專利名稱：：GnRH－白細(xì)胞毒素嵌合體的制作方法總的來(lái)說(shuō)本發(fā)明涉及免疫學(xué)載體系統(tǒng)。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及白細(xì)胞毒素-GnRH嵌合體，它包括一個(gè)以上拷貝的GnRH多肽。與單個(gè)GnRH多肽相比它顯示出具有較強(qiáng)的免疫原性。在脊椎動(dòng)物中，兩種促性腺激素，黃體化激素(LH)和促卵泡素(FSH)的合成與釋放是由稱為促性腺激素釋放激素(GnRH)(過去命名為L(zhǎng)HRH)的多肽調(diào)節(jié)的。因而，控制動(dòng)物群體繁殖的一條途徑是例如通過抗GnRH免疫法減少GnRH水平，導(dǎo)致LH和FSH水平的減低和伴隨著發(fā)情周期和精子生成的破壞。參見例如.，Adamsetal.，J.Anim.Sci.(1990)682793-2802。具體地說(shuō)，對(duì)GnRH分子的早期研究已經(jīng)表明重復(fù)注射合成的GnRH肽可能增高抗血清(Arimuraetal.，內(nèi)分泌學(xué)(1973)93(5)1092-1103)。另外，在許多種類中通過將GnRH與適當(dāng)載體的化學(xué)結(jié)合并將存在于適當(dāng)佐劑中的該結(jié)合物給藥，已產(chǎn)生了GnRH抗體(Carellietal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1982)795392-5395)。將包含GnRH或GnRH類似物的重組融合蛋白質(zhì)用于肽疫苗以對(duì)各種馴化動(dòng)物和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物免疫閹割或抑制其生殖功能的方法已有報(bào)道(Meloenetal.，疫苗(1994)12(8)741-746；Hoskinsonetal.，Aust.J.Biotechnol.(1990)4166-170；和1992年11月12日公開的國(guó)際公開號(hào)WO92/19746；1991年3月7日公開的WO91/02799；1990年10月4日公開的WO90/11298；1986年12月18日公開的WO86/07383)。然而，由于GnRH肽的極低的免疫原性和由于化學(xué)結(jié)合過程難于控制，提供適當(dāng)?shù)拿庖呓^育產(chǎn)物的努力已經(jīng)失敗，而得到了基本上不均一的很小確定性的GnRH結(jié)合物。另外，基于GnRH的肽疫苗甚至在對(duì)動(dòng)物個(gè)體重復(fù)接種后獲得均一效果的成功率也很低。在這點(diǎn)上，由于GnRH是小的“自身”的分子，通常不能由破試動(dòng)物的免疫系統(tǒng)識(shí)別，便得其免疫原性較小而不能誘導(dǎo)明顯的抗內(nèi)源GnRH的免疫應(yīng)答，現(xiàn)有的GnRH構(gòu)建體無(wú)法成為成功的免疫絕育疫苗產(chǎn)物。通常認(rèn)為病毒抗原，小蛋白質(zhì)或內(nèi)源物質(zhì)的免疫原性可以通過制備包含多重拷貝的選定抗原決定基的這些分子的免疫原形式來(lái)增強(qiáng)。在這點(diǎn)上，已經(jīng)證明I型單純皰疹病毒糖蛋白D的肽9-21的2或4個(gè)重復(fù)(Ploegetal.，J.免疫方法雜志(1989)124211-217)，Plasmodiumfalciparum的抗原環(huán)孢子小體四肽NPNA的2-6個(gè)重復(fù)(Lowelletal.，科學(xué)(1988)240800-802)，口碲疫病毒的VP1的主要免疫原位點(diǎn)的2或4個(gè)拷貝(Broekhuijsenetal.，J.gen.Virol.(1987)683137-3143)和類GnRH多肽的串聯(lián)重復(fù)基礎(chǔ)上的構(gòu)建體(Meloenetal.，疫苗(1994)12(8)741-746)能有效地提高這些分子的免疫原性。而且，為了在受激動(dòng)物中引發(fā)明顯的免疫應(yīng)答，小蛋白或內(nèi)源物質(zhì)也可以和適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合。適當(dāng)?shù)妮d體一般包含起源于如病毒表面蛋白的感染物質(zhì)的蛋白質(zhì)的抗原區(qū)或載體肽序列的多肽。這些載體的作用是非特異地刺激T輔助細(xì)胞活性并與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的分子結(jié)合以引導(dǎo)抗原在抗原呈現(xiàn)性細(xì)胞的細(xì)胞表面對(duì)該肽的加工和呈現(xiàn)。為了這一目的已經(jīng)開發(fā)了幾種載體系統(tǒng)。例如，小肽抗原通常與如鑰孔嘁血清蛋白(Bittleetal.，自然(1982)29830-33)，破傷風(fēng)類毒素(Mulleretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79569-573)，卵清蛋白，和抹香鯨肌紅蛋白的蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。這些偶聯(lián)反應(yīng)通常導(dǎo)致在每摩爾載體蛋白中摻入幾摩爾肽抗原。雖然多重拷貝的肽抗原的出現(xiàn)一般增強(qiáng)免疫原性，但是載體可以引發(fā)與肽抗原無(wú)關(guān)的強(qiáng)免疫性，這可能抑制二次免疫時(shí)對(duì)肽疫苗的免疫應(yīng)答(Schutzeetal，免疫學(xué)雜志(1985)1352319-2322)。抗原釋放系統(tǒng)也是基于特殊載體。例如，預(yù)先形成的顆粒已經(jīng)用作抗原偶聯(lián)和摻入的平臺(tái)。已經(jīng)開發(fā)出了基于蛋白體(Lowelletal.，科學(xué)(1988)240800-802)、免疫刺激復(fù)合物(Moreinetal.，自然(1984)308457-460)、和如HBsAg的病毒顆粒(Neurathetal.，Mol.Immunol.(1989)2653-62)和輪狀病毒屬內(nèi)部外殼蛋白(Redmondetal.，Mol.Immunol.(1991)28269-278)的系統(tǒng)。也利用重組生產(chǎn)的自我組裝成顆粒的嵌合蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)了載體系統(tǒng)。例如，酵母逆轉(zhuǎn)座子，Ty，編碼一系列組裝成類病毒顆粒的蛋白質(zhì)(Ty-VLPs；Kingsman，S.M.，和A.J.KingsmanVacc.(1988)6304-306)。已經(jīng)將外源基因插入TyA基因并作為融合蛋白在酵母中表達(dá)。融合蛋白保留自我組裝成均一大小的顆粒的能力。已經(jīng)檢測(cè)了其它嵌合蛋白顆粒如HBsAg(Valenzuelaetal.，Bio/Technol.(1985)3323-326；美國(guó)專利號(hào).4,722,840；Delpeyrouxetal.，科學(xué)(1986)233472-475)，乙型肝炎病毒核心抗原(Clarkeetal.，疫苗88(Ed.H.Ginsberg，etal.，1988)pp.127-131)，脊髓灰質(zhì)炎病毒(Burkeetal.，自然(1988)33281-82)，和煙草花葉病毒(Haynesetal.，Bio/Technol.(1986)4637-641)。但是，這些載體的用途受可以插入結(jié)構(gòu)蛋白而不干涉顆粒組裝的活性試劑的有限大小的限制。最后，利用與選定的抗原融合的溶血巴士德氏菌白細(xì)胞毒素(LKT)多肽設(shè)計(jì)了嵌合系統(tǒng)。參見，例如，1993年4月29日公開的國(guó)際公開號(hào)WO93/08290和1992年3月5日公開的WO92/03558，以及美國(guó)專利號(hào)5,238,823和5,273,889。通過提供具有寬譜種類反應(yīng)性的T-細(xì)胞表位，從而在免疫主體中引發(fā)一個(gè)T-細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答，包含LKT載體部分的肽抗原嵌合體提供了對(duì)該嵌合體增強(qiáng)的免疫原性。在這點(diǎn)上，誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)腡-細(xì)胞幫助對(duì)產(chǎn)生對(duì)該嵌合體肽抗原部分的免疫應(yīng)答是關(guān)鍵，特別是當(dāng)該抗原是內(nèi)源分子時(shí)。但是，到現(xiàn)在為止，還沒有白細(xì)胞毒性多肽載體與GnRH肽的多重表位結(jié)合的用途的描述。本發(fā)明基于溶血巴士德氏菌白細(xì)胞毒素基因，及其變異體和編碼多重GnRH多肽的核苷酸序列之間的新融合基因的構(gòu)建。當(dāng)與GnRH單獨(dú)給藥引發(fā)的免疫應(yīng)答相比，這些構(gòu)建體產(chǎn)生了表現(xiàn)出驚人地增強(qiáng)免疫原性的嵌合蛋白。所以在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一個(gè)包含與多體融合的白細(xì)胞毒素多肽的嵌合蛋白，該多體基本上由一個(gè)以上選定的GnRH多肽組成，而嵌合體白細(xì)胞毒素部分的作用是增強(qiáng)GnRH多肽的免疫原性。具體地說(shuō)，GnRH多體可以對(duì)應(yīng)于一個(gè)以上拷貝的選定的GnRH多肽或表位，或選定的GnRH多肽或表位的多重串聯(lián)重復(fù)。另外，GnRH多體可以定位在白細(xì)胞毒素多肽的羧基或氨基末端或內(nèi)部位點(diǎn)。GnRH多體也可以對(duì)應(yīng)于通式GnRH-X-GnRH的分子，其中X是選自于由肽鍵、氨基酸間隔基團(tuán)和(GnRH)n組成的組，其中n大于或等于1，另外其中“GnRH”可以包括任何GnRH多肽。同時(shí)公開的是包含該嵌合蛋白和藥學(xué)可接受載體的疫苗組合物，和在寄主體中提供選定的GnRH多體的方法，包括施用有效量的本疫苗組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼該嵌合蛋白的DNA構(gòu)建體。該DNA構(gòu)建體包含與編碼一個(gè)以上拷貝的GnRH表位的第二個(gè)核苷酸序列可操作地連接的編碼白細(xì)胞毒素多肽的第一個(gè)核苷酸。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含上述(a)的DNA構(gòu)建體和(b)指導(dǎo)該構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的控制序列的表達(dá)盒，從而使該構(gòu)建體在寄主細(xì)胞中可以轉(zhuǎn)錄和翻譯。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用這些表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了生產(chǎn)重組多肽的方法。該方法包括(a)提供上面描述的寄主細(xì)胞群和(b)在使表達(dá)盒編碼的多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞群。根據(jù)本文公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易想到本發(fā)明的這些和其它實(shí)施方案。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1A和1B顯示了用于嵌合白細(xì)胞毒素-GnRH多肽融合基因的GnRH構(gòu)建體的核苷酸序列和氨基酸序列。圖1A描述了包含單個(gè)拷貝的GnRH十肽的GnRH-1；圖1B描述了包含當(dāng)n＝1時(shí)四個(gè)拷貝的GnRH十肽，和當(dāng)n＝2時(shí)8個(gè)拷貝的GnRH的GnRH-2。圖2描述了質(zhì)粒pAA352的結(jié)構(gòu)，其中tac是來(lái)自大腸桿菌的雜合trp∷lac啟動(dòng)子；bla代表β-內(nèi)酰胺酶基因(氨芐青霉素抗性)；ori是基于ColE1的質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)；lktA是溶血巴士德氏菌白細(xì)胞毒素結(jié)構(gòu)基因；和lac1是E.colilac操縱子阻遏物。箭頭表示白細(xì)胞毒素基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯方向。每個(gè)成份的大小不是按比例畫出的。圖3-1到3-9表示了白細(xì)胞毒素352(LKT352)的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列。顯示了LKT352的結(jié)構(gòu)基因和側(cè)接載體區(qū)的序列。圖4表示了攜帶白細(xì)胞毒素-GnRH(LKT-GnRH)融合基因的質(zhì)粒pCB113的結(jié)構(gòu)。圖5-1到5-8表示了來(lái)自pCB113的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列。來(lái)自pCB112的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列與起源于pCB113的嵌合蛋白的序列相同，除了兩次插入多重拷貝GnRH的序列，如上面圖4所述。圖6表示了攜帶白細(xì)胞毒素-GnRH(LKT-GnRH)融合基因的質(zhì)粒pCB111的結(jié)構(gòu)。圖7-1到7-5表示了來(lái)自pCB111的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列。來(lái)自pCB114的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列與上面圖6所述的起源于pCB111的嵌合蛋白的序列相同除了兩次插入多重拷貝GnRH的序列不同。圖8表示了質(zhì)粒pCB111的截短的白細(xì)胞毒素基因的平齊末端的融合點(diǎn)的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列(圖8-2)，通過限制酶BstB1和Nael的消化從LKT352除去一個(gè)內(nèi)部DNA片段(長(zhǎng)度約為1300bp)(圖8-1)。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的方法將用到分子生物學(xué)，微生物學(xué)，病毒學(xué)，重組DNA技術(shù)，和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，它們是在本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員已知的范圍之內(nèi)的。在文獻(xiàn)中有這些技術(shù)的完全說(shuō)明。參見例如，Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)；DNA克隆，Vol.I和II(D.N.Glovered.)；低聚核苷酸合成(M.J.Gaited.)；核酸雜交(B.D.Hames和S.J.Higginseds.)；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(R.K.Freshneyed.)；固定的細(xì)胞和酶(IRL出版)；B.Perbal，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)；叢書，酶學(xué)方法(S.Colowick和N.Kaplaneds.，Academic出版社，Inc.)和實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)，Vols.I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwelleds.，Blackwell科學(xué)出版)。A.定義在描述本發(fā)明時(shí)，將用到下面的術(shù)語(yǔ)，并如下所述進(jìn)行定義。術(shù)語(yǔ)“促性腺激素釋放激素”或“GnRH”是指丘腦下部分泌的十肽，它在脊椎動(dòng)物中控制黃體化激素(LH)和促卵泡素(FSH)的釋放(Fink，G.，英國(guó)醫(yī)學(xué)通報(bào)(1979)35155-160)。在脊椎動(dòng)物之間GnRH的氨基酸序列是高度保守的，特別是在哺乳動(dòng)物中。在這點(diǎn)上，起源于大多數(shù)哺乳動(dòng)物包括人，牛，豬和羊GnRH的GnRH(過去命名為L(zhǎng)HRH)具有氨基酸序列pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(Muradetal.，激素和激素拮抗物，治療學(xué)的藥理學(xué)原理，第六版(1980)和Seeburgetal.，自然(1984)311666-668)。如本文所用，“GnRH多肽”包括起源于天然GnRH序列的分子，以及如下所述具有基本上與天然GnRH同源并保留免疫原性的的氨基酸序列的重組生產(chǎn)的或化學(xué)合成的GnRH多肽。所以，該術(shù)語(yǔ)包括在肽內(nèi)部或氨基或羧基末端發(fā)生單個(gè)或多個(gè)氨基酸疊加，替代和/或缺失的GnRH的衍生物和類似物。因此，在本發(fā)明中，“GnRH多肽”包括具有天然序列的分子，如圖1A描述的分子(具有一個(gè)N-末端Gin殘基而不是焦Glu(pyroGlu)殘基)，和具有其它氨基酸附加，替代和/或缺失的分子，它保留了引發(fā)與天然存在的GnRH交叉反應(yīng)的抗體的形成的能力。本文特別涉及的是如圖1B描述的低聚GnRH多肽的重復(fù)序列(其中每個(gè)選定的GnRH多肽包含一個(gè)N-末端Gln替代，另外其中每個(gè)其它GnRH多肽在位置2包含一個(gè)Asp殘基替代)。GnRH的表位也在該定義的范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“表位”指特異抗體分子結(jié)合的抗原或半抗原上的位點(diǎn)。由于GnRH是非常小的分子，利用本領(lǐng)域已知技術(shù)很容易完成對(duì)其中能引發(fā)抗體反應(yīng)的表位的鑒定。參見例如，Geysenetal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)813998-4002(快速合成肽在給定抗原中確定免疫原表位的位置的一般方法)；美國(guó)專利號(hào)4,708,871(鑒定和化學(xué)合成抗原的表位的方法)；和Geysenetal.，分子免疫學(xué)(1986)23709-715(鑒定對(duì)給定抗體具有高親和性的肽的技術(shù))。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“T-細(xì)胞表位”是指能誘導(dǎo)對(duì)肽構(gòu)建體或相關(guān)的半抗原的T-細(xì)胞免疫性的一種肽的特征結(jié)構(gòu)。在這點(diǎn)上，普通技術(shù)人員已接受了T-細(xì)胞表位包含在MHC分子的肽結(jié)合裂縫內(nèi)具有擴(kuò)展構(gòu)型的線性肽決定簇(Unanueetal.，科學(xué)(1987)236551-557)。將多肽轉(zhuǎn)化為MHCII類相關(guān)線性肽決定簇(長(zhǎng)度一般在5-14個(gè)氨基酸之間)定義為“抗原加工”，這是由抗原呈現(xiàn)細(xì)胞(APC)完成的。具體地說(shuō)，T-細(xì)胞表位是由短肽結(jié)構(gòu)的局部特征如一級(jí)氨基酸序列特性，包括電荷和疏水性，和不依賴于整個(gè)多肽的折疊的某些類型的二級(jí)結(jié)構(gòu)如螺旋性決定的。另外，一般認(rèn)為能夠被輔助T-細(xì)胞識(shí)別的短肽一般是兩親性結(jié)構(gòu)，包括一個(gè)疏水側(cè)鏈(與MHC分子反應(yīng))和一個(gè)親水側(cè)鏈(與T-細(xì)胞受體反應(yīng))，(Margalitetal.，計(jì)算機(jī)推測(cè)T-細(xì)胞表位，新產(chǎn)生疫苗Marcel-Dekker，Inc，ed.G.C.Woodrowetal.，(1990)pp.109-116)，另外兩親性結(jié)構(gòu)具有一個(gè)α-螺旋構(gòu)型(參見例如，Spougeetal.，J.Immunol.(1987)138204-212；Berkoweretal.，J.Immunol.(1986)1362498-2503)。所以，利用許多計(jì)算機(jī)程序可以容易地推測(cè)包括T-細(xì)胞表位的蛋白質(zhì)片段。(參見例如，Margalitetal.，T-細(xì)胞表位的計(jì)算機(jī)推測(cè)，新產(chǎn)生疫苗Marcel-Dekker，Inc，ed.G.C.Woodrowetal.，(1990)pp.109-116)。通常這些程序把肽的氨基酸序列與誘導(dǎo)T-細(xì)胞反應(yīng)的已知序列相比，尋找確信為T-細(xì)胞表位所需的氨基酸譜型?！懊庖咴缘鞍踪|(zhì)”或“免疫原性氨基酸序列”分別是在它被施用的主體中引發(fā)免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)或氨基酸。在本發(fā)明中，“GnRH免疫原”是指，當(dāng)進(jìn)入寄主時(shí)，刺激免疫應(yīng)答的GnRH分子。在這點(diǎn)上，GnRH免疫原包括對(duì)應(yīng)于一個(gè)以上選定的GnRH多肽序列的多體；具體地說(shuō)，具有多重或串聯(lián)重復(fù)的選定的GnRH多肽序列的多體、多重或串聯(lián)重復(fù)的選定的GnRH表位的多體，或其可預(yù)想到的它們的組合的多體。對(duì)抗原或疫苗的“免疫應(yīng)答”是在寄主中產(chǎn)生對(duì)所用的組合物或疫苗的細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通常，這樣一種應(yīng)答包括但不局限于一個(gè)或更多下面的結(jié)果；特異地抗包括在所用組合物或疫苗中的抗原的抗體、B細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、阻遏物T細(xì)胞、和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/或γδT細(xì)胞的產(chǎn)生?？衫帽绢I(lǐng)域已知的多個(gè)免疫測(cè)定的任何一個(gè)檢測(cè)免疫應(yīng)答。術(shù)語(yǔ)“白細(xì)胞毒素多肽”或“LKT多肽”意指包含至少一個(gè)T-細(xì)胞表位并起源于屬于以羧基末端同感氨基酸序列Gly-Gly-X-Gly-X-Asp為特征的分子的家族的蛋白質(zhì)的多肽(Highlanderetal.，DNA(1989)815-28)，其中X是Lys，Asp，Val或Asn。這些蛋白質(zhì)包括起源于溶血巴士德氏菌和Actinobacilluspleuropneumoniae的白細(xì)胞毒素，以及大腸桿菌α溶血素(Strathdeeetal.，Infect.Immun.(1987)553233-3236；Lo，Can.J.Vet.Res.(1990)54S33-S35；Welch，Mol.Microbiol.(1991)5521-528)及其它。已知這一毒素家族為毒素的“RTX”家族(Lo，Can.J.Vet.Res.(1990)54S33-S35)。另外，術(shù)語(yǔ)“白細(xì)胞毒素多肽”是指化學(xué)合成、從表達(dá)它的生物體中分離、或重組生產(chǎn)的白細(xì)胞毒素多肽。而且，該術(shù)語(yǔ)意指具有基本上與特定天然白細(xì)胞毒素分子中存在的鄰接序列同源的氨基酸序列的免疫原蛋白質(zhì)。所以，該術(shù)語(yǔ)包括全長(zhǎng)和部分序列及其類似物。雖然天然全長(zhǎng)白細(xì)胞毒素具有白細(xì)胞毒素活性，術(shù)語(yǔ)“白細(xì)胞毒素”也意指保留免疫原性但缺乏天然白細(xì)胞毒素的細(xì)胞毒性特性的分子。幾個(gè)白細(xì)胞毒素的核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列是已知的。參見例如，美國(guó)專利號(hào)4,957,739和5,055,400；Loetal.，Infect.Immun.(1985)50667-67；Loetal.，Infect.Immun.(1987)551987-1996；Strathdeeetal.，Infect.Immun.(1987)553233-3236；Highlanderetal.，DNA(1989)815-28；Welch，Mol.Microbiol.(1991)5521-528。在根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的嵌合體中，選定的白細(xì)胞毒素多肽序列提高了融合GnRH多體的免疫原性，這是通過提供含有長(zhǎng)度為5-14個(gè)氨基酸的小肽片段的T-細(xì)胞表位以及其它東西實(shí)現(xiàn)的，所述小肽片段可與MHCII類分子復(fù)合，以呈現(xiàn)于并活化T-輔助細(xì)胞。如下面進(jìn)一步討論，這些T-細(xì)胞表位存在于整個(gè)白細(xì)胞毒素分子中并認(rèn)為是集中在白細(xì)胞毒素的N-末端部分，即在氨基酸殘基1-199之間。如本文所用，“缺乏白細(xì)胞毒素活性”的白細(xì)胞毒素多肽是指如上所述的與天然全長(zhǎng)白細(xì)胞毒素(如美國(guó)專利號(hào)5,055,400和4,957,739中描述的全長(zhǎng)溶血巴士德氏菌白細(xì)胞毒素)相比缺乏明顯的細(xì)胞毒性，但仍保留免疫原性和至少一個(gè)T-細(xì)胞表位的白細(xì)胞毒素多肽。可利用已知的檢測(cè)方法如Korzeniewskietal.，免疫學(xué)方法雜志64313-320描述的乳酸脫氫酶釋放檢測(cè)來(lái)檢測(cè)白細(xì)胞毒素多肽的白細(xì)胞毒活性，其中通過從牛嗜中性白細(xì)胞乳酸脫氫酶的釋放來(lái)測(cè)定細(xì)胞毒性。如果與對(duì)照非白細(xì)胞毒性分子相比引起具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的乳酸脫氫酶的釋放，則該分子被鑒定為具有白細(xì)胞毒性。在本發(fā)明中，包含缺乏白細(xì)胞毒素活性的白細(xì)胞毒素多肽的LKT-GnRH嵌合體的構(gòu)建體提供幾個(gè)重要的益處。首先，由于注射活性毒素進(jìn)入個(gè)體能導(dǎo)致局部細(xì)胞死亡(PMN和巨噬細(xì)胞)并依次在注射位點(diǎn)引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和膿腫，因而需要缺乏白細(xì)胞毒素活性的白細(xì)胞毒素多肽。在這點(diǎn)上，導(dǎo)致殺死巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞毒素活性可以導(dǎo)致減少抗原呈現(xiàn)，因而引起最適度以下的免疫應(yīng)答。如在用于生產(chǎn)本發(fā)明融合蛋白的非白細(xì)胞毒性LKT多肽中發(fā)現(xiàn)，除去細(xì)胞毒性部分所產(chǎn)生的截短的LKT基因能在遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于全長(zhǎng)LKT的水平表達(dá)。另外，在保留足夠的T-細(xì)胞抗原性的本發(fā)明構(gòu)建的融合體中使用非白細(xì)胞毒性LKT多肽減少了白細(xì)胞毒性-GnRH抗原的整個(gè)量，該抗原量是使寄主產(chǎn)生足夠的對(duì)選定的GnRH多肽的B-細(xì)胞反應(yīng)所必需的。缺乏白細(xì)胞毒素活性的免疫原性白細(xì)胞毒素多肽的特殊例子，包括下面非常詳細(xì)描述的LKT352和LKT111?！癓KT352”意指起源于質(zhì)粒pAA352中的lktA基因的蛋白質(zhì)(圖2，ATCC登記號(hào)68283)。在國(guó)際公開號(hào)WO91/15237中描述了這一基因的核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如圖3所示。該基因編碼931個(gè)氨基酸，分子量約為99kDa的截短的白細(xì)胞毒素，它缺乏分子的細(xì)胞毒性部分。這樣產(chǎn)生的截短的基因在遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于全長(zhǎng)分子的水平(超過40％的總細(xì)胞蛋白，而全長(zhǎng)形式為1％的總細(xì)胞蛋白)表達(dá)并更易于純化。在本發(fā)明中，派生出的LKT352不是必須地物理地起源于質(zhì)粒pAA352中的序列。相反，它可能以任何方式產(chǎn)生，包括例如，化學(xué)合成或重組生產(chǎn)。另外，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列只需要與所描述的序列基本上同源。所以，只要LKT多肽能夠增強(qiáng)它所結(jié)合的抗原的免疫原性并也缺乏白細(xì)胞毒素活性，序列變異是可以存在的。“LKT111”意指起源于質(zhì)粒pCB111中的基因的白細(xì)胞毒性多肽(圖6，ATCC登記號(hào)69748)。這一基因的核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列示于圖7。該基因編碼白細(xì)胞毒素的一個(gè)截短形式，它是通過除去一個(gè)長(zhǎng)度約為1300bp的內(nèi)部DNA片段從存在于質(zhì)粒pAA352中的重組白細(xì)胞毒素基因(圖2，ATCC登記號(hào)68283)發(fā)展而來(lái)的。LKT111多肽的分子量約為52kDa(與99kDaLKT352多肽相比)，但保留了來(lái)自LKT352的含有足夠的T-細(xì)胞免疫原性所必需的T-細(xì)胞表位的N-末端部分和來(lái)自LKT352的含有用于生產(chǎn)本發(fā)明融合蛋白的適當(dāng)限制位點(diǎn)的C-末端部分。在本發(fā)明中，LKT111白細(xì)胞毒性肽不是必須起源于存在于質(zhì)粒pCB111中的序列。相反，它可以以任何方式產(chǎn)生，包括例如，化學(xué)合成或重組生產(chǎn)。另外，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列只需要與所描述的序列基本上同源。所以，只要該蛋白質(zhì)能夠增強(qiáng)它所結(jié)合的抗原的免疫原性并也缺乏白細(xì)胞毒素活性，序列變異是可以存在的。當(dāng)白細(xì)胞毒素-GnRH多肽嵌合體比對(duì)應(yīng)的單獨(dú)的GnRH多體具有更高的引發(fā)免疫應(yīng)答的能力時(shí)，它顯示出“增強(qiáng)的免疫原性”。通過給動(dòng)物施用特定的白細(xì)胞毒素-GnRH多肽和GnRH多體對(duì)照和利用如本領(lǐng)域已知的放射免疫測(cè)定和ELISA的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定比較抗兩者的抗體效價(jià)可以確定這些增強(qiáng)的免疫原性?！爸亟M”蛋白或多肽是指通過重組DNA技術(shù)，即從編碼所需多肽的外源DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生產(chǎn)的多肽?！昂铣傻摹钡鞍谆蚨嚯氖悄切┗瘜W(xué)合成制備的。DNA“編碼序列”或特定蛋白的“核苷酸編碼序列”，是在適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的控制下體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽的DNA序列。由5’(氨基)末端的起始密碼子和3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定編碼序列的分界。編碼序列可以包括，但不局限于，原核生物序列，來(lái)自真核生物mRNA的cDNA，來(lái)自真核生物(如，哺乳動(dòng)物)DNA的基因組DNA序列，甚至合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3’端。DNA“控制序列”是啟動(dòng)子序列，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，多聚腺苷酸化信號(hào)，轉(zhuǎn)錄終止序列，上游調(diào)節(jié)區(qū)，增強(qiáng)子，等的總稱，它們?cè)诩闹骷?xì)胞中共同調(diào)節(jié)編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。一個(gè)編碼序列與另一個(gè)編碼序列“可操作地連接”是指當(dāng)RNA聚合酶將兩個(gè)編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，隨后翻譯成這兩個(gè)編碼序列編碼的嵌合多肽時(shí)。編碼序列不需要一個(gè)接一個(gè)的鄰接，只要被轉(zhuǎn)錄序列最終加工產(chǎn)生所需的嵌合蛋白。當(dāng)控制序列控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄時(shí)，它就是與編碼序列“可操作地連接”的?？刂菩蛄性诩?xì)胞中“指導(dǎo)編碼序列的轉(zhuǎn)錄”是指當(dāng)RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子序列并把編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，隨后翻譯成該編碼序列編碼的多肽?！凹闹骷?xì)胞”是已經(jīng)或能夠被外源DNA序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。當(dāng)外源DNA已經(jīng)導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)被外源DNA“轉(zhuǎn)化”。外源DNA可以或可以不整合(共價(jià)連接)到染色體DNA中組成細(xì)胞的基因組。在原核生物和酵母中，例如，外源DNA可以附加體存在，如質(zhì)粒。對(duì)于真核生物細(xì)胞，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞是其中外源DNA已經(jīng)整合進(jìn)染色體中以致通過染色體復(fù)制可遺傳給子細(xì)胞。這一穩(wěn)定性被真核生物細(xì)胞能夠形成含有該外源DNA子細(xì)胞群的細(xì)胞系或克隆的所證實(shí)。當(dāng)在確定長(zhǎng)度的分子中至少約80％(優(yōu)選地至少約90％，最優(yōu)選至少約95％)的核苷酸或氨基酸匹配時(shí)，兩個(gè)DNA或多肽序列“基本同源”。在Southern雜交實(shí)驗(yàn)中，例如對(duì)特定系統(tǒng)確定的嚴(yán)饉條件下，可以鑒定基本同源的DNA序列。確定適當(dāng)雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見例如，Sambrooketa.，如上所述；DNA克隆，VolI和II，如上所述；核酸雜交，如上所述。DNA構(gòu)建體的“異源”區(qū)是附著于或存在于另一個(gè)DNA分子之中的可識(shí)別的DNA區(qū)段，該另一個(gè)分子在天然狀態(tài)不與其它分子結(jié)合存在。所以，當(dāng)異源區(qū)編碼細(xì)菌基因時(shí)，該基因通常與在源細(xì)菌基因組中不側(cè)接的細(xì)菌基因的DNA側(cè)接。異源編碼序列的另一個(gè)例子是其本身在自然界中不存在的編碼序列(例如，具有不同于天然基因的密碼子的合成序列)的構(gòu)建體。如本文所用，等位基因變化或自然發(fā)生的突變事件不產(chǎn)生DNA的異源區(qū)?！凹棺祫?dòng)物主體”是指脊索動(dòng)物亞門的任何成員，包括，但不局限于，如嚙齒動(dòng)物，牛，豬，羊，山羊，馬和人的哺乳動(dòng)物；如狗，貓的馴養(yǎng)動(dòng)物；包括如包括小雞，火雞的公雞和母雞和其它雞類鳥的馴養(yǎng)、野生和可捕獵鳥的鳥。該術(shù)語(yǔ)不表示特殊年齡。所以，成年和新生動(dòng)物都包括在內(nèi)。B.總體方法本發(fā)明的中心是發(fā)現(xiàn)了白細(xì)胞毒素多肽當(dāng)與選定的GnRH多肽重復(fù)區(qū)(或多體)偶聯(lián)時(shí)，能賦予結(jié)合的GnRH組分較高的免疫原性。在這點(diǎn)上，白細(xì)胞毒素多肽的作用是以高免疫原形式給主體的免疫系統(tǒng)提供選定的GnRH多體的載體蛋白。所以，本發(fā)明構(gòu)建的嵌合蛋白可以配制成疫苗組合物，它給存在的GnRH多肽提供增強(qiáng)的免疫原性。白細(xì)胞毒素基因與選定的GnRH多肽的融合也有利于從表達(dá)它的細(xì)胞純化該嵌合蛋白。因此，作為本文的例子的是包括與一個(gè)以上GnRH肽序列融合的白細(xì)胞毒素的白細(xì)胞毒素嵌合體。本發(fā)明特別設(shè)計(jì)的實(shí)施方案包括包含與GnRH多體融合的白細(xì)胞毒素多肽的嵌合體，其中所說(shuō)的多體基本由至少一個(gè)重復(fù)GnRH十肽序列組成，或由至少一個(gè)對(duì)應(yīng)于至少一個(gè)選定的GnRH分子的表位的序列的重復(fù)單位組成。另外，選定的GnRH肽序列可以都相同，或可以對(duì)應(yīng)于GnRH不同的衍生物、類似物、突變體或GnRH的表位，只要它們保持引發(fā)免疫應(yīng)答的能力。圖1A描述了一個(gè)具代表性的GnRH十肽的核苷酸序列。本發(fā)明的GnRH序列是通過N-末端的谷氨酰胺替代天然序列中存在的焦谷氨酸進(jìn)行修飾的。這一特殊的替代使分子保留了天然谷氨酸結(jié)構(gòu)但也保留了焦谷氨酸的無(wú)電荷結(jié)構(gòu)。因此，得到的肽不需要谷氨酸殘基的環(huán)化并可以在缺乏發(fā)生環(huán)化所必需的條件下生產(chǎn)。由于GnRH序列相當(dāng)短，用下面詳細(xì)描述的合成技術(shù)可以容易地生產(chǎn)。在本發(fā)明中，為了在脊椎動(dòng)物中幫助引發(fā)對(duì)內(nèi)源GnRH的適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答，用白細(xì)胞毒素多肽序列賦予對(duì)結(jié)合的GnRH多肽(作為載體蛋白)免疫原性。以這種方式，用GnRH的免疫接種可以在被接種動(dòng)物中通過破壞發(fā)情周期或精子生成調(diào)節(jié)繁殖力。在美國(guó)專利號(hào)4,975,420可以發(fā)現(xiàn)有關(guān)GnRH的詳細(xì)討論。另外，本文特別值得注意的是提供了目前在馴養(yǎng)和農(nóng)場(chǎng)畜牧業(yè)中使用的侵入性絕育方法如外科閹割，外科子宮卵巢切除術(shù)和諸如此類的可靠的有效的替代方法。根據(jù)本發(fā)明的在脊椎動(dòng)物中利用白細(xì)胞毒素-GnRH嵌合體對(duì)免疫抑制再生活性提供了一個(gè)有效替代方法，其中該構(gòu)建體實(shí)現(xiàn)在免疫動(dòng)物中產(chǎn)生再生活性的均一失活。在這點(diǎn)上，為了提供成功替代外科方法的手段，在個(gè)體動(dòng)物對(duì)少量接種疫苗應(yīng)答時(shí)合適的絕育疫苗產(chǎn)物必須均一地使再生能力失活。這一特性對(duì)群體動(dòng)物的免疫絕育特別重要，特別是，它如人所愿地免疫閹割雄性小豬，以防止在雄性小豬的正常功能睪丸中雄性類固醇的合成產(chǎn)生的“未閹割豬沾染”。參見例如Meloenetal.，疫苗(1994)12(8)741-746。由于GnRH肽和/或有關(guān)的載體系統(tǒng)的不充分的免疫原性，和由此產(chǎn)生的各種現(xiàn)有的基于GnRH的疫苗不能對(duì)內(nèi)源GnRH誘導(dǎo)足夠的免疫應(yīng)答，過去的開發(fā)這一產(chǎn)品的努力還沒有產(chǎn)生恒定的結(jié)果。因此，為了得到更高免疫原性的GnRH肽抗原，本發(fā)明設(shè)計(jì)的白細(xì)胞毒素-GnRH多肽嵌合體含有對(duì)應(yīng)于一個(gè)以上選定的GnRH多肽序列的GnRH部分。這一特性是基于這樣的認(rèn)識(shí)，內(nèi)源蛋白一般可以通過它們的表位的多體化而有效地賦予其自身抗原性，如上所述。具體地說(shuō)，本發(fā)明設(shè)計(jì)的新嵌合體的GnRH部分可以包含多重或串聯(lián)重復(fù)的選定的GnRH序列，多重或串聯(lián)重復(fù)的選定的GnRH表位，或其任何適當(dāng)?shù)慕M合物。在這點(diǎn)上，利用上面詳細(xì)描述的技術(shù)可以鑒定GnRH表位，或者可以測(cè)試GnRH蛋白的片段的免疫原性和可以替代整個(gè)多肽的用于組合物中的的活性片段。圖1B描述了本發(fā)明特定的GnRH部分的序列，其中四個(gè)GnRH序列、分別由(1)、(2)、(3)和(4)表示，被三個(gè)一組的氨基酸間隔序列隔開，該間隔序列含有各種絲氨酸和甘氨酸殘基組合。在該低聚物中，每隔一個(gè)的GnRH序列(分別用(2)和(4)表示)在GnRH十肽的第二位置含有一個(gè)非保守氨基酸替代，由Asp殘基替代天然GnRH序列中存在的His殘基。這樣產(chǎn)生的相間GnRH多體序列提供了一個(gè)可用于本發(fā)明融合蛋白的高免疫原性GnRH抗原肽。本發(fā)明人也特別設(shè)想了可用于重復(fù)或相間多體序列的其它對(duì)應(yīng)于任何單個(gè)或多個(gè)氨基酸附加、替代和/或缺失的GnRH類似物。此外，圖1B描述的特定的GnRH部分在GnRH部分之間含有間隔序列。為了賦予該構(gòu)建體增強(qiáng)的免疫原性，本發(fā)明人特別設(shè)想了選定的GnRH多肽之間的各種間隔序列的使用策略。因此，在本發(fā)明中，選定的間隔序列可以編碼長(zhǎng)度為一個(gè)或更多氨基酸的部分的各種類型。選定的間隔基團(tuán)可以優(yōu)選地提供酶切割位點(diǎn)以便在體內(nèi)可由蛋白水解酶(APC’s或諸如此類)加工該表達(dá)的嵌合體，產(chǎn)生多種肽——各含有至少一個(gè)起源于載體部分(白細(xì)胞毒素部分)的T-細(xì)胞表位——并優(yōu)選的是與基本上完整的GnRH多肽序列融合。另外，可以構(gòu)建間隔基團(tuán)以便在選定的GnRH組分之間的聯(lián)結(jié)區(qū)含有對(duì)免疫接種的動(dòng)物來(lái)說(shuō)為明顯的外來(lái)序列，從而賦予聯(lián)合的GnRH肽增強(qiáng)的免疫原性。另外，為了提供T-細(xì)胞抗原性，可以構(gòu)建間隔序列，如編碼兩親性和/或α-螺旋肽序列的序列，本領(lǐng)域一般認(rèn)為該序列提供免疫原性的輔助T-細(xì)胞表位。在這點(diǎn)上，由這樣的間隔序列提供的特定T-細(xì)胞表位的選擇可以依賴于所接種的特定脊椎動(dòng)物種類而變化。雖然，舉例說(shuō)明了含有間隔序列的特定的GnRH部分，本發(fā)明人也設(shè)想了包括直接鄰接的GnRH序列(沒有介入間隔序列)的GnRH多體?？梢匀菀椎刂亟M生產(chǎn)嵌合蛋白形式的白細(xì)胞毒素-GnRH多肽復(fù)合物。嵌合體的GnRH部分可以融合于該分子的白細(xì)胞毒素部分的5’或3’端，或者GnRH部分可以定位于白細(xì)胞毒素分子的內(nèi)部位點(diǎn)。編碼全長(zhǎng)溶血巴士德氏菌A1白細(xì)胞毒素的核苷酸序列已被確定，參見例如，Lo，感染免疫(1987)551987-1996；美國(guó)專利號(hào)5,055,400。另外，本文公開了幾個(gè)變異型白細(xì)胞毒素基因序列。同樣，豬，牛，羊GnRH的編碼序列已被確定，(Muradetal.，激素和激素拮抗物，治療學(xué)的藥理原理，第六版(1980))，以及人GnRH的cDNA已被克隆，所以已經(jīng)很好地建立了它的序列(Seeburgetal.，自然(1984)311666-668)。已知序列的其它GnRH多肽已經(jīng)公開，如存在于鮭魚和雞中的GnRH分子(1986年12月18日公開的國(guó)際專利申請(qǐng)公開No.WO86/07383)。在這點(diǎn)上，值得注意的是脊椎動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物中GnRH是高度保守的，另外，豬，牛，羊和人GnRH序列完全相同。利用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的重組技術(shù)可以將所需要的白細(xì)胞毒素和GnRH基因克隆分離、和連接到一起。參見例如，Sambrooketal.，如上所述。另一種可選的方法，可以合成制備而不是克隆編碼嵌合蛋白的DNA序列。用編碼特定氨基酸序列的適當(dāng)密碼子可以設(shè)計(jì)該DNA序列?？偟膩?lái)說(shuō)，如果序列將用于表達(dá)，人們將為預(yù)定的寄主選定優(yōu)選密碼子。從由標(biāo)準(zhǔn)方法制備的重疊低聚核苷酸組裝完整的序列并組裝成完整的編碼序列。參見例如，Edge，自然(1981)292756；Nambairetal.科學(xué)(1984)2231299；Jayetal.J.Biol.Chem.(1984)2596311。一旦制備或分離了嵌合蛋白的編碼序列，可以把它們克隆進(jìn)任何合適的載體或復(fù)制子。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知眾多克隆載體，使用何種載體只是一個(gè)選擇的問題。用于克隆的重組DNA載體和它們轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞的例子包括lambda噬菌體(大腸桿菌)，pBR322(大腸桿菌)，pACYC177(大腸桿菌)，pKT230(革蘭氏陰性菌)，pGV1106(革蘭氏陰性菌)，pKAFR1(革蘭氏陰性菌)，pME290(非大腸桿菌革蘭氏陰性菌)，pHV14(大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)，pBD9(芽孢桿菌)，pIJ61(鏈霉菌)，pUC6(鏈霉菌)，YIp5(酵母菌)，YCp19(酵母菌)和牛乳頭狀瘤病毒(哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。一般可參見DNA克隆Vols.I和II，如上所述；T.Maniatisetal.，如上所述；B.Perbal，如上所述。將融合基因置于啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)(用于細(xì)菌表達(dá))和可任選的操縱基因(本文總稱為“控制”元件)的控制下，以便編碼嵌合蛋白的DNA序列在由含有這一表達(dá)構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成RNA。該編碼序列可以或可以不含有信號(hào)肽或引導(dǎo)序列。利用例如，天然溶血巴士德氏菌啟動(dòng)子，大腸桿菌tac啟動(dòng)子或蛋白質(zhì)A基因(spa)啟動(dòng)子和信號(hào)序列可以表達(dá)本發(fā)明的嵌合蛋白。引導(dǎo)序列可以在翻譯后加工中被細(xì)菌寄主除去。參見例如，美國(guó)專利號(hào)4,431,739；4,425,437；4,338,397。除了控制序列，也可能需要加入調(diào)節(jié)序列，以對(duì)該蛋白質(zhì)序列的表達(dá)相對(duì)寄主的生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例子包括應(yīng)答化學(xué)或物理刺激，包括調(diào)節(jié)化合物是否存在，而使基因的表達(dá)開始或關(guān)閉的那些序列，其它類型的調(diào)節(jié)元件也可以存在于載體中，例如增強(qiáng)子序列。構(gòu)建了表達(dá)載體使特定的融合編碼序列定位于具有適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的載體中，編碼序列相對(duì)于控制序列的位置和方向應(yīng)使該編碼序列在控制序列的“控制”下轉(zhuǎn)錄(即，在控制序列上與DNA分子結(jié)合的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄該編碼序列)。為達(dá)到這一目的，可能需要修飾編碼所感興趣的特定嵌合蛋白的序列。例如，在某些情況下，可能需要修飾該序列使它能夠以適當(dāng)?shù)姆较蜻B接于控制序列，即保持讀碼框架。控制序列和其它調(diào)節(jié)序列可以在插入載體(如上所述的克隆載體)之前與編碼序列連接。另一種可選的方法，編碼序列可以直接克隆進(jìn)已經(jīng)含有控制序列和適當(dāng)?shù)南拗莆稽c(diǎn)的表達(dá)載體。在某些情況下，需要加入可引起多肽從寄主生物體分泌，隨后切割分泌信號(hào)的序列。也可能需要制備所需嵌合蛋白的突變體或類似物。由一部分編碼蛋白質(zhì)的序列的缺失、序列的插入、和/或在序列內(nèi)替代一個(gè)或多個(gè)核苷酸可以制備突變體或類似物。修飾核苷酸序列的技術(shù)，如位點(diǎn)特異性誘變，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見例如，T.Maniatisetal.，如上所述；DNA克隆，Vols.I和II，如上所述；核酸雜交，如上所述。許多原核生物表達(dá)載體是本領(lǐng)域已知的。參見例如，美國(guó)專利號(hào)4,440,859；4,436,815；4,431,740；4,431,739；4,428,941；4,425,437；4,418,149；4,411,994；4,366,246；4,342,832；同時(shí)參見英圍專利申請(qǐng)GB2,121,054；GB2,008,123；GB2,007,675；和歐洲專利申請(qǐng)103,395。酵母表達(dá)載體也是本領(lǐng)域已知的。參見例如，美國(guó)專利號(hào)4,446,235；4,443,539；4,430,428；同時(shí)參見歐洲專利申請(qǐng)103,409；100,561；96,491。根據(jù)所選擇的表達(dá)系統(tǒng)和寄主，通過在表達(dá)所需蛋白質(zhì)的條件下生長(zhǎng)由上面描述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。然后從寄主細(xì)胞分離該嵌合蛋白并純化。如果表達(dá)系統(tǒng)分泌蛋白質(zhì)進(jìn)入生長(zhǎng)培養(yǎng)基，可從培養(yǎng)基中直接純化蛋白質(zhì)。如果蛋白質(zhì)沒有被分泌，由細(xì)胞裂解物分離。適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)條件和回收方法的選擇是本領(lǐng)域的公知技術(shù)。根據(jù)確定的氨基酸序列，通過如固相肽合成的化學(xué)合成方法也可以生產(chǎn)本發(fā)明的嵌合蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見例如，J.M.Stewart和J.D.Young，固相肽合成，第二版，PierceChemicalCo.，Rockford，IL(1984)和G.Barany和R.B.Merrifield，肽分析、合成、生物學(xué)，編者E.Gross和J.Meienhofer，Vol.2，學(xué)術(shù)出版社，紐約(1980)，pp.3-254，用于固相肽合成技術(shù)；和M.Bodansky，肽合成原理，Springer-Verlag，Berlin(1984)和E.Gross和J.Meienhofer，Eds.，肽分析、合成、生物學(xué)，上述文獻(xiàn)，Vol.1，用于典型的溶液合成。對(duì)動(dòng)物個(gè)體可用根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的嵌合蛋白通過施用包含所說(shuō)蛋白質(zhì)的疫苗組合物進(jìn)行免疫接種。在免疫接種之前，可能需要進(jìn)一步增強(qiáng)特定的嵌合蛋白的免疫原性。這可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾種方法中的任何一種完成。例如，白細(xì)胞毒素-GnRH多肽融合蛋白可以與一個(gè)二級(jí)載體結(jié)合給藥。例如，一個(gè)片段可以與大分子載體結(jié)合。適當(dāng)?shù)妮d體典型地是大的代謝慢的大分子，如蛋白質(zhì)；多糖，如瓊脂糖，瓊脂，纖維素，纖維素小珠和諸如此類；聚合氨基酸，如聚谷氨酸，聚賴氨酸，和諸如此類；氨基酸共聚物；和失活的病毒顆粒。特別有用的蛋白質(zhì)底物是血清白蛋白，鑰孔嘁血藍(lán)蛋白，免疫球蛋白分子，甲狀腺球蛋白，卵清蛋白，和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)底物可以以它們的天然形式使用或者可以通過例如賴氨酸殘基的琥珀酰化或與Cys-硫內(nèi)酯反應(yīng)修飾它們的功能基團(tuán)。通過例如功能氨基與2-亞氨基thiolane或3-(4-二硫吡啶基)丙酸鹽的N-羥基琥珀酰亞胺酯的反應(yīng)也可以把巰基摻入載體(或選定的GnRH多肽)。合適的載體也可以被修飾以便摻入間隔臂(如己撐二胺或其它同樣大小的雙功能分子)用于結(jié)合肽。用于本發(fā)明的嵌合蛋白的其它合適載體包括如美國(guó)專利號(hào)5,071,651公開的輪狀病毒的VP6多肽，或其功能片段。同時(shí)有用的是病毒蛋白質(zhì)和白細(xì)胞毒素-GnRH免疫原的融合產(chǎn)物，其中該融合產(chǎn)物是由美國(guó)專利號(hào)4,722,840公開的方法制造的。還有其它合適的載體包括細(xì)胞如淋巴細(xì)胞，因?yàn)檫@一形式的呈現(xiàn)模仿了產(chǎn)生免疫接種狀態(tài)的個(gè)體中存在的天然呈現(xiàn)方式。另一種可選的方法，本發(fā)明的融合蛋白可以與紅細(xì)胞，優(yōu)選地個(gè)體自身的紅細(xì)胞偶聯(lián)。肽與蛋白質(zhì)或細(xì)胞偶聯(lián)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本發(fā)明的新嵌合蛋白也可以通過表達(dá)它們的載體病毒給藥?？捎糜诒景l(fā)明的載體病毒包括，但不局限于，痘苗和其它痘病毒，腺病毒，皰疹病毒。例如，可以如下構(gòu)建表達(dá)該新嵌合蛋白的疫苗病毒重組體。首先把編碼特定白細(xì)胞GnRH嵌合蛋白的DNA插入適當(dāng)?shù)妮d體使它與痘苗啟動(dòng)子鄰接，并且和如編碼胸腺嘧啶激酶的DNA序列側(cè)接。然后用這一載體轉(zhuǎn)染同時(shí)用痘苗感染的細(xì)胞。通過同源重組把痘苗啟動(dòng)子加上編碼本發(fā)明嵌合蛋白的基因插入病毒基因組。通過在5-溴脫氧尿苷存在時(shí)培養(yǎng)該細(xì)胞并挑選具有抗性的病毒噬菌斑可以選擇得到的TK-重組體。單獨(dú)或與藥學(xué)可接受載體或賦形劑混合給藥，將根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的嵌合蛋白免疫接種個(gè)體也是可能的。典型地，疫苗被制備成可注射的液體溶液或懸浮液；也可以制備成在注射之前適于溶于液體載體或懸浮于液體載體的固體形式。也可以將制劑乳化或?qū)⒒钚猿煞莅谥|(zhì)體載體中?；钚悦庖咴猿煞萁?jīng)常與含有藥學(xué)可接受的和與活性成份相容的賦形劑的載體混合。合適的載體是例如，水，鹽，葡萄糖，甘油，乙醇，或諸如此類，和它們的聯(lián)合。另外，如果需要，載體可以含有最小量的輔助物質(zhì)如增濕劑或乳化劑，pH緩沖劑，或增強(qiáng)疫苗效果的佐劑。佐劑可以包括例如，胞壁酰二肽，avridine，氫氧化鋁，油，皂角苷和其它本領(lǐng)域已知的物質(zhì)。制備這些藥劑形式的具體方法是已知的，或者是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。參見例如，Remington的藥學(xué)科學(xué)，Mack出版公司，Easton，Pennsylvania，第18版，1990。在任何情況下，給藥的組合物或配方中將含有一定量的適于在治療的個(gè)體中獲得所希望的免疫接種狀態(tài)的蛋白質(zhì)。適于其它給藥方式的其它的疫苗制劑包括栓劑和，某些情況下，煙霧劑，鼻內(nèi)的，口服的配方，和持續(xù)釋放配方。對(duì)于栓劑，載體組成將包括傳統(tǒng)結(jié)合物和載體如，聚堿性乙二醇，或三酰甘油酯?？梢詮暮屑s0.5％-約10％(w/w)，優(yōu)選地約1％-約2％范圍的活性成份的混合物中形成這些栓劑?？诜妮d體包括那些通常使用的賦形劑，例如，藥物級(jí)的甘露醇，乳糖，淀粉，鎂，硬脂酸鹽，糖精纖維素鈉，碳酸鎂，和諸如此類。這些口服疫苗組合物可以以溶液，懸浮液，藥片，藥丸，膠囊，維持釋放配方，或粉末的形式服用，并含有約1％-約30％的活性成份，優(yōu)選地約2％-約20％。鼻內(nèi)給藥的配方通常包括既不引起鼻粘膜刺激也不明顯打亂纖毛功能的載體。稀釋劑如水，鹽水或其它已知物質(zhì)可以用于本發(fā)明。鼻配方也可以含有防腐劑如，但不限于，三氯叔丁醇，殺藻銨。表面活性劑可能表現(xiàn)出增強(qiáng)鼻粘膜對(duì)主體蛋白的吸收。通過把嵌合蛋白摻入載體如脂質(zhì)體，不吸收的密封的聚合體如乙烯乙烯基乙酸共聚物和Hytrel共聚物，可吸脹的聚合物如水凝膠，或可吸收的聚合物如膠原和某些多元酸或如那些用于制造可吸收縫合線的聚酯制造控制的或持續(xù)釋放的制劑。嵌合蛋白也可以用本領(lǐng)域已知的植入小泵來(lái)提供。此外，嵌合蛋白(或其復(fù)合物)可以以中性或鹽形式配制成疫苗組合物。藥學(xué)可接受鹽包括酸加成鹽(用活性多肽的游離氨基形成)和那些用無(wú)機(jī)酸如鹽酸或磷酸，或有機(jī)酸如乙酸，草酸，酒石酸，苯乙醇酸，和諸如此類形成的。從游離羧基形成的鹽也可以起源于無(wú)機(jī)堿如，氫氧化鈉，鉀，銨，鈣，或鐵，和有機(jī)堿如異丙胺，三甲胺，2-乙胺基乙醇，組氨酸，普魯卡因，和諸如此類。為了免疫接種個(gè)體，將選定的GnRH-白細(xì)胞毒素嵌合體以合適的載體中非腸胃，通常肌肉內(nèi)注射給藥。但是，其它給藥方式如皮下，靜脈注射和鼻內(nèi)釋放也是可接受的?？勺⑸湟呙缰苿⒑写嬖谟谳d體中的有效量活性成份，準(zhǔn)確量是容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的。典型的活性成份的范圍為約1％-約95％(w/w)的組合物，或如果合適甚至更高或更低。給藥的量根據(jù)被治療的動(dòng)物，動(dòng)物的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力，和需要的保護(hù)程度來(lái)確定。對(duì)于該疫苗制劑，在給藥時(shí)對(duì)于產(chǎn)生免疫應(yīng)答，每ml注射溶液含有大約1μg-1mg，更通常5μg-200μgGnRH多肽是適當(dāng)?shù)?。在這點(diǎn)上，該疫苗制劑的白細(xì)胞-GnRH抗原中GnRH對(duì)白細(xì)胞毒素的比例將根據(jù)選擇的用于構(gòu)建這些分子的特定白細(xì)胞毒素和GnRH多肽組分而變化。具體地說(shuō)，在根據(jù)本發(fā)明用于生產(chǎn)疫苗制劑的白細(xì)胞毒素-GnRH多肽中，每個(gè)融合分子大約有1-25％GnRH，優(yōu)選地約3-20％和最優(yōu)選地約7-17％GnRH多肽。存在于LKT-GnRH抗原中的GnRH的百分?jǐn)?shù)的增加減少了為了引發(fā)有效的對(duì)GnRH的B-細(xì)胞應(yīng)答必須給個(gè)體施用的總抗原量。通過建立劑量應(yīng)答曲線的常規(guī)試驗(yàn)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地確立有效劑量。通過施用至少一個(gè)劑量，和優(yōu)選地兩個(gè)劑量的白細(xì)胞-GnRH多肽可以免疫接種個(gè)體。此外，可以對(duì)動(dòng)物進(jìn)行多次給藥，以維持免疫狀態(tài)。下面是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的特殊實(shí)施方案的例子。這些例子只為了說(shuō)明目的，不打算以任何方式限制本發(fā)明的范圍。C.實(shí)驗(yàn)材料和方法酶從商業(yè)途徑購(gòu)買并根據(jù)制造商的說(shuō)明使用。同時(shí)從商業(yè)途徑購(gòu)買放射性核苷酸和硝酸纖維素濾紙。在DNA片段的克隆中，除有說(shuō)明以外，所有的DNA操作都根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。參見Sambrooketal.，如上所述。從商業(yè)供應(yīng)商購(gòu)買并根據(jù)制造商的說(shuō)明使用限制酶，T4DNA連接酶，大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段，和其它生物學(xué)試劑。在瓊脂糖凝膠上分離雙鏈DNA片段。分別在pUC13和λgt11噬菌體中用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備cDNA和基因組文庫(kù)。參見DNA克隆VolI和lI，如上所述。從死于肺炎巴士德菌病的牛的肺中分離得到溶血巴士德氏菌生物型A，血清型1(“A1”)菌株B122并在-70℃儲(chǔ)存于去纖維蛋白的血液中。在血液瓊脂平板或用5％馬血清(GibcoCanadaLtd.，Burlington，Canada)補(bǔ)充的腦心浸出肉湯(Difco實(shí)驗(yàn)室，Detroit，MI)中進(jìn)行常規(guī)繁殖。所有的培養(yǎng)在37℃溫育。實(shí)施例1分離溶血巴士德氏菌白細(xì)胞毒素基因?yàn)榱朔蛛x白細(xì)胞毒素基因，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建了溶血巴士德氏菌A1(菌株B122)的基因文庫(kù)。參見，Loetal.，Infect.Immun.，如上所述；DNA克隆Vol.I和II，如上所述；和Sambrooketal.，如上所述。在質(zhì)粒載體pUC13中構(gòu)建了基因組文庫(kù)并在噬菌體λgt11中構(gòu)建了DNA文庫(kù)。將得到的克隆用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌并且收集和篩選了與來(lái)自幸免于溶血巴士德氏菌感染的并用溶血巴士德氏菌的濃縮培養(yǎng)上清液加強(qiáng)以便增加抗白細(xì)胞毒素抗體水平的牛的血清反應(yīng)的單個(gè)克隆。通過將細(xì)胞裂解物與牛中性白細(xì)胞培養(yǎng)并隨后測(cè)量后者乳酸脫氫酶的釋放來(lái)檢測(cè)陽(yáng)性克隆產(chǎn)生白細(xì)胞毒素的能力。鑒定了幾個(gè)陽(yáng)性克隆并制作限制性核酸內(nèi)切酶圖譜分析這些重組體。一個(gè)克隆似乎與過去克隆的白細(xì)胞毒素基因相同。參見，Loetal.，Infect.Immun.，如上所述。為了證明，再克隆了更小的片段并比較限制圖。證實(shí)了約4kb的DNA已被克隆。為了分離長(zhǎng)度約8kb的全長(zhǎng)重組體，通過進(jìn)行染色體步移(5’-3’方向)逐漸分離了更大的克隆。該最后的構(gòu)建體命名為pAA114。這一構(gòu)建體含有整個(gè)白細(xì)胞毒素基因序列。用DNA聚合酶I的Klenow片段加三磷酸核苷酸處理lktA，一個(gè)來(lái)自pAA114的含有整個(gè)白細(xì)胞毒素基因的MaeI限制性核酸內(nèi)切酶片段，并連接到克隆載體pUC13的SmaI位點(diǎn)。將這一質(zhì)粒命名為pAA179。由此，在用SmaI消化的基于ptac的載體pGH432lacI中制備兩個(gè)表達(dá)構(gòu)建體。一個(gè)是pAA342，含有l(wèi)ktA基因的5’-AhaIII片段，而另一個(gè)是pAA345，含有上面描述的整個(gè)MaeI片段。克隆pAA342以高水平表達(dá)截短的白細(xì)胞毒素肽，而pAA345以低水平表達(dá)全長(zhǎng)白細(xì)胞毒素。所以，lktA基因(來(lái)自pAA345的StyIBamHI片段)的3’末端與StyIBamHI消化的pAA342連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pAA352。圖2表示了pAA352的結(jié)構(gòu)，圖3表示了產(chǎn)自pAA352構(gòu)建體(下文中稱為L(zhǎng)KT352)的溶血巴士德氏菌白細(xì)胞毒素的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列。實(shí)施例2構(gòu)建LKT-GnRH融合體代表性的LKT-GnRH融合體構(gòu)建如下。用標(biāo)準(zhǔn)的氨基磷酸酯(phosphoramidite)化學(xué)方法在Pharmacia基因組裝器上構(gòu)建了含有對(duì)應(yīng)于單個(gè)拷貝GnRH和四個(gè)多重重復(fù)的GnRH的序列的低聚核苷酸。圖1A和1B顯示了這些低聚核苷酸的序列。把該低聚核苷酸退火并且連接到已經(jīng)用限制性核酸內(nèi)切酶BamH1消化的載體pAA352(ATCC號(hào)68283，如上所述)。這一載體含有溶血巴士德氏菌白細(xì)胞毒素基因。利用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株MH3000。制作限制性核酸內(nèi)切酶圖譜鑒定含有該低聚核苷酸插入體的轉(zhuǎn)化體。通過將四個(gè)拷貝的GnRH低聚核苷酸退火并把它們連接到已經(jīng)用限制性核酸內(nèi)切酶BamH1消化的載體上而制備一個(gè)八個(gè)拷貝的GnRH串聯(lián)重復(fù)序列。把低聚物設(shè)計(jì)成在插入時(shí)使上游BamH1位點(diǎn)失去功能并保證其它拷貝的低聚物的插入將定向于正確的讀碼框架。圖1B顯示了該低聚核苷酸的序列。然后分離來(lái)自大腸桿菌MH3000菌株的質(zhì)粒DNA并用于轉(zhuǎn)化菌株JM105。將該重組質(zhì)粒命名為pCB113(LKT3524個(gè)拷貝的GnRH，ATCC登記號(hào)69749)和pCB112(LKT3528個(gè)拷貝的GnRH)。圖4顯示了重組質(zhì)粒pCB113，質(zhì)粒pCB112與pCB113相同，所不同的是多個(gè)拷貝GnRH序列(對(duì)應(yīng)于圖1B的低聚物)如上所述插入兩次。圖5顯示了pCB113的重組LKT-GnRH融合體的核苷酸序列。pCB112的重組LKT-GnRH融合體的核苷酸序列是相同的，所不同的是多個(gè)拷貝的GnRH序列插入兩次。實(shí)施例3構(gòu)建截短的LKT載體肽從存在于質(zhì)粒pAA352(如上所述)的重組基因構(gòu)建重組白細(xì)胞毒素肽的一個(gè)截短形式。通過如下所述從重組LKT基因中切除長(zhǎng)度約為1300bp的內(nèi)部DNA片段產(chǎn)生截短的LKT基因。用限制酶BstBl(NewEnglandBiolabs)消化質(zhì)粒pCB113(ATCC登記號(hào)69749)，它含有與四個(gè)拷貝的GnRH多肽融合的LKT352多肽。然后用綠豆(mungbean)核酸酶(Pharmacia)消化得到的線性化質(zhì)粒，以除去BstB1消化產(chǎn)生的單鏈突出末端。然后用限制酶Nae1(NewEnglandBiolabs)消化該平齊的DNA。并把該消化的DNA加到1％的瓊脂糖凝膠上，電泳分離DNA片段。用基因清潔試劑盒(Bio101)從瓊脂糖凝膠上分離和純化約6190bp的大DNA片段，并用噬菌體T4DNA連接酶(Pharmacia)使純化片段自我連接。用得到的連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliJM105細(xì)胞，根據(jù)產(chǎn)生具有分子量約57KDa的聚集蛋白的能力鑒定陽(yáng)性克隆。這樣形成的重組質(zhì)粒命名為pCB111(ATCC登記號(hào)69748)，它產(chǎn)生與四個(gè)拷貝的GnRH多肽融合的截短的白細(xì)胞毒性多肽(下文稱為L(zhǎng)KT111)。圖6顯示了pCB111的結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒pCB114與pCB111相同，不同的是多重拷貝GnRH序列(對(duì)應(yīng)于圖1B的低聚物)插入兩次。圖7顯示了pCB111的重組LKT-GnRH融合體的核苷酸序列，pCB114的重組LKT-GnRH融合體的核苷酸序列是相同的，所不同的是多重拷貝GnRH序列插入兩次。用噬菌體T7聚合酶測(cè)序試劑盒(Pharmacia)測(cè)序，已經(jīng)證實(shí)了該克隆的連接融合點(diǎn)的核苷酸序列。圖8顯示了這些融合點(diǎn)的核苷酸序列。實(shí)施例4LKT-抗原融合體的純化用下面的方法純化實(shí)施例2和3的重組LKT-GnRH融合體。對(duì)每個(gè)融合體，在10ml用100mg/ml的氨芐青霉素補(bǔ)充的TB肉湯中接種5-10個(gè)轉(zhuǎn)化的E.coli菌株菌落，并在37C在G10搖床，220rpm上溫育6小時(shí)。把4ml該培養(yǎng)物稀釋進(jìn)兩個(gè)含有400mlTB肉湯+氨芐青霉素的涂保護(hù)層的(batfled)Fernbach燒瓶中，并如上所述溫育過夜。用SorvallGS3離心機(jī)在500ml體積的聚丙烯瓶中，以4000rpm，離心10分鐘收集細(xì)胞。將沉淀重懸浮于等體積的已經(jīng)預(yù)熱到37℃的含有氨芐青霉素的TB肉湯(即，2×400ml)，如上所述溫育細(xì)胞2小時(shí)。為了誘導(dǎo)重組融合蛋白的合成，在每個(gè)培養(yǎng)物中加入溶于水中的3.2ml異丙基-B，D-巰基吡喃半乳糖苷(IPTG，Gibco/BRL)，500mM(最后濃度＝4mM)。溫育培養(yǎng)物2小時(shí)。如上所述離心收集細(xì)胞，重懸浮于30ml50mMTris-HCl，25％(w/v)蔗糖，pH8.0，-70C冰凍。在-70℃放置60分鐘后，在室溫融化冰凍細(xì)胞，加入5ml溶菌酶(Sigma，20mg/ml于250mMTris-HCl中，pH8.0)。高速渦旋該混合物10秒，然后放于冰上15分鐘。然后把細(xì)胞加入1000ml燒杯中的500ml溶解緩沖液中并用2ml的移液管攪拌混合。把含有溶解的細(xì)胞懸浮液的燒杯放置于冰上，并用Braun超聲波器，大探針設(shè)定在100瓦特功率，聲處理共2.5分鐘(處理5-30秒間歇1分鐘)。把等體積的溶液放置在TeflonSS34離心管中并在SorvallSS34轉(zhuǎn)頭中在10000rpm離心20分鐘。在總共100ml無(wú)菌重蒸餾水中通過高速渦旋重懸浮沉淀，重復(fù)離心步驟。棄去上清液，沉淀合并入20ml10mMTris-HCl，150mMNaCl，pH8.0(Tris緩沖鹽)，并在-20℃冰凍該懸浮液過夜。在室溫下融化該重組懸浮液并加入到100ml溶于Tris-緩沖鹽中的8M鹽酸胍(Sigma)并劇烈混合。在瓶中放一磁性攪拌棒，在室溫下將溶解的樣品混合30分鐘。把溶液轉(zhuǎn)移到2000mlErlenmyer燒瓶中，快速加入1200mlTris-緩沖液。在室溫下再攪拌混合物2小時(shí)。把500ml等分試樣放入透析袋(作用譜(Spectrum)，63.7mm直徑，6000-8000MW截止值(cutoff)，#132670，來(lái)自Fisher科學(xué))，把這些放入含有3500mlTris-緩沖鹽水+0.SM鹽酸胍的4000ml燒杯中。把燒杯放于4℃室內(nèi)在磁性攪拌器上過夜，在這之后，用Tris-緩沖鹽水+0.1M鹽酸胍代替透析緩沖液并繼續(xù)透析12小時(shí)。然后將緩沖液用Tris-緩沖液+0.05M鹽酸胍替換，并繼續(xù)過夜透析。將緩沖液用Tris-緩沖液(不含胍)替換，并繼續(xù)透析12小時(shí)。把這一做法重復(fù)3次以上。把最后的溶液倒入2000ml的塑料滾筒瓶(Coming)中并加入13ml100mMPMSF(在乙醇中)抑制蛋白酶活性。以100ml等分試樣將溶液儲(chǔ)存于-20℃。為了證明融合蛋白已經(jīng)分離，把每個(gè)制劑的等分試樣在重蒸餾水中稀釋20倍，與等體積的SDS-PAGE樣品緩沖液混合，放置于沸水浴5分鐘并于12％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳。同時(shí)也對(duì)重組白細(xì)胞毒素對(duì)照進(jìn)行電泳。所有的融合蛋白以內(nèi)含體形式高水平表達(dá)。根據(jù)融合蛋白DNA序列推測(cè)的分子量是104869(LKT352∷4個(gè)拷貝的GnRH，來(lái)自pCB113)；110392(LKT352∷8個(gè)拷貝的GnRH，來(lái)自pCB112)；57542(LKT111∷4個(gè)拷貝的GnRH，來(lái)自pCB111)；63241(LKT111∷8個(gè)拷貝的GnRH，來(lái)自pCB114)。重組體LKT352分子的推測(cè)分子量是99338，重組體LKT111分子的推測(cè)分子量是51843。實(shí)施例5LKT-GnRH融合體的體內(nèi)免疫活性為了測(cè)試體內(nèi)LKT-GnRH融合體體內(nèi)誘導(dǎo)抗GnRH免疫應(yīng)答的能力，并且為了將它對(duì)其它GnRH載體結(jié)合物的應(yīng)答進(jìn)行比較，進(jìn)行了下面的免疫接種試驗(yàn)。利用了三組8個(gè)約8周齡(35-50kg)的雄性豬，它們無(wú)特異病原體。在最不易感染疾病的設(shè)施中喂養(yǎng)這些動(dòng)物并用下面的配方在試驗(yàn)的第0和21天接種組1——由用EmulsigenPlus佐劑配制的鹽組成的安慰劑(2ml)，該佐劑含有15mgDAA；組2——用同樣的佐劑配制的LKT352-GnRH(250μgLKT，如前面的實(shí)施例所述制備)(2ml)；組3——VP6-GnRH，0.5μgVP6和5μgGnRH，用同樣佐劑配制(2ml)。用美國(guó)專利號(hào)5,071,651描述的結(jié)合肽制備VP6制劑。在第0，21和35天采取血樣，凝集，在1500g離心，除去血清。用Silversidesetal.，J.Reprod.Immunol.(1985)7171-184的RIA方法測(cè)定抗GnRH的血清抗體效價(jià)。這一試驗(yàn)的結(jié)果表明只有那些用LKT352-GnRH配方免疫接種的動(dòng)物產(chǎn)生了顯著的抗GnRH的效價(jià)(效價(jià)＞1∶70)。安慰劑和VP6-GnRH組都不產(chǎn)生抗GnRH效價(jià)。過去，為了誘導(dǎo)抗激素效價(jià)需要用超過100μg的GnRH劑量，與其它載體蛋白結(jié)合重復(fù)接種。這些結(jié)果表明LKT-GnRH載體系統(tǒng)提供了大大先進(jìn)于過去的載體系統(tǒng)的免疫原。實(shí)施例6與LKT連接的多重串聯(lián)GnRH重復(fù)的體內(nèi)免疫效果為了測(cè)試含有多重GnRH多肽重復(fù)的重組LKT-GnRH融合蛋白體內(nèi)誘導(dǎo)抗GnRH免疫應(yīng)答的能力，進(jìn)行了下面的接種試驗(yàn)。如上所述制備了含有質(zhì)粒pCB113和pCB175(分別具有與LKT352連接的4和8個(gè)拷貝的GnRH)，和具有與LKT352連接的1個(gè)拷貝的GnRH的質(zhì)粒的E.coli的培養(yǎng)物。配制上面每一種培養(yǎng)物的疫苗，使之在0.2mlEmulsigenPlus中含有5μgGnRH等同物。給3組10個(gè)雌性鼠兩次相隔23天進(jìn)行皮下注射并在初次注射后的第23，35和44天收集血樣。用標(biāo)準(zhǔn)放射免疫測(cè)定方法在最終稀釋度1∶100和1∶1000測(cè)定抗GnRH的血清抗體效價(jià)。如果結(jié)合了少于5％的碘化GnRH，認(rèn)為抗體是不可測(cè)的。這樣得到的抗體效價(jià)概括于表1。這一研究的結(jié)果表明，等劑量的以多重串聯(lián)重復(fù)存在的GnRH(4或8個(gè)拷貝的GnRH)所產(chǎn)生的抗體比單個(gè)拷貝的GnRH顯著提高(如結(jié)合至碘化天然GnRH的測(cè)定)。進(jìn)一步，上面的結(jié)果表明，含有與LKT352連接的4個(gè)拷貝GnRH串聯(lián)重復(fù)的融合蛋白代表了最佳免疫原GnRH抗原形式，雖然免疫原性可能受劑量或受試個(gè)體種類影響。</tables>*平均應(yīng)答是那些以超過5％結(jié)合I125-GnRH的動(dòng)物的平均結(jié)合。表1實(shí)施例7LKT352∷GnRH和LKT111∷GnRH融合體的體內(nèi)免疫活性和生物學(xué)效應(yīng)為了測(cè)試含有多重串聯(lián)重復(fù)的GnRH的融合蛋白(與LKT352或LKT111連接)在體內(nèi)引發(fā)抗GnRH免疫應(yīng)答的能力和證明體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)行了下面的接種試驗(yàn)。如上所述制備了含有質(zhì)粒pCB113和pCB111(分別與LKT352或LKT111連接的4個(gè)拷貝的GnRH)的E.coli的培養(yǎng)物。配制上面每個(gè)培養(yǎng)物的疫苗；使0.2mlVSA-3佐劑(改良的EmulsigenPlus佐劑)中含有5μgGnRH等當(dāng)物，也制備了含有0.2ml佐劑的對(duì)照免疫苗。給3組5個(gè)雄性Swiss小鼠以21天間隔皮下注射兩次，在5-6周齡時(shí)給予首次注射(0天)。在49天殺死這些受試動(dòng)物。用標(biāo)準(zhǔn)放射免疫測(cè)定方法，以1∶1000血清稀釋度通過測(cè)定抗GnRH抗體效價(jià)測(cè)定該GnRH-LKT融合體的免疫活性。以25pg/ml的敏感度通過血清睪丸激素水平的放射免疫測(cè)試定量檢測(cè)該GnRH-LKT融合體的生物學(xué)效應(yīng)，并且稱重和組織學(xué)檢測(cè)睪丸組織。這一試驗(yàn)的結(jié)果歸納在表2。在試驗(yàn)中，所有用GnRHLKT抗原注射的動(dòng)物個(gè)體具有可容易檢測(cè)的抗體水平；然而，如應(yīng)答和效價(jià)的均一性表明LKT111∷GnRH融合體(來(lái)自質(zhì)粒pCB111)表現(xiàn)出突出的免疫原性。血清睪丸激素(由睪丸Leydig細(xì)胞產(chǎn)生)以波動(dòng)的方式分泌，因此，在正常動(dòng)物個(gè)體中可以預(yù)料血清水平值低并特別易變。在試驗(yàn)中，對(duì)照組(接受0.2ml佐劑疫苗注射)具有正常血清睪丸激素水平，而兩個(gè)處理個(gè)體組具有基本上檢測(cè)不到的血清睪丸激素。另外，在試驗(yàn)中，睪丸組織的組織學(xué)估價(jià)結(jié)果表明Leydig細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的衰退，生精子的小管直徑減小和被處理個(gè)體的精子生成的中斷；但是，被處理動(dòng)物的睪丸重量仍然接近正常-甚至在存在高抗GnRH抗體效價(jià)時(shí)-雖然在接受LKT111∷4個(gè)拷貝GnRH融合體的5個(gè)個(gè)體中的2個(gè)有明顯的睪丸退化跡象。因此，這些結(jié)果顯示與LKT352或LKT111連接的多重拷貝的GnRH組成了強(qiáng)有力的免疫原；另外表明了用本發(fā)明的融合蛋白的接種可引發(fā)能在體內(nèi)中和內(nèi)源GnRH的抗體的產(chǎn)生，并且接受這樣的接種的動(dòng)物個(gè)體可伴隨有可識(shí)別的體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)的產(chǎn)生。</tables>*在1∶1000血清稀釋度時(shí)I125-GnRH的％結(jié)合表2實(shí)施例8在豬個(gè)體中LKT∷GnRH融合體的體內(nèi)免疫活性為了測(cè)試豬個(gè)體中含有多重串聯(lián)重復(fù)的GnRH的融合蛋白(與LKT352或LKT111連接)引發(fā)體內(nèi)抗GnRH免疫應(yīng)答的能力，進(jìn)行了下面的接種試驗(yàn)。如上所述制備了含有質(zhì)粒pCB113，pCB111，pCB175和pCB114(分別為L(zhǎng)KT352∷4個(gè)拷貝GnRH，LKT111∷4個(gè)拷貝的GnRH，LKT352∷8個(gè)拷貝的GnRH，和LKT111∷8個(gè)拷貝的GnRH)的大腸桿菌培養(yǎng)物。配制上面每個(gè)培養(yǎng)物的疫苗，使之含有50μgGnRH等同物，并以2.0ml體積的溶于VSA-3佐劑中形式給藥。在試驗(yàn)的第0天注射和在21天注射4組5個(gè)雄性和5個(gè)雌性的35天齡(在第0天時(shí))的剛斷奶的小豬。在0，21和35天收集血樣，用標(biāo)準(zhǔn)放射免疫測(cè)定最終稀釋度為1∶1000的抗GnRH抗體效價(jià)。測(cè)定結(jié)果概括在表3。在試驗(yàn)中，在免疫接種之前，任何個(gè)體都不能測(cè)得抗GnRH抗體，而在第35天時(shí)大多數(shù)個(gè)體都容易地測(cè)到(處理組4的一個(gè)個(gè)體死于與處理無(wú)關(guān)的感染)。這一試驗(yàn)結(jié)果表明，含有與LKT352或LKT111載體多肽連接的多重GnRH重復(fù)的融合蛋白在豬個(gè)體中形成有用的免疫原。根據(jù)十肽GnRH(1,200)，LKT111多肽(52,000)和LKT352多肽(100,000)的推測(cè)分子量，GnRH在LKT-GnRH抗原融合體中的百分?jǐn)?shù)如下4.9％(LKT352∷4個(gè)拷貝的GnRH)；8.5％(LKT111∷4個(gè)拷貝的GnRH)；9.3％(LKT352∷8個(gè)拷貝的GnRH)；和15.7％(LKT111∷8個(gè)拷貝的GnRH)。因此，這樣得到的實(shí)際結(jié)果表明用含有LKT111多肽載體的LKT-GnRH融合體，給個(gè)體施用抗原(LKT-GnRH)的整個(gè)量可以減半(與用LKT352載體多肽系統(tǒng)的疫苗組合物相比)即可獲得相同的抗-GnRH應(yīng)答。</tables>表3實(shí)施例9在重組LKT352和LKT111分子中的T-細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)為了預(yù)測(cè)用于本發(fā)明的LKT-GnRH嵌合體的白細(xì)胞毒素多肽序列中的潛在的T-細(xì)胞表位，如表4描述將對(duì)應(yīng)于LKT分子1-199的氨基酸序列實(shí)施Margalit和合作者建議的方法(Margalitetal.，J.Immunol(1987)1382213)。在該方法中，把白細(xì)胞毒素多肽序列的氨基酸序列與其它已知的誘導(dǎo)T-細(xì)胞反應(yīng)的序列和確信是T-細(xì)胞表位所需要的氨基酸譜型相比。表4描述了比較結(jié)果。正如所看到的預(yù)測(cè)結(jié)果，根據(jù)Margalitetal(如上所述)建議的原則鑒定了白細(xì)胞毒性多肽的幾個(gè)短序列是潛在的T-細(xì)胞表位。具體地說(shuō)，鑒定9個(gè)序列具有(帶電/Gly-疏水的-疏水的-極性/Gly)序列(如表4的譜型“1”所指)，并且鑒定了3個(gè)序列具有(帶電/Gly-疏水的-疏水的-疏水的/Pro-極性/Gly)序列(如表4的譜型“2”所指)。把這些數(shù)據(jù)與上面實(shí)施例7和8的LKT352和LKT111載體系統(tǒng)產(chǎn)生的體內(nèi)抗GnRH活性結(jié)合，可看出，關(guān)鍵的T-細(xì)胞表位保留在截短的LKT111分子中，那些表位可能包含在LKT352和LKT111分子的N-末端部分。表4對(duì)應(yīng)于潛在的T-細(xì)胞表位的LKT序列圖譜顯示譜型“1”的LKT氨基酸序列GTID(aa′s27-30)GITG(aa′s66-69)GVIS(aa′s69-72)HVAN(aa′s85-88)KIVE(aa′s93-96)DLAG(aa′s152-155)KVLS(aa′s162-165)DAFE(aa′s171-174)KLVQ(aa′s183-186)GIID(aa′s192-195)顯示譜型“2”的LKT氨基酸序列RYLAN(aa′s114-118)KFLLN(aa′s124-128)KAYVD(aa′s167-171)D.工業(yè)應(yīng)用當(dāng)給脊椎動(dòng)物寄主給藥時(shí)，本發(fā)明的白細(xì)胞毒素-GnRH嵌合體可用作免疫原進(jìn)行針對(duì)內(nèi)源性GnRH的免疫，從而抑制寄主的生殖功能或生殖能力。盡管本說(shuō)明書舉例說(shuō)明的特異用途，本文公開的新嵌合分子提示了提供含有一個(gè)以上多重或串聯(lián)重復(fù)存在的GnRH肽序列的融合蛋白的方式，其中該GnRH肽序列與分子的白細(xì)胞毒素多肽部分(某些情況中，是存在于選定的GnRH序列間的間隔肽序列)提供的免疫原表位融合。本發(fā)明構(gòu)建的該嵌合蛋白提供給融合GnRH肽序列增強(qiáng)的免疫原性，使被接種的脊椎動(dòng)物寄主增強(qiáng)了對(duì)內(nèi)源GnRH的有效免疫應(yīng)答；使兩種促性腺激素，黃體化激素(LH)和促卵泡素(FSH)的合成和釋放終止，從而使寄主暫時(shí)不育。以這種方式，新白細(xì)胞毒素-GnRH構(gòu)建體可用于免疫絕育疫苗，用于替代目前用于馴養(yǎng)和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物畜牧業(yè)的侵入性絕育方法。本發(fā)明融合分子的其它的用途包括群體控制，例如破壞野生嚙齒動(dòng)物群體的再生能力。在這點(diǎn)上，LKT-GnRH融合分子可以用來(lái)替代目前使用的群體控制措施如毒害等。本發(fā)明的融合產(chǎn)物也可以具有慢和快釋放成份的構(gòu)建體形式給藥。以這種方式，可以避免多次接種的需要。另外，由于GnRH的氨基酸序列在種類之間是高度保守的，可以生產(chǎn)一種具有廣泛的種類交叉效果的白細(xì)胞毒素-GnRH融合疫苗產(chǎn)物。所以，本文公開了含有與選定的GnRH多肽融合的白細(xì)胞毒素的各種嵌合蛋白。雖然已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但仍可以做一些明顯的改變而不脫離后附的權(quán)利要求所限定的范圍。用于實(shí)施本發(fā)明的菌株的保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，12301ParklawnDrive，Rockville，Maeyland對(duì)下述菌株的生物學(xué)純培養(yǎng)物進(jìn)行了保藏。所標(biāo)明的登記號(hào)是在成功的存活力測(cè)試，付了申請(qǐng)費(fèi)后登記的。本保藏是在國(guó)際公認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約及其實(shí)施細(xì)則的規(guī)定下進(jìn)行的。這保證了從保藏日起存活的培養(yǎng)物維持30年并且要求保藏單位提供保藏樣品后至少維持5年。在布達(dá)佩斯條約的條款下可從ATCC獲得這些微生物，該條約保證由美國(guó)專利和商標(biāo)委員會(huì)根據(jù)35USC§122和委員會(huì)的規(guī)則(包括37CFR§1.12)決定給予資格的人永久和不受限制地可獲得這些培養(yǎng)物。這些保藏僅是為了方便本領(lǐng)域技術(shù)人員，并不是承認(rèn)為了滿足35USC§112的要求而進(jìn)行的保藏。這些質(zhì)粒的核酸序列以及它們編碼的多肽氨基酸序列引入本文中作為參考，并在與本文的描述的存在不一致時(shí)為對(duì)照。制造、使用、或銷售保藏材料均需得到許可，但這樣的許可是不會(huì)授予的。菌株保藏日期ATCCNo.溶血巴士德氏菌血清型1B1221989年2月1日53863在大腸桿菌W1485中的pAA3521990年3月30日68283在大腸桿菌JM105中的pCB1131995年2月1日69749在大腸桿菌JM105中的pCB1111995年2月1日69748權(quán)利要求1.一種含有與多體融合的白細(xì)胞毒素多肽的嵌合蛋白，該多體基本上由一個(gè)以上的選定的GnRH多肽組成，其中所說(shuō)的嵌合蛋白的白細(xì)胞毒素部分的作用是增強(qiáng)所說(shuō)的GnRH多體的免疫原性。2.根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合蛋白，其中所說(shuō)的白細(xì)胞毒素多肽缺失了白細(xì)胞毒素活性。3.根據(jù)權(quán)利要求2的嵌合蛋白，其中所說(shuō)的白細(xì)胞毒素是LKT352。4.根據(jù)權(quán)利要求2的嵌合蛋白，其中所說(shuō)的白細(xì)胞毒素是LKT111。5.根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合蛋白，其中所說(shuō)的GnRH多體含有通式為GnRH-X-GnRH的分子，其中X是選自于由肽鍵，氨基酸間隔基團(tuán)，白細(xì)胞毒素多肽和(GnRH)n組成的組，其中n大于或等于1，另外其中GnRH包括任何GnRH多肽。6.根據(jù)權(quán)利要求5的嵌合蛋白，其中X包括含有至少一個(gè)輔助T-細(xì)胞表位的氨基酸間隔基團(tuán)。7.根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合蛋白，其中所說(shuō)的嵌合蛋白包括圖5描述的氨基酸序列，或與其基本同源和功能相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄小?.根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合蛋白，其中所說(shuō)的嵌合蛋白包括圖7描述的氨基酸序列，和與其基本同源和功能相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄小?.含有根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)的嵌合蛋白和藥學(xué)可接受載體的疫苗組合物。10.一種給受試動(dòng)物提供選定的GnRH多體的方法，包括給所說(shuō)的動(dòng)物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求9的疫苗組合物。11.編碼權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)嵌合蛋白的DNA構(gòu)建體。12.一種表達(dá)盒，包括(a)根據(jù)權(quán)利要求11的DNA構(gòu)建體；和(b)指導(dǎo)所說(shuō)的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的控制序列，其中所說(shuō)的構(gòu)建體可以在寄主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯。13.用權(quán)利要求12的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞。14.生產(chǎn)重組多肽的方法，包括(a)提供權(quán)利要求13的寄主細(xì)胞群；和(b)在使所說(shuō)表達(dá)盒編碼的多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)所說(shuō)的細(xì)胞群。全文摘要本發(fā)明公開了新免疫學(xué)載體系統(tǒng),編碼它們的DNA,和這些系統(tǒng)的用途。該載體系統(tǒng)包括嵌合蛋白質(zhì),該嵌合蛋白質(zhì)包含一個(gè)與選定的GnRH多體融合的白細(xì)胞毒素多肽,該多體基本上由至少一個(gè)重復(fù)GnRH十肽序列組成,或由至少一個(gè)對(duì)應(yīng)于選定的GnRH分子的至少一個(gè)表位的序列的重復(fù)單位組成。在本發(fā)明中,選定的GnRH序列可能都相同,或可能對(duì)應(yīng)于GnRH不同的衍生物,類似物,變異體或GnRH的表位,只要GnRH序列能引發(fā)免疫應(yīng)答。白細(xì)胞毒素的功能是增強(qiáng)其中融合的GnRH多體的免疫原性。文檔編號(hào)C07K19/00GK1179181SQ96192680公開日1998年4月15日申請(qǐng)日期1996年1月24日優(yōu)先權(quán)日1996年1月24日發(fā)明者安德魯·A·波特,約翰·G·曼斯申請(qǐng)人:薩斯喀徹溫大學(xué)