專利名稱：調(diào)節(jié)基因表達(dá)的核被膜和核纖層結(jié)合嵌合體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含核被膜(nuclear-envelope)和/或核纖層(nuclear-lamina)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸靶特異性嵌合蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)，以及編碼這些蛋白質(zhì)的核酸，可以用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法中，特別是用于阻抑或下調(diào)選定的靶基因的表達(dá)。所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選來(lái)自天然存在的鋅指蛋白質(zhì)(ZFP)或人工鋅指蛋白質(zhì)(AZP)。本發(fā)明還涉及基因阻抑和去阻抑的分子開關(guān)系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
基因轉(zhuǎn)錄阻抑可以通過(guò)多種機(jī)制完成。一個(gè)經(jīng)典的例子是lac阻抑子，當(dāng)其結(jié)合在lac操縱子上的靶序列時(shí)，其阻止RNA聚合酶結(jié)合并由此阻止轉(zhuǎn)錄的起始。真核生物中，存在其它的機(jī)制控制基因阻抑。例如，組成性異染色質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的基因是轉(zhuǎn)錄沉默的。異染色質(zhì)不是隨機(jī)定位的，其看來(lái)和核周邊(nuclear periphery)有關(guān)[Cohen等，(2001)Trends Biochem.Sci.2641-47]，暗示將基因帶入異染色質(zhì)附近或核周邊可能至少部分地在基因沉默中起作用。
轉(zhuǎn)錄阻抑子也發(fā)現(xiàn)于真核生物的核周邊中。某些情況下，看來(lái)這樣的蛋白質(zhì)當(dāng)位于核周邊時(shí)只具有阻抑子活性。高等真核生物(多細(xì)胞動(dòng)物及以上)的核周邊由具有內(nèi)膜和外膜的核被膜(NE)和核纖層組成。核纖層位于內(nèi)層核膜的下面，由稱為核纖層蛋白和核纖層相關(guān)蛋白(LAP)的中間絲組成。某些LAP也是內(nèi)層核膜的內(nèi)在膜蛋白。Cohen等提供了關(guān)于幾個(gè)不同物種的核纖層組合物的討論。
Oct-1是一種老化相關(guān)膠原酶基因的阻抑子。實(shí)驗(yàn)證明Oct-1從核周邊的解離誘導(dǎo)了膠原酶基因表達(dá)[Imai等(1997)Mol.Biol.Cell 82404-2419]。而且，當(dāng)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Rb)的活性形式和轉(zhuǎn)錄因子E2F關(guān)聯(lián)時(shí)，復(fù)合物和核纖層蛋白A/C體內(nèi)共定位于核周邊并阻抑轉(zhuǎn)錄[Mancini等(1999)Dev.Biol.215288-297]。也參與基因阻抑的小鼠germ-cell-less蛋白(germ-cell-less protein，GCL)，[Nili等(2001)J.Cell.Sci.1143297-3307]，被報(bào)道在核纖層結(jié)合LAP2 [Cohen等]。
轉(zhuǎn)錄因子和其它DNA結(jié)合蛋白質(zhì)以序列特異性的方式結(jié)合它們的靶以調(diào)節(jié)基因表達(dá)因而激活或阻抑靶基因的表達(dá)?；虮磉_(dá)調(diào)節(jié)可以通過(guò)時(shí)間(例如，在發(fā)育或細(xì)胞周期的不同時(shí)間)和/或空間(例如，在不同的組織中)實(shí)現(xiàn)。一些情況下，可能希望在特定的時(shí)間或特定的細(xì)胞類型中關(guān)閉非所需基因的表達(dá)。例如，和腫瘤相關(guān)聯(lián)和腫瘤發(fā)生中激活的基因可能是阻抑的靶。因?yàn)楫惾旧|(zhì)和位于核周邊的基因已知是沉默的，一個(gè)攜帶基因進(jìn)入與核周邊關(guān)聯(lián)的序列特異性的方法可以提供沉默或下調(diào)(阻抑)那個(gè)靶基因表達(dá)的途徑?；蛘?，從阻抑狀態(tài)釋放基因(即去阻抑或激活這些基因)的方法也是有價(jià)值的。
然而，已知的轉(zhuǎn)錄因子具有有限的應(yīng)用-這樣的蛋白質(zhì)用于控制和它們的天然靶序列相關(guān)的基因或用于一組有限制的密切相關(guān)的靶序列。一個(gè)克服這個(gè)缺點(diǎn)的方法是設(shè)計(jì)和構(gòu)建具有預(yù)先確定的序列特異性的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)，特別是對(duì)大的，復(fù)雜的基因組中的唯一的靶序列。一個(gè)顯示可以這樣操縱的特別種類的蛋白質(zhì)是鋅指蛋白質(zhì)(ZFP)。
ZFP是熟知的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)，其通過(guò)和ZFP的每個(gè)鋅指的α-螺旋中特定氨基酸的靶序列相互作用識(shí)別和結(jié)合DNA靶序列。ZFP典型地含有3到9個(gè)且有時(shí)更多個(gè)鋅指，而且存在許多類ZFP；綜述見例如，Laity等，(2001)Curr.Opin.Struct.Biol.1139-46。Cys2His2類ZFP被廣泛研究并證明其在發(fā)展通用識(shí)別密碼中有用，該密碼可以涉及結(jié)合預(yù)先確定的DNA靶序列的人工鋅指蛋白質(zhì)(AZP)。見，例如，Wolfe等，(2000)Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.29183-212；；Choo等，(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10411-416；Segal等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA962758-2763；Kim等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 952812-2817；和U.S.Serial No.09/911,261，Takashi Sera于2001年7月23日遞交，名稱為″Zinc Finger Domain Recognition Code and Uses Thereof″。
獲得AZP可以設(shè)計(jì)能夠調(diào)節(jié)和任何獨(dú)特序列而不僅是已知的調(diào)節(jié)序列有關(guān)的靶基因的蛋白質(zhì)。當(dāng)這些AZP(或其它DNA結(jié)合蛋白質(zhì))和一或多個(gè)能夠與核周邊相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，就產(chǎn)生了一個(gè)嵌合蛋白質(zhì)，其可以用來(lái)結(jié)合核靶基因關(guān)聯(lián)的核苷酸序列并定位該靶基因于核周邊以進(jìn)行沉默或下調(diào)。當(dāng)這些嵌合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域被重排為分子開關(guān)系統(tǒng)時(shí)，可能提供激活或阻抑基因表達(dá)的系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及核酸靶特異性的嵌合蛋白質(zhì)，其具有一或多個(gè)能夠特異性結(jié)合與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列的第一結(jié)構(gòu)域并具有一或多個(gè)能夠與核周邊相關(guān)聯(lián)或結(jié)合的第二結(jié)構(gòu)域。這些蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中有用。
多個(gè)第一核第二結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選1到5個(gè)額外的結(jié)構(gòu)域還可以存在在本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)中。優(yōu)選第一結(jié)構(gòu)域是一種AZP且優(yōu)選第二結(jié)構(gòu)域是一種GCL蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白質(zhì)可包括額外的結(jié)構(gòu)域以易于細(xì)胞攝取和/或轉(zhuǎn)運(yùn)到核。
本發(fā)明其它方面提供了分離的編碼本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的核酸，包含核酸的表達(dá)載體，和以所述表達(dá)載體(通過(guò)任何方法)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。這樣的宿主細(xì)胞可以用于，例如通過(guò)在表達(dá)該嵌合蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞一段時(shí)間再回收該嵌合蛋白質(zhì)的制備嵌合蛋白質(zhì)的方法。另外宿主細(xì)胞可以用為表達(dá)載體的來(lái)源以通過(guò)基因轉(zhuǎn)移方法輸送所述嵌合蛋白質(zhì)到細(xì)胞或生物體中。另外，本發(fā)明提供了這些嵌合蛋白質(zhì)，核酸和表達(dá)載體的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及將靶核酸與本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合的方法，其通過(guò)將所述靶核酸(具有與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列)與足夠量的本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)接觸足夠的時(shí)間以便該蛋白質(zhì)結(jié)合所述靶核酸而實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白質(zhì)通過(guò)將一種核酸導(dǎo)入細(xì)胞中以進(jìn)行體內(nèi)結(jié)合。或者，本發(fā)明提供了可以用于體外結(jié)合分析的嵌合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一方面提供了一種阻抑或下調(diào)靶基因表達(dá)的方法，包含將一種含有與靶基因相關(guān)聯(lián)或足夠近的核苷酸的核酸與本發(fā)明的足夠量的嵌合蛋白質(zhì)接觸一段足夠的時(shí)間，以便相對(duì)于合適的對(duì)照而言，所述蛋白質(zhì)降低所述靶基因的表達(dá)水平。某些實(shí)施方案中，將嵌合蛋白質(zhì)作為一種蛋白質(zhì)或作為一種編碼該嵌合蛋白質(zhì)的核酸導(dǎo)入細(xì)胞或生物體中。
在試圖結(jié)合靶核酸的方法或試圖阻抑基因表達(dá)的方法中，所述靶基因編碼，或所述靶核苷酸序列位點(diǎn)是來(lái)自或控制一種植物基因，一種哺乳動(dòng)物基因，一種昆蟲基因，一種酵母基因或來(lái)自一種病毒如DAN病毒。當(dāng)所述靶基因或位點(diǎn)來(lái)自哺乳動(dòng)物，它可能編碼或控制一種細(xì)胞因子，一種白細(xì)胞介素，一種癌基因，一種抗血管發(fā)生因子，一種藥物抗性基因和/或任何其它所需的允許選定的基因被帶入核周邊附近因而產(chǎn)生沉默或下調(diào)的靶。感興趣的植物基因包括，但非限于，番茄，玉米，水稻和谷類植物的基因。而且，多種具有共同核苷酸靶序列的靶基因可以協(xié)同或同時(shí)被控制。
本發(fā)明的另一方面涉及用于基因阻抑的分子開關(guān)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包含(a)具有可以特異性結(jié)合與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列的第一結(jié)構(gòu)域的第一融合蛋白，和可以特異性結(jié)合一個(gè)二價(jià)配體的第一結(jié)合部分的第二結(jié)構(gòu)域，其中所述配體可以被細(xì)胞攝取，及所述第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域互為異源；和(b)包含可以關(guān)聯(lián)所述核周邊核的第一結(jié)構(gòu)域和可以特異性結(jié)合所述二價(jià)配體的第二結(jié)合部分的第二結(jié)構(gòu)域的第二融合蛋白。所述第一融合蛋白的第一結(jié)構(gòu)域和本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)的第一結(jié)構(gòu)域相同；及所述第二融合蛋白的第一結(jié)構(gòu)域和本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)的第二結(jié)構(gòu)域相同。所述2個(gè)融合蛋白的第二結(jié)構(gòu)域可以是分別對(duì)所述配體結(jié)合部分具有特異性的抗體的單鏈可變區(qū)(scFv)。
本發(fā)明的其它方面提供了分離的編碼本發(fā)明基因阻抑的融合蛋白的核酸，包含這些核酸的表達(dá)載體，和用所述表達(dá)載體(通過(guò)任何方法)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。這樣的宿主細(xì)胞可以用于通過(guò)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞一段時(shí)間并在一定條件下表達(dá)所述融合蛋白質(zhì)及回收所述融合蛋白質(zhì)的制備融合蛋白質(zhì)的方法中。另外所述宿主細(xì)胞可以用作表達(dá)載體的來(lái)源以通過(guò)基因轉(zhuǎn)移方法運(yùn)送所述融合蛋白待細(xì)胞或生物體中。另外，本發(fā)明提供了這些融合蛋白，所述分子開關(guān)系統(tǒng)，核酸和表達(dá)載體的藥物組合物。
用于基因阻抑的分子開關(guān)可以用于在時(shí)間上或空間上阻抑靶基因表達(dá)的方法中，其通過(guò)(a)將含有具有與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列的核酸的細(xì)胞或生物體與這些分子開關(guān)系統(tǒng)接觸，及(b)將所述細(xì)胞或生物體與所述分子開關(guān)相同的二價(jià)配體在同時(shí)或同地接觸以在所述融合蛋白質(zhì)間形成復(fù)合物因而通過(guò)將所述靶基因定位到核周邊核周邊來(lái)阻抑所述靶基因的表達(dá)。這個(gè)分子開關(guān)系統(tǒng)的融合蛋白質(zhì)可以作為蛋白質(zhì)，一或多個(gè)編碼一或多個(gè)這些蛋白質(zhì)的核酸，或其組合導(dǎo)入細(xì)胞或生物體中。
本發(fā)明的另一方面涉及用于基因阻抑的分子開關(guān)系統(tǒng)，即激活阻抑的基因。這些系統(tǒng)包含(a)包含可以特異性結(jié)合于與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列的第一結(jié)構(gòu)域的，和可以特異性結(jié)合一種結(jié)合伴侶(bindingpartner)的第二結(jié)構(gòu)域的第一融合蛋白，其中所述第一和第二結(jié)構(gòu)域是互為異源的；和(b)包含可以與核周邊關(guān)聯(lián)的第一結(jié)構(gòu)域和包含所述第一融合蛋白的第二結(jié)構(gòu)域的結(jié)合伴侶的第二結(jié)構(gòu)域的第二融合蛋白，所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域是異源的。所述第一融合蛋白的第一結(jié)構(gòu)域與本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)的第一結(jié)構(gòu)域是相同的；且所述第二融合蛋白的第一結(jié)構(gòu)域與本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)的第二結(jié)構(gòu)域是相同的。所述第一融合蛋白的第二結(jié)構(gòu)域可以是S-蛋白且所述第二融合蛋白的第二結(jié)構(gòu)域可以是S-標(biāo)簽，或反之亦然。
本發(fā)明的其它方面提供了分離的編碼用于本發(fā)明基因去阻抑的這些融合蛋白的核酸，包含這些核酸的表達(dá)載體，和用所述表達(dá)載體(通過(guò)任何方法)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。這樣的宿主細(xì)胞可以用于通過(guò)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞一段時(shí)間并在一定條件下表達(dá)所述融合蛋白及回收所述融合蛋白的制備所述融合蛋白的方法中。另外所述宿主細(xì)胞可以用作表達(dá)載體的來(lái)源以通過(guò)基因轉(zhuǎn)移方法輸送所述融合蛋白到細(xì)胞或生物體中。另外，本發(fā)明提供了這些融合蛋白，分子開關(guān)系統(tǒng)，核酸和表達(dá)載體的藥物組合物。
用于基因去阻抑的分子開關(guān)系統(tǒng)可以用于時(shí)間或空間改變靶基因表達(dá)的方法中，其通過(guò)(a)將含有具有與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列的靶核酸的細(xì)胞或生物體與這些分子開關(guān)系統(tǒng)接觸，和(b)將細(xì)胞或生物體和所述分子開關(guān)系統(tǒng)的配體同時(shí)或同地接觸以破壞第一和第二融合蛋白的關(guān)聯(lián)因而通過(guò)從與核周邊的關(guān)聯(lián)中釋放所述靶基因而使所述靶基因的表達(dá)去阻抑。這個(gè)分子開關(guān)系統(tǒng)的融合蛋白可以作為蛋白質(zhì)，一或多個(gè)編碼一或多個(gè)這些蛋白的核酸，或其組合導(dǎo)入細(xì)胞或生物體中。


圖1顯示使用本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)將一或多個(gè)靶基因帶入核周邊的附近而產(chǎn)生的單一或多個(gè)基因的阻抑。
具體實(shí)施例方式
A.本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)本發(fā)明涉及阻抑基因表達(dá)的靶特異性的嵌合蛋白質(zhì)，所述阻抑通過(guò)將靶基因帶入核周邊的附近并由此沉默或下調(diào)那個(gè)基因的表達(dá)而進(jìn)行。所述嵌合蛋白質(zhì)包含至少2個(gè)異源結(jié)構(gòu)域可以特異性結(jié)合于與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列的第一結(jié)構(gòu)域，和可以通過(guò)結(jié)合或關(guān)聯(lián)核被膜，核纖層，異染色質(zhì)或三者任意組合中的蛋白而與核周邊相關(guān)聯(lián)的第二結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中有用，特別是阻抑或下調(diào)選定的基因的表達(dá)。例如，可能希望下調(diào)或關(guān)閉涉及腫瘤發(fā)生，細(xì)胞增殖和再生，血管發(fā)生(當(dāng)發(fā)生如腫瘤的不利的血管形成時(shí))，或植物特定發(fā)育或生長(zhǎng)階段的基因。類似地，本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)可以用于下調(diào)或關(guān)閉病毒基因。
如此處所用，術(shù)語(yǔ)“核周邊”包括核被膜和核纖層。位于核周邊附近的基因是物理性臨近核周邊及，根據(jù)本發(fā)明，其通過(guò)和結(jié)合或與核被膜或核纖層相關(guān)聯(lián)的核被膜，核纖層或異染色質(zhì)的部分的蛋白形成(共價(jià)或非共價(jià))關(guān)聯(lián)而定位。為本發(fā)明的目的，不需要確定關(guān)于核周邊的基因的真實(shí)的物理位置，但應(yīng)該可以測(cè)量和應(yīng)用相對(duì)于正常表達(dá)水平，或其它表達(dá)對(duì)照水平的基因表達(dá)的減少。
如此處所用，術(shù)語(yǔ)“嵌合蛋白質(zhì)”用來(lái)表明本發(fā)明的蛋白質(zhì)是非天然存在的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)是人工構(gòu)建體，其組合了核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和可以不同來(lái)源的核周邊相關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)域，即兩個(gè)互為異源的結(jié)構(gòu)域。當(dāng)存在多個(gè)結(jié)構(gòu)域時(shí)，只有一個(gè)核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域與所述可以與核周邊相關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)域來(lái)源不同便已足夠。異源結(jié)構(gòu)域的來(lái)源可以是，獨(dú)立地，來(lái)自不同的物種，來(lái)自不同的生物體株，來(lái)自單一生物體的不同蛋白質(zhì)或來(lái)自設(shè)計(jì)具有所需活性的人工蛋白質(zhì)，并且沒有一種組合會(huì)產(chǎn)生天然存在的蛋白質(zhì)。
所述嵌合蛋白質(zhì)的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合于與所述靶基因關(guān)聯(lián)的核苷酸序列。這個(gè)結(jié)構(gòu)域的特性和性質(zhì)通過(guò)需要被所述嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合的核苷酸序列確定。如此處所用，“特異性結(jié)合”表示，包括指一種DNA結(jié)合部分或蛋白(例如，作為整個(gè)蛋白，作為結(jié)構(gòu)域，或存在于本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)中)與特定的核苷酸序列的結(jié)合或關(guān)聯(lián)，與其結(jié)合其它核苷酸序列相比，達(dá)到可檢測(cè)的程度(例如，至少背景水平的1.5倍)，并且在特定的條件下，如溫度，離子強(qiáng)度，溶劑極性等基本上排除與其它核苷酸序列結(jié)合。凝膠遷移分析，本領(lǐng)域熟知，是用于分析和證實(shí)結(jié)合是否對(duì)特定核苷酸序列特異性的一種方法。
可能控制關(guān)于靶基因的核苷酸序列性質(zhì)和位置。如此處所用，“靶多核苷酸”，“靶基因相關(guān)的核苷酸序列”或“標(biāo)的核苷酸序列”或其它類似的術(shù)語(yǔ)指一部分雙鏈多核苷酸，優(yōu)選DNA，其被所述嵌合蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。這個(gè)標(biāo)的核苷酸序列可位于任何位置，靠近或位于靶基因之內(nèi)以被調(diào)節(jié)，所述位置適于阻抑所述靶基因的表達(dá)。例如，所述標(biāo)的核苷酸序列可以位于所述編碼區(qū)之內(nèi)，其直接的上游或下游或其可以有一些距離(例如，幾百個(gè)核苷酸)，如果選定的核苷酸序列還允許所述基因被帶入核周邊足夠近的位置以相對(duì)于正常或其它對(duì)照水平減少所述基因的表達(dá)。標(biāo)的核苷酸序列還可以是所用或部分靶基因的已知的轉(zhuǎn)錄控制元件。
標(biāo)的核苷酸序列的長(zhǎng)度可以從6-10核苷酸到大約50，60，70或更多的核苷酸的范圍之間。適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄虚L(zhǎng)度的例子是大約8到大約30，大約10到25，和大約10到20個(gè)核苷酸。大約16個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度足夠提供在人基因組中的獨(dú)特靶位點(diǎn)。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性和親和性，作為標(biāo)的生物體和序列的性質(zhì)是確定標(biāo)的核苷酸序列的適當(dāng)長(zhǎng)度的所有因素?；谶@樣的考慮，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定標(biāo)的核苷酸序列的長(zhǎng)度和特性。
所述嵌合蛋白質(zhì)的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是具有DNA結(jié)合活性的已知的或人工DNA結(jié)合蛋白或其片段。DNA結(jié)合蛋白的實(shí)例包括但非限于鋅指蛋白質(zhì)(ZFP)，人工鋅指蛋白質(zhì)(AZP)，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合部分，核激素受體，同源盒結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)如engrailed或antenopedia，螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序蛋白質(zhì)如λ阻抑子和tet阻抑子，Gal4，TATA結(jié)合蛋白質(zhì)，螺旋-環(huán)-螺旋基序蛋白質(zhì)如myc和myoD，亮氨酸拉鏈類型蛋白質(zhì)如fos和jun，和β-折疊基序蛋白質(zhì)如met，arc和mnt阻抑子，或任何那些蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合部分。這樣的蛋白質(zhì)和部分是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
優(yōu)選的本發(fā)明核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)是ZFP和AZP。存在許多ZFP，包括但非限于Cys2His2類(例如，SpIC和Zif268)，Cys6(例如，Gal4 DNA結(jié)合蛋白質(zhì))和Cys4(例如，雌激素受體)；可以使用具有所需核苷酸序列特異性的任何這些蛋白質(zhì)。
“鋅指蛋白質(zhì)”，“鋅指多肽”，“ZFP”，“人工鋅指蛋白質(zhì)”指具有被鋅穩(wěn)定的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽。單獨(dú)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域典型地指“指”，所ZFP或肽具有至少一個(gè)指，更典型地2個(gè)指，更優(yōu)選地3個(gè)指，或更優(yōu)選4或5個(gè)指，到至少6或更多個(gè)指。每個(gè)指結(jié)合DNA的3或4個(gè)堿基對(duì)。在ZFP和AZP的Cys2-His2類中，每個(gè)指是典型地大約30個(gè)氨基酸，鋅螯合，DNA結(jié)合部分結(jié)構(gòu)域。Cys2-His2類的代表序列基序是Cys-(X)2-4-Cys-(X)12-His-(X)3-5-His，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO1)。兩個(gè)不變組氨酸殘基和兩個(gè)不變半胱氨酸殘基結(jié)合鋅陽(yáng)離子[見例如，Berg等，(1996)Science 2711081-1085]。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合蛋白質(zhì)具有的第一結(jié)構(gòu)域是包含至少一個(gè)鋅指，每個(gè)鋅指表示式是-X3-Cys-X2-4-Cys-X5-Z-1-X-Z2-Z3-X2-Z6-His-X3-5-His-X4-，(SEQ ID NO2)的AZP，當(dāng)存在多個(gè)鋅指時(shí)，其互相獨(dú)立地由0到10個(gè)氨基酸殘基共價(jià)結(jié)合，其中X是任何氨基酸，Xn代表在多肽鏈中X出現(xiàn)的次數(shù)，Z-1，Z2，Z3和Z6通過(guò)表1和2所示的識(shí)別密碼確定(以下進(jìn)一步解釋)。
X表示的氨基酸形成Cys2His2鋅指的骨架而且可以是已知的鋅指骨架，共有骨架，通過(guò)變化任何已知這些骨架或任何人工骨架的序列得到的骨架。優(yōu)選已知的骨架用于確定每個(gè)X的特性。某些實(shí)施方案中，確定X的骨架是來(lái)自Sp1，Sp1 C或Zif268。優(yōu)選的實(shí)施方案中，骨架具有Sp1C結(jié)構(gòu)域2的序列(即，SpIC的中間鋅指)，其序列是Pro-Tyr-Lys-Cys-Pro-Glu-Cys-Gly-Lys-Ser-Phe-Ser-Z-1-Ser-Z2-Z3-Leu-Gln-Z6-His-Gln-Arg-Thr-His-Thr-Gly-Glu-Lys-(SEQ ID NO3)。這樣的AZP在U.S.Serial No.09/911,261，Takashi Sera于2001年7月23日遞交，中被更完全地描述。
本發(fā)明的AZP可以包含3到40個(gè)鋅指，3到15個(gè)指，3到12個(gè)指，3到9個(gè)指或3到6個(gè)指，以及具有3，4，5，6，7，8或9個(gè)指的ZFP。
以上公式中Z-1，Z2，Z3和Z6的鋅指的4個(gè)核酸接觸殘基主要負(fù)責(zé)確定DNA結(jié)合的特異性和親和性。這4個(gè)氨基酸殘基還可以稱作堿基接觸氨基酸。這4個(gè)殘基相對(duì)于第一共有組氨酸和第二共有半胱氨酸處于相同的位置。第一殘基是第一共有組氨酸N末端側(cè)的7個(gè)氨基酸和第二共有半胱氨酸C末端側(cè)的6個(gè)氨基酸。第一殘基也稱作“-1位置”并且如此命名，因?yàn)樗砹司o接于鋅指α螺旋N末端的殘基(位置1是α螺旋第一個(gè)N末端殘基)。其它3個(gè)氨基酸出現(xiàn)在α螺旋的位置2，3和6，也分別稱作“2位置”，“3位置”，“6位置”。這4個(gè)位置也稱作此處的Z2，Z3和Z6位置。
識(shí)別密碼表提供了確定給定核苷酸序列的Z-1，Z2，Z3和Z6特性的方法。在識(shí)別密碼表中(及對(duì)于核苷酸序列的每4個(gè)堿基對(duì)部分)，堿基都是5’到3’順序。然而，第4個(gè)堿基總是靶序列中第4個(gè)堿基的互補(bǔ)物。例如，如果靶序列是ATCC，則表示有義鏈靶序列是5’-ATCC-3’和反義鏈?zhǔn)?’-TAGG-5’。因此，當(dāng)有義鏈序列ATCC翻譯為下表1的氨基酸，第一堿基A表示在位置6有谷氨酰胺，第二堿基T表示在位置3有絲氨酸和第三堿基C表示在位置-1有谷氨酸。然而，因?yàn)榈谒膲A基是C，它表示C的互補(bǔ)物，即G在表中而且有于鑒定位置2的氨基酸。這時(shí)，位置2的氨基酸是絲氨酸。
表1和2提供了AZP優(yōu)選和替代的識(shí)別密碼表分別用于本發(fā)明，總結(jié)為表1

表2

表2中，每個(gè)方框中所列的氨基酸的順序從左到右表示該位置最優(yōu)選到次優(yōu)選的氨基酸。
這些識(shí)別密碼表還可以如下描述。AZP的優(yōu)選識(shí)別密碼表(等同于表1)是對(duì)于每個(gè)4堿基靶序列，從5’到3’順序(i)如果第一堿基是G，則Z6是精氨酸，如果第一堿基是A，則Z6是谷氨酰胺，如果第一堿基是T，則Z6是蘇氨酸，酪氨酸或亮氨酸，如果第一堿基是C，則Z6是谷氨酸，(ii)如果第二堿基是G，則Z3是組氨酸，如果第二堿基是A，則Z3是天冬酰胺，如果第二堿基是T，則Z3是絲氨酸，如果第二堿基是C，則Z3是天冬氨酸，(iii)如果第三堿基是G，則Z-1是精氨酸，如果第三堿基是A，則Z-1是谷氨酰胺，如果第三堿基是T，則Z-1是蘇氨酸或甲硫氨酸，如果第三堿基是C，則Z-1是谷氨酸，(iv)如果第四堿基的互補(bǔ)物是G，則Z2是絲氨酸，如果第四堿基的互補(bǔ)物是A，則Z2是天冬酰胺，如果第四堿基的互補(bǔ)物是T，則Z2是蘇氨酸，和如果第四堿基的互補(bǔ)物是C，則Z2是天冬氨酸。
以上識(shí)別密碼(即，表1識(shí)別密碼)的優(yōu)選實(shí)施方案中，如果第一堿基是T，則Z6是蘇氨酸；及如果第三堿基是T，則Z-1是蘇氨酸(表1)。
替代的識(shí)別密碼表(等同于表2)也可以表示如下(i)如果第一堿基是G則Z6是精氨酸或賴氨酸，如果第一堿基是A，則Z6是谷氨酰胺或天冬酰胺，如果第一堿基是T，則Z6是蘇氨酸，酪氨酸，亮氨酸，異亮氨酸或甲硫氨酸，如果第一堿基是C，則Z6是谷氨酸或天冬氨酸，(ii)如果第二堿基是G，則Z3是組氨酸或賴氨酸，如果第二堿基是A，則Z3是天冬酰胺或谷氨酰胺，如果第二堿基是T，則Z3是絲氨酸，丙氨酸，纈氨酸或蘇氨酸，如果第二堿基是C，則Z3是天冬氨酸或谷氨酸，(iii)如果第三堿基是G，則Z-1是精氨酸或賴氨酸，如果第三堿基是A，則Z-1是谷氨酰胺或天冬酰胺，如果第三堿基是T，則Z-1是蘇氨酸，甲硫氨酸，亮氨酸或異亮氨酸，如果第三堿基是C，則Z-1是谷氨酸或天冬氨酸，
(iv)如果第四堿基的互補(bǔ)物是G，則Z2是絲氨酸或精氨酸，如果第四堿基的互補(bǔ)物是A，則Z2是天冬酰胺或谷氨酰胺，如果第四堿基的互補(bǔ)物是T，則Z2是蘇氨酸，纈氨酸或丙氨酸，和如果第四堿基的互補(bǔ)物是C，則Z2是天冬氨酸或谷氨酸。
為應(yīng)用識(shí)別密碼表設(shè)計(jì)和鑒定給定核苷酸序列的AZP，3N+1堿基對(duì)長(zhǎng)的核苷酸序列被分為重疊的4堿基對(duì)片段，其中N是靶中重疊的4堿基對(duì)片段的數(shù)目，每個(gè)片段的第四堿基，到N-1片段，是緊接下一個(gè)片段的第一堿基。鋅指中每個(gè)Z1，Z2，Z3和Z6的鑒定是按照識(shí)別密碼表確定的。
本發(fā)明設(shè)計(jì)的鋅指是互相直接共價(jià)連接或可以被1-10個(gè)氨基酸的接頭分隔。接頭氨基酸可以提供靈活性或某些程度的結(jié)構(gòu)剛性。接頭可以是，但不必須是通過(guò)ZFP對(duì)其同類核苷酸序列的所需親和性所規(guī)定的。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知測(cè)試和最佳化多種接頭序列以改良AZP對(duì)其同類靶序列的結(jié)合親和性。例如，6個(gè)鋅指ZFP的一個(gè)有用的排列是前3個(gè)鋅指不通過(guò)接頭連接，第3和第4指間有一個(gè)靈活的氨基酸接頭，最后3個(gè)指不通過(guò)接頭連接。這個(gè)排列可以使每個(gè)3指基團(tuán)獨(dú)立結(jié)合其靶序列，同時(shí)最小化了對(duì)其它3指基團(tuán)結(jié)合的空間障礙。
一個(gè)實(shí)施方案中，較長(zhǎng)的基因組序列用使用靈活的接頭連接于其它多指AZP的多指AZP定向，所述接頭包括，但非限于，GGGGS，GGGS和GGS(這些序列可以分別是AZP中1-10個(gè)額外氨基酸的部分；SEQ IDNO4，SEQ ID NO4的2-5位殘基；和SEQ ID NO4的3-5位殘基。)另外，本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以設(shè)計(jì)為通過(guò)使用單個(gè)結(jié)構(gòu)域或多個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合非連續(xù)核苷酸序列。例如，6指AZP結(jié)合的核苷酸序列可以是具有間隔堿基(其不接觸鋅指)的10堿基對(duì)序列(被3個(gè)指識(shí)別)和第二個(gè)10堿基對(duì)序列(被其它3指識(shí)別)。間隔堿基的數(shù)目可以變化，所以可以在AZP的兩個(gè)3指部分間使用適當(dāng)設(shè)計(jì)的氨基酸接頭補(bǔ)償這個(gè)間隔的距離。靶結(jié)合位點(diǎn)中的間隔核酸堿基的范圍可以是5-100，和優(yōu)選10-20或更少，更優(yōu)選10或更少，及更優(yōu)選6或更少。當(dāng)然，接頭保持了連接的AZP部分間的閱讀框架。
已知通過(guò)噬菌體展示，所及誘變，組合文庫(kù)，計(jì)算機(jī)/推理設(shè)計(jì)，親和性選擇，PCR，克隆cDNA或基因組文庫(kù)，合成構(gòu)建體等設(shè)計(jì)和構(gòu)建編碼ZFP和AZP核酸的方法。(見例如，U.S.Pat.No.5,786，538；Wu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92344-348(1995)；Jamieson等，Biochemistry 335689-5695(1994)；Rebar & Pabo，Science 263671-673(1994)；Choo &Klug，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111168-11172(1994)；Desjarlais等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897345-5349(1992)；Desjarlais等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902256-2260(1993)；Desjarlais等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111099-11103；Pomerantz等，Science 26793-96(1995)；Pomerantz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 929752-9756(1995)；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 945525-5530(1997)；Griesman & Berg，Science 275657-661(1997)；和U.S.Serial No.09/911,26l to Sera filed July 23，2001(Sera的申請(qǐng))。例如，Sera的申請(qǐng)描述了可以生產(chǎn)AZP組合文庫(kù)的制備AZP的模塊方法。這些AZP可以用于篩選和/或選擇分析以鑒定結(jié)合靶基因或靶基因附近的AZP。一旦已知這樣的AZP，它們可以作為本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的第一結(jié)構(gòu)域。同樣，通過(guò)無(wú)論體外或體內(nèi)的篩選或選擇步驟獲得的任何AZP(或ZFP)可以用作第一結(jié)構(gòu)域，只要這個(gè)AZP(或ZFP)通過(guò)本發(fā)明預(yù)期的方式特異性結(jié)合或關(guān)聯(lián)靶基因。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)可以具有多個(gè)第一核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。每個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合選定的核苷酸序列。這樣的序列可以互相鄰近或相隔一些距離，只要所述距離不阻止嵌合蛋白質(zhì)定位于核周邊和阻抑關(guān)聯(lián)的靶基因的表達(dá)。當(dāng)存在一個(gè)第一結(jié)構(gòu)域，所述核苷酸序列相對(duì)于靶基因可以位于任何位置，只要嵌合蛋白質(zhì)和核苷酸序列和核周邊的結(jié)合或關(guān)聯(lián)阻抑基因表達(dá)。額外的第一結(jié)構(gòu)域可以加入本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄阻抑。嵌合蛋白質(zhì)具有1到6個(gè)第一結(jié)構(gòu)域，1到3個(gè)第一結(jié)構(gòu)域，或1個(gè)第一結(jié)構(gòu)域。
其它轉(zhuǎn)錄阻抑子的實(shí)例包括，但非限于，人KOX-I蛋白的KRAB阻抑結(jié)構(gòu)域(Thiesen等，New Biologist 2363-374(1990)；Margolin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.914509-4513(1994)；Pengue等，Nucl.Acids Res.222908-2914(1994)；Witzgall等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.914514-4518(1994))。KAP-1，KRAB共阻抑子，可以和KRAB應(yīng)用(Friedman等proteins such as LAP 2p and the LAP 2p interaction region(amino acids138-524))。[Nili等，2001]。第二結(jié)構(gòu)域的其它優(yōu)選蛋白包括524-氨基酸小鼠GCL蛋白[Leatherman等(2000)Mech.Dev.92145-153]，或任何其它GCL蛋白如來(lái)自果蠅或任何其它哺乳動(dòng)物物種的蛋白。GCL可以通過(guò)纖層相關(guān)蛋白(LAP)間接結(jié)合核纖層。第二結(jié)構(gòu)域的其它有用的蛋白(或它們的結(jié)合部分)包括Rb，Oct-1的過(guò)磷酸化形式和胰島素激活子IPF/PDX-1(其在存在低葡萄糖時(shí)位于核膜)。對(duì)所有第二結(jié)構(gòu)域，選擇與靶基因來(lái)自相同物種的結(jié)構(gòu)域可能是有用的。異染色質(zhì)結(jié)合蛋白(或其具有結(jié)合活性的部分)還可以用作本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的第二結(jié)構(gòu)域。有用的異染色質(zhì)結(jié)合蛋白包括，但非限于，HP1和polycomb-group蛋白。
本發(fā)明的另一方面，核定位肽可以附于本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)上以幫助蛋白到核的轉(zhuǎn)運(yùn)。所述核定位肽促進(jìn)了存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白向核的轉(zhuǎn)運(yùn)。核定位肽可以單獨(dú)使用或與其它結(jié)構(gòu)域聯(lián)合使用。核定位肽的一個(gè)例子是來(lái)自SV40巨大T抗原的肽，序列為Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val(SEQ ID NO9)。
另外，嵌合蛋白質(zhì)可以具有附著的細(xì)胞攝取信號(hào)，單獨(dú)或聯(lián)合核定位肽使用，以幫助蛋白到細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。這樣的細(xì)胞攝取信號(hào)包括，但非限于，最小的Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其是人免疫缺陷病毒Tat蛋白的47-57位殘基YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO5)；Antenapedia(pAntp)同源結(jié)構(gòu)域的43-58位殘基Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys(SEQID NO10)(Derossi等，(1994)J.Biol.Chem.26910444-10450)；單純皰疹病毒(HSV)VP22蛋白的267-300位殘基Asp-Ala-Ala-Thr-Ala-Thr-Arg-Gly-Arg-Ser-Ala-Ala-Ser-Arg-Pro-Thr-Glu-Arg-Pro-Arg-Ala-Pro-Ala-Arg-SerAla-Ser-Arg-Pro-Arg-Arg-Pro-Val-Glu(SEQ ID NO11)(Elliott等(1997)Cell 88223-233)；多種具有報(bào)道的細(xì)胞攝取信號(hào)活性的基本肽如Tyr-Ala-Arg-Ala-Ala-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala(SEQ ID NO12)(Ho等(2001)Cancer Res.61474-477)，Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg(SEQ ID NO13)，也已知為R9(Jin等(2001)Free Rad.Biol.Med.311509-1519)和R9的所用D-精氨酸形式(Winder等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9713003-13008)；和Temsamani小組描述的肽，其包括可以攜帶物質(zhì)跨過(guò)血腦屏障的肽，如WO00/32236，可以攜帶抗癌物進(jìn)入癌細(xì)胞的肽，如WO00/32237描述，WO02/02595的抗生素肽的兩性肽部分，WO02/053583描述的轉(zhuǎn)運(yùn)荷負(fù)電的物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞或細(xì)胞核的兩性肽，荷WO02/067994的止痛分子的肽載體部分。
Temsamani描述的肽包括但非限于D-penetratin(rqikiwfqnrrmkwkk；所用的氨基酸是D形式)(SEQ ID NO14)，pAntp和其活性變體，SynB1(RGGRLSYSRRRFSTSTGR)(SEQ ID NO15)，L-SynB3(RRLSYSRRRF)(SEQ ID NO16)，和D-SynB3(rrlsysrrrf；所用的氨基酸是D形式)(SEQ ID NO17)。
為易于純化，監(jiān)測(cè)表達(dá)，或監(jiān)測(cè)細(xì)胞和亞細(xì)胞定位，本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)還可以表達(dá)為具有如麥芽糖結(jié)合蛋白(“MBP”)，綠色熒光蛋白(GFP)，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)，六組氨酸，c-myc，F(xiàn)LAG表位Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO18)的這樣的蛋白或蛋白部分的融合蛋白。
本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)可以合成制備或重組制備，優(yōu)選重組，使用任何本領(lǐng)域已知的技術(shù)。當(dāng)重組制備了蛋白，例如，通過(guò)編碼嵌合蛋白質(zhì)的DNA，密碼使用可以優(yōu)化以在蛋白表達(dá)的生物體中高表達(dá)。這樣的生物體包括細(xì)菌，真菌，酵母，動(dòng)物，昆蟲和植物。更特異性地，生物體包括但非限于人，小鼠，大腸桿菌，谷類植物，水稻，番茄和玉米。當(dāng)核酸用于輸送本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)時(shí)，密碼使用可以對(duì)接受核酸構(gòu)建體的真核生物進(jìn)行最優(yōu)化。
可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)?shù)牡鞍准兓姆椒▉?lái)純化本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)[見例如，Sambrook等(1989)Molecular CloningALaboratory Manual(2ded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York]。另外，可以使用任何合適的宿主進(jìn)行蛋白表達(dá)，例如，細(xì)菌細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，酵母細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，植物細(xì)胞等等。
本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)和編碼其的核酸用來(lái)阻抑，下調(diào)或降低任何真核生物體的靶基因(通過(guò)其和特定核苷酸序列的關(guān)聯(lián)確定)的表達(dá)，所述真核生物體包括酵母，動(dòng)物和植物。所述靶基因可以編碼任何需要阻抑表達(dá)的真核基因。例如，靶基因可以編碼細(xì)胞因子，白細(xì)胞介素，癌基因，血管發(fā)生因子，抗血管發(fā)生因子，藥物抗性基因，生長(zhǎng)因子和/或腫瘤抑制因子。靶基因還可以是病毒基因，特別是DNA病毒。靶基因可以編碼一個(gè)植物基因。這些植物基因的優(yōu)選來(lái)源是番茄，玉米，水稻和谷類植物。
靶基因可以是癌基因，包括，但非限于，myc，jun，fos，myb，max，mad，rel，ets，bcl，myb，mos家族成員和相關(guān)的因子和修飾物。癌基因的描述見，例如，Cooper，Oncogenes，2nded.，The Jones and Bartlett Series inBiology，Boston，MA，Jones and Bartlett Publishers，1995。ets轉(zhuǎn)錄因子的綜述見Waslylk等，Eur.J.Biochem.2117-18(1993)。Myc癌基因的綜述見例如，Ryan等，Biochem.J.314713-21(1996)。Jun和fos轉(zhuǎn)錄因子的描述見例如，The Fos and Jun Families of Transcription Factors，Angel &Herrlich，eds.(1994)。max癌基因的綜述見Hurlin等，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.59109-16。myb基因家族的綜述見Kanei-Ishii等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.21189-98(1996)。mos家族的綜述見Yew等，Curr.Opin.Genet.Dev.319-25(1993)。
本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)可以用于阻抑疾病相關(guān)的基因的表達(dá)。一個(gè)實(shí)例中，疾病相關(guān)基因是癌基因，如BCR-ABL融合癌基因或ras癌基因，以及DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)為結(jié)合DNA序列GCAGAAGCC(SEQ ID NO6)并且可以通過(guò)定位于核周邊及通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄過(guò)程中需要的一個(gè)序列而阻抑表達(dá)來(lái)阻抑BCR-ABL融合癌基因的表達(dá)。涉及疾病的轉(zhuǎn)錄因子的綜述見Aso等，J Clin.Invest.971561-9(1996)。
B.應(yīng)用方法本發(fā)明另一方面涉及通過(guò)定位所述基因于核周邊來(lái)阻抑或下調(diào)靶基因表達(dá)的方法。這個(gè)方法涉及將所述含有關(guān)聯(lián)或足夠接近所述靶基因的核苷酸序列的靶核酸與本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)接觸。所述核酸可以存在于細(xì)胞或生物體中并且優(yōu)選基因組DNA。然而，核酸還可以以染色體外DNA存在于核中。核苷酸序列和靶基因如上描述。足夠接近靶基因的核苷酸序列以測(cè)量暴露于本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)后靶基因的阻抑或下調(diào)。
根據(jù)本發(fā)明，嵌合蛋白質(zhì)可以作為蛋白質(zhì)或作為編碼該蛋白的核酸導(dǎo)入細(xì)胞。當(dāng)應(yīng)用蛋白時(shí)，嵌合蛋白質(zhì)可以，任選地，具有細(xì)胞攝取信號(hào)和/或核定位信號(hào)以促進(jìn)所述蛋白被細(xì)胞攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)到核中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定阻抑或下調(diào)靶基因表達(dá)所需的嵌合蛋白質(zhì)的量。當(dāng)應(yīng)用核酸如RNA或DNA時(shí)，其可以以任何形式，包括作為裸露質(zhì)粒或其它的DNA，在脂質(zhì)體中，病毒載體中(包括RNA病毒和DNA病毒)，通過(guò)一種壓力注射器如使用RNA或DNA的PowderjectTM系統(tǒng)，或通過(guò)任何其它方便的手段運(yùn)送。再者，基于靶細(xì)胞或生物體，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定阻抑或下調(diào)靶基因表達(dá)所需的核酸的量，運(yùn)送配方和模式和核酸是DNA或RNA。優(yōu)選應(yīng)用DNA。
根據(jù)本發(fā)明，嵌合蛋白質(zhì)在與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列處結(jié)合靶核酸。已知確定結(jié)合是否發(fā)生和感興趣的靶基因或蛋白發(fā)生阻抑的效率的方法。簡(jiǎn)言之，一個(gè)實(shí)施方案中，報(bào)道基因如3-葡萄糖苷酸酶，氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶，β-半乳糖苷酶(β-gal)或綠色熒光蛋白(GFP)可操縱地連接于控制啟動(dòng)子的靶基因序列，連接到一個(gè)轉(zhuǎn)化載體，及轉(zhuǎn)化進(jìn)動(dòng)物或植物細(xì)胞。導(dǎo)入嵌合蛋白質(zhì)后(作為蛋白或作為翻譯生產(chǎn)該蛋白的核酸)，分析報(bào)道基因相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照的水平?；蛘撸ㄟ^(guò)Northern印跡或其它方式測(cè)量RNA的水平。后一種方法當(dāng)不應(yīng)用報(bào)道構(gòu)建體時(shí)有用。
本發(fā)明試圖調(diào)控的基因可能是組織特異性的或不是，可誘導(dǎo)的或不是，并且可能發(fā)生在動(dòng)物細(xì)胞中，酵母細(xì)胞中，昆蟲細(xì)胞中，或培養(yǎng)的或完整植物的植物細(xì)胞中。有用的阻抑水平可以變化，依賴于靶基因是如何被正常調(diào)控地，調(diào)控時(shí)變化的影響，和其它類似因素。希望地，基因表達(dá)的變化被修飾至少大約1.5倍到2倍，大約3倍到5倍，大約8到10到15倍，或甚至更大如20到25到30倍，及甚至40，50，75，或100倍，或更大。基因表達(dá)的變化程度在各個(gè)系統(tǒng)還可以變化。使用的“生物體”是任何真核生物體，包括酵母，動(dòng)物，禽類，昆蟲，植物等等。動(dòng)物包括，但非限于，哺乳動(dòng)物(人，靈長(zhǎng)類，等)，商業(yè)性的或農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物(魚類，雞，牛，牲畜，豬，綿羊，山羊，火雞等)，研究動(dòng)物(小鼠，大鼠，兔子等)和寵物(狗，貓，鸚鵡和其它寵物鳥類，魚類等)。如此處，特定的動(dòng)物可以是多種動(dòng)物群的成員。
本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)(或編碼這些蛋白的核酸)可以用來(lái)，例如，阻抑，下調(diào)或降低大范圍的植物和植物組織，優(yōu)選對(duì)轉(zhuǎn)化技術(shù)接受的，特別是單子葉植物和雙子葉植物等高等植物的基因表達(dá)。
“植物”指處于任何發(fā)育階段任何植物或植物的部分，包括種子，懸浮培養(yǎng)物，胚胎，分生區(qū)，愈合組織，葉子，根，芽，配偶體，孢子體，花粉，和小孢子，及其子代。還包括切下的部分，和細(xì)胞或組織培養(yǎng)物。如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)“植物組織”包括，但非限于，植物細(xì)胞，植物器官(例如，葉子，莖，根，分裂組織)，植物種子，原生質(zhì)體，愈合組織，細(xì)胞培養(yǎng)物，和組織成結(jié)構(gòu)和/或功能單位的任何細(xì)胞群。
特別優(yōu)選的是單子葉植物如禾本科物種如高梁(Sorghum bicolor)和玉米(Zea mays)。本發(fā)明的分離的核酸和蛋白還可以用于以下屬的物種中北瓜(Cucurbita)，薔薇科(Rosa)，葡萄(Vitis)，核桃(Juglans)，草莓(Fragaria)，蓮花(Lotus)，苜蓿(Medicago)，紅豆(Onobrychis)，三葉草(Trifolium)，胡蘆巴(Trigonella)，豇豆(Vigna)，柑桔(Citrus)，亞麻(Linum)，天竺葵(Geranium)，木薯(Manihot)，野胡蘿卜(Daucus)，擬南芥(Arabidopsis)，蕓苔(Brassica)，蘿卜(Raphanus)，芥子(Sinapis)，顛茄(Atropa)，辣椒(Capsicum)，曼陀羅(Datura)，黑莨菪的干葉(Hyoscyamus)，番茄(Lycopersicon)，煙草(Nicotiana)，茄屬植物(Solanum)，矮牽?；?Petunia)，洋地黃(Digitalis)，馬喬蓮(Majorana)，Ciahorium，向日葵(Helianthus)，萵苣(Lactuca)，雀麥(Bromus)，蘆筍(Asparagus)，金魚草屬植物(Antirrhinum)，Heterocallis，Nemesis，天竺葵屬的植物(Pelargonium)，Panieum，狼尾草(Pennisetum)，毛茛屬植物(Ranunculus)，狗舌草(Senecio)，蛾蝶花(Salpiglossis)，甜瓜(Cucumis)，Browaalia，氨基乙酸(Glycine)，豌豆(Pisum)，豆科(Phaseolus)，黑麥草(Lolium)，水稻(Oryza)，燕麥(Avena)，大麥(Hordeum)，黑麥(Secale)，和小麥(Triticum)。
優(yōu)選的植物和植物組織包括來(lái)自以下的那些玉米(Zea mays)，雙低油菜(甘藍(lán)型油菜，大頭茶屬)，紫花苜蓿(Medicago sativa)，水稻(Oryzasativa)，黑麥(Secale cereale)，高梁(Sorghumbicolor，Sorghum vulgare)，向日葵(Helianthus annuus)，小麥(Triticum aestivum)，大豆(Glycine max)，煙草(Nicotiana tabacum)，馬鈴薯(Solanum tuberosum)，花生(Arachishypogaea)，棉花(Gossypium barbadense，Gossypium hirsutum)，甜馬鈴薯(Qpomoea batatus)，木薯(Manihot esculenta)，咖啡(Cqfea屬)，椰子(Cocos nucijra)，菠蘿(Ananas comosus)，柑桔樹(柑桔屬)，可可(Theobroma cacao)，茶(Camellia sinensis)，香蕉(Musa屬)，鱷梨(Perseaamericana)，無(wú)花果樹(Ficus casica)，番石榴(Psidium guajava)，芒果(Mangifera indica)，橄欖(Olea europaea)，木瓜(Carica papaya)，腰果(Anacardium occidentale)，澳大利亞堅(jiān)果(Macadamia integr～fblia)，杏仁(Prunus amygdalus)，甜菜(Beta vulgaris)，甘蔗(Saccharum spp.)，浮萍(Lemna spp.)，燕麥，大麥，蔬菜，觀賞植物，和松類。
優(yōu)選的蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)，萵苣(例如，Lactuca sativa)，青豆(Phaseolus vulgaris)，利馬豆(Phaseolus limensis)，豌豆(Lathyrus spp.)，和甜瓜類成員如黃瓜(C.sativus)，香瓜(Ccantalupensis)，和哈密瓜(C.melo)。
優(yōu)選的觀賞植物包括杜鵑花(Rhododendron spp.)，八仙花(Macrophylla hydrangea)，芙蓉(Hibiscus rosasanensis)，薔薇(Rosa spp.)，郁金香(Tulipa spp.)，水仙花(Narcissus spp.)，矮牽牛花(Petunia hybrida)，康乃馨(Dianthus caryophyllus)，猩猩木(Euphorbiapulcherrima)，和菊花。
可以應(yīng)用于本發(fā)明的松類包括，例如，松樹如厚皮刺果松(Pinustaeda)，沼澤松(Pinus elliotii)，北美黃松(Pinus ponderosa)，黑松(Pinuscontorta)，和輻射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西部鐵杉(Isuga canadensis)；錫特卡云杉(Picea glauca)；紅杉(Sequoiasempervirens)；冷杉如銀樅(Abies amabilis)和膠冷杉(Abies balsamea)；和雪松如西部紅松(Thuja plicata)和黃扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)。
最優(yōu)選地，本發(fā)明的植物和植物組織是農(nóng)作物植物(例如，谷物，紫花苜蓿，向日葵，canola，大豆，棉花，花生，高梁，小麥，煙草，等)，更優(yōu)選谷物和大豆植物，而更優(yōu)選谷物植物。
如此處所用，“轉(zhuǎn)基因植物”或“遺傳修飾的植物”指在其基因組中包含一個(gè)異源多核苷酸(即，一個(gè)來(lái)自不是受體生物體的多核苷酸)的一種植物。通常及優(yōu)選地，所述異源多核苷酸是穩(wěn)定整合在所述基因組中，因而所述多核苷酸被傳遞給繼承子代。所述異源多核苷酸可以單獨(dú)整合進(jìn)基因組或作為一個(gè)重組表達(dá)盒的一部分整合進(jìn)基因組。所用“轉(zhuǎn)基因”包括任何細(xì)胞，細(xì)胞系，愈合組織，組織，植物部分或植物，其基因型由于存在異源核酸而被改變，包括那些最初如此改變的轉(zhuǎn)基因生物以及自最初的轉(zhuǎn)基因生物有性繁殖或無(wú)性繁殖造成的基因型改變。此處所用術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋通過(guò)傳統(tǒng)植物育種方法或通過(guò)自然發(fā)生的事件如隨機(jī)異體受精，非重組病毒感染，非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化，非重組轉(zhuǎn)座，或自發(fā)突變產(chǎn)生的基因組(染色體或染色體外)改變。
C.表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明嵌合蛋白編碼核酸的重組表達(dá)盒。編碼本發(fā)明所需多核苷酸的核酸序列可以用來(lái)構(gòu)建一個(gè)可以導(dǎo)入一個(gè)所需宿主細(xì)胞的重組表達(dá)盒。一個(gè)重組表達(dá)盒典型地包含本發(fā)明的可操縱地連接到轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控序列的多核苷酸，所述轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控序列指導(dǎo)所需宿主細(xì)胞，如轉(zhuǎn)化植物的組織中所述多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。表達(dá)載體可以是哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，昆蟲表達(dá)載體，酵母表達(dá)載體或植物表達(dá)載體。當(dāng)為了制備和純化所述蛋白(其可以繼而用于，例如本發(fā)明的方法中)而表達(dá)所述蛋白時(shí)，所述表達(dá)載體可以是細(xì)菌表達(dá)載體。表達(dá)載體是本領(lǐng)域熟知的而且為了需的目的可以容易地選擇。
轉(zhuǎn)錄元件包括但非限于真核細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，包括多聚腺苷酸信號(hào)或polyA tracts的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，促進(jìn)核苷酸細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的元件等等。
適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止元件包括SV40轉(zhuǎn)錄終止區(qū)和衍生于其的終止子。
任何哺乳動(dòng)物，酵母，細(xì)菌，昆蟲，病毒，其它真核表達(dá)載體或表達(dá)盒可以應(yīng)用于本發(fā)明并且可以選自，例如，任何可商業(yè)獲得的載體或表達(dá)盒，如得自Invitrogen Corporation(San Diego，Calif.)的pECP4或pRc/RSV，得自Stratagene(La Jolla，Calif.)的pXT1，pSG5，pPbac orpMbac，得自ClonTech(PaloAlto，Calif.)的pPUR orpMAM，和得自PromegaCorporation(Madison，Wis.)的pSVβ-gal，或重新或通過(guò)應(yīng)用公開的或商業(yè)可獲得的真核表達(dá)系統(tǒng)合成。
表達(dá)盒中的各個(gè)元件可以衍生自多種來(lái)源并可以選擇來(lái)在受體細(xì)胞的表達(dá)盒激活或壽命的位點(diǎn)的特異性。這種表達(dá)盒的操縱可以通過(guò)任何標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行。
植物表達(dá)載體可以包括(1)一個(gè)克隆的位于5’和3’調(diào)控序列轉(zhuǎn)錄控制下的植物基因和(2)一個(gè)顯性選擇標(biāo)記。這樣的植物表達(dá)載體還可以含有，如果需要，一個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)(例如，產(chǎn)生可誘導(dǎo)的或組成性的，環(huán)境或發(fā)育調(diào)控的，或細(xì)胞或組織特異性的/選擇性表達(dá)的調(diào)控區(qū))，一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始開始位點(diǎn)，一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)RNA加工位點(diǎn)，一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，和/或一個(gè)多聚腺苷酸信號(hào)。
用于在高等植物中表達(dá)基因的典型載體是本領(lǐng)域熟知的并且包括衍生自根瘤農(nóng)桿菌的根瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒的載體，如Rogers等，Meth.inEnzymol.，153253-277(1987)描述。這些載體是植物整合載體，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)化時(shí)，所述載體整合載體DNA的一部分到宿主植物的基因組中。此處所用的示例根瘤農(nóng)桿菌載體是質(zhì)粒pKYLX6和pKYLX7，如Schardl等，Gene，611-11(1987)和Berger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，868402-8406(1989)所述。另一個(gè)有用的載體是質(zhì)粒pBIl01.2。
細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)和基因輸送方法(如體內(nèi)用于輸送基因的方法)是本領(lǐng)域熟知的。任何這樣的技術(shù)可以用來(lái)分別輸送編碼本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的核酸到細(xì)胞或體內(nèi)輸送到對(duì)象的細(xì)胞中。
所用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”指可以在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中指導(dǎo)特定核苷酸序列表達(dá)的DNA序列，包含可操縱地連接到感興趣的核苷酸序列的啟動(dòng)子，所述核苷酸序列被可操縱地連接于終止信號(hào)。其還典型地包含為所述核苷酸序列適當(dāng)翻譯所需的序列。所述編碼區(qū)通常編碼感興趣的蛋白但也可以編碼感興趣的功能性RNA，例如反義RNA或非翻譯RNA，以有義方向或反義方向。包含感興趣的核苷酸序列的表達(dá)盒可以是嵌合的，指至少其一個(gè)組分是與至少其另一個(gè)組分是異源的。所述表達(dá)盒還可以是一個(gè)天然存在的但以用于異源表達(dá)的重組形式獲得的表達(dá)盒。然而典型地，所述表達(dá)盒是與宿主異源的，即所述表達(dá)盒的特定DNA序列不是宿主細(xì)胞天然存在的并且必須通過(guò)轉(zhuǎn)化事件導(dǎo)入宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞的親代中。當(dāng)所述宿主細(xì)胞暴露于某些特定外部刺激時(shí)，所述表達(dá)盒中核苷酸序列的表達(dá)可能被只起始轉(zhuǎn)錄的組成性啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制。多細(xì)胞生物體中，如植物，所述啟動(dòng)子還可以是特異性于特定組織或器官或發(fā)育的階段。
多種啟動(dòng)子己知用于驅(qū)動(dòng)動(dòng)物細(xì)胞中基因的表達(dá)，如病毒衍生的SV40，CMV立即早期和，RSV啟動(dòng)子或真核衍生的 -酪蛋白，子宮珠蛋白， -肌動(dòng)蛋白或酪氨酸酶啟動(dòng)子。特定啟動(dòng)子不是本發(fā)明必需的，除非目的是獲得暫時(shí)瞬時(shí)或組織特異性的表達(dá)。例如，可以選擇只在所需組織或選定的細(xì)胞類型中有活性的啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括，但非限于，S1-和 -酪蛋白啟動(dòng)子，其特異性于乳腺組織(Platenburg等，Trans.Res.，399-108(1994)；和Maga等，Trans.Res.，336-42(1994))；烯醇丙酮酸磷酸羧激酶啟動(dòng)子，其在肝，腎，脂肪，空腸和乳腺組織中有活性，(McGrane等，J.Reprod.Fert.，4117-23(1990))；酪氨酸酶啟動(dòng)子，其在肺和脾細(xì)胞中有活性，但在睪丸，腦，心，肝或腎中沒有活性(Vile等，Canc.Res.，546228-6234(1994))；involucerin啟動(dòng)子，其只在扁平上皮的分化角化細(xì)胞中有活性(Carroll等，J.Cell Sci.，103925-930(1992))；及子宮珠蛋白啟動(dòng)子，其在肺和子宮內(nèi)膜中有活性(Helftenbein等，Annal.N.Y. Acad.Sci.，62269-79(1991))。
或者，細(xì)胞特異性增強(qiáng)序列可以用于控制表達(dá)，例如，人親神經(jīng)papovirus JCV增強(qiáng)子獨(dú)自調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的病毒轉(zhuǎn)錄(Remenick等，J.Virol.，655641-5646(1991))。另一種控制組織特異性表達(dá)的方法是使用一種激素應(yīng)答元件(HRE)以確定一種啟動(dòng)子有活性的細(xì)胞系，例如，MMTV啟動(dòng)子在其被激活前需要結(jié)合一個(gè)激素受體，如孕酮受體到上游HRE(Beato，F(xiàn)ASEB J.，52044-2051(1991)；和Truss等，J.Steroid Biochem.Mol.Biol.，41241-248(1992))。
一種植物啟動(dòng)子片段可以用于指導(dǎo)本發(fā)明的多核苷酸在一種再生植物的所有組織中表達(dá)。這樣的啟動(dòng)子此處指“組成性”啟動(dòng)子并且其在大多環(huán)境條件和發(fā)育或細(xì)胞分化狀態(tài)下有活性。組成性啟動(dòng)子的實(shí)施例包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，衍生自根瘤農(nóng)桿菌T-DNA的P-或2’-啟動(dòng)子，泛素I啟動(dòng)子，Smas啟動(dòng)子，桂醇脫氫酶啟動(dòng)子(U.S.Patent No.5,683，439)，Nos啟動(dòng)子，pEmu啟動(dòng)子，核酮糖二磷酸羧化酶-加氫酶啟動(dòng)子，GRP1-8啟動(dòng)子，和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種植物基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。
或者，所述植物啟動(dòng)子可以在特異性組織或在更精確的環(huán)境或發(fā)育控制下指導(dǎo)本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)。這樣的啟動(dòng)子這里指“可誘導(dǎo)的”啟動(dòng)子。通過(guò)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子影響轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件包括病原攻擊，無(wú)氧條件，或光的存在。可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的實(shí)例包括AdhI啟動(dòng)子，其被缺氧或冷刺激誘導(dǎo)，Hsp70啟動(dòng)子，其被熱刺激誘導(dǎo)，和PPDK啟動(dòng)子，其被光誘導(dǎo)。發(fā)育控制下的啟動(dòng)子的實(shí)例包括在某些組織，如葉，根，果實(shí)，種子，或花中只，或優(yōu)選引起轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。一個(gè)示例啟動(dòng)子是花藥特異性啟動(dòng)子5126(U.S.Patent Nos.5,689,049和5,689,051)。操縱啟動(dòng)子可能還依賴于其在基因組中的位置而變化。因而，一個(gè)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可能在某些位置是完全或部分組成性的。
可以應(yīng)用異源和非異源(即內(nèi)源)啟動(dòng)子指導(dǎo)本發(fā)明核酸的表達(dá)。這些啟動(dòng)子還可以用于，例如，重組表達(dá)盒以驅(qū)動(dòng)反義核酸的表達(dá)以在所需組織中減少，增加，或改變本發(fā)明蛋白的濃度和/或組成。因而，某些實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包含在植物細(xì)胞，如玉米中有功能的啟動(dòng)子，其可操縱地連接于本發(fā)明的多核苷酸。用于這些實(shí)施方案的啟動(dòng)子包括驅(qū)動(dòng)本發(fā)明多核苷酸表達(dá)的內(nèi)源啟動(dòng)子。
一些實(shí)施方案中，分離的核酸作為啟動(dòng)子或增強(qiáng)子元件可被導(dǎo)入非異源形式的多核苷酸的適當(dāng)位置(一般是上游)以便上或下調(diào)表達(dá)。例如，內(nèi)源啟動(dòng)子可以通過(guò)突變，缺失，和/或取代被改變(U.S.Patent 5,565,350；PCT/US93/03868)，或分離的啟動(dòng)子可以以合適的方向和距本發(fā)明的基因適當(dāng)?shù)木嚯x導(dǎo)入植物細(xì)胞中以便控制基因的表達(dá)。基因表達(dá)可以在適于植物生長(zhǎng)的條件下調(diào)節(jié)以便改變植物細(xì)胞中本發(fā)明多肽的總濃度和/或改變組成。
多種啟動(dòng)子可用于本發(fā)明，特別是控制嵌合蛋白質(zhì)表達(dá)的，選擇可以部分基于所需蛋白表達(dá)的水平和所需組織特異性，瞬時(shí)特異性或環(huán)境特異性的控制，如果植物細(xì)胞具有任何一個(gè)。組成性和組織特異性啟動(dòng)子是特別感興趣的。這樣的組成性啟動(dòng)子包括，例如，Rsyn7的核心啟動(dòng)子，核心CaMV 35S啟動(dòng)子(Odell等(1985)Nature 313810-812)，水稻肌動(dòng)蛋白(McElroy等(1990)Plant Cell 2163-171)；泛素(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12619-632和Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18675-689)，pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81581-588)，MAS(Velten等(1984)EMBOJ.32723-2730)，和例如U.S.Patent Nos.5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；和5,608,142描述的組成性啟動(dòng)子。
組織特異性的啟動(dòng)子可以用于在特定植物組織提高表達(dá)。組織特異性啟動(dòng)子包括Yamamoto等(1997)Plant J.12(2)255-265，Kawamata等(1997)Plant Cell Physiol.38(7)792-803，Hansen等(1997)Mol.Gen Genet.254(3)337)，Russell等(1997)Transgenic Res.6(2)15 7-168，Rinehart等(1996)Plant Physiol.112(3)1331，Van Camp等(1996)Plant Physiol.112(2)525-535，Canevascini等(1996)Plant Physiol.112(2)513-524，Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5)773-778，Lam(1994)Results Probl.CellDiffer.20181-196，Orozco等(1993)Plant Mol.Biol.23(6)1129-1138，Matsuoka等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)9586-9590，和Guevara-Garcia等(1993)Plant J.4(3)495-505描述的啟動(dòng)子。如果為了弱表達(dá)的需要，這樣的啟動(dòng)子可以被修飾。
葉特異性啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，包括例如Yamamoto等(1997)Plant J.12(2)255-265，Kwon等(1994)Plant Physiol.105357-67，Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5)773-778，Gotor等(1993)Plant J.3509-18，Orozco等(1993)Plant Mol.Biol.23(6)1129-1138，和Matsuoka等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(20)9586-9590描述的那些。
組成性或可誘導(dǎo)和非組織特異性的或組織特異性的啟動(dòng)子的任意組合可以用于控制本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的表達(dá)。所需的控制可以是使用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子的瞬時(shí)，發(fā)育或環(huán)境控制。環(huán)境控制的啟動(dòng)子是那些對(duì)病原攻擊，病原毒素，或其它外部化合物(例如，有意應(yīng)用的小分子誘導(dǎo)物)發(fā)生反應(yīng)的啟動(dòng)子。瞬時(shí)或發(fā)育啟動(dòng)子的實(shí)例是果實(shí)成熟依賴性啟動(dòng)子。特別優(yōu)選的是可誘導(dǎo)的PR1啟動(dòng)子，玉米泛素啟動(dòng)子，和ORS。
根據(jù)例如組織類型，細(xì)胞類型，發(fā)育階段，和/或環(huán)境條件，鑒定特定表達(dá)盒中啟動(dòng)子的方法是本領(lǐng)域熟知的。見，例如，The Maize Handbook，Chapters 114-115，F(xiàn)reeling和Walbot，Eds.，Springer，New York(1994)；Com and Corn Improvement，Pedition，Chapter 6，Sprague和Dudley，Eds.，American Society of Agronomy，Madison，Wisconsin(1988)。
植物轉(zhuǎn)化方法以及導(dǎo)入核苷酸序列進(jìn)入植物的方法因進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞的類型，即單子葉植物或雙子葉植物而可能變化。適當(dāng)?shù)膶?dǎo)入核苷酸序列進(jìn)入植物細(xì)胞和隨后插入植物基因組的方法包括微注射(Crossway等(1986)Biotechniques 4320-334)，電穿孔(Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad Sci.USA 835602-5606)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Townsend等，U.S.Pat No.5,563,055)，直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等(1984)EMBOJ.32717-2722)，和彈丸顆粒加速(見，例如，Sanford等，U.S.Patent No.4,945,050；Tomes等(1995)″Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment，″in Plant Cell，Tissue，and Organ CultureFundamental Methods，ed.Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；和McCabe等(1988)Biotechnology 6923-926)。另見Weissinger等(1988)Ann.Rev.Genet.22421-477；Sanford等(1987)Particulate Science andTechnology 527-37(洋蔥)；Christou等(1988)Plant Physiol.87671-674(大豆)；McCabe等(1988)BioTechnology 6923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.2 7P175-182(大豆)；Singh等(1998)Theor.Appl.Genet.96319-324(大豆)；Datta等(1990)Biotechnology 8736-740(水稻)；Klein等(1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA 854305-4309(玉米)；Klein等(1988)Biotechnology 6559-563(玉米)；Tomes，U.S.Patent No.5,240,855；Buising等，U.S.Patent Nos.5,322,783和5,324,646；Tomes等(1995)″Direct DNA Transfer into Intact PlantCells via Microprojectile Bombardment，″in Plant Cell Tissue，and OrganCultureFundamental Methods，ed.Gamborg(Springer-Verlag，Berlin)(玉米)；Klein等(1988)Plant Physiol.91440-444(玉米)；Fromm等(1990)Biotechnology 8833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等(1984)Nature(London)311763-764；Bowen等，U.S.Patent No.5,736,369(谷類)；Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad Sci.USA 845345-5349(Liliaceae)；DeWet等(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman等(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppleral.(1990)Plant Cell Reports 9415-418和Kaeppler等(1992)Theor.Appl.Genet.84560-566(whisker-mediated transformation)；D′Halluin等(1992)PlantCell 41495-1505(電穿孔)；Li等(1993)Plant Cell Reports 12250-255和Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75407-413(水稻)；Osjoda等(1996)Nature Biotechnology 14745-750(maize via Agrobacteriumtumefaciens)，所有都被并入?yún)⒖肌?br> 修飾的植物可以通過(guò)傳統(tǒng)方法生長(zhǎng)為植物。見，例如，McCormick等(1986)Plant Cell.Reports81-84。這些植物于是可以與相同的轉(zhuǎn)化株或不同的株生長(zhǎng)，和授粉，所得的雜種具有所需的鑒定的表型特征?？梢陨L(zhǎng)2代或更多的子代以保證所述對(duì)象表型特征是穩(wěn)定維持的并且遺傳，然后收獲種子以保證實(shí)現(xiàn)了所需的表型或其它特性。
D.基因阻抑的分子開關(guān)系統(tǒng)本發(fā)明的另一方面涉及控制基因表達(dá)的分子開關(guān)系統(tǒng)，并且特別是使用本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域阻抑或下調(diào)基因表達(dá)的分子開關(guān)系統(tǒng)。這樣的系統(tǒng)(也稱為“化學(xué)開關(guān)”)提供了進(jìn)一步操縱調(diào)控或控制基因表達(dá)的時(shí)間或位置的工具。簡(jiǎn)言之，所述分子開關(guān)系統(tǒng)導(dǎo)入了2個(gè)融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞或生物體，一個(gè)具有核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和另一個(gè)具有核周邊結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這兩個(gè)融合蛋白每個(gè)都具有特異性結(jié)合一個(gè)二價(jià)配體的一或另一個(gè)部分的第二結(jié)構(gòu)域。導(dǎo)入二價(jià)配體進(jìn)入含有所述2個(gè)融合蛋白的細(xì)胞或生物體，所述配體作為一個(gè)開關(guān)在3個(gè)實(shí)體中引發(fā)形成復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物于是與本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的功能相似，因?yàn)橐坏┬纬?，其可以攜帶靶基因與核周邊關(guān)聯(lián)以阻抑或下調(diào)基因表達(dá)。
一個(gè)實(shí)例是通過(guò)一個(gè)具有部分A和B的二價(jià)化學(xué)配體，編碼AZP和特異性于部分A的抗體(或這個(gè)抗體的活性片段)的第一融合蛋白和編碼可以與核周邊相關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)域和特異性于部分B的抗體(或這個(gè)抗體的活性片段)的第二融合蛋白形成復(fù)合物。這兩個(gè)融合蛋白可以分別或共同在相同的細(xì)胞中表達(dá)。將包括連接在一起的部分A和部分B的二價(jià)化學(xué)物加入細(xì)胞或生物體，每個(gè)融合蛋白對(duì)部分A或者部分B的親和性介導(dǎo)了復(fù)合物的形成。
因而，本發(fā)明這個(gè)方面的第一融合蛋白包含可以特異性結(jié)合于與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列的第一結(jié)構(gòu)域，和可以特異性結(jié)合二價(jià)配體第一結(jié)合部分的第二結(jié)構(gòu)域，所述配體可以被細(xì)胞攝取，其中第一和第二結(jié)構(gòu)域是互相異源的。所述融合蛋白的第一結(jié)構(gòu)域與本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的第一結(jié)構(gòu)域相同。例如，第一融合蛋白的這個(gè)第一結(jié)構(gòu)域可以是ZFP，AZP，亮氨酸拉鏈蛋白，螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋蛋白，螺旋-環(huán)-螺旋蛋白，同源盒結(jié)構(gòu)域蛋白，任何這些蛋白的DNA結(jié)合部分，或其任意組合。
同樣，與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列，和靶基因與本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)描述的相同。
本發(fā)明這個(gè)方面的第二融合蛋白包含可以與核周邊相關(guān)聯(lián)的第一結(jié)構(gòu)域和可以特異性結(jié)合二價(jià)配體第二結(jié)合部分的第二結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域是異源的。這些融合蛋白的第一結(jié)構(gòu)域與本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的第二結(jié)構(gòu)域是相同的。因而，所述第二融合蛋白的第一結(jié)構(gòu)域結(jié)合核被膜，核纖層，異染色質(zhì)，或其任意組合，以及所述第一結(jié)構(gòu)域優(yōu)選核被膜結(jié)合蛋白，核纖層結(jié)合蛋白，異染色質(zhì)結(jié)合蛋白，任何這些蛋白的結(jié)合部分，或其任意組合。
這個(gè)分子開關(guān)系統(tǒng)的第一和第二融合蛋白的第二結(jié)構(gòu)域可以特異性結(jié)合二價(jià)配體的一個(gè)結(jié)合部分。所述第一融合蛋白結(jié)合所述二價(jià)配體的一個(gè)結(jié)合部分(例如，部分A)以及所述第二融合蛋白結(jié)合所述二價(jià)配體的另一個(gè)結(jié)合部分(例如，部分B)。一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)融合蛋白的第二結(jié)構(gòu)域可以是抗體的單鏈可變區(qū)(scFV)，所述抗體對(duì)所述二價(jià)配體的其各自的結(jié)合部分具有特異性。
部分A和B存在很多可能性。標(biāo)準(zhǔn)是所述部分具有足夠的抗原性以可以選擇對(duì)那個(gè)部分特異性的抗體。而且連接在一起的2個(gè)部分形成一個(gè)可以進(jìn)入和在細(xì)胞內(nèi)起作用以介導(dǎo)所述復(fù)合物形成的化合物。一個(gè)實(shí)施方案中，部分A具有例如如下的結(jié)構(gòu) 部分B具有例如如下的結(jié)構(gòu) 而且部分A和B可以通過(guò)適當(dāng)長(zhǎng)度的接頭連接，所述接頭具有如下所述的單位
任何可以進(jìn)入細(xì)胞并具有可以引起抗體的部分的化合物都適用于本發(fā)明的二價(jià)配體。本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案允許通過(guò)在存在所述二價(jià)配體時(shí)形成復(fù)合物而將所述靶基因結(jié)構(gòu)域序列特異性的定位于核周邊。沒有所述二價(jià)配體時(shí)，沒有三級(jí)復(fù)合物形成。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了一個(gè)化學(xué)開關(guān)，其是包含2個(gè)連接的化合物的二價(jià)化學(xué)物。這些化合物可以是通過(guò)一個(gè)短接頭連接的任何可以引起抗體的化合物，例如，CH2CH2。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，單鏈抗體(例如，單鏈F，(scFv))結(jié)合所述二價(jià)化學(xué)物的一部分，所述化學(xué)物連接單鏈抗體于核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述二價(jià)化合物的另一部分結(jié)合第二個(gè)單鏈抗體，例如，單鏈F，(scFv)，其識(shí)別和結(jié)合可以與核周邊相關(guān)聯(lián)或結(jié)合的蛋白結(jié)構(gòu)域。
另一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)融合蛋白的第二結(jié)構(gòu)域可以是突變的S-標(biāo)簽和S-蛋白(下述)，其只能在存在小分子或化學(xué)物時(shí)互相結(jié)合。這個(gè)小分子因而作為二價(jià)配體令所述兩個(gè)融合蛋白形成單一的復(fù)合物以定位于核周邊并導(dǎo)致基因阻抑或下調(diào)。
這個(gè)分子開關(guān)系統(tǒng)可以用于以時(shí)間或空間方式調(diào)控靶基因阻抑的方法中。特別地，所述方法涉及將含有具有與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列的靶核酸的細(xì)胞或生物體與本發(fā)明的分子開關(guān)系統(tǒng)接觸(如本部分所述)，并在一定時(shí)間或一定位置將細(xì)胞或生物體與合適的二價(jià)配體接觸以形成具有所述融合蛋白的復(fù)合物并由此通過(guò)將靶基因定位于核周邊而阻抑或下調(diào)靶基因的表達(dá)。由于應(yīng)用了嵌合蛋白質(zhì)，所述分子開關(guān)系統(tǒng)的融合蛋白可以作為蛋白質(zhì)，作為編碼一或多個(gè)所述蛋白質(zhì)的一或多個(gè)核酸，或作為其組合導(dǎo)入細(xì)胞或生物體中。當(dāng)使用單一的核酸輸送所述融合蛋白時(shí)，每個(gè)蛋白的表達(dá)可以共同或獨(dú)立控制。同樣，對(duì)于相同的靶基因，所述方法對(duì)于使用本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)的方法是有用的。
所述融合蛋白可以進(jìn)行表達(dá)，分離和純化，如上述嵌合蛋白質(zhì)。同樣，它們可以導(dǎo)入細(xì)胞或生物體中，如上述嵌合蛋白質(zhì)。
E.基因去阻抑的分子開關(guān)系統(tǒng)可以以另一種形式提供分子開關(guān)系統(tǒng)，其可以控制調(diào)控靶基因的去阻抑，即激活正在被阻抑的靶基因的表達(dá)。在本發(fā)明的這個(gè)方面，“開關(guān)”用來(lái)破壞兩個(gè)融合蛋白間的相互作用(而不是如D部分所示促進(jìn)相互作用)。而且，這些系統(tǒng)(也稱為“化學(xué)開關(guān)”)提供了另一種操縱調(diào)控或控制基因表達(dá)的時(shí)間或位置的工具。簡(jiǎn)言之，分子開關(guān)系統(tǒng)導(dǎo)入了2個(gè)融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞或生物體中，一個(gè)具有核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域及另一個(gè)具有核周邊結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這兩個(gè)融合蛋白都具有互相特異性結(jié)合的第二結(jié)構(gòu)域，例如，第二結(jié)構(gòu)域是另一個(gè)的結(jié)合伴侶(binding partners)。這個(gè)系統(tǒng)中，導(dǎo)入所述融合蛋白導(dǎo)致了形成定位于核周邊及阻抑或下調(diào)關(guān)聯(lián)的靶基因表達(dá)的復(fù)合物。當(dāng)化學(xué)開關(guān)在所需時(shí)間(或特定細(xì)胞類型)導(dǎo)入細(xì)胞或生物體中，其破壞所述復(fù)合物并消除了阻抑狀態(tài)，即化學(xué)開關(guān)的存在導(dǎo)致了靶基因的去阻抑。
因而，本發(fā)明這個(gè)方面的第一融合蛋白包含可以特異性結(jié)合于與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列的第一結(jié)構(gòu)域，和可以特異性結(jié)合二價(jià)配體的第二結(jié)合部分的第二結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域是異源的。這些融合蛋白與D部分描述的那些不同。
所述融合蛋白的第一結(jié)構(gòu)域與本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的第一結(jié)構(gòu)域相同。例如，第一融合蛋白的這個(gè)第一結(jié)構(gòu)域可以是ZFP，AZP，亮氨酸拉鏈蛋白，螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋蛋白，螺旋-環(huán)-螺旋蛋白，同源盒結(jié)構(gòu)域蛋白，任何這些蛋白的DNA結(jié)合部分，或其任意組合。同樣，與所述靶基因關(guān)聯(lián)的核苷酸序列，和靶基因與描述本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)時(shí)的相同。
本發(fā)明這個(gè)方面的第二融合蛋白包含可以與核周邊相關(guān)聯(lián)的第一結(jié)構(gòu)域和包含所述第一融合蛋白的第二結(jié)構(gòu)域的結(jié)合伴侶的第二結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域異源。這些第二融合蛋白的第一結(jié)構(gòu)域與本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的第二結(jié)構(gòu)域相同。因此，所述第二融合蛋白的第一結(jié)構(gòu)域結(jié)合核被膜，核纖層，異染色質(zhì)，或其任何組合，而且所述第一結(jié)構(gòu)域優(yōu)選核被膜結(jié)合蛋白，核纖層結(jié)合蛋白，異染色質(zhì)結(jié)合蛋白，任何這些蛋白的結(jié)合部分，或其任意組合。
這個(gè)分子開關(guān)系統(tǒng)的第一和第二融合蛋白的第二結(jié)構(gòu)域可以互相特異性結(jié)合。一個(gè)第二結(jié)構(gòu)域的實(shí)例通過(guò)S-標(biāo)簽/S-蛋白系統(tǒng)表示[Kim等(1993)Protein Sci.3348-356]。S-標(biāo)簽是一個(gè)短肽(15個(gè)氨基酸)，S-蛋白是一個(gè)小蛋白(104個(gè)氨基酸)，而且可以交替用作所述2個(gè)融合蛋白任一個(gè)的第二結(jié)構(gòu)域。S-標(biāo)簽和S-蛋白復(fù)合物的親和性高(Kd＝1nM)。化學(xué)開關(guān)或配體于是是可以破壞S-標(biāo)簽和S-蛋白間相互作用的分子。例如，自由或綴合的S-標(biāo)簽蛋白可以作為化學(xué)開關(guān)。
這個(gè)分子開關(guān)系統(tǒng)可以用于以時(shí)間或空間方式調(diào)控靶基因阻抑的方法。特別地，所述方法涉及將含有具有與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列的靶核酸的細(xì)胞或生物體與本發(fā)明的分子開關(guān)系統(tǒng)接觸(如本部分所述)及在某一時(shí)間或位置將細(xì)胞或生物體與配體接觸以破壞第一和第二融合蛋白的關(guān)聯(lián)，由此阻抑所述靶基因的表達(dá)。由于應(yīng)用了所述嵌合蛋白質(zhì)，本分子開關(guān)系統(tǒng)的融合蛋白可以作為蛋白質(zhì)，作為編碼一或多個(gè)蛋白的一或多個(gè)核酸，或作為其組合導(dǎo)入細(xì)胞或生物體中。當(dāng)單一的核酸用于輸送所述融合蛋白，每個(gè)蛋白的表達(dá)可以共同或單獨(dú)控制。同樣，所述方法對(duì)于相同的靶基因試圖應(yīng)用使用本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的方法是有用的。
這些融合蛋白還可以被表達(dá)，分離和純化，如對(duì)嵌合蛋白質(zhì)所描述的。同樣，它們可以導(dǎo)入細(xì)胞或生物體中，如上述嵌合蛋白質(zhì)。
F.藥物配方嵌合蛋白質(zhì)，分子開關(guān)系統(tǒng)(如部分D或E提供的)，(部分D或E)的多種融合蛋白或編碼任何這些蛋白的核酸或本發(fā)明系統(tǒng)的治療配方通過(guò)將這些具有所需純度與任選的生理可接受的載體，賦形劑或穩(wěn)定劑混合而以凍干配方或水溶液的形式制備儲(chǔ)存(Remington′s PharmaceuticalSciences16th edition，Osol，A.Ed.(1980))?？山邮艿妮d體，賦形劑，或穩(wěn)定劑是在使用的劑量和濃度下對(duì)受體無(wú)毒的，并可以包括緩沖液如磷酸鹽，檸檬酸鹽，和其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化己烷雙胺；殺藻胺，苯索氯銨；苯酚，丁基或苯甲醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和m-甲酚)；低分子量(小于大約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白，凝膠，或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，組氨酸，精氨酸，或賴氨酸；單糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合劑如EDTA；糖如蔗糖，甘露糖，海藻糖或山梨醇；鹽形成反離子(salt-forming counter-ions)如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如，Zn-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如TWEEN，聚丙二醇與環(huán)氧乙烷的加聚物或聚乙二醇(PEG)。
如特定的治療癥狀需要，此處的配方還可以含有一個(gè)以上的活性化合物，優(yōu)選那些具有不相互產(chǎn)生反面影響的互補(bǔ)活性的化合物。這樣的分子適于以組合存在有效于所需目的的量。
活性成分還可以包含在制備的微膠囊中，例如，分別通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合，例如，羥甲基纖維素或凝膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，在膠狀藥物輸送系統(tǒng)或macroemulsion中。這樣的技術(shù)揭示于Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.Ed.。
用于體內(nèi)施用的配方是無(wú)菌的。而這個(gè)可以通過(guò)濾過(guò)無(wú)菌濾膜容易地完成，可以使用其它無(wú)菌方法，只要所述活性成分的活性不被破壞或改變。
可以制備持續(xù)釋放制備物。合適的持續(xù)釋放制備物的實(shí)例包括固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，所述聚合物含有多肽變體，其基質(zhì)是成形的物品，例如，膜，或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯，水凝膠(例如聚(2-羥乙基-異丁烯酸鹽)，或聚(乙烯醇))，聚交酯(U.S.Pat.No.3,773,919)，L-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸鹽的共聚物，非可降解的乙烯-乙烯乙酸，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT(乳酸-乙醇酸共聚物和亮丙瑞林(leuprolide)乙酸組成的可注射的微球體)，和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。聚合物如乙烯-乙烯乙酸和乳酸-乙醇酸能使分子釋放超過(guò)100天，某種水凝膠釋放蛋白時(shí)間較短。依賴于涉及的機(jī)制，為穩(wěn)定可以設(shè)計(jì)合理的策略。例如，如果聚集機(jī)制被發(fā)現(xiàn)是通過(guò)含硫-二硫化物交換的分子間S-S鍵，則可以通過(guò)修飾巰基殘基，凍干酸溶液，控制水分含量，使用適當(dāng)?shù)奶砑觿?，和發(fā)展特異性的聚合物基質(zhì)組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定包含在任何藥物組合物中所述嵌合蛋白質(zhì)，(如部分D或E所提供的)分子開關(guān)系統(tǒng)，(部分D或E的)多種融合蛋白或編碼任何這些蛋白的核酸或本發(fā)明系統(tǒng)的量及適當(dāng)?shù)念A(yù)期使用劑量。
本發(fā)明中，多個(gè)公開，專利，和專利申請(qǐng)被引用。這些公開，專利和專利申請(qǐng)以其全文并入?yún)⒖肌?br> 應(yīng)理解和認(rèn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員可以變化本發(fā)明在示例實(shí)施方案中揭示的原理，所以這樣的修改，變化和替代也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1阻抑人VEGF-A為下調(diào)人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)的表達(dá)，制備了編碼含有524個(gè)氨基酸的小鼠GCL蛋白[Leatherman等(2000)]和靶向序列5′-GTGTGG GTG AGT GAG TGT G-3′(SEQ ID NO7)的AZP的嵌合蛋白質(zhì)(CPI-vegf)的重組構(gòu)建體。編碼另一個(gè)嵌合蛋白質(zhì)(CP2-vegf)的第二構(gòu)建體使用相同的小鼠GCL蛋白和靶向序列5′-GGG GCT GGG GGCGGT GTC T-3′(SEQ ID NO8)的AZP制備。靶核苷酸序列來(lái)自人VEGF-A基因的啟動(dòng)子[Tischer等(1991)J.Biol.Chem.26611947-11954]。所述AZP具有6個(gè)鋅指，每個(gè)具有框架序列Pro-Tyr-Lys-Cys-Pro-Glu-Cys-Gly-Lys-Ser-Phe-Ser-Z-1-Ser-Z2-Z3-Leu-Gln-Z6-His-Gln-Arg-Thr-His-Thr-Gly-Glu-Lys-(SEQ ID NO3)；每個(gè)框架連接于下一個(gè)框架，沒有多余的氨基酸殘基。表3提供了確定DNA對(duì)CPI-vegf和CP2-vegf的結(jié)合特異性(Z-1，Z2，Z3和Z6)的殘基的身份。
為測(cè)試阻抑活性，所述嵌合蛋白質(zhì)構(gòu)建體被共轉(zhuǎn)染至人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系U-937，其具有含有人VEGF-A天然啟動(dòng)子控制下的熒光素酶基因的熒光素酶基因報(bào)道質(zhì)粒。這個(gè)熒光素酶基因報(bào)道質(zhì)粒含有熒光素酶基因的VEGF-A基因上游的-2279到+1041位核苷酸[Liu等(2001)J.Biol.Chem.27611323-11334]。對(duì)陽(yáng)性對(duì)照，U-937細(xì)胞單獨(dú)轉(zhuǎn)染了所述熒光素酶基因報(bào)道質(zhì)?；蚬厕D(zhuǎn)染了所述熒光素酶基因報(bào)道質(zhì)粒和一個(gè)無(wú)關(guān)靶序列的GCL和AZP(或其它DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的嵌合蛋白質(zhì)構(gòu)建體(作為蛋白質(zhì)或作為核酸)。相對(duì)于對(duì)照水平，熒光素酶活性的降低表明CPI-vegf和CP2-vegf下調(diào)了VEGF-A啟動(dòng)子活性。
或者，阻抑活性可以通過(guò)用CPI-vegf或CP2-vegf蛋白處理或通過(guò)用編碼CP1-vegf或CP2-vegf蛋白的核酸轉(zhuǎn)染U-937細(xì)胞，并且通過(guò)Northern印跡技術(shù)監(jiān)控內(nèi)源VEGF-AmRNA的水平來(lái)監(jiān)控。
表3

序列表<110>先正達(dá)合作有限公司<120>調(diào)節(jié)基因表達(dá)的核被膜和核纖層結(jié)合嵌合體<130>109845-163<160>18<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>25<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Zinc finger domain<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(5)<223>Amino acids 2-5 are Xaa wherein Xaa＝any amino acid，and up totwo amino acids can be missing.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(18)<223>Xaa can be any amino acid<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(20)..(24)<223>Amino acids 20-24 are Xaa wherein Xaa＝any amino acid，and up totwo amino acids can be missing.
<400>1Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15
Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His20 25<210>2<211>32<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Zinc finger domain<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(3)<223>Xaa can be any amino acid<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(8)<223>Amino acids 5-8 are Xaa wherein Xaa＝any amino acid，and up totwo amino acids can be missing<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(14)<223>Xaa can be any amino acid<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>Amino acid 15 is Z(-1)wherein Z(-1)＝Arg，Lys，Gln，Asn，Thr，Met，Leu，Ile，Glu or Asp.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>Xaa can be any amino acid<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>Amino acid 17 is Z2 wherein Z2＝Ser，Arg，Asn，Gln，Thr，Val，Ala，Asp or Glu.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>Amino acid 18 is Z3 wherein Z3＝His，Lys，Asn，Gln，Ser，Ala，Val，Thr，Asp or Glu..
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>Amino acid 18 is Z3 wherein Z3＝His，Lys，Asn，Gln，Ser，Ala，Val，Thr，Asp or Glu.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(19)..(20)<223>Xaa can be any amino acid<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>Amino acid 21 is Z6 wherein Z6＝Arg，Lys，Gln，Asn，Thr，Tyr，Leu，Ile，Met，Glu or Asp.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(23)..(27)<223>Amino acids 5-8 are Xaa wherein Xaa＝any amino acid，and up totwo amino acids can be missing<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(29)..(32)<223>Xaa can be any amino acid<400>2Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30<210>3<211>28<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Zinc finger domain<220>
<221>MLSC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>Amino acid 13 is Z(-1)wherein Z(-1)＝Arg，Lys，Gln，Asn，Thr，Met，Leu，Ile，Glu or Asp.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>Amino acid 15 is Z2 wherein Z2＝Ser，Arg，Asn，Gln，Thr，Val，Ala，Asp or Glu.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>Amino acid 16 is Z3 wherein Z3＝His，Lys，Asn，Gln，Ser，Ala，Val，Thr，Asp or Glu.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>Amino acid 19 is Z6 wherein Z6＝Arg，Lys，Gln，Asn，Thr，Tyr，Leu，Ile，Met，Glu or Asp.
<400>3Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Xaa Ser Xaa Xaa1 5 10 15
Leu Gln Xaa His Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys20 25<210>4<211>5<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>peptide<400>4Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>5<211>11<212>PRT<213>Human immunodeficiency virus<220>
<221>misc_feature<223>HLV Tat protein domain<400>5Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg1 5 10<210>6<211>9<212>DNA<213>Human immunodeficiency virus<220>
<221>misc_feature<223>DNA binding domain
<400>6gcagaagcc 9<210>7<211>19<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>DNA target sequence<400>7gtgtgggtga gtgagtgtg 19<210>8<211>19<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>DNA target sequence<400>8ggggctgggg gcggtgtct 19<210>9<211>7<212>PRT<213>simian virus 40<220>
<221>misc_feature<223>Peptide from SV40 large T antigen<400>9Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val1 5
<210>10<211>16<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Peptide，residues 43-58 of the Antennapeida homeodomain protein<400>10Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys1 5 10 15<210>11<211>34<212>PRT<213>Herpes Simplex Virus<220>
<221>misc_feature<223>Residues 267-300 of the HSV VP22 protein<400>11Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr1 5 10 15Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro20 25 30Val Glu<210>12<211>11<212>PRT
<213>Artificial Sequence<220>
<223>Basic peptide with cellular uptake signal acitivty<400>12Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala1 5 10<210>13<211>9<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Basic peptide with cellular uptake signal activity，″R9″<400>13Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg1 5<210>14<211>16<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>D-penetratin peptide<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(16)<223>All amino acids are in the D-form.
<400>14Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys1 5 10 15
<210>15<211>18<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Peptide Syn B1 from Antennapedia homeodomain protein<400>15Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr1 5 10 15Gly Arg<210>16<211>10<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>L-SynB3 peptide from Antennapedia homeodomain protein<400>16Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe1 5 10<210>17<211>10<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>D-SynB3 peptide from Antennapedia homeodomain protein
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(10)<223>All amino acids are in the D-form.
<400>17Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe1 5 10<210>18<211>8<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Flag Epitope Peptide<400>18Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 權(quán)利要求
1.一種核酸靶特異性嵌合蛋白質(zhì)，其包含一或多個(gè)可以特異性結(jié)合于與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列的第一結(jié)構(gòu)域和一或多個(gè)可以與核周邊相關(guān)聯(lián)的第二結(jié)構(gòu)域，其中至少一個(gè)所述第一結(jié)構(gòu)域與至少一個(gè)所述第二結(jié)構(gòu)域是異源的。
2.權(quán)利要求1的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述一或多個(gè)第一結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)鋅指蛋白(ZFP)、一個(gè)人工鋅指蛋白(AZP)、一個(gè)亮氨酸拉鏈蛋白、一個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋蛋白、一個(gè)螺旋-環(huán)-螺旋蛋白、一個(gè)同源盒結(jié)構(gòu)域蛋白、任何一種上述蛋白的DNA結(jié)合部分、或其任意組合。
3.權(quán)利要求2的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述AZP包含至少一個(gè)鋅指，如果存在其它的指，則所述至少一個(gè)鋅指的指獨(dú)立地通過(guò)0到10個(gè)氨基酸殘基共價(jià)連接于所述其它的指，其中所述鋅指的α-螺旋的-1，2，3和6位的氨基酸如下進(jìn)行選擇在-1位，氨基酸是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、甲硫氨酸或谷氨酸；在2位，氨基酸是絲氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸或天冬氨酸；在3位，氨基酸是組氨酸、天冬酰胺、絲氨酸或天冬氨酸；及在6位，氨基酸是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、酪氨酸、亮氨酸或谷氨酸。
4.權(quán)利要求2或3的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述AZP包含至少一個(gè)鋅指，每個(gè)鋅指獨(dú)立地表示為式-X3-Cys-X2-4-Cys-X5-Z-1-X-Z2-Z3-X2-Z6-His-X3-5-His-X4-，如果存在其它的指，則所述至少一個(gè)鋅指的指獨(dú)立地通過(guò)0到10個(gè)氨基酸殘基共價(jià)連接于所述其它的指；其中X獨(dú)立地是任何氨基酸且Xn表示多肽鏈中X出現(xiàn)的次數(shù)；Z-1是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、甲硫氨酸或谷氨酸；Z2是絲氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸或天冬氨酸；Z3是組氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、或天冬氨酸；及Z6是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、酪氨酸、亮氨酸或谷氨酸。
5.權(quán)利要求4的嵌合蛋白質(zhì)，其中Z-1是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸或谷氨酸；Z2是絲氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸或天冬氨酸；Z3是組氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、或天冬氨酸；及Z6是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸或谷氨酸。
6.權(quán)利要求4或5的嵌合蛋白質(zhì)，其中至少一個(gè)所述鋅指的X位包含來(lái)自Zif268鋅指、Sp1指或Sp1C指的相應(yīng)的氨基酸。
7.權(quán)利要求1的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述一或多個(gè)第一結(jié)構(gòu)域包含至少3個(gè)鋅指，每個(gè)鋅指表示為式-Pro-Tyr-Lys-Cys-Pro-Glu-Cys-Gly-Lys-Ser-Phe-Ser-Z-1-Ser-Z2-Z3-Leu-Gln-Z6-His-Gln-Arg-Thr-His-Thr-Gly-Glu-Lys-，所述指直接互相結(jié)合，其中Z-1是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、甲硫氨酸或谷氨酸；Z2是絲氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸或天冬氨酸；Z3是組氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、或天冬氨酸；及Z6是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、酪氨酸、亮氨酸或谷氨酸。
8.權(quán)利要求7的嵌合蛋白質(zhì)，其中Z-1是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸或谷氨酸；Z2是絲氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸或天冬氨酸；Z3是組氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、或天冬氨酸；及Z6是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸或谷氨酸。
9.權(quán)利要求3到8任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述AZP包含3到15個(gè)鋅指，其中任意一或多個(gè)由所述式表示。
10.權(quán)利要求9的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述AZP包含7、8或9個(gè)鋅指。
11.權(quán)利要求10的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述AZP包含6個(gè)鋅指。
12.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述一或多個(gè)第二結(jié)構(gòu)域與核被膜、核纖層、異染色質(zhì)、或其任意組合直接或間接相關(guān)聯(lián)或與其結(jié)合。
13.權(quán)利要求12的嵌合蛋白質(zhì)，其中一個(gè)所述第二結(jié)構(gòu)域是GCL蛋白或GCL蛋白的結(jié)合部分。
14.權(quán)利要求12的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述一或多個(gè)第二結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)核被膜結(jié)合蛋白、核纖層結(jié)合蛋白、異染色質(zhì)結(jié)合蛋白、可以與上述任一種蛋白相關(guān)聯(lián)或結(jié)合的蛋白、任何一種上述蛋白的結(jié)合部分或其任意組合。
15.權(quán)利要求14的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述核纖層結(jié)合蛋白或所述核纖層結(jié)合蛋白的結(jié)合部分是核纖層蛋白或纖層結(jié)合蛋白。
16.權(quán)利要求14的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述異染色質(zhì)結(jié)合蛋白或所述異染色質(zhì)結(jié)合蛋白的結(jié)合部分選自于HP1或polycomb-group蛋白。
17.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)，其包含1到6個(gè)第一結(jié)構(gòu)域和1到6個(gè)第二結(jié)構(gòu)域。
18.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)，其進(jìn)一步包含一個(gè)核定位信號(hào)。
19.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)，其進(jìn)一步包含一個(gè)細(xì)胞攝取信號(hào)。
20.權(quán)利要求19的嵌合蛋白質(zhì)，其進(jìn)一步包含一個(gè)核定位信號(hào)。
21.一種藥物組合物，其包含與藥物學(xué)可接受的載體的相混合的治療有效量的前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)。
22.一種核酸，其包含編碼權(quán)利要求1到20任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
23.一種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求20的核酸。
24.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求23的表達(dá)載體。
25.一種制備嵌合蛋白質(zhì)的方法，其包含(a)在表達(dá)所述嵌合蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求24的宿主細(xì)胞一段時(shí)間；及(b)回收所述嵌合蛋白質(zhì)。
26.權(quán)利要求23的表達(dá)載體，其中所述載體是適合轉(zhuǎn)染進(jìn)含有待調(diào)控的靶基因的細(xì)胞中的真核表達(dá)載體。
27.一種藥物組合物，其包含與一種藥物學(xué)可接受的載體相混合的治療有效量的權(quán)利要求22、23或26任一項(xiàng)的核酸或表達(dá)載體。
28.一種將靶核酸與嵌合蛋白質(zhì)相結(jié)合的方法，其包含將含有與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列的靶核酸與足夠量的權(quán)利要求1到20任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)相接觸一段足夠的時(shí)間以便所述蛋白與所述靶核酸結(jié)合。
29.一種阻抑或下調(diào)靶基因表達(dá)的方法，其包含將含有與所述靶基因相關(guān)聯(lián)的或足夠接近的核苷酸序列的核酸與足夠量的權(quán)利要求1到20任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)接觸一段足夠的時(shí)間以便所述嵌合蛋白質(zhì)阻抑或下調(diào)所述靶基因的表達(dá)。
30.權(quán)利要求28或29的方法，其中所述嵌合蛋白質(zhì)作為蛋白質(zhì)或作為編碼所述蛋白質(zhì)的核酸被導(dǎo)入細(xì)胞或生物體中。
31.權(quán)利要求28到30任一項(xiàng)的方法，其中所述嵌合蛋白質(zhì)進(jìn)一步包含一個(gè)核定位信號(hào)。
32.權(quán)利要求28到31任一項(xiàng)的方法，其中所述嵌合蛋白質(zhì)進(jìn)一步包含一個(gè)細(xì)胞攝取信號(hào)。
33.權(quán)利要求28到32任一項(xiàng)的方法，其中所述靶基因編碼一種哺乳動(dòng)物基因、一種昆蟲基因或一種酵母基因。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述靶基因來(lái)自哺乳動(dòng)物并編碼細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素、癌基因、血管發(fā)生因子、抗血管發(fā)生因子、藥物抗性蛋白、生長(zhǎng)因子或腫瘤抑制因子。
35.權(quán)利要求28到32任一項(xiàng)的方法，其中所述靶基因編碼病毒基因。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述病毒基因來(lái)自DNA病毒。
37.權(quán)利要求28到32任一項(xiàng)的方法，其中所述靶基因編碼植物基因。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述植物基因來(lái)自番茄、玉米、水稻或谷類植物。
39.權(quán)利要求28到32任一項(xiàng)的方法，其中所述靶基因來(lái)自一種商品化的動(dòng)物。
40.一種分子開關(guān)系統(tǒng)，其包含(a)一種第一融合蛋白，其包含可以特異性結(jié)合于與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列的第一結(jié)構(gòu)域和可以特異性結(jié)合一種二價(jià)配體的第一結(jié)合部分的第二結(jié)構(gòu)域，所述配體可以被細(xì)胞攝取，其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域是異源的；及(b)一種第二融合蛋白，其包含可以與核周邊相關(guān)聯(lián)的第一結(jié)構(gòu)域和可以特異性結(jié)合所述二價(jià)配體的第二結(jié)合部分的第二結(jié)構(gòu)域。
41.權(quán)利要求40的分子開關(guān)系統(tǒng)，其中每種融合蛋白的所述第二結(jié)構(gòu)域是抗體的單鏈可變區(qū)(scFv)，所述單鏈可變區(qū)對(duì)所述二價(jià)配體中與其相應(yīng)的結(jié)合部分具有特異性。
42.一種分子開關(guān)系統(tǒng)，其包含(a)一種第一融合蛋白，其包含可以特異性結(jié)合于與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列的第一結(jié)構(gòu)域和可以特異性結(jié)合一種結(jié)合伴侶的第二結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域是異源的；及(b)一種第二融合蛋白，其包含可以與核周邊相關(guān)聯(lián)的第一結(jié)構(gòu)域和包含所述第一融合蛋白的第二結(jié)構(gòu)域的結(jié)合伴侶的第二結(jié)構(gòu)域的，其中所述第一結(jié)構(gòu)域與所述第二結(jié)構(gòu)域是異源的。
43.權(quán)利要求42的分子開關(guān)系統(tǒng)，其中所述第一融合蛋白的第二結(jié)構(gòu)域是S-蛋白及所述第二融合蛋白的第二結(jié)構(gòu)域是S-標(biāo)簽，或反之亦然。
44.權(quán)利要求40到43任一項(xiàng)的分子開關(guān)系統(tǒng)，其中所述第一融合蛋白的第一結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)鋅指蛋白(ZFP)、一個(gè)人工鋅指蛋白(AZP)、一個(gè)亮氨酸拉鏈蛋白、一個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋蛋白、一個(gè)螺旋-環(huán)-螺旋蛋白、一個(gè)同源盒結(jié)構(gòu)域蛋白、任何一種上述蛋白的DNA結(jié)合部分、或其任意組合。
45.權(quán)利要求44的分子開關(guān)系統(tǒng)，其中所述AZP包含至少一個(gè)鋅指，每個(gè)鋅指獨(dú)立地表示為式-X3-Cys-X2-4-Cys-X5-Z-1-X-Z2-Z3-X2-Z6-His-X3-5-His-X4-，如果存在其它的指，則所述至少一個(gè)鋅指的指獨(dú)立地通過(guò)0到10個(gè)氨基酸殘基共價(jià)連接于所述其它的指；其中X獨(dú)立地是任何氨基酸且Xn表示多肽鏈中X出現(xiàn)的次數(shù)；Z-1是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、甲硫氨酸或谷氨酸；Z2是絲氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸或天冬氨酸；Z3是組氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、或天冬氨酸；及Z6是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、酪氨酸、亮氨酸或谷氨酸。
46.權(quán)利要求45的分子開關(guān)系統(tǒng)，其中Z-1是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸或谷氨酸；Z2是絲氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸或天冬氨酸；Z3是組氨酸、天冬酰胺、絲氨酸或天冬氨酸；及Z6是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸或谷氨酸。
47.權(quán)利要求45或46的分子開關(guān)系統(tǒng)，其中至少一個(gè)所述鋅指的X位包含來(lái)自Zif268鋅指、Sp1指或Sp1 C指的相應(yīng)氨基酸。
48.權(quán)利要求40到43任一項(xiàng)的分子開關(guān)系統(tǒng)，其中所述第一融合蛋白的第一結(jié)構(gòu)域包含至少3個(gè)鋅指，每個(gè)鋅指表示為式-Pro-Tyr-Lys-Cys-Pro-Glu-Cys-Gly-Lys-Ser-Phe-Ser-Z-1-Ser-Z2-Z3-Leu-Gln-Z6-His-Gln-Arg-Thr-His-Thr-Gly-Glu-Lys-，所述指直接互相連接，其中Z-1是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、甲硫氨酸或谷氨酸；Z2是絲氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸或天冬氨酸；Z3是組氨酸、天冬酰胺、絲氨酸或天冬氨酸；及Z6是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、酪氨酸、亮氨酸或谷氨酸。
49.權(quán)利要求48的分子開關(guān)系統(tǒng)，其中Z-1是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸或谷氨酸；Z2是絲氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸或天冬氨酸；Z3是組氨酸、天冬酰胺、絲氨酸或天冬氨酸；及Z6是精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸或谷氨酸。
50.權(quán)利要求44到49任一項(xiàng)的分子開關(guān)系統(tǒng)，其中所述AZP包含3到15個(gè)鋅指，其中任意一或多個(gè)鋅指表示為所述的式，或其中所述第一融合蛋白的第一結(jié)構(gòu)域包含3到15個(gè)鋅指。
51.權(quán)利要求50的分子開關(guān)系統(tǒng)，其中所述AZP或所述第一結(jié)構(gòu)域包含6，7，8或9個(gè)鋅指。
52.權(quán)利要求40到51任一項(xiàng)的分子開關(guān)系統(tǒng)，其中所述第二融合蛋白的第一結(jié)構(gòu)域與核被膜、核纖層、異染色質(zhì)、或其任意組合直接或間接相關(guān)聯(lián)或與其結(jié)合。
53.權(quán)利要求52的分子開關(guān)系統(tǒng)，其中所述第二融合蛋白的所述第一結(jié)構(gòu)域是GCL蛋白或GCL蛋白的結(jié)合部分。
54.權(quán)利要求52的分子開關(guān)系統(tǒng)，其中所述第二融合蛋白的所述第一結(jié)構(gòu)域包含核被膜結(jié)合蛋白、核纖層結(jié)合蛋白、異染色質(zhì)結(jié)合蛋白、可以與前述任一種蛋白相關(guān)聯(lián)或結(jié)合的蛋白、任何一種上述蛋白的結(jié)合部分、或其任意組合。
55.權(quán)利要求54的分子開關(guān)系統(tǒng)，其中所述核纖層結(jié)合蛋白或所述核纖層結(jié)合蛋白的結(jié)合部分是核纖層蛋白或纖層結(jié)合蛋白。
56.權(quán)利要求54的分子開關(guān)系統(tǒng)，其中所述異染色質(zhì)結(jié)合蛋白或所述異染色質(zhì)結(jié)合蛋白的結(jié)合部分選自HP1或polycomb-group蛋白。
57.一種藥物組合物，其包含與一種藥物學(xué)可接受的載體相混合的治療有效量的權(quán)利要求40到56任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)。
58.一種編碼權(quán)利要求40到56任一項(xiàng)的分子開關(guān)系統(tǒng)的第一或第二融合蛋白或兩者的核酸。
59.權(quán)利要求58的核酸，其中所述第一和第二融合蛋白是協(xié)同調(diào)控的。
60.權(quán)利要求58的核酸，其中所述第一和第二融合蛋白是獨(dú)立調(diào)控的。
61.一種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求58的核酸。
62.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求61的表達(dá)載體。
63.一種制備一或多種融合蛋白的方法，其包含(a)在表達(dá)所述一或多種融合蛋白的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求62的宿主細(xì)胞一段時(shí)間；及(b)回收所述一或多種融合蛋白。
64.權(quán)利要求61的表達(dá)載體，其中所述載體是適于轉(zhuǎn)染含有被調(diào)控的靶基因的細(xì)胞的真核表達(dá)載體。
65.一種藥物組合物，其包含與一種藥物學(xué)可接受的載體相混合的治療有效量的權(quán)利要求64的表達(dá)載體。
66.一種在時(shí)間上或空間上阻抑靶基因表達(dá)的方法，其包含(a)將含有靶核酸的細(xì)胞或生物體與權(quán)利要求40、41或44到56任一項(xiàng)的分子開關(guān)系統(tǒng)相接觸，所述靶核酸具有與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列，及(b)將所述細(xì)胞或生物體與所述分子開關(guān)系統(tǒng)的二價(jià)配體在一定的時(shí)間或位置接觸以在所述融合蛋白間形成一種復(fù)合物，由此阻抑所述靶基因的表達(dá)。
67.一種在時(shí)間上或空間上激活基因表達(dá)的方法，其包含(a)將含有靶核酸的細(xì)胞或生物體與權(quán)利要求42到56任一項(xiàng)的分子開關(guān)系統(tǒng)接觸，所述靶核酸具有與靶基因相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列，及(b)將所述細(xì)胞或生物體與一個(gè)配體在一定的時(shí)間或位置接觸以破壞第一和第二融合蛋白的關(guān)聯(lián)由此使所述靶基因的表達(dá)去阻抑。
68.權(quán)利要求66或67的方法，其中所述分子開關(guān)系統(tǒng)的融合蛋白作為蛋白質(zhì)、作為編碼一或多種所述蛋白的一或多種核酸、或作為其組合被導(dǎo)入所述細(xì)胞或生物體中。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含核被膜和/或和纖層結(jié)合結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸靶特異性嵌合蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)，以及編碼這些蛋白質(zhì)的核酸，可以用于阻抑或下調(diào)選定的基因的表達(dá)的方法中。所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選來(lái)自天然存在的鋅指蛋白質(zhì)(ZFP)或人工鋅指蛋白質(zhì)(AZP)。本發(fā)明還提供了基因調(diào)節(jié)的分子開關(guān)系統(tǒng)。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1617732SQ03802361
公開日2005年5月18日 申請(qǐng)日期2003年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月18日
發(fā)明者世良尚 申請(qǐng)人:先正達(dá)合作有限公司