用作用于營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)藥應(yīng)用的益生菌劑的細(xì)菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及用于以下應(yīng)用的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia?hominis)細(xì)菌物種：調(diào)節(jié)被試者的免疫系統(tǒng)；治療免疫失調(diào)；治療腸失調(diào)；改善腸道菌群；調(diào)節(jié)被試者的先天性免疫系統(tǒng)；調(diào)節(jié)被試者的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)；調(diào)節(jié)被試者的食欲；促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和免疫耐受性；促進(jìn)被試者的消化道健康；和/或保持被試者的免疫穩(wěn)態(tài)。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含人羅斯拜瑞氏菌的組合物。
【專利說明】用作用于營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)藥應(yīng)用的益生菌劑的細(xì)菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種及其各種營(yíng)養(yǎng)和治療應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]人類的腸道(被認(rèn)為最初在子宮內(nèi)是無菌的)在出生后立即被暴露在大量的母體和環(huán)境微生物中。隨后消化 道(gut)中的集群和演替過程在生命的最初幾年內(nèi)一直在不斷變化發(fā)展中，之后這些微生物群變得成熟并且相對(duì)穩(wěn)定(I)。人類消化道微生物群包括大于500種不同的種系型,它們基本分屬于兩個(gè)主要的細(xì)菌門:擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes) (2)。由人類消化道中的細(xì)菌集群所引起的成功的共生關(guān)系產(chǎn)生了廣泛多樣的代謝功能、結(jié)構(gòu)功能、保護(hù)功能和其它有益的功能。細(xì)菌集群后的消化道的增強(qiáng)的代謝活性可確保膳食成分(即使是難以消化的)得到消化并釋放副產(chǎn)物，從而為宿主提供重要的營(yíng)養(yǎng)來源。相似地，人們已經(jīng)很好地認(rèn)識(shí)到了消化道微生物群的免疫學(xué)重要性，并且通過在免疫系統(tǒng)受損的無菌動(dòng)物中引入共生細(xì)菌來使免疫系統(tǒng)功能性重建，從而證實(shí)了該免疫學(xué)重要性(3-5)。
[0003]與腸分泌型IgA的產(chǎn)生(其受到微生物集群本身的影響(6，7)形成強(qiáng)烈對(duì)比的是，T細(xì)胞的發(fā)育和分化似乎需要特定的共生微生物集群。梭菌屬細(xì)菌(特別是產(chǎn)生孢子的分節(jié)絲狀菌(SFB))似乎是腸Thl、Thl7和Tregs成熟的主要驅(qū)動(dòng)力(8，9)。然而，近來的研究顯示，在無菌小鼠中，通過促進(jìn)Tregs的表達(dá),包括那些ASF (altered Schaedler flora)在內(nèi)的其它消化道細(xì)菌可以誘導(dǎo)重新產(chǎn)生Tregs,而脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)的單一集群則可以修正Thl/Th2的失衡(5，10)。
[0004]本發(fā)明致力于闡明其它能夠調(diào)節(jié)消化道代謝活性和/或在免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮作用的消化道常駐細(xì)菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明以厚壁菌門的一員-人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種的
活性為重點(diǎn)。 申請(qǐng)人:的研究證明，該細(xì)菌物種在免疫調(diào)節(jié)和消化道代謝活性中發(fā)揮了重要作用，并且對(duì)食欲和飽腹感基因具有影響。下文將更詳細(xì)地描述參與集群和適應(yīng)鼠消化道的細(xì)菌基因的作用，以及對(duì)所述細(xì)菌的集群產(chǎn)生應(yīng)答的宿主基因的作用。
[0006]所附權(quán)利要求記載了本發(fā)明的各方面，以及優(yōu)選實(shí)施方案。
[0007]本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及一種用于調(diào)節(jié)被試者的免疫系統(tǒng)的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于治療以下失調(diào)的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburiahominis)細(xì)菌物種，所述失調(diào)選自炎癥性疾病、免疫失調(diào)和腸失調(diào)。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于通過恢復(fù)免疫穩(wěn)態(tài)(immune homeostasis)來促進(jìn)消化道健康的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。[0010]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于改善被試者的腸道菌群的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
[0011]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于調(diào)節(jié)被試者的先天性免疫系統(tǒng)的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于調(diào)節(jié)被試者的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
[0013]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于促進(jìn)被試者的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)和免疫耐受性的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
[0014]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于調(diào)節(jié)被試者的食欲的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
[0015]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種在制備用于調(diào)節(jié)被試者的免疫系統(tǒng)的藥物中的應(yīng)用。[0016]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種在制備用于治療被試者的以下失調(diào)的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或藥物中的應(yīng)用，所述失調(diào)選自炎癥性疾病、免疫失調(diào)和腸失調(diào)。
[0017]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種在制備用于改善被試者的腸道菌群的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或藥物中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種在制備用于調(diào)節(jié)被試者的先天性免疫系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或藥物中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種在制備用于調(diào)節(jié)被試者的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或藥物中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種在制備用于調(diào)節(jié)被試者的食欲的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或藥物中的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種治療被試者的以下失調(diào)的方法，所述失調(diào)選自炎癥性疾病、免疫失調(diào)和腸失調(diào)，所述方法包括對(duì)所述被試者施用營(yíng)養(yǎng)學(xué)或藥學(xué)有效量的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
[0022]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種改善被試者的腸道菌群的方法，所述方法包括對(duì)所述被試者施用包含人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種的組合物。
[0023]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種調(diào)節(jié)被試者的先天性免疫系統(tǒng)的方法，所述方法包括對(duì)所述被試者施用包含人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種的組合物。
[0024]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種調(diào)節(jié)被試者的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的方法，所述方法包括對(duì)所述被試者施用包含人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種的組合物。
[0025]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種調(diào)節(jié)被試者的食欲的方法，所述方法包括對(duì)所述被試者施用包含人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種的組合物。
[0026]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于醫(yī)療的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
[0027]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種藥物組合物，其包含人羅斯拜瑞氏菌(Roseburiahominis)細(xì)菌物種和藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
[0028]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，包含人羅斯拜瑞氏菌(Roseburiahominis)細(xì)菌物種和營(yíng)養(yǎng)學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
[0029]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種益生菌劑組合物，包含人羅斯拜瑞氏菌(Roseburiahominis)細(xì)菌物種。
[0030]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種飼料、食品產(chǎn)品、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、膳食補(bǔ)充劑或食品添加劑，其包含人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
[0031]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種制備根據(jù)本發(fā)明所述的藥物組合物的方法，所述方法包括將人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種與藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑混合。
[0032]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種制備根據(jù)本發(fā)明所述的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的方法，所述方法包括將人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種與營(yíng)養(yǎng)學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑混合。
[0033]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于保持被試者的免疫穩(wěn)態(tài)的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
【具體實(shí)施方式】
[0034]如上文所述，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于以下一種或多種應(yīng)用的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種:
[0035].治療免疫失調(diào)；
[0036].治療腸失調(diào)；
[0037].改善腸道菌群；
[0038].調(diào)節(jié)被試者的先天性免疫系統(tǒng)；
[0039].調(diào)節(jié)被試者的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)；
[0040].促進(jìn)Tregs和免疫耐受性；
[0041]?調(diào)節(jié)被試者的食欲；
[0042].促進(jìn)被試者的消化道健康；和/或
[0043].保持被試者的免疫穩(wěn)態(tài)。
[0044]人羅斯拜瑞氏菌(Roseburiahominis)
[0045]人羅斯拜瑞氏菌是一種近來報(bào)道的屬于厚壁菌門內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)生簇XIVa的消化道共生厭氧菌，它屬于人類消化道的優(yōu)勢(shì)組細(xì)菌，并且還是丁酸的主要生產(chǎn)者(11)。本 申請(qǐng)人:闡明了該細(xì)菌的全基因組序列和注釋。進(jìn)一步的研究調(diào)查了具有人羅斯拜瑞氏菌單一集群的無菌小鼠中的細(xì)菌和宿主的轉(zhuǎn)錄組應(yīng)答。本文描述了參與集群和適應(yīng)鼠消化道的細(xì)菌基因的作用，以及對(duì)所述細(xì)菌的集群產(chǎn)生應(yīng)答的宿主基因的作用。
[0046] 申請(qǐng)人:的實(shí)驗(yàn)表明，人羅斯拜瑞氏菌的活性是高度特異的。研究顯示，羅斯拜瑞氏菌屬(Roseburia)的重要的基因組迥然不同，這表明了功能多樣性。的確，令人出乎意料的是，實(shí)驗(yàn)顯示來自梭菌屬簇XIVa的細(xì)菌(包括腸道羅斯拜瑞氏菌(Roseburiaintestinalis)、人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)、和直腸真桿菌(Eubacteriumrectale)，它們均為丁酸生產(chǎn)者)可對(duì)消化道細(xì)胞產(chǎn)生迥然不同且獨(dú)特的作用。
[0047]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌物種是根據(jù)布達(dá)佩斯條約中的條款，于2004年10月21日以阿伯丁大學(xué)羅維特營(yíng)養(yǎng)與健康研究所(Greenburn Road, Aberdeen, AB219SB,Scotland, UK)的名義在國家食品工業(yè)與海洋細(xì)菌保藏中心(NCIMB)NCIMB公司(FergusonBuilding, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, UK, AB219YA)保藏的菌株，登錄號(hào)為NCIMB14029T Roseburia hominis A2_183T(DSM = 16839T)。
[0048]所述細(xì)菌物種優(yōu)選為文獻(xiàn)“Duncan, S.H.，Aminov, R.1.，Scott, K.P., Louis, P., Stanton, T.B., &FIi n t, H.J.(2006) Int.J.Sy s t.E vo 1.Microbiol.56:2437-2441 ” 中所述的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)。
[0049]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌物種為活細(xì)菌種群的形式、凍干細(xì)菌種群的形式、無生命細(xì)菌種群的形式、或它們的細(xì)胞組分的形式。優(yōu)選地，當(dāng)所述細(xì)菌物種為無生命細(xì)菌種群的形式時(shí)，其選自熱滅活細(xì)菌、經(jīng)輻射細(xì)菌和被溶解的細(xì)菌。
[0050]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌物種為活細(xì)菌種群的形式、或其細(xì)胞組分的形式。
[0051]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌物種是分離的形式。如本文所用，術(shù)語“分離的”是指從其天然環(huán)境中分離出來的。
[0052]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌物種為生物學(xué)上純的形式。如本文所用，術(shù)語“生物學(xué)上純的”是指基本上不含其它生物物種的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)物。優(yōu)選地，所述細(xì)菌物種為單一生物物種培養(yǎng)物的形式。
[0053]本發(fā)明還包括本文所述的細(xì)菌物種或菌株的突變體的應(yīng)用。如本文所述，術(shù)語“突變體”包括與參考 菌株的多核苷酸序列具有至少93%同源性、優(yōu)選至少96%同源性、更優(yōu)選98%同源性，但在細(xì)菌基因組的其它序列中包含突變的衍生細(xì)菌菌株。突變體可以通過使本發(fā)明的菌株的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的基因工程技術(shù)、或使本發(fā)明的菌株的遺傳物質(zhì)與其它分子重組的基因工程技術(shù)獲得。通常，為了獲得這樣的突變體菌株，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用標(biāo)準(zhǔn)突變技術(shù)，例如UV輻射或暴露于誘變化學(xué)制品。
[0054]如本文所用，術(shù)語“突變”包括包含至少一個(gè)堿基改變的天然或誘導(dǎo)突變，所述堿基改變包括刪除、插入、顛換和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它改變，包括在親本核苷酸序列或氨基酸序列中引入的但與該親本序列保留至少50%同源性的遺傳改變。優(yōu)選地，包含一個(gè)或多個(gè)突變的序列與親本序列具有至少60 %、優(yōu)選至少75 %、更優(yōu)選85 %的同源性。如本文所用，序列“同源性”可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定。例如，可以利用在線同源性算法“BLAST”程序確定同源性,所述程序在http)://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/上對(duì)公眾開放。
[0055]本發(fā)明還包括本文所述的細(xì)菌物種或菌株的同源生物的應(yīng)用。如本文所用，術(shù)語“同源生物”是指具有與親本細(xì)菌菌株的核苷酸序列有一定程度的序列同一性或序列同源性的核苷酸序列(下文稱為“同源序列”)的細(xì)菌菌株。在本文中，術(shù)語“同源”是指與目標(biāo)核苷酸序列具有一定同源性的個(gè)體。在本文中，術(shù)語“同源性”可以與“同一性”等同。
[0056]在本文中，同源序列包括這樣的核苷酸序列，其可以與親本細(xì)菌菌株的核苷酸序列(目標(biāo)序列)至少50%、60%、70%、75%、80%、85%或90%相同，優(yōu)選至少95%、97%、98%或99%相同。
[0057]可以通過眼睛或(更通常)利用現(xiàn)有的序列比對(duì)程序協(xié)助進(jìn)行同源性比較。這些市售的計(jì)算機(jī)程序可以計(jì)算兩個(gè)或多個(gè)序列之間的％同源性。
[0058]可以對(duì)鄰接序列(contiguous sequence)計(jì)算％同源性，即，將一個(gè)序列對(duì)準(zhǔn)另一個(gè)序列，并且將一個(gè)序列中的各個(gè)氨基酸與另一個(gè)序列中的相應(yīng)氨基酸進(jìn)行直接比較，一次一個(gè)殘基。這稱為“非間隙”比對(duì)。通常，該非間隙比對(duì)只對(duì)殘基數(shù)目較少的序列進(jìn)行。
[0059]雖然這是一個(gè)非常簡(jiǎn)單一致的方法，但未能考慮到(例如)在一對(duì)其它方面相同的序列中，一個(gè)插入或刪除會(huì)導(dǎo)致之后的氨基酸殘基比對(duì)失敗，因此當(dāng)進(jìn)行總體比對(duì)(global alignment)時(shí),可能導(dǎo)致％同源性大大降低。
[0060]因此，計(jì)算最大％同源性首先需要產(chǎn)生最佳比對(duì)，其考慮到間隙處理。進(jìn)行這種比對(duì)的合適的計(jì)算機(jī)程序?yàn)閂ector NTI (Invitrogen公司)。能夠進(jìn)行序列比對(duì)的軟件的例子包括但不限于(例如)BLAST包(參見Ausubel等的“Short Protocols inMolecular Biology”，1999，第四版-第 18 章)、BLAST2 (參見文獻(xiàn) “FEMS MicrobiolLettl999174(2): 247-50”、“FEMS Microbiol Lettl999177 (I): 187-8”)，F(xiàn)ASTA (參見文獻(xiàn)“Altschul et all990J.Mol.Biol.403-410”)和 AlignX。至少 BLAST、BLAST2 和 FASTA 可以離線和在線搜索(參見“Ausubel et all999, pages7-58to7_60”)。
[0061]優(yōu)選地，對(duì)至少20個(gè)鄰接核苷酸、優(yōu)選至少30個(gè)鄰接核苷酸、優(yōu)選至少40個(gè)鄰接核苷酸、優(yōu)選至少50個(gè)鄰接核苷酸、優(yōu)選至少60個(gè)鄰接核苷酸、優(yōu)選至少100個(gè)鄰接核苷酸進(jìn)行核苷酸序列同一性程度的確定。優(yōu)選地，可以對(duì)整個(gè)序列進(jìn)行核苷酸序列同一性程度的確定。
[0062]傳統(tǒng)的基于表型特征的細(xì)菌鑒定通常不如基于基因型的鑒定方法那么精確。對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因序列的比對(duì)成為優(yōu)選的基因技術(shù)，其通過利用BLAST (http://blast,ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與已知的細(xì)菌DNA序列進(jìn)行比較,使得能夠鑒定新的菌株。16S rRNA基因序列在細(xì)菌中是普遍的，因此可以測(cè)量很多不同的細(xì)菌之間的關(guān)系。通常，除了在包括種和亞種水平的多個(gè)水平上對(duì)菌株進(jìn)行分類以外，比較16S rRNA序列使得可以對(duì)細(xì)菌的所有主要的門在屬的水平上對(duì)生物進(jìn)行區(qū)分。已經(jīng)確定了大量菌株的16S rRNA基因序列。GenBank(最大的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫)具有超過2億個(gè)保藏的序列，其中超過90，000個(gè)為16S rRNA基因。這意味著可以將未知菌株的序列與已有的之前已經(jīng)保藏的很多序列進(jìn)行比較。
[0063]如本文所用，術(shù)語“16S rRNA同一性”是指與已知細(xì)菌菌株的百分比同一性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌菌株與以上述登錄號(hào)保藏的菌株具有至少99.5%的16S rRNA同一I"生。
[0064]本發(fā)明還包括突變株，其可以得自上文提及的保藏菌株，本發(fā)明還包括與以上述登錄號(hào)保藏的菌株具有至少70%的DNA-DNA同一性和/或至少99.5%的16S RNA同一性的菌株。
[0065]在本發(fā)明的內(nèi)容中，術(shù)語“DNA-DNA同一性”是指在其核苷酸序列的基礎(chǔ)上，DNA的兩個(gè)或多個(gè)單獨(dú)的股彼此的接近程度。通常，以它們的％同一性進(jìn)行測(cè)量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌菌株與以上述登錄號(hào)保藏的菌株具有至少70%的DNA-DNA同一性。
[0066]在一個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌菌株與以上述登錄號(hào)保藏的菌株具有至少70%的DNA-DNA同一性和至少99.5%的16S rRNA同一性。
[0067]治療應(yīng)用
[0068]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于醫(yī)藥的人羅斯拜瑞氏菌細(xì)菌物種。
[0069]更具體而言，所述人羅斯拜瑞氏菌細(xì)菌物種用于治療被試者的以下失調(diào)，所述失調(diào)選自炎癥性疾病、免疫失調(diào)和腸失調(diào)。
[0070]如本文所用，術(shù)語“藥物”包括用于人類和動(dòng)物應(yīng)用的人用藥物和獸用藥物。此外，本文所用的術(shù)語“藥物”是指可提供治療和/或有益效果的任何物質(zhì)。本文所用的術(shù)語“藥物”不必要被限制為需要上市許可證的物質(zhì)，而是可以包括能夠在化妝品、營(yíng)養(yǎng)品、食品(包括例如食料和飲料)、益生菌培養(yǎng)物、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和天然藥物中使用的物質(zhì)。此外，本文所用的術(shù)語“藥物”包括被設(shè)計(jì)為加入動(dòng)物飼料(例如家畜飼料和/或?qū)櫸镲暳?中的產(chǎn)品。[0071 ] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，失調(diào)選自腸易激綜合征(IBS)、結(jié)腸炎、炎癥性腸病(IBD)，包括克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸袋炎(pouchitis)、功能性消化不良、功能性便秘、功能性腹瀉(包括抗生素相關(guān)腹瀉、旅行者腹瀉和小兒腹瀉)、功能性腹痛、功能性氣脹病、上腹痛綜合征、餐后不適綜合征、胃食管反流病(GERD)、自身免疫性疾病(例如糖尿病、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化和牛皮癬變態(tài)反應(yīng))、特異反應(yīng)性疾病(例如特異反應(yīng)性皮炎)、壞死性小腸結(jié)腸炎、其它感染、以及它們的組合。
[0072]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述失調(diào)為炎癥性疾病。優(yōu)選地，宿主被試者中的前炎癥基因的表達(dá)被下調(diào)。這些研究的更多細(xì)節(jié)在下文中描述。
[0073]更優(yōu)選地，所述炎癥性疾病為結(jié)腸炎，更優(yōu)選為克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎或結(jié)腸袋炎。
[0074]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，腸失調(diào)為IBS。IBS的確切的病理生理學(xué)還有待闡明。近來的研究報(bào)道了在IBS患者中發(fā)生粘膜炎癥和腸道菌群的改變，并且報(bào)道了與腸感染相關(guān)的疾病。
[0075]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，腸失調(diào)為IBD。優(yōu)選地，在宿主被試者中增強(qiáng)了屏障基因的表達(dá)。這些研究的更多細(xì)節(jié)在下文中描述。
[0076]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，腸失調(diào)為克羅恩氏病。
[0077]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，失調(diào)為免疫失調(diào)。
[0078]優(yōu)選地，免疫失調(diào)選自潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸袋炎、其它自身免疫性疾病(包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、多發(fā)性硬化)、變態(tài)反應(yīng)(包括乳糜瀉、特異反應(yīng)性皮炎和鼻炎)。
[0079]在一個(gè)實(shí)施方案中，人羅斯拜瑞氏菌細(xì)菌物種被用于調(diào)節(jié)被試者的免疫系統(tǒng)。已知細(xì)菌物種的免疫調(diào)節(jié)是高度物種特異性的(8)。特別地，簇XIVa和簇VI細(xì)菌的免疫調(diào)節(jié)作用非常復(fù)雜，并且不依賴于丁酸的產(chǎn)生(41)。
[0080]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，調(diào)整了被試者的先天性免疫系統(tǒng)。
[0081]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以免疫調(diào)節(jié)的方式調(diào)整了被試者的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)(不是免疫激活，因此減輕了炎癥)。
[0082]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于改善被試者的腸道菌群的人羅斯拜瑞氏菌細(xì)菌物種。
[0083]腸道菌群是指生活在宿主動(dòng)物的消化管道(digestive tract)內(nèi)的微生物。這些微生物發(fā)揮廣泛多樣的代謝功能、結(jié)構(gòu)功能、保護(hù)功能和其它有益的功能。如本文所用，“改善腸道菌群”是指增加宿主腸內(nèi)的微生物數(shù)目和/或種類，和/或增強(qiáng)所述微生物在代謝功能、結(jié)構(gòu)功能、保護(hù)功能和其它有益功能方面的活性。
[0084]優(yōu)選地，人羅斯拜瑞氏菌集群在結(jié)腸和/或回腸中，更優(yōu)選集群在結(jié)腸中。
[0085] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人羅斯拜瑞氏菌調(diào)節(jié)至少一種轉(zhuǎn)移基因或趨化性基因的表達(dá)。
[0086]更優(yōu)選地，人羅斯拜瑞氏菌下調(diào)至少一種轉(zhuǎn)移基因或趨化性基因的表達(dá)。更加優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)移基因或趨化性基因選自MobA和MobL。
[0087]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人羅斯拜瑞氏菌調(diào)節(jié)選自FlaAl、FlaA2、Fla3和FlaB中的至少一種基因的表達(dá)。
[0088]在炎癥性腸病中存在對(duì)FLA型蛋白的特異性血清抗體。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人羅斯拜瑞氏菌被用于治療炎癥性腸病。
[0089]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人羅斯拜瑞氏菌調(diào)節(jié)以下一者或多者的表達(dá):乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶、3-羥基?；o酶A脫氫酶、丁酰輔酶A脫氫酶、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白β亞基、和電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白ct亞基。
[0090]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于調(diào)節(jié)被試者的先天性免疫系統(tǒng)的人羅斯拜瑞氏菌細(xì)菌物種
[0091]如本文所用，術(shù)語“先天性免疫系統(tǒng)”(也稱為非特異性免疫系統(tǒng))包括以非特異的方式為宿主提供直接防御以抵抗其它有機(jī)體感染的細(xì)胞和機(jī)制。這意味著先天性系統(tǒng)的細(xì)胞以非特異性的方式識(shí)別病原體并作出應(yīng)答，但其不為宿主提供長(zhǎng)期的免疫或保護(hù)性免疫，這與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)不同。
[0092]如本文所用，術(shù)語“調(diào)節(jié)先天性免疫系統(tǒng)”是指誘導(dǎo)先天性免疫系統(tǒng)的活性，和/或增加相對(duì)于基線水平活性的活性水平，從而促進(jìn)免疫穩(wěn)態(tài)。
[0093]先天性免疫功能喪失或調(diào)節(jié)異常與多種身體器官(包括消化道)的炎癥性疾病的風(fēng)險(xiǎn)的提高有關(guān)，其中先天性免疫功能喪失或調(diào)節(jié)異常由失去上皮屏障、先天性免疫肽(例如防御素、趨化因子和細(xì)胞因子)引起，或由TLR信號(hào)通路的缺陷引起。所述疾病包括炎癥性腸病。因此，在一個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，人羅斯拜瑞氏菌用于治療炎癥性腸病。
[0094]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人羅斯拜瑞氏菌調(diào)節(jié)選自Tlr5、Tlrl、Vnnl、Defb37、Pla2g、Mucl6、ltln、Sprrla、Cldn4、Pmp22、Crb3、Magi3、Marveld3、Mpp7、Defcr20、Pcgf2、Ltbp4、lgsf8和Tcfe2a中的至少一種基因的表達(dá)。這些基因中的很多是消化道屏障基因并且是抗微生物的，因此它們能夠降低消化道病原體的侵染力，并且還能夠降低活病原體的數(shù)目。
[0095]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于調(diào)節(jié)被試者的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的人羅斯拜瑞氏菌細(xì)菌物種。
[0096]如本文所用，術(shù)語“適應(yīng)性免疫系統(tǒng)”(還稱為特異性免疫系統(tǒng))是指消除或防止病原體生長(zhǎng)的高度特異性的、系統(tǒng)性的細(xì)胞和過程。適應(yīng)性免疫應(yīng)答為脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)提供識(shí)別和記憶特定病原體的能力(從而產(chǎn)生免疫性)，以及在每次遭遇病原體時(shí)發(fā)動(dòng)強(qiáng)烈攻擊的能力。
[0097]如本文所用，術(shù)語“調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)”是指誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的活性，和/或通過增加相對(duì)于基線水平活性的活性水平來促進(jìn)免疫穩(wěn)態(tài)。優(yōu)選地，以免疫調(diào)節(jié)的方式調(diào)整適應(yīng)性免疫系統(tǒng)(不是免疫激活，因此減輕了炎癥)。
[0098]與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)相關(guān)的缺陷和失調(diào)(特別是與T細(xì)胞的功能相關(guān)的)，與多種炎癥性疾病和自身免疫性疾病有關(guān)。與Thl、Th2和Thl7相關(guān)的T細(xì)胞應(yīng)答，與特異反應(yīng)性疾病、炎癥性疾病和自身免疫性疾病有關(guān)。改善或增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)群體的治療對(duì)控制由Thl、Th2和Thl7細(xì)胞過度應(yīng)答引起的疾病是重要的。
[0099]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人羅斯拜瑞氏菌激活結(jié)腸或回腸中的至少一種免疫應(yīng)
答基因。
[0100]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人羅斯拜瑞氏菌通過調(diào)節(jié)與T細(xì)胞調(diào)控相關(guān)基因(更優(yōu)選結(jié)腸中的)的表達(dá)來調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。更優(yōu)選的是，人羅斯拜瑞氏菌誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(TregS)。Treg數(shù)目的增加會(huì)抵抗其它效應(yīng)T細(xì)胞的作用，所述其它效應(yīng)T細(xì)胞例如為引起炎癥病狀、自身免疫性病狀和變態(tài)反應(yīng)性/特異反應(yīng)性病狀的Thl、Thl7和Th2。因此，人羅斯拜瑞氏菌的所述性質(zhì)可以用來解決Teff/Treg細(xì)胞平衡缺失的很多疾病，例如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎。
[0101]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，人羅斯拜瑞氏菌上調(diào)升結(jié)腸中選自Ly6g6c和Ly6g6e中的至少一種基因的表達(dá)。Ly6g6c和Iy6g6e耗盡會(huì)增加消化道和呼吸道的感染風(fēng)險(xiǎn)，并且與諸如嗜中性白細(xì)胞減少癥等疾病相關(guān)。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人羅斯拜瑞氏菌用于治療嗜中性白細(xì)胞減少癥。[0102]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于保持被試者的免疫穩(wěn)態(tài)的人羅斯拜瑞氏菌細(xì)菌物種。如本文所用，“保持免疫穩(wěn)態(tài)”是指自我調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)以維持響應(yīng)于變化條件的口服耐受性或免疫穩(wěn)定性?？诜褪苄允侵附】迪缹?duì)食物和共生細(xì)菌的正常免疫應(yīng)答。這些在乳糜瀉和諸如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎等炎癥性腸病中缺失。因此，在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，人羅斯拜瑞氏菌用于治療乳糜瀉和諸如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎等炎癥性腸病。
[0103]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于調(diào)節(jié)被試者的食欲的人羅斯拜瑞氏菌細(xì)菌物種。
[0104]如本文所用，“調(diào)節(jié)食欲”是指調(diào)節(jié)(即，增強(qiáng)或降低)宿主進(jìn)食的欲望的能力。優(yōu)選地，人羅斯拜瑞氏菌通過下調(diào)與食欲抑制相關(guān)的基因來對(duì)宿主的食欲產(chǎn)生刺激作用。優(yōu)選地，人羅斯拜瑞氏菌下調(diào)選自Agt、Cartpt、Cck、Cxcll2和Gcg中的至少一種基因的表達(dá)。更優(yōu)選地，人羅斯拜瑞氏菌下調(diào)飽腹感激素Cck和Gcg的表達(dá)。
[0105]本發(fā)明的細(xì)菌物種還可以用于預(yù)防應(yīng)用。在預(yù)防應(yīng)用中，對(duì)易感或有風(fēng)險(xiǎn)感染特定疾病的患者施用足以至少部分降低發(fā)生疾病的風(fēng)險(xiǎn)的量的本發(fā)明的細(xì)菌物種或組合物。將該量定義為“預(yù)防有效量”。精確的量取決于患者的特定因素(例如患者的健康和體重狀態(tài))的值。
[0106]以如下附圖的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明，其中:
[0107]圖1示出人羅斯拜瑞氏菌在升結(jié)腸中的豐度和定位。(A)人羅斯拜瑞氏菌集群的小鼠升結(jié)腸示出了細(xì)菌與宿主上皮之間的密切聯(lián)系，采用的是A2-183FISH探針，原始放大x630。(B)利用人羅斯拜瑞氏菌特異性引物的PCR顯示，集群后糞便DNA具有強(qiáng)的陽性信號(hào)，而GF動(dòng)物的糞便對(duì)任何細(xì)菌的存在均是陰性的。(C)實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示人羅斯拜瑞氏菌的集群水平/mg糞便。
[0108]圖2示出了人羅斯拜瑞氏菌基因組的序列和注釋。(A)人羅斯拜瑞氏菌圓形基因組圖譜，其上在引物所針對(duì)的區(qū)域中標(biāo)示出了 PCR實(shí)驗(yàn)的定位。該基因組圖譜的軌跡(track)為(從外軌跡O開始):軌跡0-(藍(lán)色)由帶編號(hào)的刻度線標(biāo)出的實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)；軌跡1_(淡藍(lán)色)正向⑶S ;軌跡2-(淡藍(lán)色)反向⑶S ;軌跡3-(藍(lán)色)rRNA ;軌跡4_(綠色)tRNA ;軌跡5-(紅色)實(shí)時(shí)定量PCR所針對(duì)的STS標(biāo)記區(qū)域；圖像1-GC含量；圖像2-GC偏好。(B)人羅斯拜瑞氏菌基因組的功能注釋。
[0109]圖3鑒定了人羅斯拜瑞氏菌在集群且適應(yīng)于鼠消化道之后所差異表達(dá)的不同轉(zhuǎn)錄本。(A)從小鼠盲腸內(nèi)容物中分離出的細(xì)菌RNA，它們?cè)赾DNA合成時(shí)被dCTP-Cy3或dCTP-Cy5標(biāo)記，并且與引入染料交換的微陣列玻片雜交。當(dāng)倍數(shù)變化> 2且P〈0.05時(shí)認(rèn)為數(shù)據(jù)是顯著的。微陣列分析揭示了 50種差異表達(dá)的基因(體內(nèi)vs體外)。(B)對(duì)參與接合/轉(zhuǎn)移傳遞的基因的實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。(C)對(duì)參與移動(dòng)性與趨化性的基因的實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。(D)上升消化道內(nèi)容物的蛋白質(zhì)印記(Western blot),所述上升消化道內(nèi)容物在14d時(shí)用親和純化的Fla2抗體免疫染色(泳道1:分子量階梯(ladder);泳道2_6:來自動(dòng)物1-5的消化道內(nèi)容物；泳道7-8:空；泳道9-10:人羅斯拜瑞氏菌生物質(zhì)(陽性對(duì)照))。人羅斯拜瑞氏菌的照片示出了鞭毛(黑色箭頭)。(E)對(duì)參與丁酸代謝的基因的實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。(F)對(duì)人羅斯拜瑞氏菌在體外暴露于人腸上皮細(xì)胞過程中的轉(zhuǎn)錄本的實(shí)時(shí)定量PCR分析。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果是三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，*Ρ〈0.05,林Ρ〈0.01, *林Ρ〈0.001。
[0110]圖4鑒定了在單一集群有人羅斯拜瑞氏菌之后的鼠消化道中所差異表達(dá)的不同轉(zhuǎn)錄本。(A)集群有人羅斯拜瑞氏菌的小鼠相對(duì)于GF的差異表達(dá)基因的Affymetrix微陣列分析。棒狀圖代表在14天和28天之后較高表達(dá)和較低表達(dá)的基因的數(shù)目。(B)由在14天和28天時(shí)，GF和集群有人羅斯拜瑞氏菌的小鼠之間的具有功能意義的差異表達(dá)的基因制得的熱點(diǎn)圖。列代表獨(dú)立的陣列，行代表感興趣的特定基因。Z-得分描述了與平均值的距離的測(cè)量值(以標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì))。用顏色強(qiáng)度示出各個(gè)基因的相對(duì)值，綠色代表較高表達(dá)，紅色代表較低表達(dá)。(C)集群有人羅斯拜瑞氏菌的小鼠和GF小鼠之間所顯示出的顯著不同的基因的實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果是三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01, ***Ρ〈0.001。
[0111]圖5示出T細(xì)胞標(biāo)記物在結(jié)腸中的表達(dá)和定位。在GF和用人羅斯拜瑞氏菌處理的小鼠的固有層中，對(duì)標(biāo)記有&1^1-1^66(4)、&1^^03?)和ant1-⑶Ilb(C)的固有層細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)和分析。*P〈0.05。
[0112]圖6示出在結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭腥肆_斯拜瑞氏菌的抗炎癥作用。每周對(duì)IL-10K0小鼠施用三次，持續(xù)14周。㈧與野生型小鼠相比，未處理的IL-10K0小鼠的所有基因都強(qiáng)烈升高，而在用人羅斯拜瑞氏菌處理的動(dòng)物中，差異基因表達(dá)較低。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果是三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，*Ρ〈0.05,林Ρ〈0.01，*林Ρ〈0.001。(B)在研究結(jié)束時(shí)，未處理的IL-10K0小鼠和用人羅斯拜瑞氏菌處理的IL-10K0動(dòng)物的體重。(C) IL-10K0和用人羅斯拜瑞氏菌處理的IL-10K0動(dòng)物的升結(jié)腸(蘇木精/伊紅染色)。原始放大xlOO。
[0113]圖7示出了 IL-10、IL-17和IFN-Y的mRNA水平的實(shí)時(shí)定量PCR分析。對(duì)升結(jié)腸組織進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR以測(cè)量T細(xì)胞標(biāo)記物。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果是三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01。
[0114]圖8示出GF小鼠與人羅斯拜瑞氏菌單關(guān)聯(lián)對(duì)體重組成的影響。進(jìn)行了干體重和脂質(zhì)胴體(carcass)分析。(A)人羅斯拜瑞氏菌關(guān)聯(lián)小鼠的干胴體重顯著重于GF動(dòng)物。(B)進(jìn)一步的胴體脂質(zhì)分析顯示，在14d時(shí)，總脂肪也顯著高于用人羅斯拜瑞氏菌處理的小鼠。
[0115] 圖9示出來自簇XIVa(厚壁菌門)的三種細(xì)菌菌株的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的比較結(jié)果，所述三種菌株為人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)、直腸真桿菌(Eubacteriumrectale)、和腸道羅斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)。[0116]圖10示出了人羅斯拜瑞氏菌誘導(dǎo)A20(—種具有有效抗炎癥活性的NF-κ B信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子)，而其它細(xì)菌菌株沒有效果。與直腸真桿菌(一種相關(guān)的細(xì)菌)不同，人羅斯拜瑞氏菌的鞭毛蛋白部分(人羅斯拜瑞氏菌的FLA1)也誘導(dǎo)A20。更具體地，圖10顯示了直腸真桿菌、人羅斯拜瑞氏菌、直腸真桿菌的FLA、人羅斯拜瑞氏菌的FLA1、EAV9、SV1400的FLA相對(duì)于對(duì)照的A20誘導(dǎo)倍數(shù)。
[0117]圖11示出了由RAST確定的人羅斯拜瑞氏菌A2-183的亞系統(tǒng)類別分布(Subsystem Category Distribution),其顯示了各自類別的功能亞系統(tǒng)和基因的數(shù)目。
[0118]圖12示出了由RAST確定的食葡糖羅斯拜瑞氏菌(R.1nulinivorans)DSM16841A2-183的亞系統(tǒng)類別分布，其顯示了各自類別的功能亞系統(tǒng)和基因的數(shù)目。
[0119]圖13示出由RAST確定的腸道羅斯拜瑞氏菌L1-82的亞系統(tǒng)類別分布，其顯示了各自類別的功能亞系統(tǒng)和基因的數(shù)目。
[0120]圖14示出由RAST確定的腸道羅斯拜瑞氏菌M50/1的亞系統(tǒng)類別分布，其顯示了各自類別的功能亞系統(tǒng)和基因的數(shù)目。
[0121]圖15示出由RAST確定的直腸真桿菌ATCC33656的亞系統(tǒng)類別分布，其顯示了各自類別的功能亞系統(tǒng)和基因的數(shù)目。
[0122]人羅斯拜瑞氏菌偏好集群于結(jié)腸
[0123]在連續(xù)數(shù) 天中給健康成年C3H/HeN無菌(GF)小鼠填喂人羅斯拜瑞氏菌三次以進(jìn)行接種。利用包含3%抗壞血酸和2%半胱氨酸的接種培養(yǎng)基保護(hù)細(xì)菌使其不暴露于氧氣，從而實(shí)現(xiàn)了成功集群。用熒光原位雜交(FISH)對(duì)消化道組織的分析表明，人羅斯拜瑞氏菌集群于回腸和結(jié)腸中，但在結(jié)腸中發(fā)現(xiàn)了遠(yuǎn)遠(yuǎn)更多的數(shù)目。也發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌與結(jié)腸粘膜具有緊密的聯(lián)系(圖1A)。利用人羅斯拜瑞氏菌特異的引物進(jìn)行的PCR進(jìn)一步對(duì)集群進(jìn)行了驗(yàn)證和定量，集群數(shù)目接近IxIOici細(xì)菌/g糞便(圖1B和1C)。所測(cè)試的GF動(dòng)物的糞便對(duì)于任何細(xì)菌的存在是陰性的。
[0124]人羅斯拜瑞氏菌基因組揭示出獨(dú)特的促進(jìn)宿主相互作用的基因
[0125]闡明了人羅斯拜瑞氏菌A2-183的全基因組序列(圖2A)，其由單一的3，592，125-bp的染色體所代表(圖2B)。利用RAST平臺(tái)進(jìn)行的自動(dòng)和人工基因組注釋顯示存在4個(gè)核糖體操縱子、66個(gè)RNA和3，273個(gè)預(yù)測(cè)蛋白。最大的一組基因?qū)儆谔妓衔飦喯到y(tǒng)類別(271個(gè)基因)，它們編碼參與碳水化合物代謝的蛋白；之后為蛋白質(zhì)代謝亞系統(tǒng)類別(197)和氨基酸及其衍生物亞系統(tǒng)類別(175)(圖2B)。其它重要的功能類別包括移動(dòng)性與趨化性(49)、以及休眠和孢子形成(12)。比較基因組分析確定，在全細(xì)菌基因組中，在基因組結(jié)構(gòu)和功能方面關(guān)系最接近的是直腸真桿菌(Eubacterium rectale) (12),考慮到這些生物具有接近的分類學(xué)關(guān)聯(lián)性(11，13)，因此這并不意外。對(duì)這兩個(gè)具有1，095個(gè)基因的基因組的比較重建表明，它們大約有25%的基因不同。特別地，這些差別包括編碼用于與宿主相互作用的重要功能的基因。例如，編碼IV型鞭毛組裝蛋白PilB和PilC的移動(dòng)性與趨化性基因存在于直腸真桿菌中，但不存在于人羅斯拜瑞氏菌中，然而，鞭毛基體桿蛋白FlgC、鞭毛鉤-基體復(fù)合物蛋白FliE、鞭毛蛋白FlaB和鞭毛馬達(dá)開關(guān)蛋白FliG對(duì)于人羅斯拜瑞氏菌是獨(dú)特的。這兩個(gè)細(xì)菌基因組的不同還在于42個(gè)碳水化合物基因，這反映了它們相異的營(yíng)養(yǎng)需要。
[0126]人羅斯拜瑞氏菌通過上調(diào)轉(zhuǎn)移基因和趨化性基因來響應(yīng)于消化道環(huán)境[0127]為了確定人羅斯拜瑞氏菌響應(yīng)于宿主和飲食而差異表達(dá)的基因，利用6，000種得自小插入片段(small-1nsert-size)測(cè)序文庫的PCR片段進(jìn)行了微陣列檢測(cè)。之后對(duì)42種差異表達(dá)的基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，如圖2B所示，這些基因簇集在人羅斯拜瑞氏菌基因組的特定區(qū)域。為了區(qū)分消化道環(huán)境和飲食成分的作用，在以下四種不同的實(shí)驗(yàn)條件下分離了細(xì)菌RNA:(i)體內(nèi)，從單相關(guān)小鼠的盲腸中分離；(ii)體外，從在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌中分離體外，從在飲食成分的存在下生長(zhǎng)的細(xì)菌中分離；(iv)從培養(yǎng)在Caco-2和HT-29融合細(xì)胞的表面上的細(xì)菌中分離。
[0128]鑒定了 50種差異表達(dá)的基因(體內(nèi)vs體外)(圖3A)。最令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是，在體內(nèi)被非常高度上調(diào)的基因參與接合/轉(zhuǎn)移傳遞，它們?yōu)閞nobA-和HiobL-樣基因(圖3B)。在轉(zhuǎn)錄研究中存在這些基因是令人驚奇的，因?yàn)樵趤喯到y(tǒng)類別特征中，沒有已鑒定的基因被指定為與噬菌體、原噬菌體、轉(zhuǎn)座因子和質(zhì)粒有關(guān)。該基因檢測(cè)和定位中的不同可能是由于亞系統(tǒng)類別注釋的公認(rèn)的局限性所導(dǎo)致的。飲食化合物的刺激作用非常不顯著，這表明消化道環(huán)境本身是那些參與水平基因轉(zhuǎn)移的基因的主要誘導(dǎo)物。
[0129]其它由消化道環(huán)境誘導(dǎo)的亞系統(tǒng)包括膜轉(zhuǎn)運(yùn)(特別是鎂轉(zhuǎn)運(yùn))和移動(dòng)性與趨化性，所述的移動(dòng)性與趨化性包括多種甲基接收趨化蛋白和鞭毛操縱子基因(圖3C)。人羅斯拜瑞氏菌具有多種鞭毛蛋白基因(flaAl、flaA2、flaA3和fIaB)，并且有趣地是，如利用人羅斯拜瑞氏菌特異性鞭毛蛋白抗體進(jìn)行的細(xì)菌(分離自體內(nèi)集群的小鼠)蛋白質(zhì)印記檢測(cè)所示(圖3D)，在小鼠消化道環(huán)境中生長(zhǎng)促進(jìn)了鞭毛蛋白在該細(xì)菌中的表達(dá)。這與之前的報(bào)道一致，之前的報(bào)道表明只有某些種類的厚壁菌在體內(nèi)產(chǎn)生鞭毛蛋白(14)。
[0130]不令人驚奇的是，人羅斯拜瑞氏菌在消化道環(huán)境中表達(dá)分解代謝基因主要受飲食化合物的影響(圖3E)。相關(guān)的基因包括乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶、3-羥基酰基輔酶A脫氫酶、丁酰輔酶A脫氫酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶[ATP]。雖然對(duì)這些基因的調(diào)節(jié)主要受飲食的驅(qū)動(dòng)，但是在之后的取樣點(diǎn)中，宿主的作用也是明顯的。出乎意料的是，宿主環(huán)境下調(diào)了一些參與宿主源物質(zhì)(例如葡糖醛酸)代謝的基因，這在粘膜蛋白聚糖的碳水化合物鏈中是常見的。
[0131]為了進(jìn)一步研究宿主適應(yīng)對(duì)人羅斯拜瑞氏菌轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)的影響,進(jìn)行了對(duì)人腸上皮細(xì)胞(Caco-2和HT-29)的體外刺激。其表明，通過適應(yīng)于小鼠消化道而誘導(dǎo)的接合/轉(zhuǎn)移傳遞基因mobA/mobL蛋白1，也在這兩種細(xì)胞系中增加(圖3F)。與體內(nèi)的數(shù)據(jù)一致，在Caco-2細(xì)胞中鞭毛蛋白基因MotA被下調(diào)。參與丁酸代謝的基因在兩種細(xì)胞系中不同，在Caco-2細(xì)胞中觀察到下調(diào)，而在HT-29細(xì)胞中觀察到上調(diào)。
[0132]人羅斯拜瑞氏菌主要在結(jié)腸中影響T細(xì)胞通路
[0133]人羅斯拜瑞氏菌在GF小鼠中的集群與消化道基因表達(dá)增加有關(guān)，這在結(jié)腸中增加最多(圖4A)。差異表達(dá)在集群后第28天最顯著，其中有159種基因上調(diào)，143種基因下調(diào)。在第14天，回腸中的差異表達(dá)的基因數(shù)目與升結(jié)腸相似，有79種基因上調(diào)，119種基因下調(diào)。在第28天，回腸中的差異表達(dá)非常低，這與減少的集群水平一致。如熱點(diǎn)圖分析所示的重要轉(zhuǎn)錄本的清晰分離所示(圖4B),轉(zhuǎn)錄本組的(transcriptomic)響應(yīng)在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)是不同的。Affymetrix數(shù)據(jù)的陽性的實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證在圖4C中示出。
[0134]回腸和升結(jié)腸中在第14天受到影響的大多數(shù)通路被歸為細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控和組織重塑類別。重要的是，免疫應(yīng)答是升結(jié)腸中在第28天受到誘導(dǎo)的主要通路組。在所述類別中，36個(gè)受到顯著影響的通路主要參與T細(xì)胞功能，包括IL-1O信號(hào)通路、輔助性T細(xì)胞的ICOS通路、以及CTLA-4對(duì)T細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。參與這些通路的基因顯示出被上調(diào)和下調(diào)，因此，人羅斯拜瑞氏菌的存在會(huì)顯著影響這些通路，而對(duì)T細(xì)胞分化的精確網(wǎng)狀功能性影響還需要進(jìn)一步的研究。然而，利用實(shí)時(shí)定量PCR確定了 IL-10、⑶3 ε和IL-13的增加、以及IFN- Y的表達(dá)改變(圖7)，這表明人羅斯拜瑞氏菌集群可以幫助Treg和Th2細(xì)胞分化通路。進(jìn)行了基因本體學(xué)分析，以在差異調(diào)節(jié)的基因的功能分類方面獲得其它的信息。在人羅斯拜瑞氏菌集群小鼠的結(jié)腸中，用于“肌動(dòng)蛋白聚合”的GO-過程(G0:0030041)(Arpc3、Capg、Cdc42印5和Rhoc)在第28天被上調(diào)(圖8)。T細(xì)胞活化和效應(yīng)物功能需要免疫突觸上的肌動(dòng)蛋白聚合。利用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)一步確定了基因誘導(dǎo)(圖4C)?？偟膩碚f，該數(shù)據(jù)表明，人羅斯拜瑞氏菌通過陽性地影響T細(xì)胞調(diào)節(jié)而積極影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答。
[0135]與這些結(jié)果相關(guān)的是，升結(jié)腸中的Ly6家族成員受到誘導(dǎo)。特別地，在第28天，Ly6g6c的GP1-錨定基因產(chǎn)物被上調(diào)了 25倍，相關(guān)基因Ly6g6e被上調(diào)了 2倍。大多數(shù)造血細(xì)胞表達(dá)L y6家族的一個(gè)或多個(gè)成員，所述造血細(xì)胞包括嗜中性白細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞。此外，已經(jīng)提出了 Ly6在T細(xì)胞活化、分化和成熟中的可能的作用(15)。
[0136]免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)了 Ly6G+、⑶IIb+和⑶3+細(xì)胞在人羅斯拜瑞氏菌集群小鼠中增多(圖5)。與示出T細(xì)胞通路主要由Treg應(yīng)答主導(dǎo)的數(shù)據(jù)一致的是，在接種了人羅斯拜瑞氏菌的小鼠的結(jié)腸中⑶3+FoXP3+雙陽性T細(xì)胞在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性地增多。顯然，人羅斯拜瑞氏菌(作為單一細(xì)菌物種)的集群，誘導(dǎo)了 CD3+FoXP3+細(xì)胞群體顯著性增多，特別是在這些小鼠的結(jié)腸中。
[0137]人羅斯拜瑞氏菌調(diào)節(jié)回腸和結(jié)腸中的先天性免疫應(yīng)答基因，并且減輕ILlOKO小鼠中的結(jié)腸炎
[0138]人羅斯拜瑞氏菌在升結(jié)腸中的存在可顯著誘導(dǎo)參與先天性免疫和消化道屏障功能的基因。用于“先天性免疫應(yīng)答”的GO-過程(GO:0045087)被上調(diào)并且包括TLR-相關(guān)基因Tlr5、Tlrl和Vnnl。Tlr5的上調(diào)是有意思的(特別是考慮到在消化道結(jié)群過程中人羅斯拜瑞氏菌的鞭毛基因被相應(yīng)地誘導(dǎo)并且存在鞭毛蛋白)，并且可以推斷該先天性信號(hào)通路在介導(dǎo)其它先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的作用。最近證明了有鞭毛病原體中的TLR5信號(hào)通路和⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答之間的配合(16)。相似地，已經(jīng)證明了 TLR2在促進(jìn)脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)的集群、Treg增殖和免疫穩(wěn)態(tài)中的作用(17)。
[0139]其它在結(jié)腸中受到人羅斯拜瑞氏菌影響的先天性免疫基因包括抗菌肽Defb37、Pla2g3、Mucl6 和 Itln、以及消化道屏障功能基因 Sprrla、Cldn4、Pmp22、Crb3 和Magi3。響應(yīng)于人羅斯拜瑞氏菌而在回腸中顯示出上調(diào)的先天性免疫基因包括Defcr20、Pcgf2、Ltbp4、Igsf8和Tcfe2a。有趣的是，Pcgf2負(fù)調(diào)節(jié)不同細(xì)胞因子、趨化因子和趨化因子受體的表達(dá)，并且可以在控制消化道組織響應(yīng)于所述共生細(xì)菌的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。有趣的是，發(fā)明人還顯示了人羅斯拜瑞氏菌對(duì)NF-K B通路(G0:0043124)的負(fù)調(diào)節(jié)，其(像多形擬桿菌(B.thetaiotaomicron)那樣(19))可以通過下調(diào)該炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)而有助于免疫穩(wěn)態(tài)。
[0140]由于在單相關(guān)小鼠中對(duì)炎癥通路的控制以及對(duì)Treg誘導(dǎo)的積極效果，使用了IL-10敲除小鼠模型檢測(cè)人羅斯拜瑞氏菌的治療效果。從出生20天斷奶開始對(duì)小鼠施用一周三次(~50 μ 1，IOltlCFU),持續(xù)14周。基因表達(dá)一系列的前炎癥生物標(biāo)記物顯示，與野生型小鼠相比，未經(jīng)處理的IL-10K0小鼠的所有被研究的基因都顯著提高，基因誘導(dǎo)為4-至49-倍(圖6A)。與未經(jīng)處理的小鼠相比，在經(jīng)人羅斯拜瑞氏菌處理的小鼠中，前炎癥基因誘導(dǎo)顯著較低，這表明經(jīng)口施用人羅斯拜瑞氏菌具有強(qiáng)的治療效果。在該研究的最后，與未經(jīng)處理的動(dòng)物相比，經(jīng)人羅斯拜瑞氏菌處理的動(dòng)物的體重也較重，該效果在雄性中具有統(tǒng)計(jì)顯著性(圖6B)。最后，組織學(xué)分析顯示，在未經(jīng)處理的IL-1OKO中，升結(jié)腸中存在幾處炎癥，而經(jīng)人羅斯拜瑞氏菌處理的動(dòng)物具有外觀較健康的結(jié)腸粘膜。
[0141]人羅斯拜瑞氏菌集群影響飽腹感基因和身體構(gòu)成
[0142]還證實(shí)了人羅斯拜瑞氏菌在單相關(guān)小鼠中的重要的代謝活性。在人羅斯拜瑞氏菌集群之后，GO-過程“響應(yīng)于食物的負(fù)調(diào)節(jié)”(G0:0032096)、“食欲的負(fù)調(diào)節(jié)”(G0:0032099)、和“兒茶酚胺分泌的調(diào)節(jié)”(G0:0050433)均在升結(jié)腸中下調(diào)。由該數(shù)據(jù)推斷，人羅斯拜瑞氏菌對(duì)宿主食欲發(fā)揮了刺激作用。參與這些過程的基因?yàn)锳gt、Cartpt, Cck和Cxcll2，倍數(shù)變化為2-至12-倍。特別地，Cck作為饑餓抑制劑在消化和飽腹感中發(fā)揮主要作用。在所述消化道位點(diǎn)Gcg也顯示出下調(diào)。
[0143]為了確定這些基因變化是否與食物攝取和身體構(gòu)成有生理關(guān)聯(lián)性，進(jìn)行了干胴體重和構(gòu)成分析。有趣的是，與GF動(dòng)物相比，人羅斯拜瑞氏菌相關(guān)小鼠的干胴體重顯著較重，并且在第14天，差別最易辨別。進(jìn)一步的胴體脂質(zhì)分析顯示，在第14天，經(jīng)人羅斯拜瑞氏菌處理的動(dòng)物的總脂肪也顯著較高。這些發(fā)現(xiàn)不僅與最近的數(shù)據(jù)一致，其中所述數(shù)據(jù)揭示了厚壁菌通過飲食發(fā)酵在能量采集中的作用，這些發(fā)現(xiàn)還支持消化道細(xì)菌實(shí)際上能夠調(diào)節(jié)腦-消化道軸和食欲調(diào)節(jié)激素的觀點(diǎn)。
[0144]討論
[0145]宿主-微生物互利共生的長(zhǎng)期的共同進(jìn)化可能驅(qū)動(dòng)了消化道中的具有重要功能的細(xì)菌物種的選擇，它們中的大多數(shù)在其它生態(tài)系統(tǒng)中不是高度代表性的。目前，關(guān)于微生物群落中的每個(gè)成員對(duì)腸功能的貢獻(xiàn)，特別是與粘膜免疫系統(tǒng)發(fā)展的關(guān)系，僅有有限的信
肩、O
[0146]最近，利用基于大腸桿菌(E.coli) (HA107)的可逆集群模型的研究證明，對(duì)IgA的免疫誘導(dǎo)作用需要數(shù)量為每克內(nèi)容物約IO8CFU的活細(xì)菌(20)。最近，在小鼠消化道中研究了 SFB和脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)的特定功能,從而確定了它們各自對(duì)T細(xì)胞生物學(xué)的貢獻(xiàn)，并且顯示了這兩種細(xì)菌是Treg和Thl7細(xì)胞的有效誘導(dǎo)物(5，8，9)。雖然已經(jīng)注意到簇XIVa厚壁菌存在于ASF中，而這也會(huì)影響T細(xì)胞分化(10)，但之前沒有報(bào)道過簇XIVa厚壁菌中每個(gè)成員的作用。
[0147]在本文中， 申請(qǐng)人:證明了無菌小鼠消化道與厭氧細(xì)菌人羅斯拜瑞氏菌(其為厚壁菌門的一個(gè)成員)的第一個(gè)成功的單相關(guān)。像羅斯拜瑞氏菌這樣的極度氧敏感細(xì)菌需要嚴(yán)格的厭氧培養(yǎng)技術(shù)，這使得難以進(jìn)行功能表證。 申請(qǐng)人:在無菌小鼠中建立了穩(wěn)定的人羅斯拜瑞氏菌單克隆，并且產(chǎn)生了完整的帶注釋的基因組序列，從而揭示了其代謝組織、生理學(xué)和共生性質(zhì)。發(fā)現(xiàn)人羅斯拜瑞氏菌在集群之后的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)可歸因于宿主消化道環(huán)境和飲食。宿主驅(qū)動(dòng)的作用主導(dǎo)人羅斯拜瑞氏菌在單關(guān)聯(lián)之后的響應(yīng)。這些包括基因傳遞、膜運(yùn)輸、趨化性與移動(dòng)性亞系統(tǒng)。參與代謝傳遞的基因的顯著上調(diào)支持這樣的觀點(diǎn):消化道環(huán)境高度有利于消化道微生物之間的水平基因轉(zhuǎn)移。因此，該環(huán)境可以加速對(duì)細(xì)菌生存、集群和具有重要功能的基因在消化道生態(tài)系統(tǒng)中的散布。
[0148] 對(duì)于病原菌而言，已經(jīng)很好地闡明了移動(dòng)性和鞭毛裝置在宿主集群中的作用，但對(duì)鞭毛蛋白在共生細(xì)菌中的作用還知之甚少。體外實(shí)驗(yàn)揭示了宿主腸環(huán)境對(duì)鞭毛蛋白基因表達(dá)的刺激作用。宿主的TLR5受體感知鞭毛蛋白信號(hào)(24)，并且很多病原鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)引起強(qiáng)烈的前炎癥應(yīng)答(24)。由TLR5介導(dǎo)的響應(yīng)于常駐性有鞭毛共生菌的信號(hào)通路可能對(duì)于體內(nèi)穩(wěn)態(tài)而言是重要的，因?yàn)樵谛∈笾袡z測(cè)到TLR5的刪除會(huì)導(dǎo)致自發(fā)性結(jié)腸炎(25)。因此，人羅斯拜瑞氏菌鞭毛蛋白在體內(nèi)增強(qiáng)的表達(dá)具有潛在價(jià)值。其它的研究顯示，大腸桿菌鞭毛蛋白突變體具有比野生型有鞭毛菌株更好的集群優(yōu)勢(shì)，這可能是由于缺乏由TLR5信號(hào)通路所導(dǎo)致的先天性識(shí)別(26，27)。 申請(qǐng)人:說明了對(duì)于某些厚壁菌，鞭毛蛋白上調(diào)是對(duì)消化道集群的天然響應(yīng)。人羅斯拜瑞氏菌鞭毛蛋白在體內(nèi)維持表達(dá)，并且與持續(xù)的集群、沒有明顯的炎癥和T細(xì)胞擴(kuò)增等調(diào)控型表型存在關(guān)聯(lián)。因此，通過TLR5，共生菌鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)直接免疫耐受性應(yīng)答?；赥LRKO和人羅斯拜瑞氏菌鞭毛蛋白突變體的另外的數(shù)據(jù)將會(huì)進(jìn)一步闡明共生菌鞭毛蛋白在與免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)系中的重要性，雖然其它信號(hào)通路部分(例如丁酸通路)也可以有助于免疫調(diào)節(jié)，但所觀察到的人羅斯拜瑞氏菌在IL-10K0小鼠中的保護(hù)作用支持上述假設(shè)。
[0149]已經(jīng)確定了人羅斯拜瑞氏菌在促進(jìn)小鼠結(jié)腸中的消化道屏障功能和先天性免疫力中的明確作用。緊密連接、間隙連接和粘著連接限制了細(xì)菌移位至上皮下層(28)?？肆_恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎的特征均是失去屏障功能和緊密連接的完整性。有趣的是，IBD中的消化道微生物群生態(tài)失調(diào)與厚壁菌減少有關(guān)(1，29)。有關(guān)人羅斯拜瑞氏菌積極地增強(qiáng)屏障基因的表達(dá)的發(fā)現(xiàn)表明，它們?cè)贗BD患者中的缺失在功能上有重要意義。激活緊密連接復(fù)合物并不是人羅斯拜瑞氏菌特有的，其它的共生菌，例如多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus),也可以增強(qiáng)粘膜屏障功能(18，30)，這暗示了這些細(xì)菌有機(jī)會(huì)成為人IBD的益生菌劑。
[0150]人羅斯拜瑞氏菌對(duì)消化道免疫系統(tǒng)的作用是受人關(guān)注的。注意到最強(qiáng)的作用是在升結(jié)腸中，并且諸如Ly6g6c 等基因被顯著上調(diào)，以及參與T細(xì)胞調(diào)節(jié)和分化的通路和參與免疫突觸上的肌動(dòng)蛋白聚合的通路(它們與T細(xì)胞活化和效應(yīng)子功能有關(guān))也被顯著上調(diào)。雖然Treg基因響應(yīng)于人羅斯拜瑞氏菌集群的表達(dá)不是非常強(qiáng)，但最受影響的T細(xì)胞通路包括與IL-10、IC0S和CTLA-4(它們均與支持Treg的分化有關(guān))有關(guān)的那些通路。重要的是， 申請(qǐng)人:能夠證明在這些小鼠的結(jié)腸中⑶3+FoxP3+細(xì)胞顯著增加。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)能夠驅(qū)動(dòng)Treg分化的其它梭菌物種的最新數(shù)據(jù)進(jìn)行了補(bǔ)充。顯然，人羅斯拜瑞氏菌能夠促進(jìn)粘膜T細(xì)胞擴(kuò)增，并且影響T細(xì)胞分化。
[0151]有趣的是，注意到與回腸相比，在結(jié)腸中具有強(qiáng)的免疫作用，尤其是在用人羅斯拜瑞氏菌進(jìn)行單集群之后的第28天。在第14天的轉(zhuǎn)錄本組數(shù)據(jù)表明，一些免疫引發(fā)是在該時(shí)間點(diǎn)在回腸中得以開始的。因此，在第28天在升結(jié)腸中對(duì)不同T細(xì)胞亞類的作用可以反映細(xì)胞由回腸到腸系膜淋巴結(jié)再到結(jié)腸的運(yùn)輸和歸巢過程。
[0152]人羅斯拜瑞氏菌集群的其它有趣的生物效應(yīng)為調(diào)節(jié)影響對(duì)食物的響應(yīng)的基因，以及控制食欲。特別地，飽腹感激素Cck和Gcg顯著降低。Cck對(duì)食物攝取的作用通過迷走神經(jīng)傳入通路介導(dǎo)。這是主要的神經(jīng)通路，通過該通路，有關(guān)攝取營(yíng)養(yǎng)的信息會(huì)到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而影響消化道功能和進(jìn)食行為。Cck作用于迷走神經(jīng)系統(tǒng)，從而降低刺激食欲和進(jìn)食的分子的表達(dá)，以及增加抑制進(jìn)食和降低食欲的分子的表達(dá)(Npy2i 和Cartpt，在本研究中均下調(diào)兩倍)。到目前為止，沒有報(bào)道Cck、Gcg和共生細(xì)菌之間存在聯(lián)系，然而，脂肪酸和蛋白質(zhì)均為Cck和Gcg的有效誘導(dǎo)物(31)。人羅斯拜瑞氏菌產(chǎn)生短鏈脂肪酸，例如具有少于6個(gè)碳的脂肪族尾巴的丁酸；據(jù)報(bào)道，該代謝活性可降低對(duì)血漿Cck(據(jù)觀察具有較長(zhǎng)鏈的脂肪酸)的刺激作用(32)。有趣的是，胴體重分析顯示，人羅斯拜瑞氏菌存在時(shí)體重和脂質(zhì)含量確實(shí)均顯著增加，這與在常規(guī)化的無菌小鼠中觀察到的體重增加(33)是一致的。由于之前還沒有報(bào)道過Cck和Gcg的參與作用，本研究所發(fā)現(xiàn)的是否對(duì)飽腹感激素的降低有直接的作用還有待觀察。然而，重要的是要認(rèn)識(shí)到，此前已經(jīng)顯示了微生物群集群與從飲食中獲取能量之間的聯(lián)系，其一部分是通過釋放SCFA實(shí)現(xiàn)的(34)?？紤]到人羅斯拜瑞氏菌是主要的丁酸生產(chǎn)者，如用人羅斯拜瑞氏菌處理之后所觀察到的，該機(jī)制可能也有助于代謝效率。
[0153]總而言之，鼠科動(dòng)物消化道與人羅斯拜瑞氏菌之間的單關(guān)聯(lián)導(dǎo)致了顯著的雙向基因表達(dá)事件，這些事件與細(xì)菌的膜運(yùn)輸、此消化道適應(yīng)性細(xì)菌的趨化性與移動(dòng)性、以及所伴隨的宿主的先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的激活等方面的改變是一致的。該代謝活性細(xì)菌還對(duì)食欲和飽腹感基因起到重要的作用，其中所述食欲和飽腹感基因與集群的小鼠的體重增加相關(guān)聯(lián)。[0154]組合物
[0155]本發(fā)明的其它方面涉及包含上文所述的細(xì)菌物種和藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑的組合物。合適的賦形劑、稀釋劑、載體在下文中描述。
[0156]所述組合物可以為任意組合物，但優(yōu)選為可經(jīng)口施用、經(jīng)腸內(nèi)施用或經(jīng)直腸施用的組合物。例如，組合物可以為可食用組合物。“可食用”是指經(jīng)批準(zhǔn)用于人或動(dòng)物消費(fèi)的物質(zhì)。
[0157]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含上文所述的細(xì)菌物種的益生菌劑組合物。
[0158]如本文所用，術(shù)語“益生菌劑”是指對(duì)宿主的健康或康樂具有有益效果的微生物細(xì)胞制備物或微生物細(xì)胞成分。(參見文獻(xiàn)“ Salminen S，OuwehandA.Benno Y.et aI^Probiotics: how should they be defined"Trends Food Sc1.Technol.1999:10107-10”)。
[0159]優(yōu)選地，益生菌劑組合物為具有代謝活性的(即，活的和/或凍干的)、或經(jīng)熱滅活、輻射或被溶解的無生命的益生菌的經(jīng)口施用組合物。益生菌劑組合物可以包含其它成分。本發(fā)明的益生菌劑組合物可以經(jīng)口施用，即，片劑、膠囊或粉末的形式。密封產(chǎn)品對(duì)人羅斯拜瑞氏菌是有利的，因?yàn)槠錇閰捬蹙?。可以包括其它成?例如，如維生素C)作為除氧劑。諸如這樣的益生素基質(zhì)(prebiotic substrate)可改善在體內(nèi)的集群和生存。可供選擇地，本發(fā)明的益生菌劑組合物可以作為食物或營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品(例如基于奶或乳清的發(fā)酵乳制品)經(jīng)口施用，或者作為藥物產(chǎn)品經(jīng)口施用。
[0160]所述益生細(xì)菌的合適的每日計(jì)量為約IxlO3至約IxlO11集落形成單位(CFU)，更優(yōu)選約 IxlO7 至約 IxIOiciCFU,更優(yōu)選約 IxlO6 至約 IxIO10CFU0
[0161]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，相對(duì)于組合物的重量，組合物包含量為約IxlO6至約lxl0nCFU/g，優(yōu)選約IxlO8至約lX101(lCFU/g的所述細(xì)菌物種和/或其細(xì)胞成分作為活性成分。計(jì)量可以為lg、3g、5g和10g。
[0162]通常，益生菌劑任選與至少一種合適的益生素化合物組合。益生素化合物通常為不可消化的碳水化合物，例如寡聚糖或多糖、或糖醇，它們?cè)谏舷艿乐胁粫?huì)被消化或吸收。已知的益生素包括商業(yè)產(chǎn)品，例如菊糖(inulin)和反式低聚半乳糖(transgalacto_oligosaccharides)。
[0163]優(yōu)選地，相對(duì)于組合物的總重量，本發(fā)明的組合物包含量為約I重量％至約30重量％，優(yōu)選5重量％至20重量％的益生素。優(yōu)選的碳水化合物選自:低聚果糖(或F0S)、短鏈低聚果糖、菊糖、低聚異麥芽糖、果膠、低聚木糖(或X0S)、低聚殼聚糖(或COS)、β-葡聚糖、阿拉伯膠改性的抗性淀粉、葡聚糖、D-塔格糖、阿拉伯樹膠纖維、角豆膠、燕麥、和柑橘纖維。特別優(yōu)選的益生素為短鏈低聚果糖(以下簡(jiǎn)稱FOSs-c.c);所述FOSs-c.c為不可消化的碳水化合物，通常通過轉(zhuǎn)化甜菜糖而獲得，其包含蔗糖分子并且該蔗糖分子上連接有三個(gè)葡萄糖分子。
[0164]飼料/產(chǎn)品
[0165]本發(fā)明的又一個(gè)方面涉及包含上文所述的細(xì)菌物種的食物產(chǎn)品、膳食補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)品、營(yíng)養(yǎng)配方、飲料、和藥物，以及它們的應(yīng)用。
[0166]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物還包含至少一種其它種類的其它食品級(jí)細(xì)菌，其中該食品級(jí)細(xì)菌優(yōu)選選自由乳酸菌、雙歧桿菌、丙酸桿菌或其混合物組成的組。
[0167]本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含上述細(xì)菌物種的食品產(chǎn)品，術(shù)語“食品產(chǎn)品”旨在包括所有可以為固體、膠狀或液體的消費(fèi)品。合適的食品產(chǎn)品可以包括例如功能性食品產(chǎn)品、食品組合物、寵物食品、家畜飼料、健康食品、飼料等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，食品產(chǎn)品為健康食品。
[0168]如本文所用，術(shù)語“功能性食品產(chǎn)品”是指不僅能夠?yàn)橄M(fèi)者提供營(yíng)養(yǎng)效果，還能夠提供其它有益效果的食品。因此，功能性食品是具有摻入其中并賦予該食品特定的功能(例如醫(yī)學(xué)或生理學(xué)益處)的組成或成分(例如本文所述的那些)的普通食品，而不是僅具有純粹的營(yíng)養(yǎng)效果。
[0169]可用于本發(fā)明的特定的食品產(chǎn)品的例子包括人類食用的基于奶的產(chǎn)品、即食點(diǎn)心、用于與(例如)奶或水重新組合的粉末、巧克力奶飲料、麥芽飲料、即食小菜、方便小菜或速溶飲料、或?qū)櫸锘蚣倚笫秤玫挠糜谌可攀郴虿糠稚攀车氖澄锝M合物。
[0170]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物為用于人、寵物或家畜的食品產(chǎn)品。所述組合物可以用于選自由狗、貓、豬、牛、馬、山羊、綿羊或家禽組成的組中的動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物為用于成年物種，特別是成年人的食品產(chǎn)品。
[0171]在本發(fā)明中，“基于奶的產(chǎn)品”是指任何具有可變的脂肪含量的液體或半固體的奶或基于乳清的產(chǎn)品?；谀痰漠a(chǎn)品可以為例如未經(jīng)任何加工的牛奶、山羊奶、綿羊奶、脫脂奶、全奶、由奶粉調(diào)配的奶、和乳清，或者可以為經(jīng)加工的產(chǎn)品，例如酸乳酪、凝結(jié)的奶(curdled milk)、凝乳(curd)、酸奶、全脂酸奶、酪乳、和其它酸奶制品。另一個(gè)重要的組包括奶飲料，例如乳清飲料、發(fā)酵乳、煉乳、嬰幼兒奶；增香乳、冰淇淋；含奶食品，例如糖果。
[0172]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含上文所述的細(xì)菌物種的飼料或動(dòng)物飼料。
[0173]本發(fā)明的組合物可以或能夠成為食品補(bǔ)充劑，本文還稱為膳食補(bǔ)充劑或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或食品添加劑。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含一種或多種根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌菌株的膳食補(bǔ)充劑或食品添加劑。
[0174]根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌物種和益生菌劑組合物還可以用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)(例如豬營(yíng)養(yǎng))，特別是用于斷奶早期和生長(zhǎng)育肥期。期望益生菌劑通過(例如)提高飼料轉(zhuǎn)化率而增強(qiáng)免疫功能、降低和防止感染疾病、有利地改變微生物群組成、以及改善動(dòng)物的生長(zhǎng)和性質(zhì)。
[0175]稀釋劑、賦形劑和載體
[0176]如上文所述，本發(fā)明還涉及包含上文所述的細(xì)菌物種的組合物及其應(yīng)用，所述組合物更優(yōu)選藥物組合物或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。細(xì)菌物種通常以與藥學(xué)或營(yíng)養(yǎng)學(xué)可接受的載體、賦形劑或稀釋劑(特別是用于人類治療的)的混合物的形式施用。藥物組合物可以在人類醫(yī)療或獸醫(yī)醫(yī)療中用于人類或動(dòng)物應(yīng)用。
[0177]這種用于本文所述的各種不同形式的藥物組合物的合適的賦形劑的例子可以參見“Handbook of Pharmaceutical Excipients,第二版，(1994), A Wade和PJ Weller 編”。
[0178]在藥學(xué)領(lǐng)域中，用于治療應(yīng)用的可接受的載體或稀釋劑是公知的，例如在“Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack 出版公司(A.R.Gennaro 編.1985)，，中有所描述。
[0179]合適的載體的例子包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露醇、山梨糖醇等。合適的稀釋劑的例子包括乙醇、甘油和水。
[0180]可以根據(jù)想用的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐來選擇藥物載體、賦形劑或稀釋劑的種類。作為載體、賦形劑或稀釋劑，或除了載體、賦形劑或稀釋劑以外，藥物組合物可以包含任何合適的粘結(jié)劑、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑(solubilising agent)。
[0181]合適的粘結(jié)劑的例子 包括淀粉、明膠、諸如葡萄糖、無水乳糖、自由流動(dòng)的乳糖、β -乳糖等天然糖類、玉米甜味劑、諸如阿拉伯樹膠、黃芪膠或海藻酸鈉等天然和合成樹膠、羧甲基纖維素、以及聚乙二醇。
[0182]合適的潤(rùn)滑劑的例子包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉
坐寸ο
[0183]可以在藥物組合物中提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料以及甚至增香劑。防腐劑的例子包括苯甲酸鈉、山梨酸、對(duì)羥基苯甲酸的酯。還可以使用抗氧化劑和懸浮劑。
[0184]營(yíng)養(yǎng)學(xué)可接受的載體、稀釋劑和賦形劑包括適合人或動(dòng)物消耗的那些、以及在食品工業(yè)中用作標(biāo)準(zhǔn)的那些。通常的營(yíng)養(yǎng)學(xué)可接受的載體、稀釋劑和賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
[0185]施用
[0186]本發(fā)明的組合物可以適于經(jīng)口、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道、經(jīng)腸外、肌內(nèi)、覆膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、支氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、口腔或舌下等施用途徑。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物適于經(jīng)口、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道、經(jīng)腸外、鼻內(nèi)、口腔或舌下施用途徑。
[0187]對(duì)于經(jīng)口施用，特別的使用形式由壓制片劑、丸劑、片劑、膠囊劑(gellule)、滴劑、和膠囊組成。
[0188]其它的施用形式包括由無菌或可滅菌溶液制得的溶液或乳液，其可以靜脈注射、動(dòng)脈注射、鞘內(nèi)注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、覆膜內(nèi)注射、或肌內(nèi)注射。本發(fā)明的藥物組合物還可以為栓劑、陰道栓齊?、懸浮劑、乳劑、洗齊?、軟膏、乳膏、凝膠、噴霧齊?、溶液或撲粉的形式。
[0189]使用皮膚襯片進(jìn)行另一種透皮施用的方式。例如，活性成分可以混入由聚乙二醇或液體石蠟的水乳濁液組成的乳膏中。還可以根據(jù)需要將細(xì)菌菌株混入由白蠟或白軟石蠟基與所述穩(wěn)定劑和防腐劑組成的軟膏中。[0190]可以將組合物配制成單劑量的形式，即，配制成包含單劑量(或多個(gè)或部分單劑量)的分離的部分的形式。
[0191]劑量
[0192]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以不需要過度試驗(yàn)而容易地確定一種即食組合物的合適的劑量以施用于被試者。通常，醫(yī)生會(huì)確定對(duì)于單個(gè)患者而言最合適的實(shí)際劑量，這取決于多種因素，包括所采用的特定細(xì)菌菌株的活性、該菌株的代謝穩(wěn)定性和作用時(shí)長(zhǎng)、年齡、體重、總體健康狀況、性別、飲食、施用方式和時(shí)間、排泄率、聯(lián)合用藥、特定條件的嚴(yán)格度、以及經(jīng)歷治療的個(gè)體。本文所公開的劑量是一般案例的典型。當(dāng)然可以有個(gè)別的案例，其中較高或較低的劑量是有利的，這也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0193]在人類中，通常有效的每日劑量為大約IxlO3至大約lxlOnCFU，更優(yōu)選大約IxlO7至大約IxIO11CFU,更加優(yōu)選IxlO6大約至大約1x101ciCFU。
[0194]組合
[0195]在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與一種或多種其它活性劑組合施用。在該情況中，本發(fā)明的組合物可以與一種或多種其它活性劑連續(xù)、同時(shí)或順序施用。
[0196]以以下非限制性例子的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明。
[0197]例子
[0198]材料和方法
[0199]細(xì)菌生長(zhǎng)條件
[0200]人羅斯拜瑞氏菌A2-183T( = DSM16839T = NCIMB14029T)在無氧條件下在合成YCFA或復(fù)合M2GSC培養(yǎng)介質(zhì)上生長(zhǎng)。培養(yǎng)物由冷凍儲(chǔ)存物接種于Hungate管中，并且在37°C下孵育過夜。之后，在MACS-MG-1000無氧工作站(Don Whitley Scientific)中，在80% N2, 10% C02,和10%H2中，在37°C下使細(xì)菌在M2GSC瓊脂平板上生長(zhǎng)48小時(shí)。通過向YCFA培養(yǎng)基中加入0.5% (w/v)的III型來自豬胃的粘蛋白(Sigma-Aldrich)，研究了粘蛋白的作用。對(duì)于無菌小鼠的集群而言，在37°C下、YCFA培養(yǎng)介質(zhì)中使人羅斯拜瑞氏菌生長(zhǎng)過夜。將培養(yǎng)物旋轉(zhuǎn)下來，并且在ImL YCFA培養(yǎng)介質(zhì)中將球團(tuán)重懸，補(bǔ)充2%的半胱氨酸(w/v, Sigma-Aldrich)和 3% 的抗壞血酸(w/v, Sigma-Aldrich)。
[0201]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0202] 在位于朱昂薩斯(Jouy-en-Josas)的INRA無菌嚙齒動(dòng)物繁育基地(法國朱昂薩斯的INRA的Micalis研究院的ANAXEM平臺(tái))中進(jìn)行無菌動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均得到當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)的批準(zhǔn)。將18只無菌C3H/HeN雄性小鼠分成對(duì)照組(N = 8)和處理組(N= 10)，并單獨(dú)關(guān)入塑料隔離器中。用滅菌商購飼料(R03-40;UAR)隨意喂養(yǎng)小鼠。在第O天，通過填喂法給予處理組的動(dòng)物100 μ L人羅斯拜瑞氏菌培養(yǎng)物，并給予對(duì)照組動(dòng)物100 μ L YCFA培養(yǎng)介質(zhì)。在第14天和第28天，處死4只對(duì)照動(dòng)物和5只人羅斯拜瑞氏菌處理的動(dòng)物。在羅維特營(yíng)養(yǎng)和健康研究所(位于英國蘇格蘭的阿伯丁)進(jìn)行C57/BL6IL-10K0實(shí)驗(yàn)。從實(shí)驗(yàn)的開始，對(duì)野生型小鼠(N = 8)、IL-10K0 (N = 12)和IL-10K0+R.hominis (N=11)分析14周。簡(jiǎn)而言之，以109cfu/天的劑量每周施用人羅斯拜瑞氏菌3次。
[0203]將回腸、升結(jié)腸和降結(jié)腸分成4等份，并轉(zhuǎn)移至RNAlater (Ambion)、中性福爾馬林緩沖液(Sigma-Aldrich)或液氮中。將整個(gè)盲腸和橫結(jié)腸轉(zhuǎn)移至RNAlater中。還評(píng)價(jià)了IL-1OKO小鼠的組織病理學(xué)。[0204]組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
[0205]除非特別說明，否則所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑均由Sigma-Aldrich提供。將1.5mL補(bǔ)充有熱滅活胎牛血清(Gibco)、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B和L-谷氨酰胺的DMEM(highglucose, HEPES)培養(yǎng)基中的2xl05Caco_2細(xì)胞或HT29細(xì)胞接種至6孔transwell板(Corning)的上部小室中。下部小室含有3.0mL相同的培養(yǎng)基。在37°C、5% C02環(huán)境中孵育細(xì)胞直到細(xì)胞覆蓋后的第3天，用Hanks’溶液清洗以去除抗生素和FCS，使細(xì)胞在補(bǔ)充有L-谷氨酰胺、亞硒酸鈉和轉(zhuǎn)鐵蛋白的DMEM中下落，持續(xù)24小時(shí)，不使用抗生素。之后在37°C下將transwell插入物(transwell insert)轉(zhuǎn)移至無氧工作站中的無氧培養(yǎng)盒中。各個(gè)插入物的上部小室填滿無氧DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，下部小室填滿充氧DMEM。
[0206]以3，500xg離心5分鐘從而收集指數(shù)生長(zhǎng)期的人羅斯拜瑞氏菌A2-183培養(yǎng)物。將球團(tuán)洗滌并重懸于0.8mL無氧DMEM中。將100微升的細(xì)菌懸浮液(108CFU/mL)加入實(shí)驗(yàn)孔中。在對(duì)照孔中加入相同量的培養(yǎng)基而沒有細(xì)菌細(xì)胞。包含細(xì)菌細(xì)胞的另外的對(duì)照在沒有Caco-2細(xì)胞或HT29細(xì)胞的條件下孵育。
[0207]在2小時(shí)或4小時(shí)的孵育之后，收集細(xì)菌和真核細(xì)胞。將非附著和附著的細(xì)菌吸出并儲(chǔ)存在RNAlater中。通過接種在YCFA平板中來測(cè)試人羅斯拜瑞氏菌的生存力。從孔中收集Caco-2細(xì)胞或HT-29細(xì)胞并且也儲(chǔ)存在RNAlater中。
[0208]人羅斯拜瑞氏菌文庫構(gòu)建
[0209]利用UltraClean?微生物DNA分離試劑盒(Mo Bio Laboratories Inc)分離用于小片段文庫構(gòu)建和焦磷酸測(cè)序的人羅斯拜瑞氏菌染色體DNA，并且利用Wizard基因組DNA純化試劑盒(Promega)分離用于fosmid文庫的高分子量DNA。利用凝膠電泳檢測(cè)DNA的完
整性。
[0210]利用Nebulizer試劑盒(Invitrogen)機(jī)械剪切DNA,并且利用凝膠電泳分級(jí)。將所需大小的DNA片段從凝膠中切割出來，利用Wizard? SV Gel和PCR產(chǎn)物純化系統(tǒng)(Promega)純化。利用DNA終止子末端修復(fù)試劑盒(Lucigen)完成末端修復(fù)。利用CloneSmarUl) LCAmp 試劑盒(Lucigen)克隆 1.5-3.5kb 的片段，并且利用 pJAZZ(S)-OC載體(Lucigen)構(gòu)建4_8kb的文庫。利用CopyControl?Fosmid文庫制備試劑盒(Epicentre Biotechnologies)構(gòu)建 Fosmid 文庫。利用自動(dòng)克隆選擇器(BioRoboticsBioPick, Genomic Solutions)挑選克隆，并且保存在含有70 μ L2xLB培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10%的甘油和相應(yīng)的抗生素)的384孔微量滴定板中。細(xì)胞在37°C下震蕩生長(zhǎng)過夜，并儲(chǔ)存在-80°C下。
[0211]測(cè)序、整合和注釋
[0212]利用I μ L克隆生物質(zhì)和位于pSMART-LCAmp的克隆位點(diǎn)周圍的SLl和SR2引物進(jìn)行PCR,從而產(chǎn)生用于小片段文庫測(cè)序的模板。利用Multiscreen PCR產(chǎn)物純化過濾板(Millipore)純化PCR產(chǎn)物。利用Wizard? SV96質(zhì)粒DNA純化系統(tǒng)(Promega)從
pJ/\Z/:H:M.)(.’克隆中分離重組DNA。利用FosmidMAX?DNA純化試劑盒(Epicentre)分離Fosmid DNA。利用 CEQ8000 (Beckman Coulter)和 ABI3770 (Applied Biosystems) DNA 測(cè)序儀完成對(duì)得自具有不同大小插入片段的R.hominis WGS文庫的DNA片段的末端測(cè)序。還利用454GS20(454Life Sciences)和454FLX測(cè)序儀(Roche)對(duì)人羅斯拜瑞氏菌基因組DNA進(jìn)行了測(cè)序。將 Sanger 和 454 數(shù)據(jù)與 MIRA 版本 3 (http: //chevreux.0rg/pro jects_mira.html ； (35))進(jìn)行了整合。將 RAST 注釋途徑(annotation pipeline) (http: //rast.nmpdr.0rg；(36))用于自動(dòng)和人工基因組注釋、以及比較基因組分析。將人羅斯拜瑞氏菌A2-183的注釋的基因組序列提交給GenBank，登錄號(hào)為CP003040。
[0213]微陣列分析
[0214]細(xì)菌微陣列
[0215]利用RNeasy迷你試劑盒從小鼠盲腸內(nèi)容物中分離細(xì)菌RNA，并進(jìn)一步用MICROBEnr ich? 試劑盒(Ambion)、MICROBExpress? 細(xì)菌 mRNA 富集試劑盒(Ambion)、和MessageAmp?I1-細(xì)菌RNA擴(kuò)增試劑盒(Applied Biosystems)處理。在cDNA合成過程中利用 dCTP_Cy3 或 dCTP_Cy5 標(biāo)記 RNA(CyScribe 第一鏈 cDNA 標(biāo)記試劑盒；Amersham)。利用CyScribe GFX純化試劑盒(Amersham)純化標(biāo)記產(chǎn)物。利用MicroGrid IITAS (BioRobotics)，將從RA8文庫的6000個(gè)克隆中擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物以一式兩份的方式排列在包被有氨基硅烷的顯微鏡玻片(Corning)上。將看家基因rpoD和gyrA的擴(kuò)增片段任意分布在陣列上以作為對(duì)照。在GeneTAC雜交站(Genomic Solutions)中進(jìn)行微陣列雜交。交換染料標(biāo)簽以進(jìn)行第二次雜交，分離的RNA純化物也進(jìn)行了標(biāo)記并且也雜交兩次，以確保再現(xiàn)性以及獲得具有統(tǒng)計(jì)顯著性的結(jié)果。對(duì)于每個(gè)比較，總計(jì)雜交了 4個(gè)玻片，每個(gè)擴(kuò)增的克隆總共12個(gè)雜交點(diǎn)。利用GeneTAC LS IV(Genomic Solutions)和GeneTacIntegrator軟件3.0.1版本，以雙通道測(cè)量了熒光。對(duì)點(diǎn)的強(qiáng)度進(jìn)行了 log變換，并且路易斯歸一化進(jìn)行了局部加權(quán)回歸法(Loess)標(biāo)準(zhǔn)化，以去除探針標(biāo)記和雜交效率中的差異。對(duì)log-比率值使用了單一樣本t-檢驗(yàn)以檢測(cè)差異表達(dá)。當(dāng)倍數(shù)變化>2且P〈0.05時(shí)，認(rèn)為數(shù)據(jù)具有顯著性。
[0216]小鼠微陣列分析
[0217]將回腸和升結(jié)腸組織從RNAlater中移出，并且在Trizol(Invitrogen)中裂解。采用標(biāo)準(zhǔn)氯仿/異丙醇步驟分離RNA。利用RNeasy試劑盒(Qiagen)進(jìn)一步純化總RNA,其包括無RNA酶活性的DNA酶I (RNase-free DNase I) (Qiagen)消化步驟。使用Agilent2100生物分析儀(Agilent Technologies)確定RNA的完整性。利用單循環(huán)革巴標(biāo)標(biāo)記試劑盒(One-Cycle Target Labeling Kit) (Affymetrix)將總 RNA 加工成生物素標(biāo)記的cRNA。在醫(yī)學(xué)科學(xué)微陣列核心設(shè)備學(xué)院(位于英國的阿伯丁大學(xué))，在基因芯片自動(dòng)孵育工作站450 (Affymetrix)上進(jìn)行與基因芯片小鼠基因組陣列(Affymetrix)的雜交。用Affymetrix基因芯片掃描儀3000 (Affymetrix)掃描芯片。利用基因芯片操作軟件(GCOS) (Affymetrix)進(jìn)行圖像質(zhì)量分析。用免費(fèi)開放的軟件包R(http://www.r-project.0rg)和 Bioconductor (http://www.bioconductor.0rg)進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。利用Bioconductor包Iimma提供的適中F-檢驗(yàn),檢測(cè)差異表達(dá)。當(dāng)使用Benjamini和Hochberg錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)方法(Benjamini and Hochberg false discovery method)Ρ〈0.05 時(shí)，認(rèn)為數(shù)據(jù)是顯著的。對(duì)于兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)中的每一個(gè)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將所有差異表達(dá)的基因(Ρ〈0.05)輸入MetaCore分析軟件(GeneGo，St Joseph, Ml)以生成通路圖譜。利用基于常識(shí)的標(biāo)準(zhǔn)通路和內(nèi)源代謝通路進(jìn)行完整通路富集分析。在利用超幾何分布計(jì)算得到的P-值的基礎(chǔ)上，將相關(guān)的完整通路分級(jí)。P-值表示的是，考慮到實(shí)驗(yàn)中的基因數(shù)目對(duì)在圖譜上完整的所有基因集內(nèi)的圖譜中的基因數(shù)目的比值，來自輸入列表的給定數(shù)目的基因與圖譜中的特定數(shù)目的基因偶然相匹配的概率。利用DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov)(其為原始網(wǎng)絡(luò)可用程序的擴(kuò)展版本(37))，進(jìn)行基于數(shù)據(jù)的功能說明的基因本體分析(GO)。
[0218]將顯著不同的轉(zhuǎn)錄本(P〈0.05)劃分到GO類別“生物學(xué)過程”，以揭示對(duì)于特定GO項(xiàng)目而顯著富集的基因表達(dá)模式。將微陣列數(shù)據(jù)提交至美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(登錄號(hào) GSE25544 ；http://www.ncb1.nlm.nih.gov/geo)。
[0219]RT-PCR 分析
[0220]利用在線工具Primer3Plus設(shè)計(jì)細(xì)菌PCR引物(38),并且從Sigma-Aldrich購買。利用 7500 快速實(shí)時(shí)定量 PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems)，用 Power SYBR Green PCRMaster Mix (Applied Biosystems)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。用以下程序進(jìn)行PCR:95°C，一個(gè)循環(huán)，10分鐘；之后95°C，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)15秒；以及60°C，I分鐘；最后進(jìn)行融解步驟。所有樣品一式三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由于GyrA在不同樣品間的差異低，因此將其用作參照基因以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0221]對(duì)于宿主基因表達(dá)，利用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems),用隨機(jī)引物將2 μ g分離自回腸和升結(jié)腸中的真核總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用7500快速實(shí)時(shí)定量 PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems),用 QuantiFast SYBR Green PCR 試劑盒(Qiagen)和QuantiTect Primer Assays (Qiagen)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。以下為PCR循環(huán)條件:95°C,一個(gè)循環(huán)，5分鐘；之后95°C，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)10秒；以及60°C，30秒；最后進(jìn)行融解步驟。所有樣品一式三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由于Hprt在不同樣品間的差異低，因此將其用作參照基因以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。利用學(xué)生t檢驗(yàn)在基數(shù)為2的對(duì)數(shù)級(jí)上分析所有RT-PCR數(shù)據(jù)，使得不等方差的顯著性界限(significance cut-off)為P〈0.05。將差異轉(zhuǎn)換回去以計(jì)算倍數(shù)變化。
[0222]蛋白質(zhì)印記
[0223]按照文獻(xiàn) Duck等(39)中所述的方法制備免疫純化的兔抗人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)Fla2多克隆抗體。簡(jiǎn)而言之，利用于弗氏完全佐劑中的合成多肽免疫新西蘭雌性白兔，并且加強(qiáng)免疫多次。對(duì)于人羅斯拜瑞氏菌Fla2，使用了肽261 - 275 (C-AQYNDDAKSVLEILK-C00H)和肽 58 - 71 (C-GLNKASRNSQDGIS-C0NH2)。在免疫之后，將所述多肽偶聯(lián)至ImL經(jīng)活化的瓊脂糖珠子上，從而制備免疫親和柱，利用該免疫親和柱純化抗體。
[0224]對(duì)于蛋白質(zhì)印記，在含有8M尿素的Iaemmli緩沖液中懸浮升結(jié)腸消化道內(nèi)容物。在相同的緩沖液中稀釋人羅斯拜瑞氏菌生物質(zhì)(陽性對(duì)照)。將30 μ L各樣品上樣至NuPAGE? Novex?* 4-12% Bis-Tris 凝膠(Invitrogen)的孔中，進(jìn)行電泳。之后進(jìn)一步用WesternBreeze化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)系統(tǒng)(Invitrogen)處理。在抗體稀釋劑中將Fla2抗體稀釋為1:1000,并且在4°C下孵育過夜，之后在室溫下與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗兔抗體孵育I小時(shí)。利用Fuji LAS3000圖像系統(tǒng)完成檢測(cè)。
[0225]干體重和脂質(zhì)胴體分析
[0226]將小鼠去除內(nèi)臟的胴體稱重，冷凍干燥至恒重，之后粉碎以進(jìn)行分析。如之前所述的利用氯仿/甲醇(2:lv/v)提取(l:100w/V)以確定脂質(zhì)含量(40)。
[0227]FISH 分析
[0228]利用通用細(xì)菌探針Eub338和新設(shè)計(jì)的人羅斯拜瑞氏菌A2-183特異性探針對(duì)消化道組織切片進(jìn)行FISH分析。[0229]將在中性福爾馬林緩沖液中固定的組織包埋入Technovit8100 (Heraeus Kulzer)中。利用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)(Leica/Reichert Autocut)切割兩微米切片。每張玻片在組織的100 μ m、200 μ m和300 μ m處取三個(gè)切片，使得每個(gè)動(dòng)物取9個(gè)切片。
[0230]通過連續(xù)在50% (v/v)、80%和96%乙醇中孵育來使玻片脫水,在室溫下干燥。所使用的16S rRNA FISH探針為通用細(xì)菌探針Eub338 (GCTGCCTCCCGTAGGAGT ;Cy3)和新設(shè)計(jì)的人羅斯拜瑞氏菌A2-183特異性探針(GTACATTACATACTCTGTCAGTG ；FITC)，已經(jīng)用一系列的腸細(xì)菌分離物廣泛地檢測(cè)了這些探針的特異性。將10微升溶于100 μ L雜交緩沖液中的探針(30ng/yL)應(yīng)用于脫水的樣品，并且在探針的特定溫度下孵育。在50°C下在清洗緩沖液中清洗玻片30分鐘，浸入冰-冷卻的水中以去除殘留的清洗緩沖液，在壓縮空氣流下干燥。用4’，6_ 二脒基-2-苯基Π引哚(DAPI ；Vector Laboratories公司)進(jìn)行復(fù)染色，并且用突光用Vectashield封固劑(Vector Laboratories公司)封固玻片以防止突光衰減。利用Leica DM RBE熒光顯微鏡(Leitz GMBH)使細(xì)菌可視化，并且用Penguin600CL相機(jī)(Pixera)和Viewfinder3.0軟件(Studio Lite)照相。利用復(fù)消色差系統(tǒng)(Leica)恢復(fù)高倍放大圖像(x63)。
[0231]免疫熒光
[0232]在連續(xù)冷凍切片(8 μ m)上進(jìn)行T細(xì)胞標(biāo)記物免疫定位檢測(cè)。在_20°C下在預(yù)冷甲醇中將切片固定 30 分鐘(Ly6G FITC、CD3FITC、CDllbFITC，均為 1:50 (BD Biosciences)),或者，對(duì)于雙標(biāo)記的 FoxP3 (1:500，Abeam)和 CD3FITC (1:100，BD Biosciences)，在 RT 下在I %多聚甲醛(PFA)中固定2分鐘，之后在含0.01% Triton X的PBS中固定3分鐘。用含10%溶于PBS(pH7.4)的相關(guān)預(yù)免疫血清的10% BSA(Sigma)封閉所有切片。在RT下，將經(jīng)甲醇固定的組織與第一抗體孵育I小時(shí)。在4°C下，將經(jīng)PFA固定的切片與抗體孵育過夜。利用Alexa山羊抗兔549 (1:1000,分子探針)使FoxP3可視化。切片用DAPI復(fù)染標(biāo)記，并且用Vectashield(Vector Laboratories)封固。為了對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行定量，利用上述圖像軟件和顯微鏡設(shè)置對(duì)每個(gè)小鼠切片檢驗(yàn)至少5個(gè)視野。
[0233]組織學(xué)
[0234] 在室溫下,將組織樣品在Carnoy固定劑(60% (v/v)乙醇、30% (v/v)氯仿和10%(v/v)冰醋酸)中固定3小時(shí)，同時(shí)不斷攪拌。將樣品轉(zhuǎn)移至70%乙醇中并且保存在室溫下，直到將其定向以進(jìn)行橫向切割并且利用Technovit8100 (Heraeus Kulzer)、根據(jù)制造商的說明將其包埋在冷固化樹脂中。利用Technovit3040 (Heraeus Kulzer)將包埋的組織封固在Histobloc上。利用配有玻璃刀(TAAB Laboratories Equipment公司)的旋轉(zhuǎn)切片機(jī)(Leica Autocut)切割4微米切片。利用標(biāo)準(zhǔn)蘇木精/伊紅方法將組織切片染色，利用配有xlO和x20目鏡的Zeiss Axioskop顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。利用QImaging相機(jī)和Image ProPlus軟件拍攝圖像。
[0235]羅斯拜瑞氏菌相關(guān)物種和菌株的基因組比較
[0236] 申請(qǐng)人:得到了人羅斯拜瑞氏菌A2-183的全基因組序列，其由3，592，125-bp的單一染色體表征。利用RAST平臺(tái)進(jìn)行的自動(dòng)和人工基因組注釋揭示，存在有4個(gè)核糖體操縱子，66個(gè)RNA和3，273個(gè)預(yù)測(cè)蛋白。在圖11_15中分別示出了人羅斯拜瑞氏菌A2-183、食葡糖羅斯拜瑞氏菌DSM16841、腸道羅斯拜瑞氏菌L1-82、腸道羅斯拜瑞氏菌M50/1和直腸真桿菌ATCC33656的亞系統(tǒng)類別分布。[0237]此信息示出了各個(gè)功能性亞系統(tǒng)中的基因數(shù)目(示于括號(hào)中)差異。這些基因在介導(dǎo)宿主對(duì)各個(gè)細(xì)菌的應(yīng)答中非常重要。重要的是，在各菌株之間，這些基因在數(shù)目和功能上均不同。結(jié)果總結(jié)如下:
[0238]人羅斯拜瑞氏菌A2-183
[0239]細(xì)胞壁和莢膜(57)
[0240]膜運(yùn)輸(24)
[0241]移動(dòng)性與趨化性(49)
[0242]調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號(hào)途徑(16)
[0243]休眠和孢子形成(12)
[0244]碳水化合物(271)[0245]直腸真桿菌ATCC33656
[0246]細(xì)胞壁和莢膜(41)
[0247]膜運(yùn)輸(13)
[0248]移動(dòng)性與趨化性(16)
[0249]調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號(hào)途徑(9)
[0250]休眠和孢子形成(6)
[0251]碳水化合物(172)
[0252]腸道羅斯拜瑞氏菌L1-82
[0253]細(xì)胞壁和莢膜(35)
[0254]膜運(yùn)輸(36)
[0255]移動(dòng)性與趨化性(15)
[0256]調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號(hào)途徑(10)
[0257]休眠和孢子形成(17)
[0258]腸道羅斯拜瑞氏菌M50/1
[0259]細(xì)胞壁和莢膜(28)
[0260]膜運(yùn)輸(37)
[0261]移動(dòng)性與趨化性(17)
[0262]調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號(hào)途徑(10)
[0263]休眠和孢子形成(17)
[0264]碳水化合物(201)
[0265]食葡糖羅斯拜瑞氏菌DSM16841
[0266]細(xì)胞壁和莢膜(69)
[0267]膜運(yùn)輸(26)
[0268]移動(dòng)性與趨化性(14)
[0269]調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號(hào)途徑(9)
[0270]休眠和孢子形成(17)
[0271]碳水化合物(160)
[0272]在contigl中發(fā)現(xiàn)的>3000個(gè)基因的序列同一性百分?jǐn)?shù)揭示了人羅斯拜瑞氏菌的細(xì)菌基因組與直腸真桿菌、腸道羅斯拜瑞氏菌和食葡糖羅斯拜瑞氏菌的細(xì)菌基因組之間的不同
[0273]在不同羅斯拜瑞氏菌物種和相關(guān)物種直腸真桿菌(與人羅斯拜瑞氏菌的關(guān)系最近)的基因組之間進(jìn)行比較。
[0274]人羅斯拜瑞氏菌參照基因組585394.12
[0275]直腸真桿菌基因組ATCC336556515619.3
[0276]腸道羅斯拜瑞氏菌基因組L1-82166486.4
[0277]腸道羅斯拜瑞氏菌基因組M50/1166486.5
[0278]食葡糖羅斯拜瑞氏菌DSM16841622312.3
[0279]不同羅斯拜瑞氏菌物種間的潛在基因的同一性百分?jǐn)?shù)為0%至大約90%的序列同一性。很多基因是假定的，并且它們?cè)诰觊g不同。大量的存在于人羅斯拜瑞氏菌基因組中的基因在其它羅斯拜瑞氏菌物種的基因組中是缺失的。
[0280]人羅斯拜瑞氏菌具有924個(gè)在其它羅斯拜瑞氏菌物種的基因組中未發(fā)現(xiàn)的基因(0%的同一性)，這表明人羅斯拜瑞氏菌的25%的基因組是獨(dú)特的。此外，其它基因之間的低的同源性(〈10-70% )表明，很多其 它基因的功能也似乎具有差異。
[0281]所述信息提供了引人注目的證據(jù)，其證明從基因組和功能角度來看，這些細(xì)菌迥然不同，并且除了通過它們的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)聯(lián)性以外，無法將它們分組，所述系統(tǒng)發(fā)生關(guān)聯(lián)性通?；诒Ｊ氐?6S核糖體基因，該基因是一種在所有的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的原核生物DNA的保守片段。16S rRNA基因序列被用于細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)生和分類學(xué)研究(共享的遺傳標(biāo)記)。
[0282]與宿主應(yīng)答和免疫相關(guān)的功能性為細(xì)菌菌株特異的
[0283]圖9示出了來自簇XIVa(厚壁菌門)的三種細(xì)菌菌株的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的比較結(jié)果，所述三種菌株為人羅斯拜瑞氏菌、直腸真桿菌、和腸道羅斯拜瑞氏菌。數(shù)據(jù)顯示了由系統(tǒng)發(fā)生上相關(guān)的細(xì)菌菌株在暴露于人上皮細(xì)胞之后所表達(dá)的獨(dú)特基因的數(shù)目。利用含有56，000種基因的Affymetrix人微陣列確定基因表達(dá)。該差別反映了它們各自的基因組的不同。
[0284]這些實(shí)驗(yàn)與在說明書其它地方所述的利用小鼠微陣列的實(shí)驗(yàn)相似，不同在于使用 T 特定的人微陣列。GeneChip? Human Genome U133Plus2.0Array 是第
一個(gè)且最全面的人類全基因組表達(dá)陣列。Affymetrix GeneChip? Human GenomeU133Plus2.0Array (HG-U133Plus2.0)微陣列包含1，300, 000種獨(dú)特的寡聚核苷酸特征，所述的寡聚核苷酸特征覆蓋了超過47，000種轉(zhuǎn)錄本和變體，所述的轉(zhuǎn)錄本和變體依次代表大約39，000種已被表征的人類基因。用于評(píng)價(jià)由不同共生細(xì)菌誘導(dǎo)的信號(hào)途徑應(yīng)答的細(xì)胞系包括人結(jié)腸細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞和HT-29細(xì)胞、以及細(xì)菌，包括人羅斯拜瑞氏菌、直腸真桿菌和腸道羅斯拜瑞氏菌，它們與腸病原體腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)作為比較。
[0285]簇XIVa細(xì)菌的功能差異_人羅斯拜瑞氏菌與直腸真桿菌之間的比較
[0286]圖10示出了人羅斯拜瑞氏菌可誘導(dǎo)A20( —種具有有效抗炎癥活性的NF-κ B信號(hào)通路負(fù)調(diào)控因子)，而其它細(xì)菌菌株沒有效果。與相關(guān)細(xì)菌直腸真桿菌不同，人羅斯拜瑞氏菌的鞭毛蛋白部分也誘導(dǎo)Α20。
[0287]除非特別說明，否則細(xì)胞培養(yǎng)試劑均由Sigma-Aldrich提供。將培養(yǎng)在補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS) (Gibco,UK),200mM L-谷氨酰胺、和I %抗生素/抗真菌劑的Dulbecco，s Modified Eagle Medium(DMEM)中的 Caco-2 (ECACC Cat N0.860102002)和HT29 (ATCC)細(xì)胞系接種于6孔transwell板(Corning)中。在37°C>5% C02環(huán)境中孵育細(xì)胞直到細(xì)胞覆蓋后的第3天，利用Hanks’溶液清洗以去除抗生素和FCS，使細(xì)胞在補(bǔ)充有L-谷氨酰胺、亞硒酸鈉和轉(zhuǎn)鐵蛋白的DMEM中下落，持續(xù)24小時(shí)，不使用抗生素。之后在37°C下將transwell插入物轉(zhuǎn)移至無氧工作站中的無氧培養(yǎng)盒中。各個(gè)插入物的上部小室填滿無氧DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，下部小室填滿充氧DMEM。
[0288]在指數(shù)生長(zhǎng)期，以3，500xg離心5分鐘，從而收集標(biāo)準(zhǔn)YCFA和M2培養(yǎng)介質(zhì)中的人羅斯拜瑞氏菌A2-183和直腸真桿菌ATCC336556培養(yǎng)物，以及培養(yǎng)在LB液體培養(yǎng)基中的腸炎血清型的腸沙門氏菌(Salmonella enteric serovar enteritidis)。洗漆球團(tuán)并重懸于無氧DMEM中。將100微升的細(xì)菌懸浮液(108CFU/mL)加入實(shí)驗(yàn)孔中。在對(duì)照孔中加入相同量的培養(yǎng)基而沒有細(xì)菌細(xì)胞。在沒有Caco-2細(xì)胞或HT29細(xì)胞的條件下孵育包含細(xì)菌細(xì)胞的另外的對(duì)照。
[0289]在2小時(shí)和4小時(shí)的 孵育之后，收集細(xì)菌和真核細(xì)胞。將非附著和附著的細(xì)菌吸出并儲(chǔ)存在RNAlater中。從孔中收集Caco-2細(xì)胞或HT-29細(xì)胞并且也儲(chǔ)存在RNAlater中。
[0290]用于確定A20熒光素酶基因表達(dá)的熒光素酶檢驗(yàn)
[0291 ] 利用Fugene? 6轉(zhuǎn)染試劑(Roche, UK)，用攜帶有熒光素酶報(bào)告基因和GFP
報(bào)告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞，所述熒光素酶報(bào)告基因在A20啟動(dòng)子pLuc-A20和pLuc-A20 Λ NF- K B (在Α20啟動(dòng)子區(qū)域的3個(gè)核苷酸處發(fā)生突變)的控制下，所述GFP報(bào)告基因在Α20啟動(dòng)子pCAGGS-GFP\A20和pLuc_GL2\NF-κ B的控制下。48小時(shí)之后，用活的人羅斯拜瑞氏菌、直腸真桿菌和腸炎沙門氏菌、以及腸炎沙門氏菌和人羅斯拜瑞氏菌的重組鞭毛蛋白(Flal) (100ng/ml)刺激細(xì)胞，持續(xù)9、12和24小時(shí)。利用克隆至合適的載體中的全長(zhǎng)序列，并且在大腸桿菌JM109、BL21和Rosetta中表達(dá)，從而產(chǎn)生重組鞭毛蛋白。
[0292]利用Dual-Glo?焚光素酶檢驗(yàn)系統(tǒng)(Promega, UK)和Envision2102多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀確定熒光素酶(螢火蟲-f-Luc和海腎-r-Luc)的活性。通過標(biāo)準(zhǔn)化至海腎對(duì)照，獲得了熒光素酶報(bào)告蛋白的相對(duì)活性。
[0293]本發(fā)明所述方面的不脫離本發(fā)明的范圍和精神的各種變型和改變對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。雖然結(jié)合特定的優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解所要求保護(hù)的發(fā)明不應(yīng)被不適當(dāng)?shù)叵薅樗鎏囟ǖ膶?shí)施方案。的確，對(duì)相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，所述實(shí)施本發(fā)明的方式的各種變型旨在包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
[0294]參考文獻(xiàn)
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【權(quán)利要求】
1.一種用于調(diào)節(jié)被試者的免疫系統(tǒng)的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌物種，其用于調(diào)節(jié)被試者的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌物種，其用于調(diào)節(jié)被試者的先天性免疫系統(tǒng)。
4.一種用于保持被試者的免疫穩(wěn)態(tài)的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
5.一種用于治療被試者 的免疫失調(diào)的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)菌物種，其中所述免疫失調(diào)選自潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸袋炎、其它自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)，所述其它自身免疫性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、多發(fā)性硬化，所述變態(tài)反應(yīng)包括乳糜瀉、特異反應(yīng)性皮炎和鼻炎。
7.一種用于治療被試者的失調(diào)的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種,所述失調(diào)選自炎癥性疾病、免疫失調(diào)和腸失調(diào)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)菌物種，其中所述失調(diào)選自腸易激綜合征(IBS)、結(jié)腸炎、炎癥性腸病(IBD)，包括克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸袋炎、功能性消化不良、功能性便秘、功能性腹瀉、功能性腹痛、功能性氣脹病、上腹痛綜合征、餐后不適綜合征、胃食管反流病(GERD)、自身免疫性疾病、特異反應(yīng)性疾病、壞死性小腸結(jié)腸炎、其它感染、以及它們的組合，所述功能性腹瀉包括抗生素相關(guān)腹瀉、旅行者腹瀉和小兒腹瀉，所述自身免疫性疾病例如糖尿病、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化和牛皮癬變態(tài)反應(yīng)，所述特異反應(yīng)性疾病例如特異反應(yīng)性皮炎。
9.一種用于改善被試者的腸道菌群的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
10.一種用于調(diào)節(jié)被試者的食欲的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
11.一種用于促進(jìn)被試者的消化道健康的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
12.一種用于促進(jìn)被試者的免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和免疫耐受性機(jī)制的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)所述的細(xì)菌物種，所述細(xì)菌物種調(diào)節(jié)至少一種轉(zhuǎn)移基因或趨化性基因的誘導(dǎo)和/或表達(dá)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細(xì)菌物種，所述細(xì)菌物種上調(diào)至少一種轉(zhuǎn)移基因或趨化性基因的表達(dá)，并且其中所述基因選自MobA和MobL。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的細(xì)菌物種，所述細(xì)菌物種調(diào)節(jié)選自FlaAl、Fla2、FlaA3和FlaB中的至少一種基因。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的細(xì)菌物種，所述細(xì)菌物種調(diào)節(jié)以下至少一者的表達(dá):乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶、3-羥基酰基輔酶A脫氫酶、丁酰輔酶A脫氫酶、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白β亞基、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白α亞基。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的細(xì)菌物種，所述細(xì)菌物種下調(diào)選自Agt、Cartpt> Cck、Cxcl 12和Gcg中的至少一種基因的表達(dá)。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的細(xì)菌物種，所述細(xì)菌物種激活結(jié)腸或回腸中的至少一種免疫應(yīng)答基因。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的細(xì)菌物種，所述細(xì)菌物種通過調(diào)節(jié)T-細(xì)胞調(diào)節(jié)相關(guān)的基因的誘導(dǎo)和/或表達(dá)而激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的細(xì)菌物種，所述細(xì)菌物種上調(diào)升結(jié)腸中的選自Ly6g6c和Ly6g6e中的至少一種基因的表達(dá)。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的細(xì)菌物種，所述細(xì)菌物種調(diào)節(jié)選自Tlr5、Tlrl> Vnnl> Defb37> Pla2g、Muc 16> ltln、Sprrla> Cldn4、Pmp22、Crb3> Magi3> MarveId3>Mpp7> Defcr20、Pcgf2、Ltbp4、lgsf8 和 Tcfe2a 中的至少一種基因的表達(dá)。
22.人羅斯拜瑞氏菌(Roseburiahominis)細(xì)菌物種用于制備用于調(diào)節(jié)被試者的免疫系統(tǒng)的藥物的應(yīng)用。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的細(xì)菌物種的應(yīng)用，其用于制備用于調(diào)節(jié)被試者的先天性免疫系統(tǒng)的藥物。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的細(xì)菌物種的應(yīng)用，其用于制備用于調(diào)節(jié)被試者的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的藥物。
25.人羅斯拜瑞氏菌(Roseburiahominis)細(xì)菌物種用于制備用于保持被試者的免疫穩(wěn)態(tài)的藥物的應(yīng)用。
26.人羅斯拜瑞氏菌(Roseburiahominis)細(xì)菌物種用于制備用于治療被試者的免疫失調(diào)的藥物的應(yīng)用。
27.一種調(diào)節(jié)被試者的免疫系統(tǒng)的方法，所述方法包括對(duì)所述被試者施用包含人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種的組合物。
28.一種激活被試者的先天性免疫系統(tǒng)的方法，所述方法包括對(duì)所述被試者施用包含人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種的組合物。
29.一種激活被試者的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的方法，所述方法包括對(duì)所述被試者施用包含人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種的組合物。
30.一種治 療被試者的免疫失調(diào)的方法，所述方法包括對(duì)所述被試者施用藥學(xué)有效量的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
31.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任意一項(xiàng)所述的細(xì)菌物種，或者根據(jù)權(quán)利要求27至30中任意一項(xiàng)所述的方法，或者根據(jù)權(quán)利要求22至26中任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述被試者為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人。
32.—種用于醫(yī)藥的人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
33.一種藥物組合物,其包含人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種和藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
34.—種營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑,其包含人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種和營(yíng)養(yǎng)學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
35.一種益生菌劑組合物,其包含人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
36.一種飼料、食品產(chǎn)品、膳食補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或食品添加劑，其包含人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種。
37.一種制備根據(jù)權(quán)利要求32所述的藥物組合物的方法，所述方法包括將人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)細(xì)菌物種與藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑混合。
38.一種制備根據(jù)權(quán)利要求33所述的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的方法，所述方法包括將人羅斯拜瑞氏菌(Rosebur ia hominis)細(xì)菌物種與營(yíng)養(yǎng)學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑混合。
【文檔編號(hào)】A61K35/74GK103930117SQ201280054515
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2012年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月7日
【發(fā)明者】丹尼絲·凱利 申請(qǐng)人:Gt生物制劑有限公司