多孔組織支架的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種形成多孔組織材料的方法。
【專利說(shuō)明】多孔組織支架
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及由生物相容性聚合物的溶液制造多孔材料、尤其是具有獨(dú)特孔隙幾何形狀的多孔組織支架的方法，并且涉及由這些支架制造的生物相容性物品。
【背景技術(shù)】 [0002]生物材料經(jīng)設(shè)計(jì)以取代受傷或患病的組織。理想地，它們是具有類似于它們所取代的健康組織的性質(zhì)的性質(zhì)的用于組織再生的支架。經(jīng)設(shè)計(jì)以覆蓋二維表面或填充三維空隙，它們應(yīng)與愈合并行地逐漸被吸收，以便最終損傷部位變得與周圍組織幾乎不可辨別。為了實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)，生物材料必須滿足若干設(shè)計(jì)要求:它必須具有足夠大的孔隙率，其表面化學(xué)和形態(tài)必須適合于細(xì)胞粘著、增殖和分化；它需要具有適當(dāng)架構(gòu)以引導(dǎo)組織再生；并且它應(yīng)在不再需要支架時(shí)允許受控吸收。另外，盡管具有大幅弱化其機(jī)械性質(zhì)的高的總孔隙率，支架必須具有足夠的剛度、強(qiáng)度和韌度以在傷口愈合時(shí)履行自然組織的功能。目前可用的組織支架包含不同的不可吸收的生物相容性聚合物，例如:聚對(duì)苯二甲酸乙二酯；氟化聚合物，例如聚四氟乙烯(PTFE)和膨體PTFE的纖維；和聚氨基甲酸酯。一些可用的組織支架包含可吸收聚合物，例如聚乳酸、透明質(zhì)酸、膠原蛋白和明膠。然而，其孔隙幾何形狀范圍不是最優(yōu)的。
[0003]制備所述三維多孔聚合物支架的典型方法包括:溶劑澆鑄和顆粒浙濾技術(shù)，該技術(shù)包括將聚合物與單晶鹽顆?；旌?、將混合物干燥、并且然后將經(jīng)干燥的材料浸潰以使鹽顆粒浙濾(A.G.Mikos 等人，Polymer, 35，1068 (1994));氣體成型技術(shù)(gas-formingtechnique)，該技術(shù)包括用CO2氣體使聚合物膨脹(L.D.Harris等人,J.Biomed.Mater.Res., 42, 396(1998));熱誘導(dǎo)相分離技術(shù)，該技術(shù)包括將含有聚合物的溶劑浸潰于非溶劑中以使得所述聚合物多孔(C.Schugens 等人,J.Biomed.Mater.Res., 30, 449 (1996));和冷凍干燥方法，該方法包括將聚合物溶解于溶劑中以制備聚合物溶液、以及然后用液氮冷凍干燥所述聚合物溶液(K.Whang, Polymer, 36，837 (1995))。熱誘導(dǎo)相分離的特殊形式(也稱為定向冷凍澆鑄)已經(jīng)獲得了迄今最多被定義的多孔組織支架，并且廣泛描述于文獻(xiàn)(Wegst等人Phil.Trans.R.Soc.A2010, 368第2099-2122頁(yè))中。這種方法依賴于溶劑(例如水)于分散液中的受控固化，這導(dǎo)致溶劑與所分散的材料之間由于固體溶劑晶體的定向生長(zhǎng)而定向相分離。在移除溶劑(例如冷凍干燥)之后，剩下多孔材料。這種方法通過(guò)控制冷凍前沿(freeze front)行進(jìn)穿過(guò)所分散的材料的速度而允許對(duì)材料的幾何形狀進(jìn)行一定控制。包含動(dòng)物衍生的天然膠原蛋白和彈性蛋白的組織支架材料Remaix和OptiMaix使用美國(guó)專利US6，447，701中所述的冷凍澆鑄方法來(lái)制備。
[0004]然而，對(duì)于許多應(yīng)用來(lái)說(shuō)，優(yōu)選的是材料是高度均一的(例如材料密度、孔隙尺寸和孔隙定向(pore orientation)或機(jī)械性質(zhì)在材料各處應(yīng)具有有限變化)。當(dāng)前的生物相容性聚合物多孔組織支架缺乏足夠的均一性。另外，具有就細(xì)胞附著和生長(zhǎng)而言提高的特性的優(yōu)選的定制的生物相容性聚合物經(jīng)設(shè)計(jì)以可完全并且分子溶解于含水溶劑或溶劑混合物中。此外，通常理想的是這些生物相容性聚合物經(jīng)高度純化并且不含可溶的和不可溶的(微粒)雜質(zhì)。這種分子溶解的生物相容性聚合物的使用改進(jìn)了所得多孔支架的均質(zhì)性。本發(fā)明的目標(biāo)是提供這樣一種方法，通過(guò)所述方法可以制備包含生物相容性聚合物的高度均一的生物相容性聚合物組織支架；和用這些組織支架制備的物品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種從包含生物相容性聚合物的液體溶液制造多孔材料的方法，所述方法包括:
[0006]a.將所述生物相容性聚合物溶液引入到具有導(dǎo)熱表面的絕熱容器中；
[0007]b.通過(guò)將所述容器在冷卻裝置中冷卻到樣品熔點(diǎn)(Tm)至25°C范圍內(nèi)的溫度，任選地使所述生物相容性聚合物溶液的至少一部分膠凝；
[0008]c.通過(guò)以下方法經(jīng)由所述導(dǎo)熱表面以受控方式使所述生物相容性聚合物凝膠/溶液冷凍:
[0009]⑴使所述冷卻裝置的溫度在不超過(guò)5分鐘內(nèi)快速下降到約-10°C與約-50°C之間，以便在所述導(dǎo)熱表面上形成生物相容性聚合物凝膠/溶液的冷凍薄層；
[0010](ii)使所述冷卻裝置的溫度在不超過(guò)5分鐘內(nèi)快速上升到接近于但仍低于所述Tm的溫度；
[0011](ii i)使所述冷卻裝置的溫度逐漸降低，以便誘發(fā)從步驟C(i)中形成的所述冷凍層引發(fā)的冰晶在所述生物相容性聚合物凝膠/溶液中有恒定單向生長(zhǎng)率；和
[0012]d.冷凍干燥步驟c (iii)的產(chǎn)物。
[0013]優(yōu)選地，通過(guò)本發(fā)明的方法制造的多孔材料是多孔組織支架。
[0014]Tm(含水樣品熔點(diǎn))通常接近于0°C，但在添加一些有機(jī)溶劑或鹽時(shí)，它可能顯著偏離0°C。如果將有機(jī)溶劑和/或鹽添加到樣品中，導(dǎo)致Tm降低，那么樣品熔點(diǎn)可能在O與-10°C之間的范圍內(nèi)，但大部分時(shí)間Tm在O與_5°C之間的范圍內(nèi)。
[0015]通過(guò)這種方法制造的多孔組織材料具有均一多孔結(jié)構(gòu)，其中平均當(dāng)量圓直徑(ECD)取決于靶細(xì)胞類型和組織類型和位置而在約10到約1000微米之間的范圍內(nèi)，并且具有小的E⑶標(biāo)準(zhǔn)偏差(EOTsd)。通過(guò)本發(fā)明獲得的EOTsd的典型值在E⑶值的60到20%范圍內(nèi)。優(yōu)選的ECDsd值是40%或更小。還優(yōu)選的是通過(guò)這種方法制備的多孔材料的柱狀多孔結(jié)構(gòu)的平均ECD在約10到約1000微米之間的范圍內(nèi)，并且優(yōu)選在約100到500微米之間的范圍內(nèi)。
[0016]通過(guò)本發(fā)明的方法制造的多孔組織材料在其材料密度、孔隙尺寸和孔隙定向方面相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中所述的材料具有改進(jìn)的均一性。這使得它特別適用于多孔組織支架和生物相容性物品中。
[0017]一般定義
[0018]術(shù)語(yǔ)“包含/包括”應(yīng)解釋為明確指定所陳述的部分、步驟或組分的存在，但不排除一個(gè)或多個(gè)其它部分、步驟或組分的存在。
[0019]除非上下文明確規(guī)定存在一個(gè)并且僅存在一個(gè)要素，否則由不定冠詞“一個(gè)(a或an) ”對(duì)要素的提及不排除存在多于一個(gè)要素的可能性。不定冠詞“一個(gè)”因此通常意味著“至少一個(gè)”。
[0020]術(shù)語(yǔ)“多孔組織支架”與“多孔支架”可互換地使用，并且在本文中使用時(shí)應(yīng)解釋為起到組織細(xì)胞被吸引到其上并且可以附著于其上的微環(huán)境的作用的生物相容性聚合物的三維分子基體。
[0021]如本文中所用的生物相容性聚合物意味著任何人工或天然可生物降解的或不可生物降解的聚合物，例如但不限于:膠原蛋白、明膠、殼聚糖、角叉菜膠、海藻酸鹽、透明質(zhì)酸、葡聚糖、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚(酸酐)、聚原酸酯、聚(乙烯醇)、聚(乙二醇)、聚氨基甲酸酯、聚(丙烯酸)、聚(N-異丙基丙烯酰胺)、聚(氧化乙烯)_聚(氧化丙烯)_聚(氧化乙烯)共聚物(Pluronic (TM))、其共聚物或其混合物。
[0022]如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“均一”和“均一性”應(yīng)解釋為例如但不限于以下的參數(shù)的有限變化:孔隙尺寸、(橢圓形)圓形直徑、孔隙形狀、個(gè)別定向孔隙之間的觀測(cè)角的范圍、孔隙的平直度和機(jī)械性質(zhì)(例如但不限于剛度、脆度、可壓縮性)。
[0023]如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“柱狀孔隙”應(yīng)解釋為孔隙內(nèi)腔近似于圓柱或橢圓柱的孔隙幾何形狀，其中圓柱定義為這樣一個(gè)主體，其表面通過(guò)距既定線段(該圓柱的軸)固定距離的點(diǎn)形成。由該表面和兩個(gè)垂直于所述軸的平面封閉的實(shí)體也稱為圓柱。橢圓柱是其準(zhǔn)線是橢圓的圓柱。如 本文中所用的垂直于縱向柱狀孔隙方向的橫截面可以具有圓度是0.5或更大的不規(guī)則形狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，圓度誤差是40或更小。
[0024]術(shù)語(yǔ)圓度(R)提供了孔隙圓形性的量度。正圓形的圓度是I。根據(jù)下式由孔隙面積⑷和最大直徑(dmax)計(jì)算R:
[0025]R = ,4Α η
[0026]術(shù)語(yǔ)當(dāng)量圓直徑(ECD)定義為不規(guī)則形狀的孔隙的面積Α，其可以用ECD表示?？紫兜腅CD與實(shí)際直徑之間的對(duì)應(yīng)性隨孔隙圓度增加而明顯改善。ECD由下式給出::4Α
[0027]KD= ( a

2
[0028]平均E⑶通過(guò)計(jì)算給定的固定表面區(qū)域中每個(gè)個(gè)別孔隙的孔隙像素并且通過(guò)簡(jiǎn)單數(shù)學(xué)變換得到每個(gè)個(gè)別孔隙E⑶來(lái)測(cè)定。然后，測(cè)定平均E⑶和E⑶SD。這些參數(shù)在垂直于縱向孔隙方向截取的截面圖像中測(cè)定。
[0029]關(guān)于描述生物相容性支架材料中孔隙的形狀、形式和分布的這些和其它參數(shù)的其它細(xì)節(jié)，參看用于解讀聚合組織支架的圖像的美國(guó)試驗(yàn)與材料協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)指南(ASTMStandard Guide for Interpreting Images of polymeric Tissue Scaffolds),名稱:F2603-06。“EOT”的定義也可以見(jiàn)于這一標(biāo)準(zhǔn)中。
[0030]如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“圓柱孔隙直徑”應(yīng)解釋為通過(guò)計(jì)算給定的固定表面區(qū)域中每個(gè)個(gè)別孔隙的孔隙像素并且通過(guò)簡(jiǎn)單數(shù)學(xué)變換得到每個(gè)個(gè)別孔隙ECD來(lái)測(cè)定的平均孔隙E⑶。然后，測(cè)定平均E⑶和E⑶SD。這些參數(shù)在垂直于縱向孔隙方向截取的截面圖像中測(cè)定。
[0031]如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“體外培養(yǎng)系統(tǒng)”應(yīng)解釋為任何用于細(xì)胞、組織、器官或器官部分離體生長(zhǎng)的試劑盒、設(shè)備或化合物。
[0032]如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“生物相容性物品”應(yīng)解釋為任何用于治療醫(yī)療病況或用于美容矯正的物質(zhì)，其中所述物質(zhì)被放在人類或動(dòng)物的身體之上或之中并且不會(huì)引起不良免疫反應(yīng)。這包括隨時(shí)間可以降解并且可以由身體吸收的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以呈任何形式，例如但不限于:繃帶、粉末、海綿、止血?jiǎng)┖涂p線、任何種類的移植物、可注射顆粒、微球、微載體、凝膠或膠泥(putty)。
[0033]如本文中所用，“多能的”、“多能性”、“多能細(xì)胞”和等效表述是指能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖并且自我更新、并且分化為多種細(xì)胞群體(包括展現(xiàn)多能性質(zhì)的細(xì)胞群體)的細(xì)胞，舉例來(lái)說(shuō)，多能ES細(xì)胞可以產(chǎn)生三種胚胎細(xì)胞譜系中的每一種。然而，多能細(xì)胞不能產(chǎn)生胚胎外組織，例如胎盤的羊膜、絨毛膜和其它組分，并且可能不能夠制造完整生物體，即多能細(xì)胞不是“全能的”。多能性可以通過(guò)提供具有如下的穩(wěn)定發(fā)育潛能的證據(jù)來(lái)展現(xiàn):從單細(xì)胞的子代形成所有三種胚胎胚層的衍生物以及在注射到免疫抑制的小鼠中之后產(chǎn)生畸胎瘤。多能性的其它指示性證據(jù)包括已知表達(dá)于多能細(xì)胞中的基因的表達(dá)和特征性形態(tài)。本發(fā)明的多能細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法得到?！岸嗄芗?xì)胞”包括但不限于:干細(xì)胞；誘導(dǎo)多能細(xì)胞(iPS細(xì)胞)，例如誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)，例如人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)或人類胚胎干細(xì)胞(hESC);孤雌生殖(parthenogenic)細(xì)胞等。
[0034]如本文中所用，“全能的”是指細(xì)胞發(fā)育為所有類型的細(xì)胞(包括胚胎外組織(例如胎盤))并且產(chǎn)生完整生物體(例如小鼠或人類)的能力。
[0035]“自我更新”是指干細(xì)胞分裂并且形成更多性質(zhì)與母體干細(xì)胞相同的干細(xì)胞、從而使干細(xì)胞群體無(wú)限期地補(bǔ)充的能力。
[0036]如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“顆?！睉?yīng)解釋為具有至少20到50nm的“最小維度尺寸”的不規(guī)則或離散的任何形狀的固體物質(zhì)的任何顆粒，這包括微球、任何類型的粒子、任何類型的纖維或細(xì)絲(filament)。
[0037]如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“不含顆?！币庵溉芤夯旧喜缓叽绱笥?0nm的顆粒，并且優(yōu)選地它不含尺寸大于20nm的顆粒。任何顆粒的尺寸都可以通過(guò)電子顯微鏡檢查或激光光散射技術(shù)(動(dòng)態(tài)(PCS)或靜態(tài)(SLS))來(lái)測(cè)定。顆粒的存在可以借助于各種獨(dú)立方法來(lái)檢測(cè)，所述方法例如:元素映射(EDAX)樣品截面以觀測(cè)特定元素的局部增強(qiáng)密度；或(光學(xué)或電子)顯微鏡檢查樣品截面以檢測(cè)嵌入顆粒；或使用特定酶(例如針對(duì)膠原蛋白或明膠的胰蛋白酶)以使樣品聚合物網(wǎng)絡(luò)水解直到完成并且使用光散射技術(shù)以檢測(cè)顆粒。
[0038]術(shù)語(yǔ)“冷凍澆鑄”和“熱誘導(dǎo)相分離”可互換地使用，并且是指通過(guò)經(jīng)由以使得溶劑與所溶解的和所分散的材料分離的方式降低溶液、分散液或溶膠-凝膠的溫度來(lái)使溶劑在溶液、溶膠-凝膠或分散液內(nèi)凝固而產(chǎn)生多孔結(jié)構(gòu)的方法。通過(guò)用另一方法移除已凝固的溶劑，被溶解材料的多孔結(jié)構(gòu)保留下來(lái)。通過(guò)控制溫度變化在整個(gè)分散液、溶液或溶膠-凝膠中耗散的方式，可以調(diào)節(jié)孔隙的幾何形狀。當(dāng)溫度梯度在一個(gè)方向(也稱為冷凍前部行進(jìn)方向)上施用時(shí)，它稱為“單向冷凍澆鑄”。
[0039]如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“垂直的”應(yīng)解釋為與另一線或平面形成約80到110度的角的線或平面。
[0040]術(shù)語(yǔ)“蛋白”或“多肽”或“肽”可互換地使用，并且是指由氨基酸鏈組成的分子，與具體作用模式、尺寸、三維結(jié)構(gòu)或來(lái)源無(wú)關(guān)。
[0041]如本文中所用的“明膠”和“明膠樣”是指任何明膠，無(wú)論是通過(guò)傳統(tǒng)方法提取還是來(lái)源上是重組的或生物合成的；或指具有明膠的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)特征和/或功能特征的任何分子。所述術(shù)語(yǔ)包括在明膠產(chǎn)品中所包含的多于一種多肽的組合物，以及對(duì)明膠材料有貢獻(xiàn)的個(gè)別多肽。因此，如關(guān)于本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)明膠涵蓋包含明膠多肽的明膠材料，以及個(gè)別明膠多肽?？梢缘玫矫髂z的多肽是具有膠原蛋白的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)特征和/或功能特征的多肽，例如膠原蛋白、原膠原和其它多肽。這樣的多肽可以包括含有至少一個(gè)膠原蛋白域(Gly-Xaa-Yaa區(qū)，其中Xaa和Yaa獨(dú)立地是任何氨基酸)的膠原蛋白單鏈或者膠原蛋白同源三聚體或異源三聚體或者其任何片段、衍生物、低聚物、聚合物或亞單位。所述術(shù)語(yǔ)具體地涵蓋自然界中未發(fā)現(xiàn)的工程序列，例如改變的膠原蛋白序列，如通過(guò)缺失、添加、取代或其它變化而改變天然存在的膠原蛋白序列得到的序列。所述序列可以由例如合適改變的膠原蛋白多核苷酸構(gòu)建體獲得，如EP0926543、EP1014176、W001/34646、W004/085473、EP1894945, W008/10304U W008/103044, W008/103043 以及特別是 EP0926543 和 EP1014176的實(shí)施例中所述，所述文獻(xiàn)在此通過(guò)援引加入的方式納入本文。
[0042]如本文中所述的“交聯(lián)劑(cross-linking agent) ”是指包含交聯(lián)子(cross-linker)的組合物。如本文中所用的“交聯(lián)子”是指能夠在有機(jī)分子中引入共價(jià)的分子內(nèi)和分子間化學(xué)鍵的反應(yīng)性化學(xué)化合物。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0043]圖1展示了用于根據(jù)本發(fā)明從生物相容性聚合物制造多孔材料的溫度/時(shí)間分布。
[0044]圖2展示了當(dāng)需要較小柱狀孔隙時(shí)用于根據(jù)本發(fā)明從生物相容性聚合物制造多孔材料的溫度/時(shí)間。
[0045]圖3展示了一系列可以使用根據(jù)本發(fā)明的方法用無(wú)顆粒重組明膠溶液均一地制備的柱狀孔隙尺寸的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像。上排是在中心樣品部分中側(cè)向/垂直地切割的截面的圖像，并且下排從上到下橫向/水平地切割2-3mm。
[0046]圖4展示了整個(gè)比較實(shí)施例3的側(cè)向截面的光學(xué)顯微照片。樣品高度是12mm，并且樣品圓形直徑是4.5cm。
[0047]圖5展示了在上部樣品區(qū)域切割的比較實(shí)施例3的側(cè)向(垂直)截面的SEM圖像。
[0048]圖6展示了在底部樣品區(qū)域切割的比較實(shí)施例3的橫向(水平)截面的SEM圖像。
[0049]圖7展示了在頂部樣品區(qū)域切割的比較實(shí)施例3的橫向(水平)截面的SEM圖像。
[0050]圖8展示了本發(fā)明實(shí)施例1的側(cè)向截面的光學(xué)顯微照片。樣品高度是12_，樣品圓形直徑是4.5mm。
[0051 ] 圖9展示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1制備的樣品的全樣品高度的側(cè)向(垂直)截面的SEM圖像，其展示了底部的薄致密成核層和從這一層到樣品頂部的均一平行孔隙。
[0052]圖10展示了在緊挨著成核層上方的下部區(qū)域切割的本發(fā)明實(shí)施例1的橫向(水平)截面的SEM。
[0053]圖11展 示了在樣品頂部區(qū)域切割的本發(fā)明實(shí)施例1的橫向(水平)截面的SEM圖像。
[0054]圖12展示了接近于樣品頂部切割的比較實(shí)施例4的側(cè)向(垂直)截面的SEM圖像。
[0055]圖13展示了在接近于樣品頂部的區(qū)域切割的比較實(shí)施例4的橫向(水平)截面的SEM圖像。
[0056]圖14展示了整個(gè)比較實(shí)施例5的側(cè)向截面的光學(xué)顯微照片。樣品高度是12mm，并且樣品圓形直徑是4.5mm。
[0057]圖15展示了接近于樣品頂部切割的比較實(shí)施例5的側(cè)向(垂直)截面的SEM圖像。
[0058]圖16展示了在接近于緊挨著成核層上方的樣品底部區(qū)域切割的比較實(shí)施例5的橫向(水平)截面的SEM圖像。
[0059]圖17展示了接近于樣品頂部切割的比較實(shí)施例5的橫向(水平)截面的SEM圖像。
[0060]圖18展示了整個(gè)比較實(shí)施例6的側(cè)向截面的光學(xué)顯微照片。樣品高度是12mm，并且樣品圓形直徑是4.5mm。
[0061]圖19展示了接近于樣品頂部切割的比較實(shí)施例6的側(cè)向(垂直)截面的SEM圖像。
[0062]圖20展示了 在接近于緊挨著成核層上方的樣品底部區(qū)域切割的比較實(shí)施例6的橫向(水平)截面的SEM圖像。
[0063]圖21展示了接近于樣品頂部切割的比較實(shí)施例6的橫向(水平)截面的SEM圖像。
[0064]圖22展示了本發(fā)明實(shí)施例3的側(cè)向(垂直)截面的SEM圖像。
[0065]圖23展示了在接近于緊挨著成核層上方的樣品底部區(qū)域切割的本發(fā)明實(shí)施例3的橫向(水平)截面的SEM圖像。
[0066]圖24展示了接近于樣品頂部切割的本發(fā)明實(shí)施例3的橫向(水平)截面的SEM圖像。
[0067]圖25展示了本發(fā)明實(shí)施例4的側(cè)向(垂直)截面的SEM圖像。
[0068]圖26展示了在接近于緊挨著成核層上方的樣品底部區(qū)域切割的本發(fā)明實(shí)施例4的橫向(水平)截面的SEM圖像。
[0069]圖27展示了接近于樣品頂部切割的本發(fā)明實(shí)施例4的橫向(水平)截面的SEM圖像。
【具體實(shí)施方式】
[0070]令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在冷凍澆鑄程序期間使用新的三步驟方法，可制備在于整個(gè)多孔支架材料中具有一致柱狀孔隙尺寸方面比先前所述的多孔支架材料更均一的多孔組織支架。這一方法在于其至少一側(cè)上導(dǎo)熱的容器中進(jìn)行。所述方法實(shí)質(zhì)上提供了使用超低急冷溫度以快速冷卻和冷凍整個(gè)樣品的一小部分以在所述容器的一側(cè)的整個(gè)區(qū)域上產(chǎn)生薄冷凍樣品層。這一冷凍薄層隨后充當(dāng)用于該方法的后續(xù)步驟中柱狀冰晶的生長(zhǎng)的模板冰位點(diǎn)。這一薄致密冷凍層的存在更均一地并且更好地控制了柱狀冰晶的后續(xù)生長(zhǎng)，并且因此更好地控制了留在生物相容性聚合物材料中的孔隙腔體的尺寸、形式和數(shù)量密度。這一層的厚度可以通過(guò)最優(yōu)化冷凍容器設(shè)計(jì)的熱性質(zhì)和幾何形狀以及步驟c (i)和c(ii)中的冷卻和加熱速率來(lái)最小化。通常的厚度值是0.1到1.5_，還取決于生物相容性聚合物的類型和其濃度。冷凍/溫度控制可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適冷卻裝置實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，冷卻裝置是冷浴。
[0071]本發(fā)明現(xiàn)在將參考圖1和2進(jìn)行描述。
[0072]圖1和2展示了被引入到在冷浴(Ttl, t0)中的具有單個(gè)導(dǎo)熱表面的絕熱容器中的生物相容性聚合物溶液?？梢匀芜x地添加添加劑(例如乙醇、甲醇或乙酸或者其它無(wú)毒的或其它可易于移除的化合物)以改變最終冷凍干燥樣品的平均孔隙尺寸。
[0073]1.將生物相容性聚合物溶液冷卻，并且其至少一部分形成凝膠(I體積百分比或更多，其中凝膠通常占據(jù)最接近冷卻表面的體積)(T1, 。
[0074]然后使溫度快速下降。
[0075]i1.將冷浴在5分鐘內(nèi)冷卻到溫度(T2)，并且使生物相容性聚合物凝膠/溶液在容器的導(dǎo)熱側(cè)形成生物相容性聚合物溶液的冷凍薄層(T3，t3)。
[0076]ii1.然后將冷浴溫度在5分鐘(t4_t3)內(nèi)快速升高到溫度(T4)，其中T4比T2更接近于Tm但仍低于Tm。
[0077]iv.至少5分鐘的從T4到T5的緩慢并且逐漸斜變溫度下降的時(shí)間(t5_t4)，其中T5低于T4以誘發(fā)從已經(jīng)形成的生物相容性聚合物溶液冷凍層引發(fā)的冰晶在生物相容性聚合物溶液或凝膠中有柱狀生長(zhǎng)，所述冷凍層垂直于所述容器的導(dǎo)熱側(cè)。
[0078]用以獲得目標(biāo)孔隙結(jié)構(gòu)和平均E⑶的溫度參數(shù)WTy!^、!^和T5以及時(shí)間參數(shù) t2、t3、t4和t5需要針對(duì)生物相容性聚合物的每種類型和濃度并且針對(duì)任何添加劑的存 在而最優(yōu)化。此外，樣品聞度需要相對(duì)于T4和t4而最優(yōu)化參數(shù)T5和t5。越聞的樣品將需要越久的溫度從T4緩慢斜變到T5的持續(xù)時(shí)間以完成冷凍過(guò)程。
[0079]多孔材料中使用本發(fā)明的方法形成的柱狀孔隙與先前所述的材料相比具有優(yōu)越的均一性和對(duì)稱性。優(yōu)選地，將對(duì)應(yīng)于步驟c i中形成的冷凍薄層并且不具有柱狀孔隙的材料移除。這一致密底層典型地測(cè)量為0.1到2_厚，但必要時(shí)，可以通過(guò)最優(yōu)化冷浴溫度分布而減小到小于1mm。具體來(lái)說(shuō)，可優(yōu)化參數(shù)tfV T2、t3-t2、T3、T4和t4_t3。
[0080]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，溫度T2在約負(fù)10°C到約負(fù)50°C范圍內(nèi)。從T1到T2的冷浴溫度下降優(yōu)選地在3分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)，并且更優(yōu)選地在少于2分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)。這一溫度變化的溫度分布可以具有任何形狀或形式。這包括線性和非線性分布并且可以經(jīng)最優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)特定的均一孔隙尺寸。
[0081]在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，溫度T4是約負(fù)4°C，但總是高于溫度T3。從TjIjT4的冷浴溫度升高優(yōu)選地在2分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)，并且更優(yōu)選地在少于I分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)。這一溫度變化的溫度分布可以具有任何形狀或形式。這包括線性和非線性分布并且可以經(jīng)最優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)特定的均一平均孔隙尺寸。
[0082]溫度分布T4到T5可以具有任何形狀或形式。這包括線性和非線性分布并且可以經(jīng)最優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)特定的均一孔隙尺寸。
[0083]一般來(lái)說(shuō)，T4設(shè)定得越低并且溫度下降T4到T5的斜率越大，則孔隙尺寸越小。
[0084]絕熱容器可以具有任何形狀或形式，并且可以由任何合適材料制造。導(dǎo)熱表面可以由任何合適導(dǎo)熱材料(例如金屬，如銅和鋁)制造，并且所述導(dǎo)熱材料包括導(dǎo)熱陶瓷和聚合物。
[0085]優(yōu)選地，絕熱容器是PTFE或特氟隆類塑料，任選地與發(fā)泡材料(例如聚氨基甲酸酯或陶瓷泡沫)組合，并且導(dǎo)熱表面是金屬、特別是良好的熱導(dǎo)體(如鋁或銅)。[0086]優(yōu)選地，容器是圓柱形、橢圓柱形或圓角矩形，其側(cè)面并且任選地頂側(cè)是絕熱的。
[0087]在步驟d中，可以使用本領(lǐng)域中已知的任何合適冷凍干燥方法。
[0088]優(yōu)選地，在冷凍干燥之后，將對(duì)應(yīng)于步驟c (i)中形成的所述薄致密層并且不具有柱狀孔隙的材料移除。 [0089]優(yōu)選地，通過(guò)本發(fā)明的方法形成的多孔材料包含多孔材料，其包含基本上不含顆粒的生物相容性聚合物，其具有一種對(duì)稱的均一柱狀多孔結(jié)構(gòu)并且平均孔隙ECD在約10到1000微米之間。更優(yōu)選地，平均孔隙E⑶在約50 (優(yōu)選地100)到500微米之間。
[0090]優(yōu)選地，生物相容性聚合物溶液在使用之前經(jīng)脫氣。這可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)進(jìn)行。優(yōu)選地，生物相容性聚合物溶液通過(guò)將大氣壓力降低到低于50毫巴持續(xù)至少10分鐘而脫氣。
[0091]還優(yōu)選的是生物相容性聚合物溶液基本上不含顆粒。通過(guò)使用基本上不含顆粒的生物相容性聚合物分子溶液，可制備不僅在于整個(gè)多孔支架材料中具有一致柱狀孔隙尺寸方面比先前所述的多孔支架材料更均一、而且由于不含顆粒而在材料密度方面更均一的多孔組織支架。在現(xiàn)有技術(shù)中，使用材料的懸浮液或分散液來(lái)制備多孔支架(Kuberka等A 2002Int J Artif 0rgans20 (I): 67-73 ;Wegst 等人 Phil.Trans.R.Soc.A2010, 368 第2099-2122 頁(yè)；Meghri 等人 2010J0M62(7):71-75 ;和美國(guó)專利 6,447，701)。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這些材料中的顆粒不僅導(dǎo)致材料密度方面的變化，而且還導(dǎo)致柱狀孔隙的對(duì)稱性和孔隙尺寸方面的變化。認(rèn)為這第二種作用是顆粒充當(dāng)在冷凍澆鑄方法期間用于冰形成的成核位點(diǎn)的結(jié)果。在本發(fā)明中，不含這樣的顆粒降低了樣品凝膠/溶液的成核溫度。這由以下事實(shí)示出:生物相容性聚合物分子溶液中的冰形成在比含有顆粒的系統(tǒng)更低的溫度下發(fā)生。不含顆粒的生物相容性聚合物溶液中的典型成核溫度在-8與_30°C之間，而 Schoof 等人，2001，J Biomed Mater Res58 (4): 352-357 顯示，膠原蛋白懸浮液在(TC下就冷凍。由于這一較低溫度，因此生物相容性聚合物分子溶液中形成的冰晶的后續(xù)生長(zhǎng)比在含有顆粒的系統(tǒng)中更突然并且更不好控制。然而，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，這一問(wèn)題可以通過(guò)在冷凍澆鑄程序期間使用本發(fā)明的新的三步驟方法來(lái)規(guī)避。
[0092]還優(yōu)選的是生物相容性聚合物溶液在使用之前優(yōu)選地通過(guò)0.45微米過(guò)濾器并且更優(yōu)選地通過(guò)0.2微米過(guò)濾器而過(guò)濾法滅菌。
[0093]優(yōu)選在冷凍干燥(在步驟d中)之后，多孔材料被交聯(lián)。
[0094]優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用以制備多孔組織支架材料，并且在這種情況下，優(yōu)選使來(lái)自步驟d的冷凍干燥材料交聯(lián)。
[0095]交聯(lián)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何交聯(lián)劑和技術(shù)。
[0096]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多孔材料通過(guò)包括化學(xué)交聯(lián)的方法被交聯(lián)。合適的化學(xué)交聯(lián)劑包括:醛或二醛，例如甲醛和戊二醛；碳化二亞胺；二異氰酸酯；二酮，例如二乙?；c氯戍燒二酮(diacetyl and chloropentanedion);雙(2_氯乙基脲)、2_輕基-4，6- 二氯-1, 3，5-三嗪；US3, 288，775中公開(kāi)的反應(yīng)性含鹵素化合物；US4, 063，952和US5, 529，892中公開(kāi)的氨甲酰基吡啶鎗化合物，其中吡啶環(huán)帶有硫酸酯或烷基硫酸酯基；二乙烯砜等；和S-三嗪衍生物，例如2-羥基-4，6- 二氯-S-三嗪。它還包括光活化交聯(lián)技術(shù)。
[0097]優(yōu)選的化學(xué)交聯(lián)劑是1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和六亞甲基二異氰酸酯(HMDIC)。
[0098]在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，多孔材料通過(guò)包括脫氫加熱交聯(lián)(dehydrothermalcross-linking)的方法被交聯(lián)。
[0099]在一優(yōu)選實(shí)施方案中，優(yōu)選地，生物相容性聚合物是選自聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)和聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的合成可生物降解聚合物，或選自殼聚糖、膠原蛋白、明膠、其共聚物或其混合物的天然可生物降解聚合物。在一更優(yōu)選實(shí)施方案中，生物相容性聚合物溶液包含重組明膠樣蛋白。
[0100]重組明膠樣蛋白的使用與由動(dòng)物來(lái)源按照常規(guī)制造的明膠相比具有醫(yī)療益處。天然明膠存在安全性問(wèn)題，例如對(duì)潛在免疫原性(例如抗原性和變應(yīng)原性)反應(yīng)的憂慮。此外，不能完全表征、純化或令人滿意地復(fù)制天然衍生的明膠混合物在制藥界和醫(yī)療界中受到持續(xù)關(guān)注。還存在對(duì)于由提取和純化過(guò)程導(dǎo)致的細(xì)菌污染和內(nèi)毒素負(fù)荷的其它安全性憂 慮。
[0101]重組技術(shù)使得明膠樣蛋白設(shè)計(jì)具有優(yōu)越特征，例如低免疫原性、改進(jìn)的細(xì)胞附著和受控生物可降解性。EP0926543、EP1014176、WOO1/34646, W02004/085473、EP1894945、W02008/10304UW02008/103044,ff02008/103043 以及特別是 EP0926543 和 EP1014176 的實(shí)施例描述了重組明膠和其制造方法，其中使用甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母——特別是巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris);這些參考文獻(xiàn)中公開(kāi)的重組明膠樣蛋白通過(guò)援引加入的方式納入本文。
[0102]優(yōu)選的是用于本發(fā)明的方法中的生物相容性聚合物溶液包含含有至少一個(gè)RGD基序的重組明膠樣蛋白。更優(yōu)選地，生物相容性聚合物溶液包含進(jìn)一步富集RGD基序的重組明膠樣蛋白。在本發(fā)明的情況下的富集RGD的明膠描述于W02004/085473和W02008/103041中，并且其中公開(kāi)的富集RGD的明膠通過(guò)援引加入的方式納入本文。
[0103]優(yōu)選地，在重組明膠樣蛋白中，R⑶基序相對(duì)于氨基酸總數(shù)目的百分比是至少
0.4%，并且如果所述重組明膠樣蛋白包含350個(gè)或更多氨基酸，那么每個(gè)含350個(gè)氨基酸的區(qū)段含有至少一個(gè)RGD基序。
[0104]更優(yōu)選地，在重組明膠樣蛋白中，R⑶基序相對(duì)于氨基酸總數(shù)目的百分比是至少
0.6%、尤其至少0.8%、更尤其至少1.0 %、特別地至少1.2%并且更特別地至少1.5%。
[0105]在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，重組明膠樣蛋白具有降低的羥基脯氨酸殘基水平。脯氨酸的羥基化為膠原蛋白中三股螺旋的形成所需，其是通過(guò)本發(fā)明形成的多孔支架材料的一個(gè)不利特征，因?yàn)槠鋵?dǎo)致蛋白質(zhì)類材料的微粒聚集體和纖維或細(xì)絲。優(yōu)選地，在重組明膠樣蛋白中，重組明膠樣蛋白中少于10%、更優(yōu)選地少于5%的氨基酸殘基是羥基脯氨酸。尤其優(yōu)選的是，重組明膠樣蛋白不含羥基脯氨酸。不含羥基脯氨酸的重組明膠樣蛋白的在W02002/070000中描述的另一益處在于，與天然明膠不同，它們不展示涉及IgE的免疫反應(yīng)。
[0106]在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，明膠樣蛋白經(jīng)官能化以便增強(qiáng)細(xì)胞結(jié)合和/或具有最小免疫原性，例如EP1608681和EP1368056中公開(kāi)的那些明膠樣蛋白。官能化重組明膠樣蛋白可以經(jīng)設(shè)計(jì)以具有改進(jìn)的細(xì)胞結(jié)合性質(zhì)，其在植入之后刺激醫(yī)療裝置周圍的組織的細(xì)胞浸潤(rùn)。
[0107]在另一實(shí)施方案中，用于本發(fā)明中的重組明膠樣蛋白是計(jì)算等電點(diǎn)高于5、優(yōu)選地計(jì)算等電點(diǎn)高于6并且最優(yōu)選地計(jì)算等電點(diǎn)高于7的重組明膠樣蛋白。
[0108]在另一實(shí)施方案中，用于本發(fā)明中的重組明膠樣蛋白的分子量是至少20kDa、更優(yōu)選地25kDa、尤其至少35kDa并且更尤其至少50kDa。
[0109]優(yōu)選的是用于本發(fā)明中的重組明膠樣蛋白的分子量在20kDa到75kDa范圍內(nèi)。
[0110]在制備包含明膠樣蛋白的多孔材料期間，可以使用多于一種形式的明膠。
[0111]當(dāng)本發(fā)明的方法用于制備多孔組織支架材料時(shí)，優(yōu)選的是所用明膠應(yīng)是可生物降解的并且因此在刺激/組織再生之后不需要用于其移除的侵襲手術(shù)方法。此外，生物可降解性是組織再生中的另一重要刺激因子。重組明膠是否將通過(guò)導(dǎo)致天然明膠降解的相同機(jī)制而分解的先驗(yàn)并不明顯。已知，天然明膠和膠原蛋白在人體內(nèi)通過(guò)蛋白酶并且更特別地是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)降解。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是鋅依賴性內(nèi)肽酶。MMP屬于稱為甲硫氨酸鋅蛋白(metzincin)超家族的較大蛋白酶家族。總的來(lái)說(shuō)，它們能夠使所有種類的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解，但它們還可以處理多種生物活性分子。MMP的重要群組是膠原蛋白酶。這些MMP能夠?qū)⑷陕菪w維膠原蛋白降解為獨(dú)特的3/4和1/4片段。這些膠原蛋白是骨和軟骨的主要組分，并且MMP是唯一已知的能夠降解膠原蛋白的哺乳動(dòng)物酶。傳統(tǒng)上，膠原蛋白酶是=MMP-1 (間質(zhì)膠原蛋白酶)、MMP_8 (中性粒細(xì)胞膠原蛋白酶)、MMP_13 (膠原蛋白酶3)和MMP_ 18(膠原蛋白酶4)。MMP的另一重要群組由明膠酶形成。這些MMP的主要底物是IV型膠原蛋白和明膠，并且這些酶通過(guò)插入到催化域中的另一域的存在來(lái)區(qū)分。這一明膠結(jié)合區(qū)緊挨著鋅結(jié)合基序之前定位，并且形成不破壞催化域的結(jié)構(gòu)的單獨(dú)的折疊單位。這一子組的兩種成員是:MMP_2(72kDa明膠酶，明膠酶-A)和MMP-9 (92kDa明膠酶，明膠酶-B)。然而，國(guó)際專利申請(qǐng)W02008/103045公開(kāi)了，不包含MMP的已知裂解位點(diǎn)的重組明膠通過(guò)人類基質(zhì)金屬蛋白酶I (MMPl)可酶促降解。顯然遠(yuǎn)多于預(yù)期類型的重組明膠可以被降解。因此，包含重組明膠的多孔組織支架將展現(xiàn)對(duì)于在第一情況下提供細(xì)胞支架功能的組合物而言的所需的逐漸生物降解，其中隨著所述支架降解其逐漸被自體細(xì)胞外基質(zhì)代替。
[0112]本發(fā)明的優(yōu)選方面提供了一種制備多孔組織支架材料的方法，其包括一種包括以下步驟的方法:
[0113]a.使所述生物相容性聚合物溶解于溶劑或溶劑混合物中；
[0114]b.使所述生物相容性聚合物溶液脫氣；
[0115]c.將所述生物相容性聚合物溶液弓丨入到具有單個(gè)導(dǎo)熱表面的絕熱容器中，任選地添加添加劑；
[0116]d.通過(guò)將所述容器冷卻到樣品Tm至25°C范圍內(nèi)的溫度，任選地使所述生物相容性聚合物溶液的至少一部分膠凝；
[0117]e.通過(guò)將所述容器暴露于利用包括至少三個(gè)步驟的溫度分布的冷卻裝置，使所述樣品在控制冷凍速率的情況下單向冷凍:
[0118](i)使所述冷卻裝置的溫度在不超過(guò)5分鐘內(nèi)快速下降到約-10°C與約_50°C之間，以便在所述導(dǎo)熱表面上形成生物相容性聚合物凝膠/溶液的冷凍薄層；
[0119](ii)使所述冷卻裝置的溫度在不超過(guò)5分鐘內(nèi)快速上升到接近于但仍低于樣品Tm的溫度；
[0120](iii)使所述冷卻裝置的溫度逐漸降低，以便誘發(fā)從步驟e(i)中形成的所述冷凍層引發(fā)的冰晶在所述生物相容性聚合物凝膠/溶液中有層狀生長(zhǎng)；
[0121]f.在減壓下冷凍干燥步驟e中獲得的所述材料；
[0122]g.任選地移除對(duì)應(yīng)于步驟e(i)中形成的所述薄致密層并且不具有柱狀孔隙的材料；和
[0123]h.使步驟g中獲得的所述材料交聯(lián)。
[0124]優(yōu)選地，在步驟a中，所述溶液基本上不含顆粒。
[0125]使用根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠制備具有孔隙ECD標(biāo)準(zhǔn)偏差ECDsd狹窄的大范圍的柱狀孔隙的多孔組織支架材料。這通過(guò)使用從T4到T3的冷卻步驟的溫度分布(其控制了冷凍前沿通過(guò)生物相容性聚合物溶液的速度)來(lái)實(shí)現(xiàn)。一般來(lái)說(shuō)，平均柱狀孔隙直徑隨冷凍前沿行進(jìn)速率的增加而減小。這種調(diào)節(jié)平均柱狀孔隙直徑的能力是有利的，因?yàn)椴煌?xì)胞類型需要不同的關(guān)于幾何形狀和機(jī)械性質(zhì)方面的環(huán)境。
[0126]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法制備這樣的多孔組織支架材料，其具有均一柱狀多孔結(jié)構(gòu)，并且 平均柱狀孔隙ECD在約10到約1000微米范圍內(nèi)、優(yōu)選地在約50到約1000微米范圍內(nèi)并且更優(yōu)選地在約50到約500微米范圍內(nèi)并且尤其在約100到約500微米范圍內(nèi)。
[0127]本發(fā)明的第二方面提供了一種可通過(guò)如在本發(fā)明的第一方面所述并且優(yōu)選的方法獲得的多孔材料。
[0128]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的第二方面的材料是多孔組織支架。
[0129]本發(fā)明的第三方面提供了一種體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其包含根據(jù)本發(fā)明的第二方面的多孔組織支架。
[0130]本發(fā)明的第四方面提供了一種可植入生物相容性物品，其包含根據(jù)本發(fā)明的第二方面的多孔組織支架材料。
[0131]本發(fā)明的第五方面提供了一種可植入生物相容性物品，其包含根據(jù)本發(fā)明的第二方面的多孔組織支架材料，其用作骨填充材料或骨填料、優(yōu)選地牙骨填料。
[0132]本發(fā)明的第六方面提供了一種可植入生物相容性物品，其包含根據(jù)本發(fā)明的第二方面的多孔組織支架材料，其用作細(xì)胞——優(yōu)選地多能細(xì)胞——的微載體。
[0133]本發(fā)明將在以下非限制性實(shí)施例中更詳細(xì)地進(jìn)行解釋。
[0134]實(shí)施例
[0135]一般方法:
[0136]1.在使生物相容性聚合物溶解之后，將樣品溶液在減壓下(優(yōu)選地低于90毫巴持續(xù)至少5分鐘)脫氣。
[0137]2.然后將樣品通過(guò)滅菌(0.2微米)注射器過(guò)濾器來(lái)過(guò)濾，并且存放在圓柱形導(dǎo)熱的經(jīng)特氟隆涂布的薄壁鋁容器中，其側(cè)面用特氟隆襯套(bush)和特氟隆襯套與鋁制側(cè)面之間的絕緣聚合物泡沫絕熱。
[0138]3.任選地使樣品在降低的溫度Ttl至T1下、優(yōu)選地在樣品Tm與+25°C之間的溫度下膠凝。
[0139]4.然后通過(guò)以下方式使液體或膠凝的樣品溶液定向冷凍:
[0140](a)將樣品容器的導(dǎo)熱表面的溫度快速降低到低零下溫度T2 (-10至_50°C )以形成冷凍樣品薄層，并且[0141](b)當(dāng)冷凍樣品薄層覆蓋整個(gè)導(dǎo)熱表面時(shí)(T3，t3)，將導(dǎo)熱表面的溫度增加到所想要的樣品冷凍速率所需的零下溫度T4。
[0142](c)使導(dǎo)熱表面所經(jīng)歷的溫度逐漸降低，其中溫度下降速率由所想要的孔隙結(jié)構(gòu)和孔隙尺寸(T4，t4至T5，t5)規(guī)定。T-分布T4到T5不一定是線性的但可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員最優(yōu)化。
[0143]將冷凍樣品如本領(lǐng)域常見(jiàn)地在真空下干燥以制造干燥的多孔支架。然后使所述支架在不存在水的情況下通過(guò)許多常用的試劑(HMDIC、EDC、戊二醛等)之一或方法(在真空條件下加熱)交聯(lián)。
[0144]比較實(shí)施例1
[0145]這一實(shí)施例中所用的基礎(chǔ)膠原蛋白懸浮液由市售小牛皮膠原蛋白I型Sigma-Aldrich， 產(chǎn)品編號(hào)C3511制備。將一定量的所述懸浮液在燒瓶中稱重，并且添加水以制造2% (質(zhì)量百分比)分散液。然后添加HCl以將pH值調(diào)節(jié)到3.2。根據(jù)Sch00f，Apel等人2001，應(yīng)添加乙酸以制造定向孔隙結(jié)構(gòu)。因此，添加2.5重量％乙酸到樣品中。這一膠原蛋白制劑是由牛皮膚分離的原纖維的不可溶的I型膠原蛋白。根據(jù)Schoof，這一懸浮液是含有低濃度的分子、原纖維和纖維的多分散系統(tǒng)。膠原蛋白聚集體的長(zhǎng)度和寬度在大范圍內(nèi)變化。然后，將分散液離心以移除氣泡，并且將204克的量存放到冷凍容器中。使樣品在冰箱中冷卻到2°C后持續(xù)2小時(shí)，并且然后放在冷浴中_5°C下以允許完全冷凍。
[0146]益果
[0147]干燥之后的海綿結(jié)構(gòu)展示定向孔隙。然而，孔隙結(jié)構(gòu)均質(zhì)性不是很好。
[0148]比較實(shí)施例2
[0149]將經(jīng)純化的重組CBE3明膠(如EP0926543的實(shí)施例1或EP1014176的實(shí)施例I中所述制備，所述實(shí)施例通過(guò)援引加入的方式納入本文)用于樣品。乙醇(無(wú)水)來(lái)自J.T.Baker。將所用水超濾和去離子化至與藥物級(jí)注射用水(WFI)相同的規(guī)格。將溶液經(jīng)由通過(guò)Whatman PURADISC? 25AS (PES)注射器過(guò)濾器0.2 μ m使用IOml N0RM-JECT?魯爾注射器(luer syringe)而過(guò)濾。用于樣品冷凍和干燥的容器是0.1mm厚的聚苯乙烯IOcmX IOcmX 2cm (2cm =高度)杯。所用冷凍干燥器是Zirbus3x4x5升華器。將具有Thermo-Electra手持式探頭編號(hào)80106的AZ8852雙輸入型K/J/T溫度計(jì)用于溶液溫度測(cè)量。使用配備有Olympus數(shù)碼相機(jī)C-3040Z00M和DP-Soft V3.2軟件的Olympus SZX12顯微鏡進(jìn)行光學(xué)海綿檢查。使用內(nèi)部光源或F0STEC?DCR(DDL)外部光源進(jìn)行樣品照明。將Jeol JSM-6330F場(chǎng)致發(fā)射掃描電子顯微鏡用于產(chǎn)生SEM圖像。使用GEM不銹鋼剃刀片(未經(jīng)涂布)手動(dòng)進(jìn)行樣品切割。
[0150]樣品制各
[0151]將一定量的重組明膠CBE3稱重，并且轉(zhuǎn)移到300ml燒瓶中，并且隨后添加熱水(50-600C )以制造4% (質(zhì)量百分比)濃度。然后將CBE3溶液用磁力攪拌器在50°C下于熱浴中攪拌30分鐘以使明膠完全溶解。在使所述溶液冷卻到室溫的同時(shí)，使其在20到90毫巴的真空下脫氣15分鐘。注意，每當(dāng)觀測(cè)到或預(yù)期有過(guò)度沸騰時(shí)通過(guò)手動(dòng)控制真空而使得不發(fā)生這種現(xiàn)象。將樣品溶液(20.4g)使用注射器和0.2微米PES注射器過(guò)濾器添加到冷凍容器中。注意移除在填充期間或之后出現(xiàn)在樣品中的所有表面粘附氣泡。然后使CBE3溶液在冰箱中冷卻到2°C后持續(xù)2小時(shí)，并且然后放在冷浴中_5°C下。[0152]MS
[0153]樣品在至少24小時(shí)內(nèi)保持呈凝膠狀態(tài)并且不冷凍。在稍微擾動(dòng)樣品之后，樣品在擾動(dòng)位置立即開(kāi)始冷凍。這顯示，根據(jù)這種方法實(shí)現(xiàn)從底向上的定向冷凍是不可能的。
[0154]比較實(shí)施例3
[0155]將一定量的CBE3稱重，轉(zhuǎn)移到300ml燒瓶中，并且添加熱水(50-60°C)以制造4%(質(zhì)量百分比)濃度溶液。然后將溶液用磁力攪拌器在50°C下于熱浴中攪拌30分鐘以使明膠完全溶解。在將溶液冷卻到室溫的同時(shí)，使其在20到90毫巴的真空下脫氣15分鐘。注意，每當(dāng)觀測(cè)到或預(yù)期有過(guò)度沸騰時(shí)通過(guò)手動(dòng)控制真空而使得不發(fā)生這種現(xiàn)象。隨后將溶液使用注射器和0.2微米PES注射器過(guò)濾器以20.4克的等分試樣添加到冷凍容器中。注意移除在填充期間或之后出現(xiàn)在樣品中的所有表面粘附氣泡。對(duì)于所有樣品來(lái)說(shuō)，將PE箔用作覆蓋物以隔絕空氣中的粉塵并且防止水或乙醇從樣品頂部蒸發(fā)。
[0156]將樣品溶液通過(guò)將其放在冰箱中2°C下至少3小時(shí)而膠凝。然后使(預(yù)膠凝)樣品在恒溫循環(huán)浴(2到3mm深)中經(jīng)歷_10°C的冷凍條件45分鐘直到完全冷凍。然后將冷凍樣品在真空下干燥2天。通過(guò)脫氫加熱(DHT)處理進(jìn)行的交聯(lián)用切割成所要尺寸的樣品通過(guò)將其在真空烘箱中在160°C下在少于2毫巴的壓力下加熱2天來(lái)進(jìn)行。 [0157]
[0158]所得孔隙結(jié)構(gòu)呈柱狀(參看圖4和5)。然而，孔隙尺寸從底部(50微米)到頂部(100微米)存在大的非所希望的差異，也參看圖6和7。圓度大于0.5。頂部的平均孔隙ECD是155微米，ECDsd是46微米。
[0159]比較實(shí)施例4
[0160]將一定量的CBE3稱重，轉(zhuǎn)移到300ml燒瓶中，并且添加熱水(50_60°C)以制造4%(質(zhì)量百分比)溶液。然后將溶液用磁力攪拌器在50°C下于熱浴中攪拌30分鐘以使明膠完全溶解。在使溶液冷卻到室溫的同時(shí)，使其在20到90毫巴的真空下脫氣15分鐘。注意，每當(dāng)觀測(cè)到或預(yù)期有過(guò)度沸騰時(shí)通過(guò)手動(dòng)控制真空而使得不發(fā)生這種現(xiàn)象。隨后將溶液使用注射器和0.2微米PES注射器過(guò)濾器以20.4克的等分試樣添加到冷凍容器中。這時(shí)，經(jīng)由通過(guò)0.2微米PES注射器過(guò)濾器緩慢添加溶劑來(lái)添加0.2g的乙醇(無(wú)水)，并且將混合物通過(guò)使用吸液管產(chǎn)生液體流來(lái)攪拌。注意移除在填充期間或之后出現(xiàn)在樣品中的所有表面粘附氣泡。對(duì)于所有樣品來(lái)說(shuō)，將PE箔用作覆蓋物以隔絕空氣中的粉塵并且防止水或乙醇從樣品頂部蒸發(fā)。使樣品溶液在設(shè)定在2°C下的冰箱中膠凝至少3小時(shí)。然后使(預(yù)膠凝)樣品在恒溫循環(huán)浴(2到3mm深)中經(jīng)歷_10°C的冷凍條件45分鐘直到完全冷凍。然后將冷凍樣品在真空下干燥2天。通過(guò)脫氫加熱(DHT)處理進(jìn)行的交聯(lián)用切割成所要尺寸的樣品通過(guò)將其在真空烘箱中在160°C下在少于2毫巴的壓力下加熱2天來(lái)進(jìn)行。
[0161]
[0162]所得孔隙結(jié)構(gòu)在整個(gè)樣品體積內(nèi)相當(dāng)均質(zhì)，其柱狀孔隙具有狹窄尺寸分布以及約350微米的大的平均尺寸(參看圖13)。然而，由于恒定溫度冷浴，因此孔隙尺寸從底部到頂部存在輕微但仍然非所希望的差異(參看圖12)。
[0163]比較實(shí)施例5
[0164]將一定量的CBE3稱重，轉(zhuǎn)移到300ml燒瓶中，并且添加熱水(50_60°C)以制造8%(質(zhì)量百分比)溶液。然后將溶液用磁力攪拌器在50°C下于熱浴中攪拌30分鐘以使明膠完全溶解。在使溶液冷卻到室溫的同時(shí)，使其在20到90毫巴的真空下脫氣15分鐘。注意，每當(dāng)觀測(cè)到或預(yù)期有過(guò)度沸騰時(shí)通過(guò)手動(dòng)控制真空而使得不發(fā)生這種現(xiàn)象。隨后將溶液使用注射器和0.2微米PES注射器過(guò)濾器以20.4克的等分試樣添加到冷凍容器中。通過(guò)0.2微米PES注射器過(guò)濾器緩慢添加0.2g的乙醇(無(wú)水)，并且將混合物通過(guò)使用吸液管“噴射”來(lái)攪拌。注意移除在填充期間或之后出現(xiàn)在樣品中的所有表面粘附氣泡。對(duì)于所有樣品來(lái)說(shuō)，將PE箔用作覆蓋物以阻止空氣中的粉塵沉降以及水或乙醇從樣品頂部蒸發(fā)。
[0165]使樣品溶液在設(shè)定在2°C下的冰箱中膠凝45分鐘。然后使(預(yù)膠凝)樣品在冷浴(2到3mm深)中經(jīng)歷_10°C的冷凍條件45分鐘直到完全冷凍。然后將冷凍樣品在真空下干燥2天。通過(guò)脫氫加熱(DHT)處理進(jìn)行的交聯(lián)用切割成所要尺寸的樣品在真空烘箱中在160°C和少于2毫巴的壓力下進(jìn)行2天。
[0166]益果
[0167]所得孔隙結(jié)構(gòu)在整個(gè)樣品體積內(nèi)呈柱狀，其柱狀孔隙具有狹窄尺寸分布以及約350微米的大的平均尺寸(在上半部樣品中)。還看到從下部向上部樣品體積的柱狀孔隙變寬，參看圖16和17。相信，這是由于使用恒定冷浴溫度代替逐漸溫度斜變。因此，隨著冷凍前沿移動(dòng)遠(yuǎn)離冷卻容器，預(yù)期局部冷凍溫度越來(lái)越高，并且由于這個(gè)，孔隙變得更大。
[0168]比較實(shí)施例6
[0169]將一定量的CBE3稱重，轉(zhuǎn)移到300ml燒瓶中，并且添加熱水(50_60°C )以制造7.5% (質(zhì)量百分比)溶液。然后將溶液用磁力攪拌器在50°C下于熱浴中攪拌30分鐘以使明膠完全溶解。在使溶液冷卻到室溫的同時(shí)，使其在20到90毫巴的真空下脫氣15分鐘。注意，每當(dāng)觀測(cè)到或預(yù)期有過(guò)度沸騰時(shí)通過(guò)手動(dòng)控制真空而使得不發(fā)生這種現(xiàn)象。然后將溶液使用注射器和0.2微米PES注射器過(guò)濾器以20.4克的等分試樣添加到冷凍容器中。注意移除在填充期間或之后出現(xiàn)在樣品中的所有表面粘附氣泡。對(duì)于所有樣品來(lái)說(shuō)，將PE箔用作覆蓋物以隔絕空氣中的粉塵并且防止水或乙醇從樣品頂部蒸發(fā)。通過(guò)放在冰箱中2V下I天來(lái)使樣品溶液膠凝。然后將樣品放在設(shè)定在18°C下的冷浴中，并且啟動(dòng)泵A，在充分混合下將非常冷(_72±2°C )的液體(乙醇)以使得冷浴溫度以22°C /min速率下降直到冷浴溫度達(dá)到_52°C的速率泵送到冷浴中。在這一 T斜變期間，冰形成的第一次出現(xiàn)在-16°C的冷浴溫度下觀測(cè)到。在10分鐘內(nèi)，樣品體積完全冷凍。然后將冷凍樣品在真空下干燥4天。通過(guò)脫氫加熱(DHT)處理進(jìn)行的交聯(lián)通過(guò)將樣品切割成所要尺寸并且然后放在真空烘箱中在160°C和少于2毫巴的壓力下2天來(lái)進(jìn)行。
[0170]
[0171]所得孔隙結(jié)構(gòu)在整個(gè)樣品體積內(nèi)呈柱狀，其柱狀孔隙具有狹窄尺寸分布(參看圖18和19)并且約20微米的非常小的平均尺寸(在下部樣品區(qū)中)(參看圖20)。然而，孔隙尺寸從頂部到底部仍然存在非所希望的差異(比較圖20和21)。
[0172]本發(fā)明實(shí)施例1
[0173]將一定量的CBE3稱重，轉(zhuǎn)移到300ml燒瓶中，并且添加熱水(50_60°C )以制造7.5% (質(zhì)量百分比)溶液。然后將溶液用磁力攪拌器在50°C下于熱浴中攪拌30分鐘以使明膠完全溶解。在使溶液冷卻到室溫的同時(shí)，使其在20到90毫巴的真空下脫氣15分鐘。注意，每當(dāng)觀測(cè)到或預(yù)期有過(guò)度沸騰時(shí)通過(guò)手動(dòng)控制真空而使得不發(fā)生這種現(xiàn)象。隨后將溶液使用注射器和0.2微米PES注射器過(guò)濾器以20.4克的等分試樣添加到冷凍容器中。這時(shí)，經(jīng)由通過(guò)0.2微米PES注射器過(guò)濾器緩慢添加溶劑來(lái)添加0.2g的乙醇(無(wú)水)，并且將混合物通過(guò)使用吸液管“噴射”來(lái)攪拌。注意移除在填充期間或之后出現(xiàn)在樣品中的所有表面粘附氣泡。對(duì)于所有樣品來(lái)說(shuō)，將PE箔用作覆蓋物以隔絕空氣中的粉塵并且防止水或乙醇從樣品頂部蒸發(fā)。
[0174]使樣品溶液在冷浴中10°C下膠凝20分鐘。然后通過(guò)以下方式使冷浴快速冷卻:在充分混合下將非常冷(_72±2°C )的液體(乙醇)以使得冷浴溫度以28°C /min速率下降直到溫度達(dá)到-30°C的速率泵送到冷浴中。在這一 T斜變期間，冰形成的第一次出現(xiàn)在_25°C的冷浴溫度下觀測(cè)到。隨后，停止冷液體泵A，并且冷浴溫度在完全接觸樣品容器以開(kāi)始覆蓋有冷凍樣品層所需的時(shí)間內(nèi)保持相當(dāng)恒定。在完全覆蓋后立即以使得冷浴溫度以約100°C /分鐘速率增加到-4°C的速率啟動(dòng)溫(+40°C )的液體(乙醇)泵B。一旦冷浴溫度達(dá)到_4°C，就停止泵B，并且以使得冷浴溫度以0.10C /min速率降低直到完整樣品體積冷凍的非常慢的速率啟動(dòng)泵A。
[0175]然后將冷凍樣品在真空下干燥2天。脫氫加熱(DHT)交聯(lián)用切割成所要尺寸的樣品通過(guò)在真空烘箱中在160°C下在少于2毫巴的壓力下加熱2天來(lái)進(jìn)行。
[0176]
[0177]所得孔隙結(jié)構(gòu)在整個(gè)樣品體積內(nèi)非常均質(zhì)，其柱狀孔隙具有狹窄尺寸分布以及約350微米的大的平均尺寸。與比較實(shí)施例6(圖20和21)不同，下部樣品區(qū)中的孔隙結(jié)構(gòu)非常類似于上部樣品區(qū)中的結(jié)構(gòu)(圖10和11)。孔隙的圓度高于0.5，為優(yōu)選的。致密成核底層(參看圖 8和9)可以隨意進(jìn)行切割和舍棄。這一實(shí)施例的平均孔隙ECD是300微米，ECDsd是90微米。
[0178]本發(fā)明實(shí)施例2
[0179]將一定量的去離子骨-石灰明膠稱重，轉(zhuǎn)移到300ml燒瓶中，并且隨后添加熱水(50-60 0C )以制造7.5% (質(zhì)量百分比)溶液。將溶液用磁力攪拌器在50°C下于熱浴中攪拌30分鐘以使明膠完全溶解。在將溶液冷卻到室溫的同時(shí)，使其在20到90毫巴的真空下脫氣15分鐘。注意，每當(dāng)觀測(cè)到或預(yù)期有過(guò)度沸騰時(shí)通過(guò)手動(dòng)控制真空而使得不發(fā)生這種現(xiàn)象。隨后將溶液使用注射器和0.2微米PES注射器過(guò)濾器以20.4克的等分試樣添加到冷凍容器中。通過(guò)0.2微米PES注射器過(guò)濾器緩慢添加0.2g的乙醇(無(wú)水)，并且將混合物通過(guò)使用吸液管“噴射”來(lái)攪拌。注意移除在填充期間或之后出現(xiàn)在樣品中的所有表面粘附氣泡。對(duì)于所有樣品來(lái)說(shuō)，將PE箔用作覆蓋物以防止空氣中粉塵的污染以及水或乙醇從樣品頂部蒸發(fā)。使樣品溶液在冷浴中10°C下膠凝20分鐘。然后通過(guò)以下方式使冷浴快速冷卻:在充分混合下將非常冷(_72±2°C )的液體(乙醇)以使得冷浴溫度以28°C /分鐘速率下降直到冷浴溫度達(dá)到_30°C的速率泵送到冷浴中。在這一 T斜變期間，冰形成的第一次出現(xiàn)在_25°C的冷浴溫度下觀測(cè)到。隨后，停止冷液體泵A，并且冷浴溫度在完全接觸樣品容器以開(kāi)始覆蓋有冷凍樣品層所需的時(shí)間內(nèi)保持相當(dāng)恒定。在完全覆蓋后立即以使得冷浴溫度以約100°C /分鐘速率增加到-4°C的速率啟動(dòng)溫(+40°C )的液體(乙醇)泵B。一旦冷浴溫度達(dá)到所要的-4°C，就停止泵B，并且以使得冷浴溫度以0.rc /分鐘速率降低直到完整樣品體積冷凍的非常慢的速率啟動(dòng)泵A。
[0180]益果
[0181]所得孔隙結(jié)構(gòu)類似于本發(fā)明實(shí)施例1。它在整個(gè)樣品體積內(nèi)非常均質(zhì)，其柱狀孔隙具有狹窄尺寸分布以及約350微米的大的平均尺寸。下部樣品區(qū)中的孔隙結(jié)構(gòu)非常類似于上部樣品中的結(jié)構(gòu)?？紫兜膱A度大于0.5，為優(yōu)選的。致密成核底層可以隨意進(jìn)行切割和舍棄。
[0182]本發(fā)明實(shí)施例3
[0183]將一定量的K-角叉菜膠稱重，轉(zhuǎn)移到300ml燒瓶中，并且添加熱水(約70°C )以制造4.0% (質(zhì)量百分比)溶液。將溶液用磁力攪拌器在70°C下于熱浴中攪拌I小時(shí)以使生物相容性聚合物完全溶解。在使溶液保溫的同時(shí)，使其在20到90毫巴的真空下脫氣15分鐘。隨后將溶液使用注射器以20.4克的等分試樣添加到冷凍容器中。注意一旦有任何氣泡沉積在冷凍容器中就將其從溶液中移除。對(duì)于所有樣品來(lái)說(shuō)，將PE箔用作覆蓋物以防止空氣中粉塵的污染以及水或乙醇從樣品頂部蒸發(fā)。使樣品溶液在冰箱中2°C下膠凝2小時(shí)，并且隨后將樣品安置在冷浴中達(dá)到幾毫米的深度。然后通過(guò)以下方式使冷浴溫度快速降低:在充分混合下將非常冷(_73±3°C )的液體(乙醇)以使得冷浴溫度以20到100°C /分鐘中間的速率下降直到冷浴溫度達(dá)到-30至_40°C的速率泵送到冷浴中。在這一 T斜變期間，冰形成的第一次出現(xiàn)在-20到_30°C的冷浴溫度下觀測(cè)到。在樣品底部含有覆蓋全部冷凍容器底部的薄冰層之后立即以使得冷浴溫度以約100°C /分鐘速率增加的高速率啟動(dòng)溫(+50°C )的液體(乙醇)泵B。一旦冷浴溫度達(dá)到所要的-4°C，就停止泵B，并且以使得冷浴溫度以約0.50C /分鐘速率降低直到完整樣品體積冷凍的非常慢的速率啟動(dòng)泵A。
[0184]
[0185]所得孔隙結(jié)構(gòu)類似于本發(fā)明實(shí)施例1。它在整個(gè)樣品體積內(nèi)非常均質(zhì)，其孔隙具有狹窄尺寸分布以及500到800微米的大的平均尺寸。下部樣品區(qū)中的孔隙結(jié)構(gòu)非常類似于上部樣品中的結(jié)構(gòu)?？紫兜膱A度大過(guò)0.5，為優(yōu)選的。這一實(shí)施例的平均孔隙ECD是450微米，ECDsd是200微米。致密成核底層厚度小于半毫米，并且可以隨意進(jìn)行切割和舍棄。參看圖22,23和24。
[0186]本發(fā)明實(shí)施例4
[0187]將一定量的來(lái)自蝦殼的殼聚糖稱重，轉(zhuǎn)移到300ml燒瓶中，并且添加熱水(約50°C)以制造7.5% (質(zhì)量百分比)溶液。將溶液用磁力攪拌器在50°C下于熱浴中攪拌I小時(shí)以使生物相容性聚合物完全溶解。在使溶液保溫的同時(shí)，使其在20到90毫巴的真空下脫氣15分鐘。隨后將溶液使用注射器以20.4克的等分試樣添加到冷凍容器中。注意一旦有任何氣泡沉積在冷凍容器中就將其從溶液中移除。對(duì)于所有樣品來(lái)說(shuō)，將PE箔用作覆蓋物以防止空氣中粉塵的污染以及水或乙醇從樣品頂部蒸發(fā)。使樣品溶液在冰箱中2°C下膠凝2小時(shí)，并且隨后將樣品安置在冷浴中達(dá)到幾毫米的深度。然后通過(guò)以下方式使冷浴溫度快速降低:在充分混合下將非常冷(_73±3°C )的液體(乙醇)以使得冷浴溫度以20到100°C /分鐘中間的速率下降直到冷浴溫度達(dá)到-30至-40°C的速率泵送到冷浴中。在這一 T斜變期間，冰形成的第一次出現(xiàn)在-20到-30°C的冷浴溫度下觀測(cè)到。一旦薄冰層覆蓋容器的全部冷凍表面，就以使得冷浴溫度以約100°C /分鐘速率增加的高的速率啟動(dòng)溫(+50°C )液體(乙醇)泵B。當(dāng)冷浴溫度達(dá)到所要溫度(_4°C )時(shí)，停止泵B，并且以使得冷浴溫度以約0.1°C /分鐘速率降低直到完整樣品體積冷凍的非常慢的速率啟動(dòng)泵A。
[0188]
[0189] 所得孔隙結(jié)構(gòu)在整個(gè)樣品體積內(nèi)非常均質(zhì)，其具有拉伸的孔隙形狀和狹窄尺寸分布。平均孔隙尺寸是約100微米。下部樣品區(qū)中的孔隙結(jié)構(gòu)非常類似于上部樣品中的結(jié)構(gòu)。這一實(shí)施例的平均孔隙ECD是60微米，ECDsd是27微米。致密成核底層厚度是約半毫米，并且可以隨意進(jìn)行切 割和舍棄。參看圖25、26和27。
【權(quán)利要求】
1.從包含生物相容性聚合物的液體溶液制造多孔材料的方法，所述方法包括: a.將所述生物相容性聚合物溶液引入到具有導(dǎo)熱表面的絕熱容器中； b.通過(guò)將所述容器在冷卻裝置中冷卻到樣品熔點(diǎn)(Tm)至25°C范圍內(nèi)的溫度，任選地使所述生物相容性聚合物溶液的至少一部分膠凝； c.通過(guò)以下方法經(jīng)由所述導(dǎo)熱表面以受控方式使所述生物相容性聚合物凝膠/溶液冷凍: (i)使所述冷卻裝置的溫度在不超過(guò)5分鐘內(nèi)快速下降到約-10°C與約_50°C之間，以便在所述導(dǎo)熱表面上形成生物相容性聚合物凝膠/溶液的冷凍薄層； (ii)使所述冷卻裝置的溫度在不超過(guò)5分鐘內(nèi)快速上升到接近于但仍低于樣品Tm的溫度; (iii)使所述冷卻裝置的溫度逐漸降低，以便誘發(fā)從步驟c(i)中形成的所述冷凍層引發(fā)的冰晶在所述生物相容性聚合物凝膠/溶液中有恒定單向生長(zhǎng)率； d.冷凍干燥步驟c(iii)的產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多孔材料是多孔組織支架。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中在冷凍干燥之后，將對(duì)應(yīng)于步驟c(i)中形成的所述薄致密層并且不具有柱狀孔隙的材料移除。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在冷凍干燥之后，所述多孔材料被交聯(lián)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述多孔材料通過(guò)包括化學(xué)交聯(lián)的方法被交聯(lián)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述多孔材料通過(guò)包括脫氫加熱交聯(lián)的方法被交聯(lián)。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物相容性聚合物溶液在使用之前經(jīng)脫氣。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物相容性聚合物溶液基本上不含顆粒。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物相容性聚合物溶液在使用之前經(jīng)過(guò)濾法滅菌。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物相容性聚合物溶液包含重組明膠樣蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述重組明膠樣蛋白包含至少一個(gè)RGD基序。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的方法，其中在所述重組明膠樣蛋白中，RGD基序相對(duì)于氨基酸總數(shù)目的百分比是至少0.4%，并且如果所述重組明膠樣蛋白包含350個(gè)或更多氨基酸，那么每個(gè)含350個(gè)氨基酸的區(qū)段含有至少一個(gè)RGD基序。
13.根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的方法，其中在所述重組明膠樣蛋白中，RGD基序相對(duì)于氨基酸總數(shù)目的百分比是至少0.6 %。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其提供一種制備多孔組織支架材料的方法，所述方法包含以下步驟: a.使所述生物相容性聚合物溶解于溶劑或溶劑混合物中； b.使所述生物相容性聚合物溶液脫氣；C.將所述生物相容性聚合物溶液引入到具有單個(gè)導(dǎo)熱表面的絕熱容器中，任選地添加添加劑； d.通過(guò)將所述容器冷卻到樣品熔點(diǎn)Tm至25°C范圍內(nèi)的溫度，任選地使所述生物相容性聚合物溶液的至少一部分膠凝； e.通過(guò)將所述容器暴露于利用包括至少三個(gè)步驟的溫度分布的冷卻裝置使所述樣品在控制冷凍速率的情況下單向冷凍: (i)使所述冷卻裝置的溫度在不超過(guò)5分鐘內(nèi)快速下降到約-10°C與約-50°C之間，以便在所述導(dǎo)熱表面上形成生物相容性聚合物凝膠/溶液的冷凍薄層； (ii)使所述冷卻裝置的溫度在不超過(guò)5分鐘內(nèi)快速上升到接近于但仍低于樣品Tm的溫度; (iii)使所述冷卻裝置的溫度逐漸降低，以便誘發(fā)從步驟e(i)中形成的所述冷凍層引發(fā)的冰晶在所述生物相容性聚合物凝膠/溶液中有層狀生長(zhǎng)； f.在減壓下冷凍干燥步驟e中獲得的所述材料； g.任選地移除對(duì)應(yīng)于步驟e(i)中形成的所述冷凍薄層并且不具有柱狀孔隙的材料；和 h.使步驟g中獲得的所述材料交聯(lián)。
15.多孔材料，其通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1到14中任一項(xiàng)所述的方法獲得。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的多孔材料，其是多孔組織支架。
17.體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其包含根據(jù)權(quán)利要求16所述的多孔組織支架。
18.可植入生物相容性物品，其包含根據(jù)權(quán)利要求16所述的多孔組織支架。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的可植入生物相容性物品，其用作牙骨填料。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的可植入生物相容性物品，其用作多能細(xì)胞的微載體。
【文檔編號(hào)】A61L27/22GK103974727SQ201280054603
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月7日
【發(fā)明者】H·范博克斯泰爾 申請(qǐng)人:富士膠片株式會(huì)社