增加。特別是被稱為泰國子類群(Clade)E型的病毒(E亞型病毒)的感染性極高，世界衛(wèi)生組織(WHO)預(yù)測今后世界上E亞型病毒的感染者將會最多。
在日本與歐美一樣，B亞型病毒的感染者居多，但最近也有E亞型病毒感染者增加的趨勢。
為了能夠有效控制HIV感染癥，預(yù)防新感染者的產(chǎn)生，即疫苗的開發(fā)成為了很緊急的課題。尤其是美國和法國等國家，對疫苗的研究正積極地進行，但現(xiàn)狀是目前研究中的疫苗都是針對B亞型病毒的，對E亞型病毒的疫苗研究幾乎沒有。而且，作為D亞型病毒，已知的是主要分布于亞洲和中非的顯現(xiàn)暴發(fā)性病癥的NDK株。
如前所述，現(xiàn)狀是B亞型病毒雖然廣泛地分布于世界各地，但其疫苗還在研究中，離實用化還差得很遠。此外，E亞型病毒CRF01_AE的感染力很強，預(yù)測今后其感染范圍將會擴大。另外，D亞型病毒是顯現(xiàn)暴發(fā)性病癥的病毒。因此，希望開發(fā)出能夠有效抑制屬于這種亞型的病毒的藥物。
此外，艾滋病(AIDS)疫苗中，研究了直接使用艾滋病毒的病毒顆粒的生疫苗、使用病毒顆粒的一部分的組成性疫苗、進行病毒基因重組而獲得的再組合疫苗、使病毒滅活僅保留其蛋白結(jié)構(gòu)的滅活疫苗等。但是，如果考慮它們的實用性，則不僅要考慮HIV感染的防御效果，即有效性(免疫性的誘導(dǎo))，還必須考慮到其安全性。
現(xiàn)在，在艾滋病的治療中，大多數(shù)采用多劑并用療法(HAART)。提倡HAART療法時它被稱為跨時代的化學(xué)療法，但現(xiàn)在認識到出現(xiàn)耐藥性病毒、HIV的基因組高度變異、長期及大量服用會產(chǎn)生副作用等問題，所用的藥物的選擇及使用方法極為復(fù)雜。
HIV是具有高度的基因組多樣性的病毒，其原因主要有以下2種。
首先第一，HIV基因組的復(fù)制錯誤導(dǎo)致多樣性增加。通常采取從基因組RNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA，然后被編入宿主細胞基因組的復(fù)制過程。由于逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏3′→5′核酸外切酶活性，所以對被復(fù)制的堿基序列不具有校正功能。此外，由于逆轉(zhuǎn)錄酶的底物特異性低，所以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時的堿基置換、缺失、插入、重復(fù)等變異的發(fā)生頻率極高[Mansky，L.M.，J.Gen.Virol.，79，pp.1337-1345(1998)]。
而且，HIV在生物體內(nèi)以109-10/天的比例繁殖[Perelson，A.S.等，Science，271，pp.1582-1586(1996)]，一年要重復(fù)進行300次循環(huán)的復(fù)制。因此，感染HIV的同時開始變異的蓄積，進一步造成基因組的多樣性。
此外，不同體系的病毒間的基因組重組也會增加多樣性。HIV所屬的逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因重組通常是通過在病毒顆粒內(nèi)進入具有相同性的2個RNA基因組和通過逆轉(zhuǎn)錄酶的模板轉(zhuǎn)換(template switch)功能奏效的被稱為強制復(fù)制選擇(forced copy choice)[Coffin，J.M.，J.Gen.Virol.，42，pp.1-26(1979)]的機理而以高頻率發(fā)生[Jetzt，A.E.等，J.Virol.，74，pp.1234-1240(2000)]。因此，有通過獲得這種高度的基因組多樣性，引發(fā)了HIV的準種性、亞型的分化、重組病毒的出現(xiàn)、耐藥性變異、CTL逃逸變異等的看法。
HIV根據(jù)遺傳學(xué)體系被大致分為HIV-1型(HIV-1)和HIV2型(HIV-2)這2種。HIV-1又被分為M組、O組及N組。
M組是HIV-1中最主要的組，被分為A～D、F～H、J及K亞型9種。A及F亞型又分別被分為A亞-亞型、A2及F1、F2。
E亞型目前被作為CRF01_AE分類，所以本說明書中將E亞型作為“CRF01_AE”(前述)。
HIV-2被分為A～G亞型[Charneau，P.等，Virology，205，pp.247-253(1994)；Gurtler，L.G.等，J.Virol.，68，pp.1581-1585(1994)；Simon，F(xiàn).等，Nat.Med.，4，pp.1032-1037(1998)；Triques，K.等，AIDS Re s.Hum.Retroviruses，16，pp.139-151(2000)；Robertoson，D.L.等，Science，288，pp.55-56(2000)；Trique s，K.等，Virology，259，pp.99-109(1999)]。
作為HIV的重組病毒的分類，有報道包括重組型流行株(CRFsCRF01～CRF12)、孤立型重組病毒(URFsURFsA/C、URFsA/D、URFsB/E、URFsB/C)、歸屬不明的重組病毒(MAL株)、M組/O組間的重組病毒等[Carr，J.K.等，Virology，247，pp.22-31(1998)；Motomura，K.等，AIDS Res.Hum.Restroviruses，16，pp.1831-1843(2000)；Peeters，M.等，J.Virol.，73，pp.7368-7375(1999)；Takehisa，J.等，J.Virol.，73，pp.6810-6820(1999)；武部豐，日本病毒學(xué)會雜志，50(2)，pp.123-138(2001)]。
作為HIV的糖蛋白，有包膜糖蛋白gp120和膜貫通糖蛋白gp41。被稱為病毒基因組狀的“env”的基因編碼的gp160被宿主蛋白酶切斷可生成這些糖蛋白[Hallenberger，S.等，Nature，360，pp.358-361(1992)]。
由于gp120中存在24處N-結(jié)合型糖鏈結(jié)合部位[Leonard，C.K.等，J.Biol.Chem.，265，pp.10373-10382(1990)]，糖鏈占gp120分子的約一半[Allans，J.S.等，Science，228，pp.1091-1094(1985)]，所以，HIV可以說是被糖鏈覆蓋的病毒。各種實驗證明，HIV對目標(biāo)細胞進行感染時gp120的糖鏈是必須的[Fennie，C.等，J.Virol.，63，pp.369-646(1989)；Matthews，T.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，pp.5424-5428(1987)；Montefiori，D.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，pp.9248-9252(1988)；Pal，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，pp.3384-3388(1989)]。
但是，作為HIV-1顆粒感染細胞時的作用機制，考慮是首先gp120與細胞膜上的CD4結(jié)合，然后gp120的V3環(huán)與復(fù)合受體(趨化因子受體)結(jié)合，接著gp41侵入細胞膜引發(fā)膜融合這一系列的作用。目前報道了多種趨化受體，例如，報道了CCR5(巨噬細胞向性病毒的復(fù)合受體)、CXCR4(T細胞向性病毒的復(fù)合受體)、CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、CCR8、CCR9、CXCR2、CXCR5、CXCR6/STRL33及CX3CR1等。作為HIV的分類方法，除了前述遺傳學(xué)體系的方法之外，還有基于這些趨化因子受體分類的方法。例如，作為復(fù)合受體介入CCR5的病毒被分類為CCR5(簡稱為R5)向性病毒、作為復(fù)合受體介入CXCR4的病毒被分類為CXCR4(簡稱為X4)向性病毒，同樣，被分類為CCR1向性病毒和CCR2b向性病毒等。其中，R5向性病毒是巨噬細胞向性病毒，X4向性病毒被分類為T細胞向性病毒。此外，R5X4向性病毒被分類對巨噬細胞及T細胞都具有向性的病毒。
關(guān)于MBP和HIV的關(guān)系，具有MBP的同源變異的人感染HIV的機率較高，此外，有報道認為這類人被診斷為AIDS后的生存時間較短[Garred，P.等，Lancet，349，pp.236-240(1997)]。但是，然后有報道認為相反是具有基因變異的組很難感染AIDS[Mass，J.等，Aids，12，pp.2275-2280(1998)]。也有基因變異和AIDS的預(yù)后無關(guān)的報道[McBride，M.O.等，Int.J.STD.AIDS.，9，pp.683-688(1998)]。此外，有MBP與gp120結(jié)合的報道[Larkin，M.等，AIDS，3，pp.793-798(1989)；Mizuochi，T.等，J.Biol.Chem.，264，pp.13834-13839(1989)；Saifuddin，M.等，J.Gen.Virol.，81，pp.949-955(2000)]。
但是，完全不知MBP有無抗HIV作用，且MBP有無抑制HIV增殖作用。這些雖然都是判定MBP作為抗HIV劑是否有用的最重要的因素，但目前為止表示沒有任何證明。
此外，能夠評價MBP的抗HIV作用的評價體系也不存在，所以利用MBP的抗HIV劑的開發(fā)目前無任何進展。
此外，藥物治療HIV時擔(dān)心的耐藥性病毒的出現(xiàn)、HIV的基因組高度變異、長期及大量服用引發(fā)的副作用等問題還未解決。另外，疫苗的開發(fā)也是極為困難的，特別是E亞型的研究現(xiàn)在完全沒有開展。
但是，現(xiàn)在已經(jīng)知道R5向性病毒很難由中和抗體被中和，與病癥的進展有很大關(guān)系。尤其是感染初期時對R5向性病毒的治療方法對患者的預(yù)后會產(chǎn)生很大的影響，所以，要求在初期感染時能夠?qū)5向性病毒進行正確的處理。此外，感染傳播的HIV大多數(shù)為CCR5向性病毒，所以CCR5作為預(yù)防治療和抑制感染·傳播的目標(biāo)倍受矚目。另一方面，隨著臨床治療病癥臨近后期階段，CCR5向性病毒向CXCR4向性病毒進行轉(zhuǎn)變，到后期階段，CXCR4向性病毒的存在變得非常明顯為一般所知。
這種趨化因子受體的存在是最近才知道的，以這些趨化因子受體為目標(biāo)的治療藥物的開發(fā)目前僅處于基礎(chǔ)藥劑階段。對這些趨化因子受體的抑制劑的開發(fā)也在進行中，但服用CCR5抑制劑時，還有CXCR4向性病毒的出現(xiàn)加快，可能會加快病癥的發(fā)展等令人擔(dān)心的重大問題未解決。
因此，臨床醫(yī)生希望開發(fā)出能夠避免上述這一連串的問題，而安全且與HIV病毒的亞型、趨化因子受體向性、巨噬細胞和T細胞向性等各種要素都無關(guān)的顯現(xiàn)抗HIV作用的藥物。
尤其希望開發(fā)出對B亞型病毒、CRF01_AE、D亞型病毒顯現(xiàn)出抗病毒作用的藥物，還希望開發(fā)出對CCR5向性病毒、CXCR4向性病毒、CCR5/CXCR4向性病毒顯現(xiàn)出抗HIV作用的藥物。同樣也希望開發(fā)出對巨噬細胞向性病毒、T細胞向性病毒、巨噬細胞/T細胞向性病毒顯現(xiàn)出抗HIV作用的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是鑒于上述以往技術(shù)中指出的問題完成的發(fā)明，尤其是本發(fā)明者率先確立了能夠定量評價MBP的抗HIV作用的體系。此外，通過利用該評價體系，第一次證明了MBP的抗HIV作用，即HIV增殖抑制作用，開辟了MBP作為抗HIV劑的用途。此外，本發(fā)明者還證明MBP不僅對E亞型HIV，對屬于其它子類群(Clade)(亞型)的HIV也顯現(xiàn)出抗HIV作用。
即，本發(fā)明的主題是以MBP為有效成分的抗HIV劑。以MBP為有效成分的本發(fā)明的抗HIV劑，由于MBP的目標(biāo)是糖鏈，所以其優(yōu)點是很難受到因HIV基因組變異而出現(xiàn)的MBP耐性株的影響。此外，由于MBP是生物體中常見的物質(zhì)，所以具有不會產(chǎn)生用于以往的化學(xué)療法的化合物所確認出現(xiàn)的副作用。
本發(fā)明還提供了抗HIV作用的評價方法，即提供了包括以下4個步驟的MBP顯現(xiàn)抗HIV作用的評價方法，(1)培養(yǎng)使目標(biāo)細胞和HIV共存而獲得的感染細胞，(2)對經(jīng)過培養(yǎng)的感染細胞進行洗滌獲得洗凈細胞，(3)在MBP存在下對洗凈細胞進行培養(yǎng)，以及(4)測定來自培養(yǎng)上清液中的HIV的p24蛋白。
本發(fā)明還提供了另一抗HIV作用的評價方法，即提供了包括以下7個步驟的MBP顯現(xiàn)抗HIV作用的評價方法，(a)培養(yǎng)HIV和MBP共存的第一混合系，(b)較好的是與第一混合系同時培養(yǎng)目標(biāo)細胞和MBP共存的第二混合系，(c)合并第一混合系和第二混合系獲得感染細胞，(d)對所得感染細胞進行培養(yǎng)，(e)對經(jīng)過培養(yǎng)的感染細胞進行洗滌獲得洗凈細胞，(f)較好的是在MBP存在下對洗凈細胞進行培養(yǎng)，以及(g)測定來自培養(yǎng)上清液中的HIV的p24蛋白。
利用這些評價方法，能夠客觀且容易地確認及驗證MBP潛在的抗HIV作用。


圖1為表示HIV感染細胞NDK/M8166中的重組型結(jié)合甘露糖的蛋白質(zhì)(rMBP)和HIV活性間的關(guān)系的圖表。
圖2為表示HIV感染細胞LP65/M8166中的重組型結(jié)合甘露糖的蛋白質(zhì)(rMBP)和HIV活性間的關(guān)系的圖表。
圖3為表示HIV感染細胞NDK/M8166中的天然型結(jié)合甘露糖的蛋白質(zhì)(nMBP)和HIV活性間的關(guān)系的圖表。
圖4為表示結(jié)合甘露糖的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的略圖。
具體實施例方式
本發(fā)明的抗HIV劑由于利用了作為有效成分的MBP顯現(xiàn)的HIV增殖抑制作用，例如，HIV中和作用和HIV萌芽抑制作用等，所以對艾滋病患者及HIV感染者的治療和病癥發(fā)展的抑制有用。
此外，本發(fā)明的抗HIV劑的有效成分MBP不論是天然物及合成物(包括重組體)還是其它，只要具有規(guī)定的HIV增殖抑制作用，可以是任何一種。尤其適用于本發(fā)明的MBP包括分離自人血清并精制的MBP以及動物細胞，較好的是通過基因工程方法從中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(以下簡稱為“CHO細胞”)分泌的MBP。
例如，參考國際公開公報第WO 99/37676號公報，經(jīng)過以下一系列的步驟，能夠制得作為本發(fā)明可使用的一種MBP的重組型人結(jié)合甘露聚糖的蛋白質(zhì)(以下簡稱為“rhMBP”)，即，(i)在質(zhì)粒pNOW1中插入對應(yīng)于天然型人結(jié)合甘露聚糖的蛋白質(zhì)(以下簡稱為“nhMBP”)的cDNA的堿基序列(序列號1)的66bp～812bp的747個連續(xù)的多核苷酸(序列號2)，構(gòu)建表達載體pNOW1-hMBP；(ii)將表達載體pNOW1-hMBP導(dǎo)入二氫葉酸還原酶缺陷(dhfr-)的CHO細胞，獲得轉(zhuǎn)化體；(iii)將所得轉(zhuǎn)化體在含有新霉素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，獲得新霉素耐性細胞；(iv)將選擇的新霉素耐性細胞在含有甲氨喋呤(MTX)的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，獲得甲氨喋呤耐性細胞；以及(v)從選擇的甲氨喋呤耐性細胞回收rhMBP。
以下，對前述制造方法進行詳細說明。
首先，進行表達載體pNOW1-hMBP的構(gòu)建。關(guān)于構(gòu)成nhMBP的氨基酸，Herman等已經(jīng)有所分析和報道[Sastry等，“人結(jié)合甘露糖的蛋白質(zhì)基因。外顯子結(jié)構(gòu)揭示其與人類肺表面活性物質(zhì)基團的進化關(guān)系以及在10號染色體上的定位?！?，J.Exp.Med.170(4)，pp.1175-1189(1989)]。構(gòu)成nhMBP的氨基酸序列用序列號3表示。
根據(jù)這些序列信息，從人肝臟cDNA文庫(クロ-ンラツク公司制)擴增起始密碼子到終止密碼子的nhMBP，所得nhMBP的cDNA被限制性酶消化，獲得對應(yīng)于nhMBP的cDNA的66～812bp的747個連續(xù)的多核苷酸(序列號2)，將其作為插入體。然后，用限制性酶消化表達載體pMOW1，在pCMV和BGP多聚A間用DNA連結(jié)試劑盒(寶酒造制)插入前述插入體。將籍此獲得的表達載體命名為質(zhì)粒pNOW1-hMBP。
然后，進行表達克隆的選擇。在二氫葉酸還原酶缺陷(dhfr-)的CHO細胞導(dǎo)入表達載體pNOW1-hMBP按照以下步驟進行。即，調(diào)制添加了胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基(GIBCO公司)，在其中混合(dhfr-)DG44CHO細胞株，在37℃、5％二氧化碳氣體的條件下進行24小時的培養(yǎng)。然后廢棄培養(yǎng)上清液，替其將表達載體pNOW1-hMBP混入脂轉(zhuǎn)染溶液中，在其中加入添加了含有預(yù)先調(diào)制的溶液的FCS的IMDM，在加入次黃嘌呤(GIBCO公司制)和胸苷(GIBCO公司制)后進行培養(yǎng)，進行表達載體pNOW1-hMBP向dhfr-的宿主CHO細胞的導(dǎo)入。然后，廢棄培養(yǎng)上清液，加入添加了FCS、次黃嘌呤和胸苷的IMDM再進行培養(yǎng)。
為了獲得新霉素(G418)耐性CHO細胞，在培養(yǎng)導(dǎo)入了表達載體pNOW1-hMBP的細胞后，用胰蛋白酶對其進行處理，使細胞懸浮于添加了含有新霉素(G418)的FCS的IMDM。然后，將該懸浮物接種于微型板，在37℃、5％二氧化碳(CO2)的條件下培養(yǎng)2周，出現(xiàn)新霉素耐性細胞(克隆)。
從確認了rhMBP的產(chǎn)生的克隆中選擇數(shù)個，進行各克隆的培養(yǎng)。廢棄各培養(yǎng)上清液，加入與前述同樣組成的添加了FCS的IMDM，培養(yǎng)4天，回收該培養(yǎng)上清液。測定回收的培養(yǎng)上清液中的rhMBP的產(chǎn)生量。用對應(yīng)于作為對照的nhMBP、膠原凝集素的糖識別區(qū)域(CRD)及頸區(qū)域的(在大腸菌顯現(xiàn))的抗兔子多克隆抗體及nhMBP(定量對象)，按照鈴木等的方法[Y.Suzuki等，“哺乳動物細胞中表達的重組牛膠固素的特性”，Biothem.Biophys.Res.Comun.，238，pp.856-863(1997)]能夠?qū)hMBP的產(chǎn)生量進行定量。
為了獲得甲氨喋呤耐性的CHO細胞，對rhMBP產(chǎn)生的克隆進一步進行傳代培養(yǎng)使其穩(wěn)定化后，在培養(yǎng)基中加入低濃度的甲氨喋呤進行基因擴增。首先，在添加了加入甲氨喋呤、新霉素(G418)的10％經(jīng)過透析的FCS(JRH生物科學(xué)公司制)(JRH Biosciences)的IMDM中混合選擇的各細胞克隆，播種。在37℃、5％二氧化碳(CO2)的條件下，通過2周的培養(yǎng)，出現(xiàn)甲氨喋呤耐性細胞(克隆)。通過確認這些甲氨喋呤耐性的克隆的rhMBP產(chǎn)生性，高水準的產(chǎn)生水平得到確認。
從這些克隆選擇任意的克隆，各自播種，培養(yǎng)2周。廢棄培養(yǎng)上清液，加入與前述同樣組成的添加了FCS的IMDM(加入了甲氨喋呤、新霉素(G418)的物質(zhì))，培養(yǎng)4天，回收培養(yǎng)上清液，確認rhMBP的產(chǎn)生水平。
為了精制rhMBP，播種所得克隆中產(chǎn)生效率最高的克隆，并進行培養(yǎng)。然后，廢棄培養(yǎng)上清液，添加含有甲氨喋呤和新霉素(G418)的CHO-S-SFM II培養(yǎng)基(添加維生素C時，添加維生素C直至終濃度為100mM)，培養(yǎng)4天?；厥赵撆囵B(yǎng)上清液，進行對應(yīng)于TBS(由TBS粉(寶酒造社制)調(diào)制)的透析，然后，進行對應(yīng)于TBSC(5mM CaCl2，TBS)的透析。接著，利用甘露聚糖-瓊脂糖(SIGMA公司制)進行精制。即，將甘露聚糖-瓊脂糖裝入柱子(Column PD-10，空，法瑪西亞公司制)中，在其中通入經(jīng)過透析的培養(yǎng)液，用TBSC洗滌后，用TBSE(10mM EDTA，TBS)溶出。溶出后，加入1M的CaCl2，使終濃度達到15mM。然后，再次用于甘露聚糖-瓊脂糖，用TBSC洗滌后，用含10mM的甘露糖的TBS溶出。接著，再次進行對應(yīng)于TBSC的透析，獲得rhMBP的精制品。
以上獲得的精制的rhMBP用凝膠過濾色譜法進行處理時的280nm的吸光度在1000～1300kDa的分子量，特別是1150kDa的分子量顯現(xiàn)出特定峰。此外，在200～400kDa的分子量，特別是300kDa的分子量顯現(xiàn)出特定峰。再者rhMBP的凝膠滲透色譜分析在使用20mM Tris-HCl(pH8.0)、0.15mM NaCl、5mM EDTA，以0.5ml/分鐘的流速，超級玫瑰(Superrose)6HR10/30(φ10mm×長300mm，法瑪西亞株式會社制)的條件下進行。40μg的rnMBP通過該柱子，在280nm的吸光度下進行測定。
按照國際公開公報第WO 99/37676號記載的方法合成的rhMBP作為本發(fā)明的抗HIV劑的有效成分使用時，最好采用前述精制的rhMBP。也可采用該精制rhMBP再次通過凝膠過濾色譜法而獲得的、利用280nm的吸光度測定在1000～1300kDa的分子量出現(xiàn)的級分、在200～400kDa的分子量出現(xiàn)的級分或含有上述兩種級分的精制rhMBP。
本發(fā)明的抗HIV劑對任一類型的HIV株都有效，從后述的實施例的記載可知，除了對屬于HIV-1的M組的B亞型的HIV顯示出明顯的抗HIV作用之外，還對屬于HIV-1的M組的D亞型的HIV、重組型流行株，特別是CRF01_AE株顯現(xiàn)出明顯的抗HIV作用。
本發(fā)明的抗HIV劑還對CCR5向性病毒、CXCR4向性病毒及CCR5/CXCR4向性病毒顯現(xiàn)出明顯的抗HIV作用。此外，本發(fā)明的抗HIV劑對巨噬細胞向性病毒、T細胞向性病毒及巨噬細胞/T細胞向性病毒同樣顯現(xiàn)出明顯的抗HIV作用。
本發(fā)明的抗HIV劑作為艾滋病治療劑或HIV感染的病癥發(fā)展抑制劑使用時，最好選擇蛋白質(zhì)容易與生物體結(jié)合的合適的劑型及給藥途徑(靜脈內(nèi)給藥等)。例如，作為本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的給藥方法，除了靜脈內(nèi)給藥外，還可適當(dāng)選擇經(jīng)粘膜給藥、經(jīng)皮給藥、肌肉內(nèi)給藥、皮下給藥、直腸內(nèi)給藥、經(jīng)口給藥等。而根據(jù)給藥方法，可采用各種形態(tài)的制劑。以下所述為靜脈給藥制劑，但本發(fā)明所用的劑型并不僅限于這些，可利用醫(yī)藥制劑領(lǐng)域內(nèi)常用的各種制劑。
研究日本人(479例)的MBP的基因變異及血中MBP濃度后有報道，僅有密碼子54(GGC→GAC)的突變導(dǎo)致MBP的基因變異，各基因型的比例是野生型/野生型為70.8％、野生型/突變型為22.5％、突變型/突變型為6.7％。此外，有報道認為血中的MBP濃度是野生型/野生型為0.18～4.35μg/ml(平均1.26μg/ml)、野生型/突變型為0.00～0.80μg/ml(平均0.23μg/ml)、突變型/突變型為0.00～0.20μg/ml(平均0.04μg/ml)[芥子宏行等，醫(yī)學(xué)的進展，194(12)，pp.957-958(2000)]。
本發(fā)明的抗HIV劑作為艾滋病治療劑或HIV感染后的病癥進展抑制劑使用時，由于健康常人的血中MBP濃度為約1μg/ml～約1.5μg/ml，利用ELISA等的方法測定血中MBP濃度后，因丙型肝炎等肝病癥的影響MBP的產(chǎn)量下降，或因基因變異血中濃度較低時，最好按血中MBP濃度達到約1μg/ml～約1.5μg/ml的標(biāo)準也可以決定本發(fā)明的抗HIV劑的靜脈內(nèi)給藥量。此外，必須定期對HIV-RNA量及CD4陽性細胞數(shù)進行監(jiān)控，掌握監(jiān)控結(jié)果和MBP給藥量的關(guān)系后再決定有效的血中MBP濃度值。血中MBP濃度如果為正常值，也可以慢慢提高血中濃度(例如，約1.5μg/ml～約5.0μg/ml)，定期對HIV-RNA量及CD4陽性細胞進行定期監(jiān)控，在掌握監(jiān)控結(jié)果和MBP給藥量的關(guān)系后再決定有效的血中MBP濃度值。
MBP的有效血中濃度由于受個人天生的血中MBP濃度的左右，所以并不是一定的，較好設(shè)定為約1.0μg/ml～約50μg/ml，更好設(shè)定為約1.5μg/ml～約10μg/ml，給藥前或給藥后的血中濃度可在此范圍外。由于基因變異也會導(dǎo)致血中MBP濃度下降，所以決定MBP給藥量時也需考慮到基因變異的因素。
此外，根據(jù)其劑型(口服劑、注射劑、栓劑等公知的劑型)，作為制劑原料可加入溶劑、賦形劑、覆膜劑、基劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、溶解助劑、懸浮劑、粘稠劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、等張劑、無痛化劑、保存劑、矯味劑、芳香劑和著色劑等添加劑。
這些添加劑的具體例子如下所述，但并不僅限于此。
溶劑精制水、注射用水、生理鹽水、花生油、乙醇、甘油。
賦形劑淀粉類、乳糖、葡萄糖、白糖、結(jié)晶纖維素、硫酸鈣、碳酸鈣、滑石粉、二氧化鈦、海藻糖、木糖醇。
覆膜劑白糖、明膠、乙酸鄰苯二甲酸纖維素及上述高分子賦形劑。
基劑凡士林、植物油、聚乙二醇、水包油型乳劑性基劑、油包水型乳劑性基劑。
粘合劑淀粉及其衍生物、纖維素及其衍生物、明膠、褐藻酸鈉、西黃耆膠、阿拉伯膠等天然高分子化合物、聚乙烯吡咯烷酮等合成高分子化合物、糊精、羥丙基淀粉。
潤滑劑硬酯酸及其鹽類、滑石粉、蠟類、小麥淀粉、聚乙二醇、加氫植物油、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇。
崩解劑淀粉及其衍生物、瓊脂、明膠末、碳酸氫鈉、纖維素及其衍生物、羧甲基纖維素鈣、羥丙基淀粉、羧甲基纖維素及其鹽類及其交聯(lián)體、低取代型羥丙基纖維素。
溶解助劑環(huán)糊精、乙醇、丙二醇、聚乙二醇。
懸浮劑阿拉伯膠、西黃耆膠、褐藻酸鈉、單硬酯酸鋁、檸檬酸、各種表面活性劑。
粘稠劑羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯醇、西黃耆膠、阿拉伯膠、褐藻酸鈉。
乳化劑阿拉伯膠、膽固醇、西黃耆膠、甲基纖維素、各種表面活性劑、卵磷脂。
穩(wěn)定劑亞硫酸氫鈉、天冬氨酸、維生素E、螯和劑、惰性氣體、還原性物質(zhì)。
緩沖劑磷酸氫鈉、乙酸鈉、硼酸。
等張劑氯化鈉、葡萄糖。
無痛化劑鹽酸普魯卡因、利多卡因、苯甲醇。
保存劑苯甲酸及其鹽類、對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、逆性肥皂、苯甲醇、苯酚、乙汞智利水楊酸鈉。
矯味劑白糖、糖精、肝精、山梨糖醇、木糖醇、甘油。
芳香劑苦橙皮酊、玫瑰油。
著色劑水溶性食用色素、色淀染料。
本發(fā)明的抗HIV劑除了上述成分之外，還可含有制藥上允許的鹽。制藥上允許的鹽(類)例如包括與無機堿、有機堿等堿形成的鹽，與無機酸、有機酸、堿性或酸性氨基酸等的酸加成鹽。這些鹽(類)的具體例子如下所示，但并不僅限于此。
無機堿鈉、鈣等堿金屬，鈣、鎂等堿土金屬，鋁和銨等。
有機堿乙醇胺等伯胺，二乙胺、二乙醇胺、二環(huán)己胺、N，N′-二苯甲基乙二胺等仲胺，三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、三乙醇胺等叔胺。
無機酸鹽酸、氫溴酸、硝酸、硫酸、磷酸。
有機酸甲酸、乙酸、乳酸、三氟乙酸、富馬酸、草酸、酒石酸、馬來酸、苯甲酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸。
堿性氨基酸精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸。
酸性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸。
實施例以下，通過實施例對本發(fā)明進行具體說明，這些實施例的揭示，并不是對本發(fā)明進行限定性的解釋。
以下實施例中被確證的抗HIV作用的用語不僅包括對HIV的中和作用，還包括對HIV的萌芽抑制作用，但為了方便起見簡稱為“中和作用”。
實施例1及2所用的HIV株的詳細情況示于表1。
表1

實施例1本實施例對MBP的抗HIV活性進行研究。
首先，作為HIV株準備HIV-NDK實驗株(D亞型，以下簡稱為“NDK”)和重組型流行株CRF01-AE(臨床分離株，以下簡稱為“LP65”)。
然后，用這些HIV株使通過植物凝集素胚細胞化的人外周血單核細胞(人PBMC，以下簡稱為“PBMC”)和T細胞系的株化細胞M8166(以下簡稱為“M8166”)分別感染。
NDK和M8166都是能從美國國立衛(wèi)生研究所(NIH)的AIDS Research and ReferenceRegent Program獲得的菌株。
但是，MBP采用從人血液精制的nhMBP和通過國際公開公報第WO 99/37676號記載的方法合成的rhMBP。
在PBMC及M8166中分別添加暴發(fā)癥型病毒NDK，在37℃對它們培養(yǎng)1小時使它們感染，所得感染株分別被稱為NDK/PBMC及NDK/M8166。此外，分別在PBMC及M8166中添加LP65，在37℃對它們培養(yǎng)1小時使它們感染HIV。然后，在5×106個/ml的細胞中同時添加相當(dāng)于100 TCID50的病毒的量的NDK及LP65。所得感染細胞分別被稱為“LP65/PBMC”及“LP65/M8166”。
然后，用PBS對感染細胞洗滌2次。以1～100μg/ml的濃度(圖1)或1～30μg/ml的濃度(圖2～3)在4種病毒感染細胞(NDK/PBMC、NDK/M8166、LP65/PBMC、LP65/M8166)中添加nhMBP或rhMBP。此時的細胞濃度每200μl為1×106個/ml(即，2×105個/200μl)。即，1/5規(guī)模的200μl體系內(nèi)放置了MBP1～100μg/l×106個/ml或1～30μg/l×106個/ml濃度的細胞，在添加了人血清的培養(yǎng)基中，在37℃、5％二氧化碳存在下對這些細胞培養(yǎng)1周。作為培養(yǎng)后的病毒量的變化指標(biāo)，用全自動化學(xué)發(fā)光酶免疫測定系統(tǒng)(LUMIPULSE F富士REBIO株式會社制)，對培養(yǎng)上清液中的來自HIV的p24抗原量進行ELISA測定，與未添加MBP的組進行比較。
其結(jié)果是，如圖3所示，確認了添加nhMBP的組對HIV量的抑制(HIV增殖抑制)。此外，如圖1所示，確認NDK/M8166在rhMBP濃度為10μg/ml～30μg/ml的情況下，培養(yǎng)上清液中的p24抗原量在培養(yǎng)后迅速被抑制為未添加rhMBP的組的約50％。此外，從圖2可明顯看出，對于臨床分離株LP65(HIV-1的重組型流行株CRF01_AE)，rhMBP在依賴濃度中和LP65的IC50約為10μg/ml時顯現(xiàn)出抗HIV效果(HIV增殖抑制效果)，即，其抗HIV作用(中和作用)與亞型無關(guān)。
此外，在所用的MBP濃度范圍內(nèi)確認nhMBP及rhMBP都對細胞沒有明顯的增殖抑制作用和細胞毒性。本實驗體系中，也暗示HIV的萌芽抑制作用，即從感染細胞釋放HIV的抑制作用。
如上所述，本發(fā)明的抗HIV劑對E亞型HIV及D亞型HIV都顯現(xiàn)出抗HIV作用。同樣，本發(fā)明的抗HIV劑對CCR5/CXCR4向性病毒、巨噬細胞/T細胞向性病毒也顯現(xiàn)出抗HIV作用。
實施例2
作為HIV株準備92Th014實驗株(B亞型)和JRCSF實驗株(B亞型)。這些實驗株都可從美國國立衛(wèi)生研究所的AIDS Research and Reference Regent Program獲得。此外，PBMC、nhMBP及rhMBP與實施例1所用相同。
首先，混合相當(dāng)于100 TCID50的效價的病毒溶液50μl和終濃度為2、6、20、60μg/ml的nhMBP或rhMBP溶液50μl。然后，在37℃、5％二氧化碳氣體存在下，對該混合溶液培養(yǎng)1小時，調(diào)制出nhMBP或rhMBP的終濃度為1、3、10、30μg/ml的第一混合系。
與此同時，將PBMC的濃度調(diào)整為2×105個/50μl，在其中混合終濃度為2、6、20、60μg/ml的nhMBP或rhMBP溶液50μl。然后，在37℃、5％二氧化碳氣體存在下，對該混合溶液培養(yǎng)1小時，調(diào)制出nhMBP或rhMBP的終濃度為1、3、10、30μg/ml的第二混合系。
接著，合并MBP濃度(終濃度)被調(diào)整為1、3、10、30μg/ml的任何一個的第一混合系和第二混合系，于37℃培養(yǎng)一晝夜后，洗滌除去未反應(yīng)的MBP和病毒。洗滌后，為了與洗滌前的MBP終濃度相等，添加新鮮的nhMBP或rhMBP，在含有10％的FCS的RPMI培養(yǎng)基(含有20單位/ml的白細胞介素2、50單位/ml的青霉素、50單位/ml的鏈霉素)中培養(yǎng)7天。作為培養(yǎng)后的病毒量變化指標(biāo)，用全自動化學(xué)發(fā)光酶免疫測定系統(tǒng)(LUMIPULSE F富士REBIO株式會社制)，對培養(yǎng)上清液中的來自HIV的p24抗原量進行ELISA測定，與未添加MBP的組進行比較。
其結(jié)果是，對作為野生株病毒的JRCSF及92Th014都具有明顯的抗HIV活性(HIV增殖抑制活性)。使p24抗原量減半所必須的MBP量(50％抑制濃度)在用于JRCSF時，nhMBP為0.19μg，rhMBP在2.74μg以下。同樣，在用于92Th014時，nhMBP為7μg，rhMBP在1.57μg以下。從這些事實可說明，MBP對野生型B亞型病毒株也具有很好的抗HIV活性(中和活性)。
此外，從本實施例的結(jié)果可看出，本發(fā)明的抗HIV劑對CCR5向性病毒、巨噬細胞向性病毒也顯現(xiàn)出抗HIV作用。本實施例中，直接證明了MBP對CCR5向性病毒顯現(xiàn)出的抗HIV作用，所以MBP不僅可用于HIV感染初期的治療，還可有效用于預(yù)防治療和對感染·傳播的抑制。另外，本實施例中直接證明了本發(fā)明的抗HIV劑對CCR5/CXCR4向性病毒也具有抗HIV作用，所以不僅對HIV感染的感染初期有效，對臨床發(fā)展病癥(即，不僅對HIV感染者對HIV患者)也有效。
從實施例1及實施例2獲得結(jié)果可看出，因為對CCR5/CXCR4向性病毒顯現(xiàn)出抗HIV作用的MBP對CCR5向性病毒顯現(xiàn)出同樣的抗HIV作用，所以認為MBP對CXCR4向性病毒也應(yīng)顯現(xiàn)出抗HIV作用。同樣，因為對巨噬細胞/T細胞向性病毒顯現(xiàn)出抗HIV作用的MBP對巨噬細胞向性病毒顯現(xiàn)出同樣的抗HIV作用，所以認為MBP對T細胞向性病毒也應(yīng)顯現(xiàn)出抗HIV作用。
從實施例1及實施例2的實驗結(jié)果可看出，本發(fā)明的抗HIV劑對CCR5向性病毒、CXCR4向性病毒及CCR5/CXCR4向性病毒都顯現(xiàn)出抗HIV作用。此外，本發(fā)明的抗HIV劑對巨噬細胞向性病毒、T細胞向性病毒及巨噬細胞/T細胞向性病毒都顯現(xiàn)出抗HIV作用。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性以MBP為有效成分的本發(fā)明的抗HIV劑對包含活性中和最困難的重組型流行株CRF01_AE病毒的多種HIV株顯現(xiàn)出中和活性。即，本發(fā)明的抗HIV劑與病毒的亞型、趨化因子受體向性、巨噬細胞/T細胞向性的種類和程度無關(guān)，尤其是對目前最不確定的B亞型HIV、D亞型HIV及CRF01_AE顯現(xiàn)出規(guī)定的抗HIV作用。
此外，本發(fā)明的抗HIV劑也對CCR5向性病毒、CXCR4向性病毒及CCR5/CXCR4向性病毒都顯現(xiàn)出抗HIV作用。另外，本發(fā)明的抗HIV劑還對巨噬細胞向性病毒、T細胞向性病毒及巨噬細胞/T細胞向性病毒顯現(xiàn)出抗HIV作用。
本發(fā)明的抗HIV劑由于以糖鏈為目標(biāo)，所以因HIV基因組變異而出現(xiàn)MBP耐性株的可能性很小。而且，由于MBP本身存在于生物體內(nèi)，所以沒有以往的HIV治療中所用的化合物所產(chǎn)生的副作用。
因此，本發(fā)明的抗HIV劑能夠應(yīng)對多種因HIV而導(dǎo)致的感染癥，對其治療極為有用。
序列表序列表<110>扶桑藥品工業(yè)株式會社(FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES，LTD.)<120>抗HIV劑(Anti-HIV Agent)<130>03P451WO<150>JP 2002-189534<151>2002-06-28<160>3<210>1<211>3605<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1ggtaaatatg tgttcattaa ctgagattaa ccttccctga gttttctcac accaaggtga 60ggaccatgtc cctgtttcca tcactccctc tccttctcct gagtatggtg gcagcgtctt 120actcagaaac tgtgacctgt gaggatgccc aaaagacctg ccctgcagtg attgcctgta 180gctctccagg catcaacggc ttcccaggca aagatgggcg tgatggcacc aagggagaaa 240agggggaacc aggccaaggg ctcagaggct tacagggccc ccctggaaag ttggggcctc 300caggaaatcc agggccttct gggtcaccag gaccaaaggg ccaaaaagga gaccctggaa 360aaagtccgga tggtgatagt agcctggctg cctcagaaag aaaagctctg caaacagaaa 420tggcacgtat caaaaagtgg ctgaccttct ctctgggcaa acaagttggg aacaagttct 480tcctgaccaa tggtgaaata atgacctttg aaaaagtgaa ggccttgtgt gtcaagttcc 540aggcctctgt ggccaccccc aggaatgctg cagagaatgg agccattcag aatctcatca 600aggaggaagc cttcctgggc atcactgatg agaagacaga agggcagttt gtggatctga 660caggaaatag actgacctac acaaactgga acgagggtga acccaacaat gctggttctg 720atgaagattg tgtattgcta ctgaaaaatg gccagtggaa tgacgtcccc tgctccacct 780cccatctggc cgtctgtgag ttccctatct gaagggtcat atcactcagg ccctccttgt 840ctttttactg caacccacag gcccacagta tgcttgaaaa gataaattat atcaatttcc900
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<210>3<211>248<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Met Ser Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala15 10 15Ala Ser Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys20 25 30Pro Ala Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly35 4045Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln50 5560Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly6570 75 80Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp85 90 95Pro Gly Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg100 105 110Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe115 120 125Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu130 135 140Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala145 150 155 160Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn165 170 175Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu180 185 190Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp195 200 205Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu
210215220Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His225 230 235 240Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile24權(quán)利要求
1.抗HIV劑，其特征在于，以結(jié)合甘露糖的蛋白質(zhì)(MBP)為有效成分。
2.如權(quán)利要求1所述的抗HIV劑，其特征在于，前述MBP具有HIV增殖抑制作用。
3.如權(quán)利要求2所述的抗HIV劑，其特征在于，前述增殖抑制作用為HIV中和作用。
4.如權(quán)利要求2所述的抗HIV劑，其特征在于，前述增殖抑制作用為HIV萌芽抑制作用。
5.如權(quán)利要求1或2所述的抗HIV劑，其特征在于，前述MBP分離自人血清并被精制。
6.如權(quán)利要求1或2所述的抗HIV劑，其特征在于，前述MBP從動物細胞遺傳工程學(xué)式的分泌。
7.如權(quán)利要求6所述的抗HIV劑，其特征在于，前述動物細胞為中國倉鼠卵巢細胞。
8.如權(quán)利要求1或2所述的抗HIV劑，其特征在于，前述HIV是屬于HIV-1型的M組的B亞型的HIV株。
9.如權(quán)利要求1或2所述的抗HIV劑，其特征在于，前述HIV是屬于HIV-1型的M組的D亞型的HIV株。
10.如權(quán)利要求1或2所述的抗HIV劑，其特征在于，前述HIV是重組型流行株。
11.如權(quán)利要求10所述的抗HIV劑，其特征在于，前述重組型流行株為CRF01_AE。
12.如權(quán)利要求1或2所述的抗HIV劑，其特征在于，前述HIV是具有CCR5向性的病毒。
13.如權(quán)利要求1或2所述的抗HIV劑，其特征在于，前述HIV是具有CXCR4向性的病毒。
14.如權(quán)利要求1或2所述的抗HIV劑，其特征在于，前述HIV是同時具有CCR 5向性及CXCR4向性的病毒。
15.如權(quán)利要求1或2所述的抗HIV劑，其特征在于，前述HIV是具有巨噬細胞向性的病毒。
16.如權(quán)利要求1或2所述的抗HIV劑，其特征在于，前述HIV是具有T細胞向性的病毒。
17.如權(quán)利要求1或2所述的抗HIV劑，其特征在于，前述HIV是對巨噬細胞及T細胞的雙方具有向性的病毒。
18.MBP的抗HIV作用的評價方法，其特征在于，包括以下步驟(1)培養(yǎng)使目標(biāo)細胞和HIV共存而獲得的感染細胞，(2)對經(jīng)過培養(yǎng)的感染細胞進行洗滌獲得洗凈細胞，(3)在MBP存在下對洗凈細胞進行培養(yǎng)，以及(4)測定來自培養(yǎng)上清液中的HIV的p24蛋白。
19.MBP的抗HIV作用的評價方法，其特征在于，包括以下步驟(a)培養(yǎng)HIV和MBP共存的第一混合系，(b)培養(yǎng)目標(biāo)細胞和MBP共存的第二混合系，(c)合并第一混合系和第二混合系獲得感染細胞，(d)對所得感染細胞進行培養(yǎng)，(e)對經(jīng)過培養(yǎng)的感染細胞進行洗滌獲得洗凈細胞，(f)對洗凈細胞進行培養(yǎng)，以及(g)測定來自培養(yǎng)上清液中的HIV的p24蛋白。
20.如權(quán)利要求19所述的評價方法，其特征在于，前述步驟(a)及(b)同時進行。
21.如權(quán)利要求19或20所述的評價方法，其特征在于，前述步驟(f)是在MBP存在下對洗凈細胞進行培養(yǎng)。
22.如權(quán)利要求18或19所述的評價方法，其特征在于，前述抗HIV作用為HIV增殖抑制作用。
23.如權(quán)利要求22所述的評價方法，其特征在于，前述增殖抑制作用為HIV中和作用。
24.如權(quán)利要求22所述的評價方法，其特征在于，前述增殖抑制作用為HIV萌芽抑制作用。
25.如權(quán)利要求18或19所述的評價方法，其特征在于，前述MBP分離自人血清并被精制。
26.如權(quán)利要求18或19所述的評價方法，其特征在于，前述MBP通過基因工程方法從動物細胞分泌。
27.如權(quán)利要求26所述的評價方法，其特征在于，前述動物細胞為中國倉鼠卵巢細胞。
28.如權(quán)利要求18或19所述的評價方法，其特征在于，前述HIV是屬于HIV-1型的M組的B亞型的HIV株。
29.如權(quán)利要求18或19所述的評價方法，其特征在于，前述HIV是屬于HIV-1型的M組的D亞型的HIV株。
30.如權(quán)利要求18或19所述的評價方法，其特征在于，前述HIV是重組型流行株。
31.如權(quán)利要求30所述的評價方法，其特征在于，前述重組型流行株為CRF01_AE。
32.如權(quán)利要求18或19所述的評價方法，其特征在于，前述HIV是具有CCR5向性的病毒。
33.如權(quán)利要求18或19所述的評價方法，其特征在于，前述HIV是具有CXCR4向性的病毒。
34.如權(quán)利要求18或19所述的評價方法，其特征在于，前述HIV是同時具有CCR5向性及CXCR4向性的病毒。
35.如權(quán)利要求18或19所述的評價方法，其特征在于，前述HIV是具有巨噬細胞向性的病毒。
36.如權(quán)利要求18或19所述的評價方法，其特征在于，前述HIV是具有T細胞向性的病毒。
37.如權(quán)利要求18或19所述的評價方法，其特征在于，前述HIV是同時具有巨噬細胞及T細胞向性的病毒。
38.MBP，其特征在于，具有權(quán)利要求18或19所述的評價方法確定的抗HIV作用。
39.以MBP為有效成分的抗HIV劑對HIV感染者的應(yīng)用。
40.如權(quán)利要求39所述的抗HIV劑的應(yīng)用，其特征在于，前述HIV感染者為具有CCR5向性的病毒的感染者。
全文摘要
本發(fā)明揭示了以結(jié)合甘露糖的蛋白質(zhì)(MBP)為有效成分、能夠用于人免疫缺陷病毒(HIV)感染者的治療及有效抑制病癥發(fā)展的抗HIV劑。此外，還揭示了包括在MBP存在下對HIV感染細胞進行培養(yǎng)的步驟在內(nèi)的MBP所顯現(xiàn)的抗HIV活性的評價方法。
文檔編號A61P43/00GK1620307SQ0380245
公開日2005年5月25日 申請日期2003年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月28日
發(fā)明者若宮伸隆, 大谷克城, 坂本隆志, 芥子宏行, 岸雄一郎 申請人:扶桑藥品工業(yè)株式會社