天冬氨酰-tRNA合成酶-FC綴合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了天冬氨酰-tRNA合成酶與Fc區(qū)的綴合多肽（DRS-Fc綴合物）如DRS-Fc融合蛋白、包含其的組合物，以及使用該綴合物和組合物治療或診斷各種病癥的方法。相對(duì)于對(duì)應(yīng)的未改性的DRS多肽，本發(fā)明的DRS-Fc綴合物具有改善的受控釋放特性、穩(wěn)定性、半衰期和其他藥代動(dòng)力學(xué)和生物學(xué)特性。
【專利說明】天冬氨酰-tRNA合成酶-FC綴合物
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)基于35U.S.C. § 119(e)要求于2011年12月29日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第 61/581，550號(hào)的權(quán)益，其通過引用整體并入本文。
[0003] 關(guān)于序列表的聲明
[0004] 與本申請(qǐng)相關(guān)的序列表以文本格式提供代替紙件副本，其通過引用并入本說明書 中。含有該序列表的文本文件的名稱為ATYR_109_01W0.ST25.txt。該文本文件大小為約 263KB，創(chuàng)建于2012年12月20日，其通過EFS-Web電子遞交。
[0005] 發(fā)明背景

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0006] 本發(fā)明總體涉及一個(gè)或多個(gè)天冬氨酰-tRNA合成酶（DRS)多肽和免疫球蛋白Fc區(qū)的綴合物如融合蛋白、含有其的組合物，以及使用該多肽和組合物治療或診斷各種病癥 的方法。
[0007] 相關(guān)領(lǐng)域的描述
[0008] 最近已經(jīng)表明，天冬氨酰-tRNA合成酶（DRS)及其片段和變體（總稱DRS或AspRS多肽）具有多種與治療和診斷相關(guān)的非經(jīng)典活性。具體地，已經(jīng)確定某些天冬氨酰-tRNA合 成酶片段為內(nèi)源性生成的高效力Toll樣受體調(diào)節(jié)劑。不受任何一種具體操作理論的束縛， 據(jù)認(rèn)為這類DRS多肽在蛋白水解切割后或通過全長(zhǎng)DRStRNA合成酶的替代性剪切自巨噬 細(xì)胞釋放，且能夠結(jié)合至其他細(xì)胞類型并調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)活性。當(dāng)給予這類DRS多肽時(shí)，提供 了選擇性調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的新機(jī)制，且沒有通常與傳統(tǒng)抗炎劑如類固醇關(guān)聯(lián)的副作用特性。
[0009]Toll樣受體（TLR)是在啟動(dòng)生物體的快速先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的模式 識(shí)別受體家族。TLR識(shí)別某些病原體或源自宿主的細(xì)胞組分，其特征通常分別為病原體相關(guān) 的分子樽式（PAMP)或損傷相關(guān)的分子模式（DAMP)。PAMP對(duì)于給定類型的病原體通過為獨(dú) 特的，并包括例如細(xì)菌組分如革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖，以及病毒特異性核酸基序或者病 毒特異性的RNA或DNA修飾。相反，DAMP通常為內(nèi)源性分子，其在細(xì)胞應(yīng)激或組織損傷后 子垂死的宿主細(xì)胞釋放。
[0010] TLR通過不同的可能機(jī)制參與幾種慢性炎癥和免疫介導(dǎo)的病癥，包括那些被認(rèn)為 是感染試劑啟動(dòng)了疾病發(fā)展的病癥。例如，內(nèi)源性損傷信號(hào)或自體抗原以TLR依賴性方式 引起慢性炎癥的情況，或者其中TLR可能與免疫耐受性崩潰有關(guān)。已發(fā)現(xiàn)TLR與慢性炎癥 疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，如炎癥性腸病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和多發(fā)性硬化。
[0011]目前越來越認(rèn)識(shí)到，組織的一些自體免疫性和炎癥病癥的成功治療，需要有 效控制炎癥反應(yīng)，以便保護(hù)組織的完整性和功能而不造成患者的免疫損傷。近來的實(shí) 驗(yàn)證據(jù)表明，TLR途徑的具體調(diào)控引起一些炎癥病癥的改善而沒有損傷組織功能或促 進(jìn)細(xì)菌或病毒感染，這暗示了具有明顯改善的副作用特性的新抗炎治療策略的可能 性。此外，已經(jīng)證明TLR激動(dòng)劑可用于過敏性、感染性和自體免疫疾病的臨床試驗(yàn)，并正 發(fā)展用于多種其他疾病，包括癌癥、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、炎癥性腸病，一般參見Zhu和 Mohan(2010),MediatorsofInflammationdoi:10. 1155/2010/781235;Hennessyet al.，Nat.Rev. 9:293-307, 2010)。因此，TLR越來越被認(rèn)為是調(diào)控多種疾病和病患的可能的 新治療靶標(biāo)。
[0012] 為了最好地開發(fā)治療或診斷環(huán)境中的這些和其他活性，本領(lǐng)域需要具有改善的藥 代動(dòng)力學(xué)特性的DRS多肽。這些改善的治療形式的DRS多肽使得能夠開發(fā)出治療各種疾病 和病患的更有效的治療方案，并比未改性的蛋白需要明顯更少的給藥頻率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖 1 顯示了純化的蛋白AspRSlN1(C76S) (DRS(1-154) (C76S)(SEQIDN0:29)和相 應(yīng)的非突變蛋白AspRSlN1(DRS(l-154))(SEQIDN0:31)的SDS-PAGE分析。在還原性條 件下運(yùn)行泳道1-3,并在非還原性條件下運(yùn)行泳道4-6。泳道1和4:AspRSlN1DRS(l-154)lot#D-Nl-V5H-046，泳道 2 和 5AspRSlN1(DRS(l-154))lot#D-Nl-V5H-047，泳道 3 和 6:AspRSlN1(C76S)(SEQIDN0:29)lot#D-Nl:l-V5H-048。
[0014] 圖2顯示了HEK-Blue2細(xì)胞中針對(duì)AspRSlN1(SEQIDN0:31)(灰色方塊）和AspRSlN1(C76S)(SEQIDN0:29)(黑色圓圈）刺激受TLR2受體介導(dǎo)的報(bào)告基因活性的能力 的直接比較?；疑切蝊Pam3CSK4。
[0015] 圖3顯示了HEK-Blue4細(xì)胞中針對(duì)AspRSlN1(SEQIDN0:31)(灰色方塊）和AspRSlN1(C76S)(SEQIDN0:29)(黑色圓圈）刺激受TLR4受體介導(dǎo)的報(bào)告基因活性的能力 的直接比較。
[0016] 圖4顯示了DRS-Fc(SEQIDN0:37)純化的SDS-PAGE分析。泳道1，澄清的裂解 產(chǎn)物；泳道2,MabSelect穿流（flow-through);泳道3,MabSelect洗漆；泳道4,純化的DRS-Fc〇
[0017] 圖5顯示了DRS-Fc融合蛋白（SEQIDNO:37)的SEC分析。上面的跡線（trace) 是280nm處的吸光度，而下面的跡線是260nm處的吸光度。
[0018] 圖6顯示了示例性免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)組成，并提供了抗體類型和亞類的概述。
[0019] 圖 7 顯示了 來自人IgAl(SEQIDN0:66)、IgA2(SEQIDN0:67)、IgM(SEQID N0:68)、IgGl(SEQIDN0:69)、IgG2(SEQIDN0:70)、IgG3(SEQIDN0:71)、IgG4(SEQID N0:72)和IgE(SEQIDN0:73)的Fc區(qū)的比對(duì)。序列上方顯示了Fca的二級(jí)結(jié)構(gòu)。脫字符O和星號(hào)（*)顯示了分別占結(jié)合表面的0-4%和5-12%的殘基。
[0020] 圖8顯示了在身體局部輻照生存模型中給予AspRSlN1(C76S)的結(jié)果；AspRSlN1 (C76S)顯示為正方形，而PBS對(duì)照顯示為菱形。
[0021] 圖9A和9B顯示了相比媒介物對(duì)照（PBS)(菱形）和陽性對(duì)照（地塞米松（三角 形），在痛風(fēng)炎癥（正方形）的MSU誘導(dǎo)的模型中給予AspRSlN1(C76S)的結(jié)果。插圖顯示 了AspRSlN1(C76S)( "穩(wěn)定素（Homeokine)"）相比媒介物對(duì)照的統(tǒng)計(jì)顯著性。
[0022] 發(fā)明概述
[0023] 本發(fā)明的實(shí)施方案總體上涉及具有一個(gè)或多個(gè)與其共價(jià)結(jié)合的免疫球蛋白Fc區(qū) 的天冬氨酰-tRNA合成酶（DRS)多肽綴合物、包含這類分子的藥物組合物、生產(chǎn)方法及其治 療應(yīng)用方法。除其他優(yōu)勢(shì)外，相對(duì)于相應(yīng)的未修飾的DRS多肽，本發(fā)明的DRS-Fc綴合物可 具有改善的藥代動(dòng)力學(xué)特性和/或改善的治療相關(guān)的生物學(xué)活性。
[0024] 因此，某些實(shí)施方案包括DRS融合多肽，其包含與SEQIDN0:l、3_24、29、31或 154-197中任一序列具有至少80%同一性的DRS氨基酸序列，和至少一個(gè)融合至所述DRS多肽的C-末端、N-末端或兩端的Fc區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述DRS多肽包含與SEQID NO: 1、3-24、29、31或154-197中任一序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在具體的實(shí) 施方案中，所述DRS多肽包含SEQIDN0:l、3-24、29、31或154-197中任一序列所示的氨基 酸序列。
[0025] 在某些實(shí)施方案中，所述DRS多肽長(zhǎng)度為約130-300個(gè)氨基酸，且包含SEQID N0:1 的氨基酸殘基 1-154、11-146、13-146、23-154、1-171 或 1-174、1-182、1-184、1-224 或 1-274,或者包含與SEQIDN0:1 的殘基 1-154、11-146、13-146、23-154、1-171 或 1-174、 I- 182、1-184、1-224或1-274具有至少90 %同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所 述DRS多肽長(zhǎng)度為約130-200個(gè)氨基酸，且包含SEQIDN0:1的氨基酸殘基1-154、11-146、 13-146、23-154、1-171、1-174、1-182 或 1-184,或者包含與SEQIDN0:1 的殘基 1-154、 II- 146、13-146、23-154、1-171、1-174、1-182 或 1-184 具有至少 90% 同一性的氨基酸序列。 在某些實(shí)施方案中，所述DRS多肽長(zhǎng)度為約130-175個(gè)氨基酸，且包含SEQIDNO: 1的氨 基酸殘基1-154、23-154、1-171或1-174，或者包含與5￡0 1〇勵(lì)：1的殘基1-154、23-154、 1-171或1-174具有至少90%同一性的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述DRS多肽包 含SEQIDNO: 1 的氨基酸殘基 1-154、11-146、13-146、23-154、1-171 或 1-174。在特定的實(shí) 施方案中，所述DRS多肽基本上由SEQIDNO: 1的氨基酸殘基1-154組成。在一些實(shí)施方 案中，所述DRS多肽基本上由SEQIDNO: 1的氨基酸殘基13-146組成。在具體的實(shí)施方案 中，所述DRS多肽包含0B折疊結(jié)構(gòu)域、N-末端兩親性螺旋或兩者。
[0026] 在一些實(shí)施方案中，所述Fc區(qū)和DRS多肽被肽連接子隔開。在某些實(shí)施方案中， 所述肽連接子長(zhǎng)度為約1-200個(gè)氨基酸、約1-150個(gè)氨基酸、約1-100個(gè)氨基酸、約1-90個(gè) 氨基酸、約1-80個(gè)氨基酸、約1-70個(gè)氨基酸、約1-60個(gè)氨基酸、約1-50個(gè)氨基酸、約1-40 個(gè)氨基酸、約1-30個(gè)氨基酸、約1-20個(gè)氨基酸、約1-10個(gè)氨基酸或約1-5個(gè)氨基酸。在具 體的實(shí)施方案中，肽連接子長(zhǎng)度為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，所述肽連接子 由或基本上由Gly和/或Ser殘基組成。在一些實(shí)施方案中，所述肽連接子為生理學(xué)上穩(wěn) 定的連接子。在其他實(shí)施方案中，所述肽連接子為可釋放的連接子，任選地為可酶切的連接 子。在特定的實(shí)施方案中，所述肽連接子包含SEQIDN0:80-139中任一序列。
[0027] 在一些實(shí)施方案中，所述Fc區(qū)融合至DRS多肽的C-末端。在某些實(shí)施方案中，所 述Fc區(qū)融合至DRS多肽的N-末端。
[0028] 在某些實(shí)施方案中，所述Fc區(qū)包含以下的一個(gè)或多個(gè)：來自哺乳動(dòng)物IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4 和 / 或IgM的鉸鏈、CH2、CH3 和 / 或CH4 結(jié)構(gòu)域。在具體的 實(shí)施方案中，所述DRS融合多肽不包含免疫球蛋白的CHpQ、'和VH區(qū)。在特定的實(shí)施方 案中，所述Fc區(qū)包含SEQIDN0: 38-64中任一序列或者其變體、片段或組合。
[0029] 在某些情況下，相對(duì)于相應(yīng)的DRS多肽，所述DRS融合多肽具有改變的藥代動(dòng)力 學(xué)。所述改變的藥代動(dòng)力學(xué)的實(shí)例包括增加的血清半衰期、增加的生物利用度和/或降低 的清除率。在一些情況下，相對(duì)于相應(yīng)的DRS多肽，所述DRS融合多肽具有改變的免疫效應(yīng) 子活性。這類免疫效應(yīng)子活性的實(shí)例包括以下一種或多種：補(bǔ)體活化、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒 作用（CDC)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC)或抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用 (ADCP)。
[0030] 在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型Fc區(qū)，所述Fc區(qū)包含F(xiàn)c區(qū)變體。在一些實(shí)施 方案中，所述Fc區(qū)變體包含與SEQIDN0:38-64中任一序列具有至少90%同一性的序列或 所述序列的組合。在某些實(shí)施方案中，所述Fc區(qū)變體包含來自不同物種、不同Ig類型或不 同Ig亞類的一個(gè)或多個(gè)Fc區(qū)的雜合體。在具體的實(shí)施方案中，所述Fc區(qū)變體包含來自不 同物種、不同Ig類型和/或不同Ig亞類的Fc區(qū)的一個(gè)或多個(gè)鉸鏈、012、013和/或014結(jié) 構(gòu)域的雜合體。
[0031] 在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于相應(yīng)的野生型Fc區(qū)，所述Fc區(qū)變體為改性的糖型。在 具體的實(shí)施方案中，相對(duì)于相應(yīng)的野生型Fc區(qū)，所述Fc區(qū)變體具有改變的藥代動(dòng)力學(xué)。這 類改變的藥代動(dòng)力學(xué)的實(shí)例包括血清半衰期、生物利用度和/或清除率。在一些實(shí)施方案 中，相對(duì)于相應(yīng)的野生型Fc區(qū)，所述Fc區(qū)變體具有改變的效應(yīng)子活性。這類效應(yīng)子活性的 實(shí)例包括以下一種或多種：補(bǔ)體活化、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用（CDC)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo) 的細(xì)胞毒作用（ADCC)或抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用（ADCP)。
[0032] 在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于相應(yīng)的野生型Fc區(qū)，所述Fc區(qū)變體具有對(duì)一種或多種Fcy受體的改變的結(jié)合。示例性Fcy受體描述于本文中且為本領(lǐng)域已知。
[0033] 在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于相應(yīng)的野生型Fc區(qū)，所述Fc區(qū)變體具有改變的（例 如，增加的）溶解度；且相對(duì)于相應(yīng)的未改性DRS多肽，DRS-Fc融合蛋白具有改變的溶解 度。
[0034] 在特定的實(shí)施方案中，所述DRS-Fc融合多肽在生理溶液中或在其他生理?xiàng)l件如 體內(nèi)條件下基本上為二聚體形式。在特定的實(shí)施方案中，如通過UV圓二色譜分析所測(cè)定， 所述DRS-Fc融合多肽具有和相應(yīng)未改性的或不同地改性的DRS多肽基本上相同的二級(jí)結(jié) 構(gòu)。
[0035] 在一些實(shí)施方案中，當(dāng)給予至哺乳動(dòng)物時(shí)，所述DRS-Fc融合多肽具有的血漿或血 清藥代動(dòng)力學(xué)AUC譜為相應(yīng)的未改性DRS多肽的至少5倍。
[0036] 在某些實(shí)施方案中，在基于TLR2或TLR4的分析中，所述DRS-Fc融合多肽具有 與相應(yīng)未改性的或不同地改性的DRS多肽基本上相同的活性。
[0037] 在某些實(shí)施方案中，在基于TLR2或TLR4的分析中，所述DRS-Fc融合多肽具有 的活性大于相應(yīng)未改性的或不同地改性的DRS多肽的2倍。
[0038] 在某些實(shí)施方案中，當(dāng)于室溫和類似條件下，在pH7. 4的PBS中進(jìn)行7天的比較 時(shí)，所述DRS-Fc融合多肽具有的穩(wěn)定性比相應(yīng)未改性的或不同地改性的DRS多肽大至少 30%。
[0039] DRS-Fc融合多肽的特定實(shí)例包含SEQIDN0:36或37,或者與SEQIDN0:36或37 具有至少80%、90%、95%、98%同一性的氨基酸序列。
[0040] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括給藥方案，當(dāng)采用的給藥間隔為3天或更長(zhǎng)時(shí)，其 將對(duì)象血漿中DRS多肽的平均穩(wěn)態(tài)濃度維持在約0. 3yg/ml至約3yg/ml，所述方案包括將 治療劑量的本文描述的任何DRS-Fc融合多肽給予至該患者。
[0041] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在有需要的對(duì)象中維持DRS多肽水平高于最低有 效治療水平的方法，包括將治療劑量的本文描述的任何DRS-Fc融合多肽給予至所述對(duì)象。
[0042] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括治療對(duì)象中的炎癥反應(yīng)的方法，包括將前述公開的本 文描述的任何DRS-Fc融合多肽給予至有需要的對(duì)象。
[0043] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括治療有需要的對(duì)象中TLR相關(guān)的疾病的方法，包括將 治療劑量的本文描述的任何DRS-Fc融合多肽給予至所述對(duì)象。
[0044] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括調(diào)節(jié)對(duì)象中的TLR活性的方法，包括將治療劑量的本 文描述的任何DRS-Fc融合多肽給予至所述對(duì)象。
[0045] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括殺死癌癥細(xì)胞的方法，包括將包含本文描述的任何DRS-Fc融合多肽的疫苗或免疫原性組合物給予至有需要的對(duì)象。
[0046] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括治療患癌對(duì)象或防止對(duì)象中癌癥發(fā)展的方法，包括將 包含本文描述的任何DRS-Fc融合多肽的疫苗或免疫原性組合物給予至有需要的對(duì)象。
[0047] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括克服對(duì)象中對(duì)抗原的耐受性的方法，包括將包含本文 描述的任何DRS-Fc融合多肽的疫苗或免疫原性組合物給予至有需要的對(duì)象。
[0048] 還包括分離的多核苷酸，其包含編碼本文描述的DRS-Fc融合多肽的核苷酸序列， 包括包含這類多核苷酸的載體，以及包含所述多核苷酸和/或載體的宿主細(xì)胞。
[0049] -些實(shí)施方案包括制備本文描述的DRS融合多肽的方法，其包括a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞 以表達(dá)DRS-Fc融合多肽，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼本文描述的DRS-Fc融合多肽的多核 苷酸，其任選地連接至調(diào)控元件；以及b)從所述宿主細(xì)胞中分離DRS-Fc融合多肽。
[0050] 發(fā)明詳述
[0051] 除非另有相反的說明，本發(fā)明的實(shí)施可使用本【技術(shù)領(lǐng)域】的分子生物學(xué)和重 組DNA技術(shù)的常規(guī)方法，為說明的目的其中許多在下文有描述。這類技術(shù)在文獻(xiàn)中 有充分的描述。參見，例如Sambrook，etal.，MolecularCloning:ALaboratory Manual(3rdEdition, 2000)；DNACloning:APracticalApproach,vol.I&II(D.Glover,ed.) ；01igonucleotideSynthesis(N.Gait,ed. , 1984) ；01igonucleotide Synthesis:MethodsandApplications(P.Herdewijn,ed. , 2004)；NucleicAcid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,eds. , 1985)；NucleicAcidHybridization:Modern Applications(BuzdinandLukyanov,eds. , 2009)；TranscriptionandTranslation(B.Hames&S.Higgins,eds., 1984)；AnimalCellCulture(R.Freshney,ed., 1986)；Freshney,R.I. (2005)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique, 5thEd.HobokenNJ,Johnffiley&Sons；B.Perbal,APracticalGuidetoMolecular Cloning(3rdEdition2010) ；Farre11,R. ,RNAMethodologies:ALaboratory GuideforIsolationandCharacterization(3rdEdition2005).Poly(ethylene glycol),ChemistryandBiologicalApplications,ACS,Washington,1997 ；Veronese,F. ,andJ.M.Harris,Eds. ,PeptideandProteinPEGylation,AdvancedDrug DeliveryReviews, 54(4)453-609(2002) ；Zalipsky,S. ,etal. ,^Useoffunctionalized Poly(EthyleneGlycols)formodificationofpolypeptides"，PolyethyleneGlycol Chemistry:BiotechnicalandBiomedicalApplications。
[0052] 本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均通過引用方式整體并入本文。
[0053] 定義
[0054] 除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通 常所理解的相同的含義。盡管任何與本文描述的類似或等同的方法和材料均可用于實(shí)施或 測(cè)試本發(fā)明，本文描述了優(yōu)選的方法和材料。為本發(fā)明的目的，對(duì)以下術(shù)語定義如下。
[0055] 本文所用冠詞（"a/an"）是指一個(gè)或多于一個(gè)（即至少一個(gè)）該冠詞的語法上的 賓語。舉例來說，"成分"是指一種成分或多于一種成分。
[0056] "約"是指相對(duì)于參考數(shù)量、水平、數(shù)值、數(shù)目、頻率、百分比、容積、尺寸、量、重量或 長(zhǎng)度，變化達(dá)30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的數(shù) 量、水平、數(shù)值、數(shù)目、頻率、百分比、容積、尺寸、量、重量或長(zhǎng)度。
[0057] 如本文所用，術(shù)語"氨基酸"是指天然存在的和非天然存在的氨基酸以及氨基酸類 似物和模擬物。天然存在的氨基酸包括蛋白質(zhì)生物合成中所用的20種（L)-氨基酸和其他 氨基酸如4-羥脯氨酸、羥賴氨酸、鎖鏈素、異鎖鏈素、同型半胱氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸。非天 然存在的氨基酸包括，例如，（D)-氨基酸、正亮氨酸、正纈氨酸、對(duì)氟苯丙氨酸、乙硫氨基酪 酸等，其為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。氨基酸類似物包括天然和非天然存在的氨基酸的修飾形 式。這類修飾可包括，例如，氨基酸上的化學(xué)基團(tuán)和部分的取代或替換，或者通過氨基酸的 衍生化。氨基酸模擬物包括例如，表現(xiàn)出與參考氨基酸功能上類似的特性如電荷和電荷間 距（chargespacing)特性的有機(jī)結(jié)構(gòu)。例如，模擬精氨酸（Arg或R)的有機(jī)結(jié)構(gòu)具有的正 電荷部分（moiety)以類似的分子間距布置，，并具有與天然存在的Arg側(cè)鏈的e-氨基相同 的遷移率。模擬物還包括受約束的結(jié)構(gòu)，從而維持氨基酸或氨基酸功能基團(tuán)的最佳間隔和 電荷相互作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道或能夠確定什么結(jié)構(gòu)構(gòu)成了功能上等同的氨基酸類似 物和氨基酸模擬物。
[0058] 在整個(gè)本申請(qǐng)文件中，除非上下文另有要求，詞語"包含/包括（comprise/comprises/comprising) "應(yīng)理解為是指包括所陳述的步驟或成分或者步驟或成分的組，但 不排除任何其他步驟或成分或者步驟或成分的組。"由…組成（consistingof)"是指包括 且限于詞組"由…組成"后所列舉的內(nèi)容。因此，詞組"由…組成"表示所列舉的成分為必 需的或必要的，且不可以存在其他成分。"基本上由…組成（consistingessentiallyof)" 是指包括該詞組后所列舉的任何成分，并限于不干擾或促進(jìn)本公開中明確的所列舉成分的 活性或作用的其他成分。因此，詞組"基本上由…組成"表示所列舉的成分為必需的或必要 的，但其他成分是任選的，且根據(jù)其是否實(shí)質(zhì)上影響所列舉成分的活性或作用而可以存在 或不可以存在。
[0059] 術(shù)語"綴合物"是指由于將分子例如生物活性分子共價(jià)連接至免疫球蛋白Fc區(qū)而 形成的實(shí)體。綴合多肽的一個(gè)實(shí)例為"融合蛋白"或"融合多肽"，即通過將最初編碼單獨(dú)的 多肽的兩個(gè)或更多個(gè)編碼序列連接起來而形成的多肽；連接的編碼序列翻譯后產(chǎn)生單一的 融合多肽，其通常具有源自各單獨(dú)的多肽的功能特性。
[0060] 詞語"無內(nèi)毒素"或"基本上無內(nèi)毒素"通常是指組合物、溶劑和/或容器，其包含 至多微量（例如對(duì)于對(duì)象沒有臨床不良生理作用的量）的內(nèi)毒素，優(yōu)選為無法檢測(cè)到的內(nèi) 毒素量。內(nèi)毒素是與某些細(xì)菌，通常為革蘭氏陰性菌有關(guān)的毒素，盡管內(nèi)毒素可發(fā)現(xiàn)于革蘭 氏陽性菌，如單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes)。最普遍的內(nèi)毒素是發(fā)現(xiàn) 于多種革蘭氏陰性菌外膜中的脂多糖（LPS)或脂寡糖（L0S)，其代表這些細(xì)菌導(dǎo)致疾病的 重要致病特性。人體中少量的內(nèi)毒素可引起發(fā)燒、血壓降低以及炎癥和凝聚等的激活及其 他不良生理作用。
[0061] 因此，在藥物生產(chǎn)中，通常最好是從藥物產(chǎn)品和/或藥物容器中去除大多數(shù)的或 所有微量的內(nèi)毒素，因?yàn)榧词股倭恳部稍谌梭w中引起不良作用。除熱原烘箱可用于該目的， 因?yàn)橥ǔＰ枰^300°C的溫度來破壞大多數(shù)的內(nèi)毒素。例如，基于初級(jí)包裝材料如注射器 或小瓶，結(jié)合250°C的玻璃溫度和30min的保持時(shí)間通常足以獲得3個(gè)對(duì)數(shù)的內(nèi)毒素水平減 少。本文包括其他去除內(nèi)毒素的方法，包括例如,如本文所述和本領(lǐng)域已知的色譜法和過濾 法。還包括在真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生DRS多肽并從其中分離出DRS多肽的方法， 以降低（如果沒有消除）本發(fā)明的組合物中存在內(nèi)毒素的風(fēng)險(xiǎn)。優(yōu)選在無血清的細(xì)胞中產(chǎn) 生DRS多肽并從其中分離出DRS多肽的方法。
[0062] 可采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)檢測(cè)內(nèi)毒素。例如，鱟變形細(xì)胞裂解物檢測(cè)法（其 利用馬蹄蟹（鱟）的血）是檢測(cè)內(nèi)毒素存在的非常靈敏的檢測(cè)方法。在該檢測(cè)中，由于有 力的酶促級(jí)聯(lián)放大了該反應(yīng)，很低水平的LPS可導(dǎo)致鱟裂解物的可檢測(cè)凝聚。也可通過酶 聯(lián)免疫法（ELISA)來定量?jī)?nèi)毒素?；旧蠠o內(nèi)毒素為，內(nèi)毒素水平可小于約0.00U0. 005、 0? 01、0. 02、0. 03、0. 04、0. 05、0. 06、0. 08、0. 09、0. 1、0. 5、1. 0、1. 5、2、2. 5、3、4、5、6、7、8、9 或 10EU/ml。通常，lng脂多糖（LPS)對(duì)應(yīng)于約1-10EU。
[0063] 如本文所用，術(shù)語"功能"和"功能的（functional) "等是指生物學(xué)、酶學(xué)或治療上 的功能。
[0064] "同源性"是指相同的或構(gòu)成保守替換的氨基酸百分?jǐn)?shù)。可使用序列比較程序如GAP(Deverauxetal.，NucleicAcidsResearch. 12, 387-395, 1984)測(cè)定同源性，其通過引 用并入本文。以這種方式，與本文所列舉的序列長(zhǎng)度類似或完全不同的序列，可通過將空位 插入至該比對(duì)中來進(jìn)行比較，例如通過使用GAP的比較算法來確定這類空位。
[0065] "生理上穩(wěn)定的"連接子是指在水中或在生理?xiàng)l件下（例如在體內(nèi)、體外培養(yǎng)條件 下，例如在一種或多種蛋白酶存在下）基本上穩(wěn)定的連接子，也就是說，在生理?xiàng)l件下其在 較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)不會(huì)經(jīng)歷任何可評(píng)估程度的降解反應(yīng)（例如，可酶促降解的反應(yīng)）。通常，生理 上穩(wěn)定的連接子其在生理?xiàng)l件下表現(xiàn)的降解率小于每天約〇. 5 %、約1 %、約2 %、約3 %、約 4%或約5%。
[0066] "分離的"是指基本上或?qū)嵸|(zhì)上與天然狀態(tài)下通常伴隨其的組分分開的材料。如本 文所用，例如，"分離的肽"或"分離的多肽"等，包括從其天然的細(xì)胞環(huán)境中，以及從結(jié)合的 其他細(xì)胞組分中，體外分離和/或純化肽或多肽分子；即其不再結(jié)合有大量體內(nèi)物質(zhì)。
[0067] 術(shù)語"半最大有效濃度"或"EC5Q"是指本文描述的DRS-Fc綴合物的濃度，在該濃 度下在一些特定的暴露時(shí)間后其誘導(dǎo)基線和最大值間的一半反應(yīng)；因此，分級(jí)劑量反應(yīng)曲 線的EC5(I表示觀察到其最大效果的50 %時(shí)的化合物濃度。在某些實(shí)施方案中，本文提供的 試劑的EC5(I相對(duì)于上文所述的"非經(jīng)典的"活性表示。EC5(I還表示獲得50%的體內(nèi)最大效 果所需的血漿濃度。同樣地，"EC9/表示觀察到其最大效果的90%時(shí)的試劑或組合物濃度。 "EC9(I"可從"EC5(I"和Hill斜率計(jì)算，或者使用本領(lǐng)域常規(guī)知識(shí)從數(shù)據(jù)直接確定。在一些實(shí) 施方案中，DRS-Fc綴合物的EC5Q 小于約 0? 01、0. 05、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、 0?9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、 90或100nM。優(yōu)選地，生物治療性組合物具有的EC5(I值為約InM或更小。
[0068]DRS-Fc綴合物的"半衰期"可指相對(duì)于給予至生物體的血清或組織中時(shí)的該活性， 或者相對(duì)于任何其他限定的時(shí)間點(diǎn)，該綴合物失去其一半的藥理學(xué)、生理學(xué)或其他活性所 用的時(shí)間。"半衰期"也可指相對(duì)于給予至生物體的血清或組織中時(shí)的該量或濃度，或者相 對(duì)于任何其他限定的時(shí)間點(diǎn)，DRS-Fc綴合物的量或濃度減少為最初給予至生物體的血清或 組織中的量的一半所用的時(shí)間。半衰期可在血清和/或任何一種或多種選定的組織中測(cè) 量。
[0069] 本文所用術(shù)語"連接（linkage) "、"連接子（linker) "、"連接部分（linker moiety) "或"L"是指可用于將DRS多肽與另一DRS多肽和/或與一個(gè)或多個(gè)Fc區(qū)隔開的 連接子。所述連接子可為生理上穩(wěn)定的或者可包括可釋放的連接子如可酶促降解的連接子 (例如可蛋白切割的連接子）。在某些方面，所述連接子可為肽連接子，例如作為DRS-Fc融 合蛋白的一部分。在一些方面，所述連接子可為非肽連接子。
[0070] 術(shù)語"調(diào)節(jié)"和"改變"包括通常為相對(duì)于對(duì)照的統(tǒng)計(jì)意義上或生理學(xué)意義上的量 或程度的"增加"、"促進(jìn)"或"刺激"，以及"減少"或"降低"，通常為相對(duì)于對(duì)照統(tǒng)計(jì)上顯著的 或生理上顯著的量或度。"增加"、"刺激"或"促進(jìn)"的量通常為"統(tǒng)計(jì)上顯著的"量，且可包 括增加為沒有組合物（例如，無任何本發(fā)明的DRS-FC綴合物）時(shí)或?qū)φ战M合物、樣品或測(cè) 試對(duì)象所產(chǎn)生的量的1. 1、1. 2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍（例如，500、1000 倍）（包括其間的且大于1的所有整數(shù)和小數(shù)部分，例如，1. 5、1. 6、1. 7、1. 8等）。"減少"或 "降低"的量通常為"統(tǒng)計(jì)上顯著的"量，且可包括沒有組合物（無試劑或化合物）時(shí)或?qū)φ?組合物產(chǎn)生的量的 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、 15 %U6 %U7 %U8 %U9 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %, 70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包括其間的所有整數(shù)）的減少。作為一個(gè)非限 制性實(shí)例，比較經(jīng)典和非經(jīng)典活性中的對(duì)照可包括相比相應(yīng)的（按序列）未改性的、或不同 地改性的DRS多肽的目標(biāo)DRS-Fc綴合物。本文描述了比較和"統(tǒng)計(jì)上顯著的"量的其他實(shí) 例。
[0071] 如本文所用，"非經(jīng)典的"活性通常指：i)本發(fā)明的DRS多肽具有的新活性，其為完 整的天然全長(zhǎng)親本蛋白在任何明顯的程度上所不具有的，或者ii)完整的天然全長(zhǎng)親本蛋 白所具有的活性，其中相比完整的天然全長(zhǎng)親本蛋白，針對(duì)非經(jīng)典的活性，所述DRS多肽表 現(xiàn)出明顯更高（即至少大20% )的特定活性，或者在新環(huán)境中表現(xiàn)出該活性；例如，通過將 該活性與完整的天然全長(zhǎng)親本蛋白具有的其他活性分開。在DRS多肽的情況下，非經(jīng)典的 活性的非限制性實(shí)例包括胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括調(diào)節(jié)TLR、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、調(diào)節(jié) 細(xì)胞分化（例如，血細(xì)胞生成、神經(jīng)細(xì)胞生成、肌細(xì)胞生成、骨細(xì)胞生成和脂肪細(xì)胞生成）、 調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡或其他形式的細(xì)胞死亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞攝取或 分泌、調(diào)節(jié)血管生成、調(diào)節(jié)細(xì)胞結(jié)合、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生或活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞因 子受體活性、調(diào)節(jié)炎癥和免疫原性等。
[0072] 在某些實(shí)施方案中，組合物中任何給定試劑（例如，DRS-Fc綴合物如融合蛋白）的 "純度"可具體限定。例如，某些組合物包含的試劑的純度可為至少80%、85%、90%、91 %、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，包括其間的所有小數(shù)，如通過例如 但不限于高壓液相色譜（HPLC)(其為生物化學(xué)和分析化學(xué)中經(jīng)常使用的用于分離、鑒定和 定量化合物的柱層析的一種熟知的形式）所測(cè)定的。
[0073] 不希望受限于任何具體理論，"可酶促降解的連接子"是指可被一種或多種酶如肽 酶或蛋白酶降解的連接子，例如氨基酸序列。
[0074] 術(shù)語"多肽"和"蛋白"在本文中可互換使用，指氨基酸殘基聚合物及其變體和合 成的類似物。因此，這些術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為合成的非天然存在的氨 基酸的氨基酸聚合物如相應(yīng)的天然存在的氨基酸的化學(xué)類似物，以及天然存在的氨基酸聚 合物。
[0075]"可釋放的連接子"包括但不限于，生理上可切割的連接子和可酶促降解的連接 子。因此，"可釋放的連接子"是在生理?xiàng)l件下可進(jìn)行自發(fā)水解或通過一些其他機(jī)制切割（例 如，酶催化的切割、酸催化的切割、堿催化的切割等）的連接子。例如，"可釋放的連接子"可 包括具有堿性移去質(zhì)子（例如，可電離的氫原子，Ha)作為驅(qū)動(dòng)力的消除反應(yīng)。為本文的目 的，"可釋放的連接子"與"可降解的連接子"同義。在具體的實(shí)施方案中，可釋放的連接子 于pH7. 4、25°C，例如生理pH、人體溫度（例如在體內(nèi)）的半衰期為約30min、約lh、約2h、 約3h、約4h、約5h、約6h、約12h、約18h、約24h、約36h、約48h、約72h、或約96h或更多。
[0076]"統(tǒng)計(jì)上顯著的"是指該結(jié)果不可能隨機(jī)出現(xiàn)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域任何已知的方法確定 統(tǒng)計(jì)顯著性。通常使用的顯著性測(cè)量包括P-值，如果零假設(shè)為正確的，其為觀察的事件會(huì) 發(fā)生的頻率或可能性。如果獲得的P-值小于該顯著性水平，那么該零假設(shè)被拒絕。在簡(jiǎn)單 的情況下，該顯著性水平限定在P-值為〇. 05或更小。
[0077] 術(shù)語"溶解度"是指本文提供的DRS-Fc綴合多肽溶解于液體溶劑中形成均勻溶液 的特性。溶解度通常表示為濃度，通過每單位體積的溶劑中的溶質(zhì)質(zhì)量（g溶質(zhì)/kg溶劑、g/dL(100mL)、mg/ml等）、摩爾濃度、質(zhì)量摩爾濃度、摩爾分?jǐn)?shù)或濃度的其他類似描述。每量的 溶劑能夠溶解的溶質(zhì)的最大平衡量，是特定條件（包括溫度、壓力、pH和溶劑的特性）下該 溶質(zhì)在該溶劑中的溶解度。在某些實(shí)施方案中，在生理pH或其他pH下測(cè)量溶解度，例如pH 5. 0、pH6.0、pH7.0或pH7. 4。在某些實(shí)施方案中，在水或生理緩沖液如PBS或NaCl(有 或沒有NaP)中測(cè)量溶解度。在特定的實(shí)施方案中，在相對(duì)較低的pH(例如，pH6.0)和相 對(duì)較高的鹽（例如，500mMNaCl和10mMNaP)下測(cè)量溶解度。在某些實(shí)施方案中，在生物 流體（溶劑）如血液或血清中測(cè)量溶解度。在某些實(shí)施方案中，所述溫度可為約室溫（例 如，約20、21、22、23、24、25°C)或約體溫（37°C)。在某些實(shí)施方案中，DRS-Fc綴合多肽在 室溫或 37°C具有的溶解度為至少約 0? 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1、2、3、4、5、 6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25 或 30mg/ml。
[0078] 如本文所用，"對(duì)象"包括任何表現(xiàn)有癥狀或有表現(xiàn)癥狀風(fēng)險(xiǎn)的動(dòng)物，該癥狀可用 本發(fā)明的DRS-Fc綴合多肽治療或診斷。合適的對(duì)象（患者）包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（如小鼠、大鼠、 兔或豚鼠）、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物和家養(yǎng)動(dòng)物或?qū)櫸铮ㄈ缲埢蚬罚?。包括非人的靈長(zhǎng)類，以及優(yōu)選地，人 患者。
[0079]"基本上"或"實(shí)質(zhì)上"是指幾乎整個(gè)或全部地，例如，95 %、96 %、97 %、98 %、99 % 或更多的某給定量。
[0080] 如本文所用，術(shù)語"治療有效量"是指治療或改善病癥或減少傷害或損傷而不引起 明顯負(fù)面效果或不利副作用所需的試劑如DRS-Fc綴合多肽或其衍生物的水平或量。
[0081] 如本文所用，"治療（Treatment/treating) "包括對(duì)于疾病或病癥的癥狀或病理的 任何所需的效果，且可包括接受治療的疾病或病癥的一種或多種可測(cè)量標(biāo)記的甚至最小的 變化或改善。"治療（Treatment/treating)"不一定表示完全根除或治愈疾病或病癥或其 相關(guān)癥狀。接受該治療的對(duì)象是任何有需要的對(duì)象。臨床改善的示例性標(biāo)記對(duì)本領(lǐng)域技術(shù) 人員來說是顯而易見的。
[0082] 天冬氨酰-tRNA合成酶衍生的多肽
[0083] 本發(fā)明的實(shí)施方案涉及天冬氨酰-tRNA合成酶多肽（DRS或AspRS多肽）的應(yīng) 用，包括野生型序列、天然存在的序列和非天然存在的序列，還包括其變體和片段。天冬氨 酰-tRNA合成酶衍生的多肽的特定實(shí)例包括具有改變的半胱氨酸含量的那些。
[0084] 天冬氨酰-tRNA合成酶屬于I型tRNA合成酶家族，其在活性位點(diǎn)具有兩個(gè)高度保 守序列基序HIGH(SEQIDN0:152)和KMSKS(SEQIDN0:153)。I型tRNA合成酶普遍被認(rèn) 為在2-步驟反應(yīng)中負(fù)責(zé)氨基酸特異性結(jié)合至其同源tRNA:首先由ATP活化氨基酸（AA)以 形成AA-AMP，然后轉(zhuǎn)移至tRNA的受體末端。全長(zhǎng)天冬氨酰-tRNA合成酶通常存在為同源二 聚體；并且還形成多亞基復(fù)合體的部分，該復(fù)合體通常包括蛋白AMP1、AMP2、EEF1A1以及Arg、Asp、Glu、Gin、lie、Leu、Lys、Met和Pro的tRNA合成酶。
[0085] 最近已經(jīng)證明，真核生物天冬氨酰-tRNA合成酶的某些生物片段或者替代性地剪 接的同種型，或在某些情況下完整的合成酶，能夠從該多亞基復(fù)合體分離，并激活某些細(xì)胞 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，或在細(xì)胞核中起作用以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。這些不同于蛋白合成中tRNA合成酶的經(jīng) 典作用的活性，在本文總稱為"非經(jīng)典的活性"。這些DRS多肽可通過替代性剪切或蛋白水 解而天然產(chǎn)生，且能夠以細(xì)胞自發(fā)性（即在宿主細(xì)胞內(nèi)）或者非細(xì)胞自發(fā)性方式（即在宿 主細(xì)胞外）發(fā)揮作用，以調(diào)節(jié)各種自我平衡機(jī)制。例如，如本發(fā)明所提供的，天冬氨酰-tRNA合成酶的N-末端片段DRS(1-154)能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)某些TLR的活性。而且，相對(duì)于全長(zhǎng)DRS多肽序列的某些突變和缺失賦予了增加的TLR結(jié)合或其他非經(jīng)典的活性。各種示例性DRS多肽的序列提供于表D1-D5和D7中。
[0086]

【權(quán)利要求】
1. 天冬氨酰-tRNA合成酶（DRS)融合多肽，其包含與SEQID勵(lì):1、3-24、29、31或 154-197中任一序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，和融合至所述DRS多肽的C-末 端、N-末端或兩端的至少一個(gè)Fc區(qū)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的DRS融合多肽，其包含與SEQID勵(lì)：1、3-24、29、31或 154-197中任一序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的DRS融合多肽，其包含SEQIDNO: 1或3-24中任一序列的氨 基酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的DRS融合多肽，其中所述DRS多肽為約130-300個(gè)氨基酸的 長(zhǎng)度，且包含SEQIDN0:1 的氨基酸殘基 1-154、11-146、13-146、23-154、1-171或1-174、 1-182、1-184、1-224 或 1-274,或者與SEQIDN0:1 的殘基 1-154、23-154、1-171、或1-174、 1-182、1-184、1-224或1-274具有至少90%同一性的氨基酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的DRS融合多肽，其中所述DRS多肽為約130-200個(gè)氨基酸的長(zhǎng) 度，且包含SEQIDN0:1 的氨基酸殘基 1-154、11-146、13-146、23-154、1-171、1-174、1-182 或 1-184,或者與殘基 1-154、23-154、1-171、1-174、1-182 或 1-184 具有至少 90% 同一性的 氨基酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的DRS融合多肽，其中所述DRS多肽為約130-175個(gè)氨基酸的 長(zhǎng)度，且包含SEQIDNO: 1 的氨基酸殘基 1-154、11-146、13-146、23-154、1-171 或 1-174,或 者與SEQIDN0:1的殘基1-154、23-154、1-171或1-174具有至少90%同一性的氨基酸序 列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的DRS融合多肽，其中所述DRS多肽包含SEQIDNO: 1的氨基 酸殘基 1-154、11-146、13-146、23-154、1-171 或 1-174。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的DRS融合多肽，其中所述DRS多肽基本上由SEQIDNO: 1的 氨基酸殘基1-154組成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的DRS融合多肽，其中所述DRS多肽基本上由SEQIDNO: 1的 氨基酸殘基13-146組成。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其中所述DRS多肽包含至少一 個(gè)半胱氨酸殘基突變，所述半胱氨酸殘基選自Cys76、Cysl30、Cys203、Cys259、Cys334和Cys349〇
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其中所述Fc區(qū)和所述DRS多肽 被肽連接子隔開。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的DRS融合多肽，其中所述肽連接子為約1-200個(gè)氨基酸、 1-150個(gè)氨基酸、1-100個(gè)氨基酸、1-90個(gè)氨基酸、1-80個(gè)氨基酸、1-70個(gè)氨基酸、1-60個(gè)氨 基酸、1-50個(gè)氨基酸、1-40個(gè)氨基酸、1-30個(gè)氨基酸、1-20個(gè)氨基酸、1-10個(gè)氨基酸或1-5 個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的DRS融合多肽，其中所述肽連接子為約1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90 或 100 個(gè)氨基酸的長(zhǎng) 度。
14. 枏掘叔剎要龍n-n中仵一頂所沭的DRS融合名肽，中所沭肽連捽子某本卜由 Gly和/或Ser殘基組成。
15. 根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其中所述肽連接子為生理學(xué)上 穩(wěn)定的連接子。
16. 根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其中所述肽連接子為可釋放的 連接子，任選地為可酶切的連接子。
17. 根據(jù)權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其中所述肽連接子包含SEQID N0:80-139中任一序列。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其中所述Fc區(qū)融合至所述DRS多肽的C-末端。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其中所述Fc區(qū)融合至所述DRS多肽的N-末端。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其中所述Fc區(qū)包含一個(gè)或多個(gè) 來自哺乳動(dòng)物IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4 和 / 或IgM的鉸鏈、CH2、CH3 和 /或014結(jié)構(gòu)域。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其不包含免疫球蛋白的CHpQ、 八和VH區(qū)。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其中所述Fc區(qū)包含SEQID NO:38-64中任一序列或其變體、片段或組合。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，相對(duì)于相應(yīng)的DRS多肽，其具有 改變的藥代動(dòng)力學(xué)。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的DRS融合多肽，其中所述改變的藥代動(dòng)力學(xué)為增加的血清 半衰期、增加的生物利用度和/或降低的清除率。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，相對(duì)于相應(yīng)的DRS多肽，其具有 改變的免疫效應(yīng)子活性。
26. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的DRS融合多肽，其中所述免疫效應(yīng)子活性為下述一種或多 種：補(bǔ)體活化、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用（CDC)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC)或 抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用（ADCP)。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其中相對(duì)于野生型Fc區(qū)，所述Fc區(qū)包含F(xiàn)c區(qū)變體。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的DRS融合多肽，其中所述Fc區(qū)變體包含與SEQID NO: 38-64中任一序列具有至少90%同一性的序列或所述序列的組合。
29. 根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的DRS融合多肽，其中所述Fc區(qū)變體包含來自不同物 種、不同Ig類型或不同Ig亞類的一個(gè)或多個(gè)Fc區(qū)的雜合體。
30. 根據(jù)權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其中所述Fc區(qū)變體包含來自 不同物種、不同Ig類型和/或不同Ig亞類的Fc區(qū)的一個(gè)或多個(gè)鉸鏈、CH2、CH3和/或CH4結(jié)構(gòu)域的雜合體。
31. 根據(jù)權(quán)利要求27-30中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其中相對(duì)于相應(yīng)的野生型Fc區(qū)，所述Fc區(qū)變體為改性的糖型。
32. 根據(jù)權(quán)利要求27-31中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其中相對(duì)于相應(yīng)的野生型Fc 區(qū)，所述Fc區(qū)變體具有改變的藥代動(dòng)力學(xué)。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的DRS融合多肽，其中所述改變的藥代動(dòng)力學(xué)包括血清半衰 期、生物利用度和/或清除率。
34. 根據(jù)權(quán)利要求27-33中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其中相對(duì)于相應(yīng)的野生型Fc區(qū)，所述Fc區(qū)變體具有改變的效應(yīng)子活性。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的DRS融合多肽，其中所述效應(yīng)子活性為下述一種或多種：補(bǔ)體活化、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用（CDC)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC)或抗 體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用（ADCP)。
36. 根據(jù)權(quán)利要求27-35中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其中相對(duì)于相應(yīng)的野生型Fc區(qū)，所述Fc區(qū)變體具有針對(duì)一個(gè)或多個(gè)FcY受體的改變的結(jié)合。
37. 根據(jù)權(quán)利要求27-36中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其中相對(duì)于相應(yīng)的野生型Fc區(qū)，所述Fc區(qū)變體具有改變的溶解度。
38. 根據(jù)權(quán)利要求1-37中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，其在生理溶液中基本上為二聚 體形式。
39. 根據(jù)權(quán)利要求1-38中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，如通過UV圓二色譜分析所測(cè) 定，其具有與相應(yīng)的未改性DRS多肽基本上相同的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
40. 根據(jù)權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽，當(dāng)給予至哺乳動(dòng)物時(shí)，其具有的 血漿或血清藥代動(dòng)力學(xué)AUC譜為相應(yīng)的未改性DRS多肽的至少5倍。
41. 天冬氨酰-tRNA合成酶（DRS)-Fc融合多肽，其包含與SEQIDNO:36或37具有至 少80%同一性的氨基酸序列。
42. 給藥方案，當(dāng)采用的給藥間隔為3天或更長(zhǎng)時(shí)，其將對(duì)象血漿中DRS融合多肽的平 均穩(wěn)態(tài)濃度維持在約0. 3yg/ml至約3yg/ml，所述方案包括將治療劑量的權(quán)利要求1-41 中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽給予至患者。
43. 在有需要的對(duì)象中維持DRS多肽水平高于最低有效治療水平的方法，包括將治療 劑量的權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽給予至所述對(duì)象。
44. 治療對(duì)象中的炎癥反應(yīng)的方法，包括將治療劑量的權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽給予至有需要的對(duì)象。
45. 治療有需要的對(duì)象中的TLR相關(guān)疾病的方法，包括將治療劑量的權(quán)利要求1-41中 任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽給予至有需要的對(duì)象。
46. 調(diào)節(jié)對(duì)象中的TLR活性的方法，包括將治療劑量的權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽給予至有需要的對(duì)象。
47. 殺死癌癥細(xì)胞的方法，包括將包含權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽的 疫苗或免疫原性組合物給予至有需要的對(duì)象。
48. 治療患癌對(duì)象或防止對(duì)象中癌癥發(fā)展的方法，包括將包含權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng) 所述的DRS融合多肽的疫苗或免疫原性組合物給予至有需要的對(duì)象。
49. 克服對(duì)象中對(duì)抗原的耐受性的方法，包括將包含權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽的疫苗或免疫原性組合物給予至有需要的對(duì)象。
50. 藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)中所述的DRS融合多肽以及藥學(xué)上可接 受的載體或賦形劑。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的藥物組合物，其中所述組合物包含約lOnM至約lOOnM精氨 酸。
52. 分離的多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽的核苷 酸序列。
53. 載體，其包含權(quán)利要求52所述的分離的多核苷酸。
54. 宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求53所述的載體。
55. 制備權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)所述的DRS融合多肽的方法，包括 a) 培養(yǎng)宿主細(xì)胞以表達(dá)DRS融合多肽，其中所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求49所述的多核 苷酸，其可操作地連接至調(diào)控元件；以及 b) 從所述宿主細(xì)胞中分離所述DRS融合多肽。
【文檔編號(hào)】A61K38/16GK104220461SQ201280069923
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月29日
【發(fā)明者】紀(jì)英, 吳其芳, 賴安·A·亞當(dāng)斯, 杰弗里·D·沃特金斯, 約翰·D·門德萊恩 申請(qǐng)人:Atyr醫(yī)藥公司