專利名稱:用于使化合物靶向多種選定器官或組織的分子的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及體內(nèi)靶向領域,并提供了歸巢于、結(jié)合于多種器官或組織并被多種器官或組織吸收的分子。
背景技術:
大多數(shù)治療性化合物通過循環(huán)遞送至靶器官或組織。然而,在大多數(shù)情況下,藥物或其它治療不僅靶向患病器官或組織,而且會被體內(nèi)的其它器官和組織吸收。這由于例如遍及患者身體的普遍毒性效應而導致不期望的副作用。因此,選擇性靶向特定器官或組織是理想的。另外,將治療化合物與靶向分子偶聯(lián)能夠改善被靶向的組織或細胞對化合物的攝取性質(zhì),這產(chǎn)生更有效的分子。因此,與靶向分子偶聯(lián)獲得相比于母體化合物更有效且毒性更低的化合物,參見 Curnis et al., 2000, Nature Biotechnol.18,1185-1190。這能夠應用于多種化合物,例如肽、蛋白質(zhì)、細胞抑制劑、抗菌素和抗病毒劑。在諸如杜興氏肌營養(yǎng)不良(DMD)、肌強直性營養(yǎng)不良(MD)或脊髓性肌萎縮(SMA)的肌肉疾病的情況下,肌特異性肽能夠與例如反義寡核苷酸(AON)和小干擾RNA(SiRNA)結(jié)合。AON和SiRNA通過阻斷不期望基因的轉(zhuǎn)錄而具有用作治療特定疾病的新型藥品的高效能。在DMD治療領域中,反義誘導的外顯子跳讀(antisense-1nduced exon skipping)作為用于校正抗肌萎縮蛋白(dystrophin)轉(zhuǎn)錄子的翻譯讀碼框的新穎且有前景的工具而備受關注。其目的是以如下方式操作剪接:跳讀被靶向的外顯子(通過將AON與前體mRNA結(jié)合)并產(chǎn)生較短但為框內(nèi)的轉(zhuǎn)錄子。這允許校正翻譯讀碼框,并誘導合成貝克肌營養(yǎng)不良(Becker’s muscular dys trophy, BMD)樣抗肌萎縮蛋白,所述蛋白可以顯著緩解疾病進展。已有若干報道顯示出在體外培養(yǎng)的患者來源的肌細胞中(van Deutekom etal.,2001, Hum.Mol.Genet.10, 1547-1554)和在體內(nèi)通過肌內(nèi)注射的轉(zhuǎn)基因hDMD小鼠肌組織中(Bremmer-Bout et al., 2004, Mol.Ther.10,232-240),外顯子跳讀策略用于恢復抗肌萎縮蛋白生成的治療潛力。然而,要克服的最大障礙是這些AON的體內(nèi)攝取差,特別是在如肌強直性營養(yǎng)不良(MD)和脊髓性肌萎縮(SM)的各類肌病中。這些肌萎縮癥的有效治療需要靶向包括臂和腿的骨骼肌的基本上所有的骨骼肌和參與呼吸的肌肉以及心肌。至今沒有研究出能夠同時將(反義)寡核苷酸(更不用說完整基因)特異性遞送至全身基本上所有肌組織/細胞的機理,。迄今為止已經(jīng)公開的用于將基因或其它化合物體內(nèi)遞送至肌肉的方法包括采用或不采用電轉(zhuǎn)移注射裸DNA、使用微泡(Lu et al.2003,Gene Ther.10,396-405)和使用泊洛沙姆(羥基聚(氧-乙烯)聚(氧丙烯))的全身遞送。最近在mdx小鼠中顯示出全身遞送嗎啉代AON導致抗肌萎縮蛋白在若干肌肉中表達增加(Alter et al., 2006, Nature Med.12, 1-3) 然而,即使在重復給予后,抗肌萎縮蛋白表達在膈中幾乎檢測不到,并且在心肌中檢測不出。此外,在這些mdx小鼠中AON相當容易被吸收進入肌肉中,因為肌膜受損,但例如年輕杜興氏患者的肌肉的情況并非如此。而且,在如SMA和MD的其它肌肉疾病中,AON的遞送是復雜的,因為在該情況下肌細胞壁未受損。理論上,全身肌肉治療使用具有細胞特異性靶向能力的化合物的全身遞送(例如靜脈內(nèi)或皮下)。某些分子已經(jīng)被描述為具有肌細胞靶向的潛力。最先報道的是具有增強的體內(nèi)骨骼和心肌結(jié)合的肽序列,其通過篩選隨機曬菌體展示文庫被鑒定(Samoylova andSmith, 1999, Muscle Nerve22,460-466)。然而,沒有表明該肽是否能夠用于使偶聯(lián)的化合物體內(nèi)靶向肌細胞。還已經(jīng)描述了在噬菌體隨機肽文庫的體內(nèi)篩選后從人骨骼肌中回收的多個7-聚肽序列(Arap et al., 2002, Nature Medicine8, 121-127)。未提供與心肌細胞結(jié)合的信息。該文同樣沒有表明,這些肽是否能夠用于使偶聯(lián)的化合物體內(nèi)靶向肌細胞。已經(jīng)描述的另一分子是體內(nèi)選擇性轉(zhuǎn)運至骨骼肌的單克隆抗體(mAb)的Fv部分(Weisbartet al.,2003,Mol.1mmunol.39,783-789)。將鼠源性mAb的單鏈Fv片段注射入小鼠尾靜脈,4小時后,在20%的骨骼肌細胞中發(fā)現(xiàn)片段,所述片段主要位于細胞核中。mAb顯示出與骨骼肌細胞裂解物中的蛋白肌球蛋白IIb結(jié)合,但其未與心肌細胞裂解物中的任何蛋白結(jié)合。因此,該抗體可以用于靶向骨骼肌而不是靶向心肌。在溶酶體貯積癥的情況下,酶 替代療法中的問題是肌細胞對治療性重組酶的體內(nèi)攝取差。例如在龐貝氏病(糖原貯積病II型)中,由于骨骼肌對rhGAA的攝取差,因此臨床研究中需要的重組人酸性α -葡糖苷酶(rhGAA)的劑量非常高(Winkel et al.,2004, Ann.Neurol.55,495-502)。鑒于以上所述,進一步改善遞送系統(tǒng)是實現(xiàn)諸如AON的藥劑的體內(nèi)特異性攝取明顯所需的。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供化合物,優(yōu)選肽或模擬肽(peptidomimetic),其歸巢于感興趣的器官或組織或細胞型,特別是包括心臟在內(nèi)的肌細胞。通過將診斷部分或具有生物活性的部分與這樣的歸巢化合物(homing compound)偶聯(lián),使所述部分祀向特定器官或組織或細胞。在廣泛研究后,本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出大量與肌細胞選擇性結(jié)合并被肌細胞攝取的肽,所述肌細胞包括心臟。因此本發(fā)明通過將例如治療性重組酶或(反義)寡核苷酸與肌肉特異性肽結(jié)合滿足了改善所述酶或寡核苷酸體內(nèi)攝取的需要。分子有利地用于治療肌病的反義治療方法、其中肌肉潛在地用作蛋白生成儲庫的疾病的基因治療、以及將多種診斷或藥物遞送至心臟和肌細胞。因此,本發(fā)明涉及包含選自以下序列或 由選自以下序列組成的肽或模擬肽:LGAQSNF(SEQ ID NO:100)QLFTSAS(SEQ ID NO:3)LYQDYSL(SEQ ID NO:85)SPNSIGT stfthprSTIHGST SAPRPLYAAQTSTP yqdsakt avtinep VTAATLS TYPAALLELSPSAP tvpqltt qnappsl YDIDNRR QTLLPSHTSFQPHR gntpsra ltqmsis RLTLPMP GTAPPVHHSPSKIP fphypms ashleps amttkid ATLTHPPHMATFHY llatptp aqpnkfk mpallrs LPPEHPLAHPQLAT YAGPYQH HWEMWSY QAPRLffS HTPNSTHSNQLVEG fspstpn asspvhr SPHSASL DQLPLIPSLAAYLH wsqmhfl sipllnh NQQFYIL FESRLTA
QPLSNAS KPAYGST ANYSVSIYSHTAAT QHPPffRVMPAVPHS sallpsf thpptth snsirpn asvqqrgFPPSFTA mqqgprp qktalpltygtkis slkllnqTSSTMNR YKHTPTT GSffYQVPYYFPPFY AYKPVGRASTLKffA TffTFRIP SYMIQLSIQSPHFF SVSPffGITHLPffQT AHSMGTG FMSPLffTIVNTAPL STFTKSPIPTLPSS AFVSRQP SSLPLRKTYSTLGY VTYKTASEPLQLKM WSLQASH TLffVPSR QGMHRGTSESMSIK LPffKPLG QSPHTAPTPAHPNY SLLGSTPTALPPSY VNSATHS LPLTPLPNQLPLHA TQTPLKQHAIYPRH AMISAIH NLTRLHTHVIANAG以上序列的序列標識符為SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 100。本發(fā)明還涉及肽或模擬肽與部分的偶聯(lián)物,所述部分選自與肽或模擬肽連接的生物活性部分和診斷部分,所述肽或模擬肽包含選自以下的序列或由選自以下的序列組成:
LGAQSNF(SEQ ID NO:100)QLFTSAS (SEQ ID NO: 3)LYQDYSL(SEQ ID NO:85)SPNSIGT STFTHPRSTIHGST SAPRPLYAAQTSTP YQDSAKT AVTINEPVTAATLS TYPAALLELSPSAP TVPQLTT QNAPPSLYDIDNRR QTLLPSHTSFQPHR GNTPSRA LTQMSISRLTLPMP GTAPPVHHSPSKIP FPHYPMS ASHLEPSAMTTKID ATLTHPPHMATFHY LLATPTP AQPNKFKMPALLRS LPPEHPLAHPQLAT YAGPYQH HWEMWSYQAPRLffS HTPNSTHSNQLVEG FSPSTPN ASSPVHR SPHSASL DQLPLIPSLAAYLH WSQMHFL SIPLLNH NQQFYIL FESRLTAQPLSNAS KPAYGST ANYSVSIYSHTAAT QHPPffRVMPAVPHS SALLPSF THPPTTH SNSIRPN ASVQQRGFPPSFTA MQQGPRP QKTALPLTYGTKIS SLKLLNQTSSTMNR YKHTPTT GSffYQVPYYFPPFY AYKPVGRASTLKffA TffTFRIP SYMIQLSIQSPHFF SVSPffGITHLPffQT AHSMGTG FMSPLffTIVNTAPL STFTKSPIPTLPSS AFVSRQP SSLPLRKTYSTLGY VTYKTASEPLQLKM WSLQASH TLffVPSR QGMHRGTSESMSIK LPffKPLG QSPHTAPTPAHPNY SLLGSTPTALPPSY VNSATHS LPLTPLPNQLPLHA TQTPLKQHAIYPRH AMISAIH NLTRLHTHVIANAG上述的偶聯(lián)物用作藥物是本發(fā)明的一方面。發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了用于將診斷部分或生物活性部分靶向感興趣的器官或組織或細胞型的肽或模擬肽,所述細胞型特別是包括心臟在內(nèi)的肌細胞。本發(fā)明范圍內(nèi)的肽包含至少7個氨基酸。所述肽可以完全由天然存在的L-氨基酸構建,或者可以包含一種或多種對主鏈和/或側(cè)鏈的修飾。可以通過摻入氨基酸模擬物來引入這些修飾,所述氨基酸模擬物顯示出與天然氨基酸的類似性。上述包含一種或多種氨基酸模擬物的肽序列被稱為模擬肽。在本發(fā)明范圍內(nèi),氨基酸模擬物包括但不限于β2-和β 3-氨基酸、β 2,2- β 2,3和β 3,3- 二取代氨基酸、α,α - 二取代氨基酸、氨基酸的抑制素(statine)衍生物、D-氨基酸、α -羥基酸、α -氨基腈、N-烷基氨基酸等。此外,肽的C-末端可以是羧酸或羧胺,或由摻入一種上述氨基酸模擬物生成的其它物質(zhì)。此外,上述肽可以包含一個或多個天然肽鍵由下述基團取代的取代,所述基團包括但不限于:磺酰胺、逆酰胺(retroamide)、含氨氧基的鍵、酯、燒基酮、α, α - 二氟酮、α-氟酮、類肽(peptoid)鍵(N-烷基化甘氨酰酰胺鍵)。此外,上述肽可以包含氨基酸側(cè)鏈(是指相應天然氨基酸的側(cè)鏈)的取代,例如4-氟苯丙氨酸、4-羥賴氨酸、3-氨基脯氨酸、2-硝基酪氨酸、N-烷基組氨酸或者在β_側(cè)鏈碳原子處具有與天然手性相反的手性的β_支鏈氨基酸或β_支鏈氨基酸模擬物(例如別蘇氨酸、別異亮氨酸及其衍生物)。在一個其它實施方案中,以上提及的肽序列可以包含氨基酸的相似結(jié)構類似物或氨基酸模擬物,例如取代賴氨酸的鳥氨酸、取代苯丙氨酸的高苯丙氨酸或苯基甘氨酸、取代甘氨酸的β -丙氨酸、取代谷氨酸的焦谷氨酸、取代亮氨酸的正亮氨酸或者甲硫氨酸和/或半胱氨酸的硫氧化形式。本專利包括上述肽的線性或環(huán)狀形式,以及它們的逆向、反向和/或逆反類似物。本領域技術人員已知更多的類似變型,但是本文并未提及這些,這并不限制本發(fā)明的范圍。在一實施方案中,本發(fā)明的肽或模擬肽長度至多為30個氨基酸,或者長度至少為25個氨基酸或20個氨基酸或19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8 或 7 個氨基酸。生物活性部分是發(fā)揮(直接或間接)生物學功能優(yōu)選治療功能的化合物,因此優(yōu)選治療活性化合物。治療活性化合物能夠是本領域已知的任何化合物,并優(yōu)選為通過調(diào)節(jié)細胞間過程而具有治療作 用的化合物。具有(直接)調(diào)節(jié)作用或(直接)生物學功能的治療活性化合物能夠為例如任何蛋白、酶抑制劑、寡核苷酸、siRNA、基因、或藥物。能夠使用任何生物活性化合物或治療活性化合物,只要它能夠與本發(fā)明的肽或模擬肽連接或能夠使其適于與本發(fā)明的肽或模擬肽連接。生物活性化合物或治療活性化合物因此成為本發(fā)明化合物中的部分。本領域技術人員能夠鑒定合適的生物活性或治療活性化合物。在一個實施方案中,生物活性化合物或治療活性化合物是包含核酸或其類似物或者由核酸或其類似物組成的化合物。這樣的化合物可以被認為通過特別是在蛋白生成水平調(diào)節(jié)細胞內(nèi)遺傳機構來發(fā)揮(間接)生物學功能,優(yōu)選治療功能。核酸可以是DNA、RNA或其類似物,諸如包含例如2’ -O-甲基_、2’ -O-甲氧基乙基-(MOE)和2’ -O-烯丙基核苷酸的2’ -O-烷基或2’ -O-烯基(烯丙基)或2’ -O-炔基核苷酸的化合物,鎖核酸(LNA),肽核酸(PNA),乙烯橋聯(lián)核酸(ENA),硫代磷酸修飾的核苷酸例如2’ -O-甲氧基乙基硫代磷酸RNA核苷酸或2’ -O-甲基硫代磷酸RNA核苷酸,基于嗎啉代的核苷酸及其組合等。核酸可以是基因、多核苷酸或寡核苷酸、小干擾RNA等等。在一個實施方案中,診斷部分與本發(fā)明的肽或模擬肽連接。診斷部分可以用于體內(nèi)或體外診斷目的。常用的成像標記、放射標記或突光標記例如Cy3、Cy5、Cy5.5等,或者綠色熒光蛋白(GFP)或其它可能經(jīng)由重組表達的診斷蛋白可以用作診斷部分。為了制備本發(fā)明的偶聯(lián)物,通過將化合物與氨基酸或肽偶聯(lián)的已知方法,將生物活性部分或診斷部分與本發(fā)明的肽或模擬肽進行偶聯(lián)。常規(guī)方法是將部分與肽或模擬肽中的自由氨基或自由羥基或自由羧酸基團或自由硫醇基連接。通常的結(jié)合方法包括硫醇/馬來酰亞胺偶聯(lián)、酰胺或酯鍵形成,或混合二硫化物形成。本領域技術人員熟知能夠用于產(chǎn)生所需偶聯(lián)的標準化學方法。生物活性部分或診斷部分可以與肽或模擬肽直接偶聯(lián)或經(jīng)由間隔子或連接子分子偶聯(lián)。生物活性或診斷部分并不必需與本發(fā)明的肽或模擬肽共價連接。它還可以通過靜電相互作用結(jié)合。在一個實施方案中,本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的肽或模擬肽以及連接部分的分子,所述連接部分不是肽,用于將所述分子與生物活性部分或診斷部分連接。連接部分例如可以是與生物活性多-或寡核苷酸配合的(聚)陽離子基團。這樣的(聚)陽離子基團可以是精胺或聚乙烯亞胺、聚乙二醇、聚-L-賴氨酸等等。如在一個實施方案中提及的,本發(fā)明的肽或模擬肽與生物活性部分連接。例如肽或模擬肽能夠與生物活性或治療性肽連接,并且在一個實施方案中,肽或模擬肽甚至能夠是肽或模擬肽基礎結(jié)構的一部分。例如,治療性肽的氨基-或羧基-末端能夠用包含上述肽或由上述肽組成的序列延伸。應當理解,用本發(fā)明的肽或模擬肽延伸的肽包含在本發(fā)明的偶聯(lián)物中。制備這樣的肽能夠通過標準的氨基酸或肽偶聯(lián)步驟實現(xiàn)。在一個實施方案中,本發(fā)明的肽或模擬肽與核定位信號(NLS)結(jié)合。在一個實施方案中,本發(fā)明的偶聯(lián)物與NLS結(jié)合。在本發(fā)明范圍內(nèi),NLS的作用為引導本發(fā)明的偶聯(lián)物例如生物活性部分或診斷部分進入細胞核,大概是通過它被胞質(zhì)的核轉(zhuǎn)運受體識別發(fā)揮作用的。NLS可以是本發(fā)明的肽或模擬肽的一部分,例如NLS的氨基或羧基末端能夠用包含上述肽或由上述肽組成的序列延伸。NLS還可以在不同于本發(fā)明的肽或模擬肽的位置與生物活性部分或診斷部分偶聯(lián)。NLS序列在本領域是已知的。通常NLS信號由帶正電荷的賴氨酸和/或精氨酸的(幾個)短序列組成或包含帶正電荷的賴氨酸和/或精氨酸的(幾個)短序列,例如 NLS 由(K)KKR(K)、(K)KRS(K), (K) (S)RK(R) (K)組成或包含(K)KKR(K)、(K)KRS (K)、(K) (S) RK(R) (K)。已知的 NLS 是 PKKKRKV、GKKRSKV、KSRKRKL。在一個實施方案中,本發(fā)明的肽或模擬肽與選自SEQ ID NO: 101-115的NLS結(jié)合。在一個實施方案中,通過肽或模擬肽與生物活性蛋白的重組表達來制備本發(fā)明的偶聯(lián)物,在所述偶聯(lián)物中,生物活性部分是蛋白或多肽且肽或模擬肽包含在所述蛋白或多肽骨架中。優(yōu)選制備DNA構建體使得本發(fā)明的肽或模擬肽在生物活性肽的末端表達,優(yōu)選在生物活性肽的C-末端表達。通過重組DNA方法制備這樣的DNA構建體并在適當宿主中表達是本領域技術人員的常規(guī)實踐。因此,在一個實施方案中,本發(fā)明的偶聯(lián)物是本發(fā)明的肽與治療活性蛋白(例如抗體)或診斷(例如熒光)蛋白或兩者的融合蛋白,任選地還包含NLS,所述本發(fā)明的肽為例如SEQ ID NO: 1-100的肽。這樣的融合蛋白能夠通過適當DNA構建體的表達來制備。因此,本發(fā)明提供了用于將生物活性部分例如寡核苷酸、基因、蛋白、藥物等靶向多種正常器官或組織特別是肌細胞和心臟的肽或模擬肽。因此,本發(fā)明還涉及本發(fā)明的偶聯(lián)物制備用于將 生物活性部分或診斷部分靶向肌細胞的藥物的用途。在一個實施方案中,所述藥物用于治療與肌細胞相關的病癥,包括心臟病癥。與肌細胞相關的病癥包括肌病、肌營養(yǎng)不良和肌萎縮癥。在一個實施方案中,所述藥物用于治療與肌肉生長抑制素(myostatin)相關的病癥。肌肉生長抑制素還與II型糖尿病和肥胖相關。因此,在一個實施方案中,所述藥物用于治療II型糖尿病和/或肥胖。在另一實施方案中,所述藥物用于治療包括心臟病癥在內(nèi)的肌細胞相關病癥,所述病癥選自杜興氏肌營養(yǎng)不良、貝克肌營養(yǎng)不良、艾-德肌營養(yǎng)不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy)、肢帶型肌營養(yǎng)不良、面肩肱型肌營養(yǎng)不良、強直性肌營養(yǎng)不良、眼咽型肌營養(yǎng)不良、先天性肌營養(yǎng)不良、遠端型肌營養(yǎng)不良、肌萎縮側(cè)索硬化、嬰兒型脊髓性肌萎縮、(少年型、中間期和成年型)脊髓性肌萎縮、脊髓延髓肌萎縮、皮肌炎、多肌炎、包涵體肌炎、重癥肌無力、蘭伯特-伊頓肌無力綜合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)、先天性肌無力綜合征、甲狀腺機能允進性肌病、甲狀腺機能減退性肌病、夏-馬-圖三氏肌萎縮(Charcot-Marie-Tooth disease)、弗里德賴希型共濟失調(diào)、德-索氏病(Dejerine-Sottas disease)、先天性肌強直(湯姆森氏病和貝克氏病)、先天性肌強直、中央軸空病、桿狀體肌病、肌管肌病(中央核肌病)、周期性癱瘓(低鉀性和高鉀性);線粒體肌病和由肉堿和以下酶缺陷導致的肌肉疾病:磷酸化酶、酸性麥芽糖酶(龐貝氏病)、果糖磷酸激酶、脫支酶(也被稱為淀粉-1,6-葡糖苷酶);也被稱為福布斯病的糖原貯積病、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、乳酸脫氫酶和肌腺苷酸脫氨酶。在一個實施方案中,本發(fā)明的偶聯(lián)物還能夠用作非病毒基因遞送或非病毒基因治療的工具。作為偶聯(lián)物,本發(fā)明的肽或模擬肽能夠使基因靶向細胞,特別是肌細胞。在一個實施方案中,基因構建體允許在酶替代治療中生成酶或者基因構建體允許生成治療性蛋白,例如諸如因子VII1、因子IX、因子VI1、膽紅素UDP葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、所有溶酶體貯積癥蛋白如α -葡糖苷酶或特別是Aldurazyme 、Cerezyme 、Fabrazyme .成Myozyme 。 本發(fā)明的一個實施方案是將病毒或病毒顆粒靶向細胞。在本發(fā)明的偶聯(lián)物中,病毒或病毒顆粒是生物活性部分。在一個實施方案中,本發(fā)明的肽或模擬肽與病毒生物活性部分如下連接:在病毒基因組中包括肽或模擬肽的DNA/RNA序列使得肽或模擬肽在病毒或病毒顆粒的外表面處表達。產(chǎn)生這樣的表達的重組方法學是本領域技術人員熟知的。因此,所述肽或模擬肽使病毒或病毒顆粒靶向特定細胞/組織。這對于靶向接種、基因治療、基因替代或病毒外顯子跳讀構建體(AAVvectors expressing antisense sequences fused toeither Ulor U7small nuclear RNA (表達與Ul或U7小核RNA融合的反義序列的AAV載體);Denti et al.,2006,Hum.Gene Ther.17,565-574)特別有用。在一個實施方案中,本發(fā)明的肽或模擬肽選自YQDSAKT、VTYKTAS、EPLQLKM、WSLQASH、TLWVPSR、QGMHRGT、LYQDYSL、SESMSIK、LPffKPLG, QSPHTAP、TPAHPNY、SLLGSTP、TALPPSY、VNSATHS、LPLTPLP、NQLPLHA、GNTPSRA、TQTPLKQ、AMISAIH、NLTRLHT、HVIANAG、HAIYPRH和 LGAQSNF。在另一實施方案中,本發(fā)明的肽或模擬肽選自SPNSIGT、STFTHPR、QLFTSAS、STIHGST、SAPRPLY、AAQTSTP、YQDSAKT、EPLQLKM、TLWVPSR、LYQDYSL、LPffKPLG, TPAHPNY、TALPPSY、LPLTPLP、HAIYPRH 和 GNTPSRA。在另一實施方案中,本發(fā)明的肽或模擬肽選自YQDSAKT、EPLQLKM、TLWVPSR、LYQDYSL、LPffKPLG, TPAHPNY、TALPPSY、LPLTPLP、HAIYPRH 和 GNTPSRA。在一個實施方案中,本發(fā)明的肽或模擬肽選自YQDSAKT和GNTPSRA。
在一個實施方案中,本發(fā)明的肽或模擬肽選自QLFTSAS、LYQDYSL和LGAQSNF。本發(fā)明還包括DNA和其互補DNA序列,以及DNA序列的RNA轉(zhuǎn)錄子及其互補RNA序列,所述DNA由編碼本發(fā)明的肽的序列組成或包含編碼本發(fā)明的肽的序列,所述DNA序列由編碼本發(fā)明的肽的序列組成或包含編碼本發(fā)明的肽的序列。本發(fā)明還涉及藥物組合物,其包含本發(fā)明的偶聯(lián)物和藥物可接受的載體。
實施例實施例1:針對成肌細胞和肌管的肽的體外選擇已經(jīng)篩選了包含20億表達隨機7-mer肽的噬菌體的預制噬菌體肽文庫(NewEngland Biolabs Inc.)以鑒定肌肉特異性肽。簡短地說,將曬菌體展示肽的文庫用鋪于培養(yǎng)瓶中的細胞進行孵育。在洗掉未結(jié)合的噬菌體后,洗脫特異性結(jié)合或內(nèi)在化的噬菌體并進行擴增。包括分別針對人或小鼠肌管和成纖維細胞的正負選擇輪次在內(nèi)的一系列不同體外生物淘選(biopanning)步驟后,富集結(jié)合序列庫,所述結(jié)合序列通過DNA測序來表征。因此,鑒定出與靶細胞結(jié)合并被靶細胞內(nèi)在化的肌肉特異性肽。所發(fā)現(xiàn)的特異性肽序列如表I所示。表1:針對人和小鼠肌管的體外選擇后發(fā)現(xiàn)的肽序列
權利要求
1.與選自生物活性部分和診斷部分的部分連接的肽或模擬肽的偶聯(lián)物,所述肽或模擬肽包含NLTRLHT或由NLTRLHT組成。
2.如權利要求1所述的偶聯(lián)物,其中所述生物活性部分選自DNA、RNA或其類似物,諸如包含2,-O-燒基特別是2’ -O-甲氧基乙基-和2’ -O-甲基、或2’ -O-稀基(稀丙基)或2’ -O-炔基核苷酸的化合物,鎖核酸(LNA),肽核酸(PNA),乙烯橋聯(lián)核酸(ENA),硫代磷酸修飾的核苷酸,基于嗎啉代的核苷酸及其組合。
3.如權利要求1或2所述的偶聯(lián)物,所述偶聯(lián)物是NLTRLHT與治療活性蛋白和/或診斷蛋白的融合蛋白。
4.如權利要求3所述的偶聯(lián)物,其還包含核定位信號。
5.權利要求1-4中任一項所述的偶聯(lián)物用于制備使生物活性部分或診斷部分靶向肌細胞的藥物的用途。
6.如權利要求5所述的用途,其中所述藥物用于治療與肌細胞相關的病癥,包括心臟病癥。
7.如權利要求6所述的用途,其中所述藥物用于治療肌病、肌營養(yǎng)不良或肌萎縮癥。
8.如權利要求5所述的用途,其中所述藥物用于治療II型糖尿病或肥胖。
9.分子,其包含肽或模擬肽以及用于連接所述分子與生物活性部分或診斷部分的非肽的連接部分,所述肽或 模擬肽包含NLTRLHT或由NLTRLHT組成。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含與部分連接的器官、組織或腫瘤細胞歸巢分子的偶聯(lián)物。所述部分能夠是例如寡核苷酸、小干擾RNA、基因、病毒、蛋白、藥物或可檢測劑。此外,本發(fā)明提供了通過給予患有或疑似患有病變的個體分子或偶聯(lián)物以診斷或治療肌肉或心臟病變的方法,所述分子或偶聯(lián)物歸巢于、結(jié)合于肌細胞或心臟細胞并被肌細胞或心臟細胞攝取。
文檔編號A61K47/48GK103212085SQ20131009128
公開日2013年7月24日 申請日期2008年7月14日 優(yōu)先權日2007年7月12日
發(fā)明者約翰尼斯·安東尼烏斯·海姆斯凱克, 朱迪思·克里斯蒂娜·塞奧多拉·萬多伊特科姆, 皮特拉·萬庫伊克-羅梅恩, 杰勒德·約翰尼斯·普拉滕伯格 申請人:普羅森那技術公司