納米乳液呼吸道合胞病毒(rsv)亞單位疫苗的制作方法
【專利摘要】本申請涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及呼吸道合胞病毒(RSV)表面蛋白的疫苗組合物，融合物(F)和糖蛋白(G)蛋白質(zhì)亞單位疫苗，優(yōu)選與免疫細(xì)胞靶向和增強(qiáng)物——納米乳液混合，以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答和避免疫苗疫苗引起的疾病加重。
【專利說明】納米乳液呼吸道合胞病毒（RSV)亞單位疫苗
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請要求美國臨時(shí)申請?zhí)?1/533, 062--2011年9月9日提交--的權(quán)益，其 通過引用被具體并入。
[0003] 本申請的領(lǐng)域
[0004] 本申請涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，尤其地，涉及納米乳液呼吸道合胞病毒（RSV)疫苗組合 物，其包括與納米乳液佐劑組合的至少一種RSV免疫原。RSV免疫原可以是任意合適的RSV 抗原，諸如RSV表面蛋白質(zhì)、融合物（F)和糖蛋白（G)蛋白質(zhì)，以形成亞單位疫苗。納米乳 液RSV疫苗引起保護(hù)性免疫應(yīng)答并且避免疫苗引起的疾病加重。
[0005] 發(fā)明的背景
[0006] 呼吸道合胞病毒（RSV)是世界范圍內(nèi)幼兒和老人中嚴(yán)重呼吸疾病的主要原因，并 且，沒有疫苗可對抗該病原體。人呼吸道合胞病毒（HRSV)是嬰兒急性下呼吸道疾病的最常 見病原，并且，在一生中可導(dǎo)致反復(fù)感染。其被歸于副黏液病毒科（paramyxoviridae)肺病 毒（pneumovirus)屬。如該科中的其他成員一樣，HRSV具有兩種主要的表面糖蛋白（G和 F)，其在感染周期的初始階段發(fā)揮重要作用。G蛋白介導(dǎo)病毒到細(xì)胞表面受體的附著，而F 蛋白促進(jìn)病毒和細(xì)胞膜的融合，使得病毒核糖核蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。
[0007] 呼吸道合胞病毒（RSV)感染常常導(dǎo)致細(xì)支氣管炎，并且是發(fā)達(dá)國家中嬰兒住院的 主要原因。另外，RSV日益被描述為老年患者、移植患者和慢性阻塞性肺疾?。–0PD)患者 中的主要病原體（Hacking and Hull，2002)。開發(fā)安全和免疫原性疫苗以解決嬰兒和老年 群體展現(xiàn)出獨(dú)特的時(shí)機(jī)。
[0008] 之前的疫苗制劑的病毒滅活方法諸如甲醛導(dǎo)致肺疾病加重和死亡率增加。對于 病毒疫苗開發(fā)以解決RSV的廣泛研究已經(jīng)取得有限的成功。RSV疫苗開發(fā)的一些主要挑戰(zhàn) 包括，感染的早期、先天免疫逃避、不引起預(yù)防感染的免疫性的自然感染失敗和與疫苗穩(wěn)定 性、純度、再現(xiàn)性和效價(jià)有關(guān)問題有關(guān)聯(lián)的疫苗-加重疾病的證明（Graham, 2011 ;Swanson and Settembre，2011)〇
[0009] 方法已經(jīng)包括用福爾馬林滅活病毒和在感染RSV時(shí)證明疫苗引起的疾病加重。如 下的觀察對于產(chǎn)生中和抗體是必要的：福爾馬林滅活的疫苗已經(jīng)顯示疾病加重，包括顯示 對于預(yù)防加重重要的偏移的免疫應(yīng)答對于保護(hù)性免疫應(yīng)答和使F蛋白質(zhì)處于其原始狀態(tài) 以維持構(gòu)象表位是必要的（Krujigen，2011 ;Swanson2011 ;McLellan等，2011)。對于福 爾馬林-滅活的RSV疫苗疾病加重不歸因于G蛋白質(zhì)和G蛋白質(zhì)抗體可降低病毒滴度和 實(shí)際上保護(hù)免受疾病加重的證明表明，G蛋白質(zhì)可被并入到候選疫苗中（Radu等，2010 ; Haynes等，2009 Johnson等，2004)。減毒活疫苗的應(yīng)用已經(jīng)取得有限的成功，因?yàn)橐呀?jīng) 顯示疫苗是最低免疫原性的（Gomez等2009)。重組病毒表達(dá)的F和G蛋白質(zhì)疫苗的應(yīng)用 顯示與下列有關(guān)的免疫原性降低：低抗原表達(dá)水平、瞬時(shí)表達(dá)水平、細(xì)胞特異性和對于純化 F蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上可以是不成熟的并且不是引起中和抗體的適當(dāng)形式的證明（Singh and Dennis，2007 ;Kim等，2010)。在應(yīng)用亞單位疫苗時(shí)，具有最佳F蛋白質(zhì)水平對于引起適當(dāng) 的免疫應(yīng)答是至關(guān)重要的，因?yàn)閬唵挝灰呙缫呀?jīng)通過F和G蛋白質(zhì)的低效和不適當(dāng)表達(dá)而 被阻止（Nallet等，2009;Huang and Lawlor2010)。對于含有F蛋白質(zhì)、甚至還有佐劑的 亞單位疫苗不是完全保護(hù)性的和最佳的觀察（Langley等，2009)表明，病毒體內(nèi)F蛋白質(zhì) 以其初始狀態(tài)的呈遞對于用作疫苗是重要的。
[0010] 與納米乳液有關(guān)的之前的教導(dǎo)描述在美國專利號6, 015, 832中，該專利涉及滅 活革蘭氏陽性細(xì)菌、細(xì)菌芽孢或革蘭氏陰性細(xì)菌的方法。該方法包括使革蘭氏陽性細(xì)菌、 細(xì)菌芽孢或革蘭氏陰性細(xì)菌與滅活細(xì)菌的（或滅活細(xì)菌芽孢的）乳液接觸。美國專利 號6, 506, 803涉及利用乳液殺死或中和人體上或人體中的微生物劑（例如，細(xì)菌、病毒、 孢子、真菌的方法。美國專利號6, 559, 189涉及凈化樣品（人、動(dòng)物、食品、醫(yī)療器械等） 的方法，包括使樣品與納米乳液接觸。納米乳液在與細(xì)菌、病毒、真菌、原生動(dòng)物或孢子 接觸時(shí)殺死病原體或使病原體失去能力。抗微生物納米乳液包括季銨化合物、乙醇/甘 油/PEG之一和表面活性劑。美國專利號6, 635, 676涉及兩種不同的組合物和通過用任 一組合物處理樣品而凈化樣品的方法。組合物1包括乳液，其是抵抗細(xì)菌、病毒、真菌、 原生動(dòng)物和孢子的抗微生物乳液。乳液包括油和季銨化合物。美國專利號7, 314, 624涉 及引起對免疫原的免疫應(yīng)答的方法，包括用免疫原和納米乳液的組合通過黏膜表面處理 對象。納米乳液包括油、乙醇、表面活性劑、季銨化合物和蒸餾水。US-2005-0208083和 US-2006-0251684涉及納米乳液，其含具有優(yōu)選尺寸的小滴。US-2007-0054834涉及包 括季銨鹵化物的組合物和利用其治療感染狀況的方法。季銨化合物可被提供作為乳液 的部分。US-2007-0036831和US2011-0200657涉及納米乳液，其包括抗炎劑。描述納米 乳液的其它出版物包括美國專利號8,226,965，"Methods of treating fungal, yeast and mold infections" ；US2009-0269394, "Methods and compositions for treating onychomycosis" ；US2010_0075914, "Methods for treating herpes virus infections"； US2010-0092526,"Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of using the same，';US2010_0226983,"Compositions for treatment and prevention of acne, methods of making the compositions, and methods of use thereof" ；US2012_0171249, "Compositions for inactivating pathogenic microorganisms, methods of making the compositions, and methods of use thereof"；和 US2012-0064136, "Anti-aging and wrinkle treatment methods using nanoemulsion compositions，'。然而，這些參考文獻(xiàn) 均未教導(dǎo)本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒。
[0011] 尤其地，美國專利號7, 314, 624描述納米乳液疫苗。然而，該參考文獻(xiàn)沒有教導(dǎo)利 用本發(fā)明的免疫原引起對RSV的保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力。
[0012] 涉及疫苗的現(xiàn)有技術(shù)包括，例如美國專利號7,731，967，"Composition for inducing immune response"（Novartis)，其描述抗原/佐劑復(fù)合物-包括至少兩種佐 齊1|。美國專利號 7,357,936，"4(1加￥31^85^七61118 311(1￥3(^；[1168"(631()，描述佐劑和抗原的 組合。美國專利號 7, 323, 182, "Oil in water emulsion containing saponins，'（GSK)， 描述疫苗組合物和油/水制劑。美國專利號6, 867, 000, "Method of enhancing immune response to herpes"（Wyeth),描述病毒抗原和細(xì)胞因子（IL12)的組合。美國專利號 6, 623, 739、6, 372, 227 和 6, 146, 632,名稱均為 "Vaccines"（GSK)，涉及包括抗原和 / 或抗 原組合物的免疫原性組合物和由可代謝的油和水包油乳液形式的α生育酚組成的佐劑。 美國專利號 6, 451，325, "Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion"（Chiron),涉及佐劑組合物，包括可代謝的油、乳化劑和抗原物質(zhì),其中油和乳化 劑以水包油乳液的形式存在。佐劑組合物不含有任何聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物；和 抗原物質(zhì)不存在于佐劑組合物的內(nèi)相中。最后，US20040151734, "Vaccine and method of use"（GSK)，描述治療患有或容易患有一種或多種性傳播疾?。⊿TDs)的女性對象的方法。 該方法包括給需要的女性對象施用有效量的疫苗制劑，該制劑包括一種或多種抗原，所述 抗原源自或結(jié)合導(dǎo)致STD的病原體和佐劑。
[0013] 在本領(lǐng)域中對于有效的RSV疫苗及其制造和應(yīng)用方法仍存在需要。本發(fā)明滿足這 些需要。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 本發(fā)明提供通過組合至少一種關(guān)鍵免疫原性病毒表面抗原例如F和G蛋白質(zhì)或其 抗原片段與遞送型和免疫增強(qiáng)型水包油納米乳液而遞送和引起針對RSV感染的保護(hù)性免 疫應(yīng)答的新方法。例如，本發(fā)明納米乳液RSV亞單位疫苗引起Thl免疫應(yīng)答、Th2免疫應(yīng)答、 Th 17免疫應(yīng)答、或其任意組合。
[0016] 納米乳液RSV亞單位疫苗包括至少一種RSV免疫原，其是RSV F蛋白質(zhì)、RSV G蛋 白質(zhì)、RSV F蛋白質(zhì)的免疫原性片段、RSV G蛋白質(zhì)的免疫原性片段、或其任意組合。另外， 納米乳液RSV亞單位疫苗包括平均直徑小于約lOOOnm的小滴。存在于RSV亞單位疫苗中 的納米乳液包括：(a)含水相，（b)至少一種油，（c)至少一種表面活性劑，（d)至少一種有 機(jī)溶劑，和（e)任選地至少一種螯合劑。優(yōu)選地，RSV免疫原存在于納米乳液小滴中。在另 外的實(shí)施方式中，納米乳液RSV疫苗可經(jīng)鼻內(nèi)施用。在本發(fā)明再另外的實(shí)施方式中，納米乳 液RSV疫苗不含有機(jī)溶劑。而且，另外的佐劑可加入至納米乳液RSV疫苗。
[0017] 在本發(fā)明的另外實(shí)施方式中，RSV病毒體顆粒還存在于納米乳液RSV亞單位疫苗 中。優(yōu)選地，RSV病毒體顆粒存在于納米乳液小滴中。RSV病毒體顆?？山?jīng)納米乳液滅活。 在一個(gè)實(shí)施方式中，RSV病毒基因組包括至少一個(gè)減毒突變。
[0018] 納米乳液RSV亞單位疫苗可被配制成任何藥學(xué)上可接受的劑型，諸如液體分散 體、凝膠、氣溶膠、肺氣溶膠、鼻氣溶膠、軟膏、霜或固體劑型。
[0019] RSV表面抗原和/或RSV病毒體顆?？蓙碜匀我釸SV毒株。在一個(gè)實(shí)施方式中， RSV表面抗原和/或RSV病毒體顆粒源自呼吸道合胞病毒（RSV)毒株L19 (RSV-L19)。在另 外的實(shí)施方式中，RSV-L19病毒是與病毒顆粒結(jié)合的融合物（F)和糖蛋白（G)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì) 的超級生產(chǎn)者。在再另外的實(shí)施方式中，RSV-L19病毒是減毒的人呼吸道合胞病毒（HRSV) 毒株L19。在一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗組合物包括人呼吸道合胞病毒，其以HRSV-L19保藏在美 國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方式中，RSV表面抗原還包括至少一種指不減毒表型的核苷酸修飾。在 另外的實(shí)施方式中，RSV表面抗原或其抗原片段存在于融合蛋白質(zhì)中。RSV表面抗原可以是 RSV F蛋白質(zhì)的肽片段、RSV G蛋白質(zhì)的肽片段、或其任意組合。另外，RSV表面抗原可以是 多價(jià)的。
[0021] 在本發(fā)明的另外實(shí)施方式中，提供制備免疫原性制劑的方法，由此RSV毒株，諸如 HRSV-L19,通過導(dǎo)致減毒表型的減毒突變和缺失被遺傳工程化。所得減毒RSV病毒在適當(dāng) 的細(xì)胞系中培養(yǎng)和收獲。然后，純化收獲的病毒去除細(xì)胞和血清成分。然后，純化病毒混合 在可接受的制藥學(xué)載體中用于疫苗組合物。因此，描述的是這樣的疫苗組合物，其包括包含 至少一個(gè)減毒突變的RSV病毒基因組（諸如RSV毒株L19)，優(yōu)選與以下物質(zhì)組合：F蛋白 質(zhì)、G蛋白質(zhì)、F和/或G蛋白質(zhì)的抗原片段、或其任意組合。在再另外的實(shí)施方式中，疫苗 組合物包括RSV病毒基因組（諸如RSV毒株L19)，其包含指示減毒表型的核苷酸修飾。
[0022] 在本發(fā)明的另外實(shí)施方式中，疫苗組合物對于對象不是全身毒性的，并且在施用 后產(chǎn)生最小炎癥或不產(chǎn)生炎癥。在另外的實(shí)施方式中，對象在單一施用疫苗后經(jīng)歷血清轉(zhuǎn) 換。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方式中，描述的是增強(qiáng)對人呼吸道合胞病毒感染的免疫性的方法，包 括給對象施用納米乳液制劑--其包括RSV F和/或G蛋白質(zhì)和/或其抗原片段。本發(fā)明 的另外實(shí)施方式涉及引起針對由人呼吸道合胞病毒引起的疾病增強(qiáng)的免疫性的方法，包括 給對象使用有效量的本發(fā)明疫苗組合物的步驟。在一些實(shí)施方式中，對象在至少單一施用 納米乳液RSV疫苗后可產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。另外，免疫應(yīng)答針對一種或多種RSV毒株可 以是保護(hù)性的。對HRSV增強(qiáng)的免疫性的誘導(dǎo)取決于最佳水平抗原的存在。而且，對抗原臨 界水平的鑒定對于提供有力的免疫應(yīng)答是重要的。對于RSV F蛋白質(zhì)水平與中和抗體的存 在和持續(xù)以及針對病毒攻擊的保護(hù)直接相關(guān)的證明，表明使產(chǎn)生最佳水平的關(guān)鍵免疫原性 F蛋白質(zhì)的病毒毒株以其自然方向表達(dá)對于用作候選疫苗是基本的。
[0024] 在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中，RSV F和/或G蛋白質(zhì)和/或其抗原片段和/或 RSV病毒體顆粒被滅活，并輔助以納米乳液制劑，以提供非感染性并且免疫原性病毒制劑。 納米乳液與候選疫苗的簡單混合已經(jīng)被顯示同時(shí)產(chǎn)生黏膜和系統(tǒng)性免疫應(yīng)答。RSV病毒體 顆粒與納米乳液的混合導(dǎo)致小滴的油核心中離散的抗原顆粒。抗原并入核心中，這使其處 于促進(jìn)正常抗原構(gòu)象的自由形式。
[0025] RSV疫苗可被配制為液體分散體、凝膠、氣溶膠、肺氣溶膠、鼻氣溶膠、軟膏、霜或固 體劑型。另外，RSV疫苗可經(jīng)任意藥學(xué)上可接受的方法施用，諸如腸胃外、經(jīng)口、經(jīng)鼻內(nèi)或經(jīng) 直腸。腸胃外施用可通過皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)注射進(jìn)行。
[0026] 在本發(fā)明的另外實(shí)施方式中，納米乳液RSV疫苗組合物包括（a)至少一種陽離子 表面活性劑和至少一種非陽離子表面活性劑；(b)至少一種陽離子表面活性劑和至少一種 非陽離子表面活性劑，其中非陽離子表面活性劑是非離子表面活性劑；（c)至少一種陽離 子表面活性劑和至少一種非陽離子表面活性劑，其中非陽離子表面活性劑是聚山梨醇酯非 離子表面活性劑、波洛沙姆非離子表面活性劑、或其組合；（d)至少一種陽離子表面活性劑 和至少一種非離子表面活性劑，其是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、波洛沙姆188、波洛沙 姆407、或其組合；(e)至少一種陽離子表面活性劑和至少一種非離子表面活性劑，其是聚 山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、波洛沙姆188、波洛沙姆407、或其組合，并且其中非離子表 面活性劑以約0.01%至約5.0%、或以約0. 1%至約3%存在；（e)至少一種陽離子表面活 性劑和至少一種非陽離子表面活性劑，其中非陽離子表面活性劑是非離子表面活性劑，并 且非離子表面活性劑以約〇. 05%至約10%、約0. 05%至約7. 0%、約0. 1 %至約7%或約 0.5%至約4%的濃度存在；（f)至少一種陽離子表面活性劑和至少一種非離子表面活性 齊?，其中陽離子表面活性劑以約0.05%至約2%或約0.01%至約2%的濃度存在；或（g)其 任意組合。
[0027] 在本發(fā)明再另外的實(shí)施方式中，RSV疫苗包括低分子量脫乙酰殼多糖、中分子量脫 乙酰殼多糖、高分子量脫乙酰殼多糖、葡聚糖、或其任意組合。低分子量脫乙酰殼多糖、中分 子量脫乙酰殼多糖、高分子量脫乙酰殼多糖、葡聚糖、或其任意組合可存在于納米乳液中。
[0028] 上面的一般性描述和下面對附圖的簡述以及詳細(xì)描述均是示例性的和說明性的， 并意圖對所要求保護(hù)的發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。其它目標(biāo)、優(yōu)勢和新特征通過以下對本發(fā) 明的詳細(xì)描述對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。 附圖簡介
[0029] 圖1:顯示具有和不具有30 μ g總HA的20% W8Q5EC NE的TEM橫截面圖。右邊的 圖圖示HA抗原位于油小滴中。染成深色的抗原位于NE顆粒外面。
[0030] 圖2 :顯示用RSV免疫的BALB/c小鼠血清中RSV特異性IgG的終點(diǎn)滴度。僅用 20% W8(I5EC混合F-蛋白質(zhì)免疫的組響應(yīng)接種。條表示組平均水平。
[0031] 圖3 :顯示用NE+Fptn免疫的BALB/c小鼠血清中RSV特異性IgGl⑷、IgG2a(B)、 IgG2b(C)和IgE(D)的終點(diǎn)滴度。血清在第二次免疫后兩周獲得。
[0032] 圖4 :顯示用納米乳液（NE)-F-蛋白質(zhì)接種小鼠的結(jié)果在經(jīng)活RSV鼻內(nèi)攻擊后減 輕疾病。免疫的小鼠經(jīng)鼻內(nèi)（i. η.)接種兩次--在第0和28天--以NE+F-蛋白質(zhì)、單獨(dú) 的F-蛋白質(zhì)，或僅以PBS進(jìn)行處理。對照和接種的小鼠在通過105PFU活RSV加強(qiáng)（i. η.) 后兩周被攻擊。病毒轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)在感染后第八天通過肺RNA的QPCR測定。
[0033] 圖5 :顯示與未接種小鼠相比時(shí)，納米乳液（NE)-RSV免疫不促進(jìn)免疫強(qiáng)化。如下 所述用NE-RSV接種小鼠。對照和接種的小鼠在第56天被攻擊。氣道高反應(yīng)性在攻擊后第 八天經(jīng)體積描述法評估。柱表示在單一、最優(yōu)的靜脈內(nèi)劑量的乙酰甲基膽堿之后氣道阻力 的增加。
[0034] 圖6 :顯示納米乳液（NE)+F_蛋白質(zhì)接種的小鼠中炎癥和黏液產(chǎn)生與對照并無不 同。（A)描述在感染后第八天RSV感染的對照和NE+F-蛋白質(zhì)接種的小鼠的代表性組織學(xué) (過碘酸希夫，PAS;蘇木精和曙紅，H&E)。嗜伊紅粒細(xì)胞不存在。在（B)中，Muc5ac和Gob5 的表達(dá)在感染后第八天經(jīng)肺RNA的QPCR評估。
[0035] 圖7 :顯示納米乳液（NE) +F-蛋白質(zhì)接種促進(jìn)混合的Thl和Th2應(yīng)答。小鼠被接 種NE+F-蛋白質(zhì)、單獨(dú)的F-蛋白質(zhì)，如下所述，并被活RSV攻擊。在（A)中，IL-12(p40)和 (B)IL-17細(xì)胞因子的表達(dá)由肺RNA經(jīng)QPCR評估。在（C)中，肺相關(guān)淋巴結(jié)（LALN)細(xì)胞懸 浮液用RSV(M0I，0. 5)再刺激。收集上清液用于分析Bioplex，以分析每個(gè)樣品中細(xì)胞因子 產(chǎn)量。
[0036] 圖8 :顯示F蛋白質(zhì)單位，其在通過以下各種制劑施用/免疫后被測量：（1) 4. 5 μ g F 蛋白質(zhì)；（2)2.5^ F 蛋白質(zhì)；（3)5.5yL RSV/β-丙酸內(nèi)酯（β-PL) ;(4)5·6μ? RSV; (5)0.5yg F/5.6yL RSV;(6)lyg F/5.6yL RSV/β-丙酸內(nèi)酯（β-PL);和（7)2.5yg F/5. 6μ L RSV〇
[0037] 圖9 :顯示在僅經(jīng)（1)F蛋白；僅經(jīng)（2)RSV病毒；和經(jīng)（3)RSV病毒+F蛋白質(zhì)免疫 后，肺中11-4、11^-5、幾-13、正^^、11^-17六和6(*5的1111?隱表達(dá)。
[0038] 圖10 :顯示被免疫和攻擊的小鼠的組織學(xué)檢查。圖10A顯示初始RSV感染的組織 學(xué)檢查；圖10B顯示RSV-NE免疫動(dòng)物的組織學(xué)檢查；圖10C顯示F蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物的組織 學(xué)檢查；和圖10D顯示RSV+F蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物的組織學(xué)檢查。
[0039] 圖11 :顯示通過L19和A2的HRSV感染的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物（SDS處理的）的SDSPAGE。
[0040] 圖12 :顯示RSV毒株L19和RSV毒株A2HRSV細(xì)胞溶胞產(chǎn)物（細(xì)胞&上清液）的 SDS-PAGE。
[0041] 圖13 :顯示HRSV毒株L19和毒株A2純化病毒的SDS PAGE。
[0042] 圖14:顯示HRSV毒株L19和毒株A2F的蛋白質(zhì)印跡和病毒感染后24小時(shí)的G蛋 白質(zhì)表達(dá)。
[0043] 圖15 :通過蛋白質(zhì)印跡評估顯示病毒滅活，其中泳道含有：（1)W8Q5EC(泳道1)，（2) W8(l5EC+0. 03 % B1，3葡聚糖（泳道2)，（3) W8Q5EC+0. 3 %脫乙酰殼多糖（中分子量）+乙酸（泳 道 3)，（4) W8Q5EC+0. 3 % P407 (泳道 4)，（5) W8Q5EC+0. 3 % 脫乙酰殼多糖（低分子量）+0· 1 % 乙酸（泳道5)，（6)僅介質(zhì)（泳道6) ; (7) β PL -滅活的病毒（泳道7)和（8) L19陽性對照 (泳道9)。
[0044] 圖16 :顯示利用抗-RSV抗體（抗-G)進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析；L19病毒4X106PFU/ 泳道、2 X 106PFU/泳道和1 X 106PFU/泳道+/- β PL滅活組合W8(i5EC，如所指示。在開始時(shí) (圖8A)或14天后在4°C或室溫（RT)(圖8B)下分析樣本。麗=分子量。
[0045] 圖17 :顯不在用具有和不具有脫乙醜殼多糖的不同納米乳液制劑IM接種的小鼠 中接種后第三周的免疫應(yīng)答（IgG，yg/ml) :(1)RSV毒株L19+2. 5%W8Q5EC+0. 1%低分子 量脫乙酰殼多糖；（2) RSV 毒株 L19+5 % W8Q5EC ; (3) RSV 毒株 L19+2. 5 % W8Q5EC ; (4) RSV 毒株 L19+β PL滅活的病毒；和（5)未接種小鼠（沒有疫苗）。
[0046] 圖18 :顯示接種時(shí)間表，用于在棉鼠中評估兩種納米乳液-輔助的疫苗（實(shí)施例 13)。評估的兩種制劑包括W8(I5EC和W 8(IP1885EC (1:1:5)(見下面表5和6)。棉鼠接收兩種劑量 的30μ 1 IN的納米乳液-輔助的疫苗，其含有6.6yg F-ptn。它們在23周時(shí)被5X105pfu RSV毒株A2攻擊。一半動(dòng)物在第4天被處死，而另一半在第8天被處死。
[0047] 圖19 :顯示棉鼠中W8QP1885EC納米乳液滅活的RSV疫苗的免疫原性研究的結(jié)果。 在左圖中，Y軸顯示特異性抗體對F蛋白質(zhì)的終點(diǎn)滴度，和X軸以周為單位顯示時(shí)間段。在 右圖中，Y-軸顯示血清抗體水平，為yg/ml，和X-軸以周為單位顯示時(shí)間段。D4和08顯 示攻擊后血清中的抗體水平。
[0048] 圖20 :顯示棉鼠中W8(I5EC納米乳液滅活的RSV疫苗的免疫原性研究的結(jié)果。Y軸 顯示特異性抗體對F蛋白質(zhì)的終點(diǎn)滴度，和X軸以周為單位顯示時(shí)間段。
[0049] 圖21 :顯示棉鼠中RSV中和的免疫原性。棉鼠被經(jīng)鼻內(nèi)接種30μ 1疫苗，在4周 時(shí)加強(qiáng)和在〇、4、6和8周時(shí)抽血。研究組包括兩組，其接收混合以1.6X105PFURSV毒株 L19-含 3· 3μ g F 蛋白質(zhì)（η = 8)-或 3· 2 X 105PFU RSV 毒株 L19-含 6· 6 μ g F 蛋 白質(zhì)（n = 8)20%W8Q5EC納米乳液，以及這樣的兩組，其接收混合以1.6X105PFU RSV毒株 L19-含 3· 3μ g F 蛋白質(zhì)（η = 8)-或 3· 2 X 105PFU RSV 毒株 L19-含 6· 6 μ g F 蛋 白質(zhì)（η = 8)的20% W8QP1885EC納米乳液。中和單位（NEU)表示導(dǎo)致50%空斑減少的最高 稀釋度的倒數(shù)。NEU測量在4周（加強(qiáng)前）和6周（加強(qiáng)后2周）時(shí)進(jìn)行。在6周時(shí)獲得 的樣本產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答足以允許進(jìn)行NEU分析。數(shù)據(jù)表示為幾何平均值，具有95%置 信區(qū)間（CI)(圖21A)。利用施佩爾曼秩相關(guān)系數(shù)在6周時(shí)對所有動(dòng)物進(jìn)行EU和NEU相關(guān)。
[0050] 圖22 :顯示第4天和第8天的中和抗體。圖22A顯示W(wǎng)8QP1885EC納米乳液組合RSV 毒株L19的結(jié)果，和圖22B顯示W(wǎng)8(I5EC納米乳液組合RSV毒株L19的結(jié)果。所有棉鼠均顯 示針對疫苗RSV毒株L19的高中和抗體（NU)。中和抗體在攻擊后穩(wěn)定增加（Y軸）。第8 天中和單位（NU)高于第4天NU。未接種小鼠在其血清中不顯示任何中和活性。
[0051] 圖23 :顯示血清抗體的特異性活性，當(dāng)與攻擊后第4天相比時(shí)，顯示血清抗體的特 異性活性（中和單位/ELISA單位）趨于在第8天提高。圖23A顯示在第4天和第8天， W8QP1885EC納米乳液組合RSV毒株L19的結(jié)果（NU/EU，Y軸）。圖23B顯示在第4天和第8 天，W 8(I5EC納米乳液組合RSV毒株L19的結(jié)果（NU/EU，Y軸）。
[0052] 圖24 :顯示接收3劑量的RSV L19輔助的疫苗，然后被RSV毒株A2攻擊的棉鼠在 第4天的交叉保護(hù)。圖24A顯示W(wǎng)8QP1885EC納米乳液組合RSV毒株L19的結(jié)果，和圖24B顯 示W(wǎng) 8(I5EC納米乳液組合RSV毒株L19的結(jié)果。血清中和活性顯示針對RSV毒株L19或RSV 毒株A2相當(dāng)?shù)腘U，表明兩個(gè)RSV毒株之間的交叉保護(hù)。
[0053] 圖25 :顯示第4天在棉鼠肺中的病毒清除（RSV毒株A2)。接種的棉鼠（接種 W8QP1885EC納米乳液組合RSV毒株L19或W8Q5EC納米乳液組合RSV毒株L19)顯示從棉鼠肺 中完成清除RSV毒株A2激發(fā)的病毒。未接種動(dòng)物的肺顯示>10 3pfu RSV毒株A2/克。
[0054] 圖26 :顯示頂棉鼠接種和攻擊時(shí)間表。
[0055] 圖27 :顯示IM接種混合1.6X105PFU RSV毒株L19-含3.3yg F蛋白質(zhì)- 的20% W8(I5EC納米乳液的棉鼠中的血清免疫應(yīng)答。Y軸顯示14周周期內(nèi)在攻擊后第4天 和攻擊后第8天的血清IgG, μ g/mL。
[0056] 圖28 :顯示頂接種混合1.6X105PFU RSV毒株L19-含3.3yg F蛋白質(zhì)- 的20% W8(I5EC納米乳液的棉鼠中的血清免疫應(yīng)答。圖28A顯示14周周期內(nèi)在攻擊后第4 天和攻擊后第8天的終點(diǎn)滴度（Y軸）。圖28B顯示14周周期內(nèi)在攻擊后第4天和攻擊后 第8天的ELISA單位（Y軸）。
[0057] 圖29 :顯示頂接種的棉鼠，與未接種動(dòng)物相比，其在攻擊后4天顯示完全清除 RSV4。顯示第4天在棉鼠肺中的病毒清除（RSV毒株A2)。IM接種的棉鼠（接種W8(I5EC納 米乳液組合RSV毒株L19)顯示從棉鼠肺中完全清除RSV毒株A2激發(fā)的病毒。未接種動(dòng)物 顯示肺的10 3pfu RSV毒株A2或更高/克。
[0058] 圖30 :顯示頂或IN接種RSV疫苗--含2 X 105空斑形成單位（PFU)的L19RSV病 毒--和由20% W8Q5EC納米乳液佐劑滅活的1. 7 μ g的F蛋白質(zhì)的小鼠在8周周期（X軸） 內(nèi)的抗-F抗體（Y軸）的測量結(jié)果。BALB/C小鼠 （η = 10/臂）在第0和4周被IN或IM 接種。分析血清的抗-F抗體。
[0059] 圖31 :顯示RSV-特異性細(xì)胞因子的測量結(jié)果。在BALB/C小鼠 （η = 10/臂）在第 0和4周IN或頂接種RSV疫苗--含2 X 105空斑形成單位（PFU)的L19RSV病毒--和由 20% W8(I5EC納米乳液佐劑滅活的1. 7μ g的F蛋白質(zhì)后，在來自脾、子宮頸和腸淋巴結(jié)（LN) 細(xì)胞中測量細(xì)胞因子。被測量的細(xì)胞因子包括IFNg、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和IL-17。
[0060] 圖32 :顯示在BALB/C小鼠 （η = 10/臂）在第0和4周IN或頂接種RSV疫苗-- 含2X 105空斑形成單位（PFU)的L19RSV病毒--和由20% W8(I5EC納米乳液佐劑滅活的 1. 7 μ g的F蛋白質(zhì)后，肺組織中細(xì)胞因子IL-4、IL-13和IL-17的測量結(jié)果。在頂施用后， IL-4和IL-13顯示較高的表達(dá)，其中IL-17在IN施用后顯示較高的表達(dá)。
[0061] 圖33 :顯示在BALB/C小鼠 （n = 10/臂）在第0和4周IN或頂接種RSV疫苗-- 含2X105空斑形成單位（PFU)的L19RSV病毒--和1. 7 μ g F蛋白質(zhì)后，小鼠中氣道阻力 (cm H20/mL/sec)的測量結(jié)果。
[0062] 發(fā)明描述
[0063] I.概述
[0064] 本發(fā)明提供RSV表面抗原、F和G蛋白質(zhì)混合納米乳液的新制劑，以解決在RSV疫 苗的之前的數(shù)據(jù)中觀察到的不足的免疫應(yīng)答。針對RSV的最佳疫苗不僅要預(yù)防急性病毒感 染，而且還要預(yù)防再感染。
[0065] 納米乳液RSV亞單位疫苗包括至少一種RSV免疫原，其是RSV F蛋白質(zhì)、RSV G蛋 白質(zhì)、RSV F蛋白質(zhì)的免疫原性片段、RSV G蛋白質(zhì)的免疫原性片段、或其任意組合。另外， 納米乳液RSV亞單位疫苗包括納米乳液小滴，其平均直徑小于約lOOOnm。優(yōu)選地，RSV免疫 原存在于納米乳液小滴中。在本發(fā)明的另外實(shí)施方式中，RSV病毒體顆粒還存在于納米乳 液RSV亞單位疫苗中。優(yōu)選地，RSV病毒體顆粒存在于納米乳液小滴中。
[0066] 本發(fā)明提供新方法，其通過組合關(guān)鍵免疫原性RSV病毒表面抗原、F和/或G蛋白 質(zhì)與遞送型和免疫增強(qiáng)型水包油納米乳液，遞送和引起針對RSV感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答。 分離的RSV病毒表面抗原--顯示為獨(dú)立于其它病毒成分，諸如病毒蛋白質(zhì)NS1，的主要病 毒免疫原--可使導(dǎo)致疾病加重的免疫應(yīng)答偏移，其是亞單位疫苗的重要基礎(chǔ)。進(jìn)一步，混 合一種或多種RSV表面抗原與納米乳液加強(qiáng)本發(fā)明的新穎性，其中所述納米乳液優(yōu)先封裝 抗原和充當(dāng)適當(dāng)?shù)拿庖呒?xì)胞的遞送系統(tǒng)而且還充當(dāng)有效的免疫增強(qiáng)型組分。與其它亞單位 疫苗和結(jié)果缺乏全功能的人疫苗的重組疫苗相比，納米乳液RSV亞單位病毒表面抗原提供 相比于之前的候選物在產(chǎn)生強(qiáng)的、可持續(xù)和保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力方面明顯的新穎性。
[0067] 對RSV的增強(qiáng)的免疫性的引發(fā)取決于最佳水平的抗原的存在和呈遞。組合分離的 RSV表面抗原與納米乳液提供新的方法，以將疫苗遞送至免疫應(yīng)答的合適的抗原呈遞細(xì)胞。 [0068] 本發(fā)明納米乳液組合物用作疫苗佐劑。佐劑用于：（1)使抗原一刺激特異性保護(hù) 性免疫應(yīng)答的物質(zhì)一與免疫系統(tǒng)接觸和影響產(chǎn)生的免疫的類型以及免疫應(yīng)答的質(zhì)量（量 級或持續(xù)時(shí)間）；（2)降低某些抗原的毒性；(3)降低保護(hù)性應(yīng)答所需的抗原的量；(4)降低 保護(hù)所需要的劑量數(shù)；（5)增強(qiáng)差的響應(yīng)亞群的免疫性和/或（7)提供一些疫苗成分的溶 解度。
[0069] 在一個(gè)實(shí)施方式中，可利用衍生自RSV和與納米乳液混合的表面抗原F和G蛋白 質(zhì)構(gòu)建多價(jià)亞單位疫苗。
[0070] 在另外的實(shí)施方式中，衍生物和融合蛋白質(zhì)可自RSV表面抗原F和G蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)， 然后與納米乳液混合以產(chǎn)生亞單位疫苗。
[0071] 在一個(gè)實(shí)施方式中，亞單位疫苗可用一種或多種RSV表面抗原-即，F(xiàn)和G蛋白 質(zhì)-混合納米乳液構(gòu)建。完全有可能使F和G蛋白質(zhì)一起加入并與納米乳液混合在所得 亞單位疫苗組合物中。在另外的實(shí)施方式中，混合納米乳液的F或G蛋白質(zhì)是根據(jù)本發(fā)明 的合適的亞單位疫苗。F和/或G蛋白質(zhì)的抗原片段也可用于本發(fā)明的納米乳液RSV疫苗 中。
[0072] 納米乳液是水包油乳液，其由納米尺寸的小滴與油-水界面處的表面活性劑（一 種或多種）組成。由于其尺寸，納米乳液小滴被樹突細(xì)胞胞飲，所述樹突細(xì)胞控制細(xì)胞 成熟和對免疫系統(tǒng)有效抗原呈遞。當(dāng)混合不同的抗原時(shí)，納米乳液佐劑引起并上調(diào)強(qiáng)的 體液和細(xì)胞T H1_型應(yīng)答以及黏膜免疫性（Makidon等，"Pre Clinical Evaluation of a Novel Nanoemulsion-Based Hepatitis B Mucosal Vaccine"，PLoS ONE. 3(8):2954 ; 1-15(2008) ;Hamouda 等，"A Novel Nanoemulsion Adjuvant Enhancing The Immune Response from Intranasal Influenza Vaccine in Mice in National Foundation for Infectious Disease"， 11th Annual Conference on Vaccine Research. Baltimore，MD (2008) ;Myc 等，"Development of immune response that protects mice from viral pneumonitis after a single intranasal immunization with influenza A virus and nanoemulsion，'，Vaccine, 21 (25-26) :3801-14 (2003) ;Bielinska 等，"Mucosal Immunization with a Novel Nanoemulsion-Based Recombinant Anthrax Protective Antigen Vaccine Protects against Bacillus anthracis Spore Challenge，'，Infect Tmmun. , 75 (8) : 4020-9 (2007) ;Bielinska 等，"Nasal Immunization with a Recombinant HIV gpl20and Nanoemulsion Adjuvant Produces ThlPolarized Responses and Neutralizing Antibodies to Primary HIV Typellsolates, ''AIDS Research and Human Retroviruses, 24(2):271-81 (2008) ;Bielinska 等，"A Novel, Killed-Virus Nasal Vaccinia Virus Vaccine,，'Clin. Vaccine Immunol. , 15(2) :348-58(2008) ；ffarren 等,"Pharmacological and Toxicological Studies on Cetylpyridinium, A New Germicide, "J. Pharmacol. Exp. Ther.，74:401-8) (1942))。這樣的抗原的實(shí)例包括炭疽病 (Bielinska 等，Infect. Tmmun.，75 (8) : 4020-9 (2007))、全牛痘病毒（Bielinska 等，（]1;[11· Vaccine Immunol. ,15(2) :348-58(2008))或人免疫缺陷病毒的 gpl20 蛋白質(zhì)（Bielinska 等，AIDS Research and Human Retroviruses. 24(2) :271-81(2008))的保護(hù)性抗原（PA)。 這些研究表明納米乳液佐劑與各種抗原--包括RSV抗原--的廣泛應(yīng)用。
[0073] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，納米乳液RSV疫苗包括平均直徑小于約lOOOnrn的 小滴和：（a)含水相；(b)約1 %油至約80 %油；（c)約0. 1 %至約50 %有機(jī)溶劑；（d)約 0.001%至約10%的表面活性劑或洗滌劑；或（e)其任意組合。在本發(fā)明的另外實(shí)施方式 中，納米乳液疫苗包括：（a)含水相；(b)約1%油至約80%油；（c)約0. 1%至約50%有機(jī) 溶劑；(d)約0.001 %至約10 %的表面活性劑或洗滌劑；和（e)RSV的F和G表面抗原或其 免疫原性片段。在本發(fā)明的另外實(shí)施方式中，納米乳液不含有機(jī)溶劑。
[0074] 納米乳液和/或納米乳液疫苗中存在的每種組分的量涉及治療性納米乳液和/或 納米乳液RSV疫苗。
[0075] 方法包括給對象施用納米乳液RSV疫苗，其中納米乳液疫苗包括平均直徑小于約 lOOOnrn的小滴。在本發(fā)明的示例性實(shí)施方式中，納米乳液RSV疫苗還包括（a)含水相，（b) 至少一種油，（c)至少一種表面活性劑，（d)至少一種有機(jī)溶劑，（e)RSV表面抗原、F和G蛋 白質(zhì)，和（f)任選地包括至少一種螯合劑、或其任意組合。在本發(fā)明的另外實(shí)施方式中，納 米乳液不含有機(jī)溶劑。
[0076] 在一個(gè)實(shí)施方式中，對象選自成年人、老年對象、青少年對象、嬰兒、高風(fēng)險(xiǎn)對象、 孕婦和無免疫應(yīng)答對象。在另外的實(shí)施方式中，納米乳液RSV疫苗可經(jīng)鼻內(nèi)施用。
[0077] 納米乳液RSV亞單位疫苗組合物可經(jīng)任意藥學(xué)上可接受的途徑遞送，所述途徑諸 如通過鼻內(nèi)途徑或其它黏膜途徑。其它示例性的藥學(xué)上可接受的方法包括鼻內(nèi)、口腔、舌 下、口、直腸、眼、腸胃外（靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腦池內(nèi)、腹膜內(nèi)）、肺部、陰道內(nèi)、局部 化（locally)施用、局部（topically)施用、劃破后局部施用、黏膜施用、通過氣溶膠或通過 口腔或鼻噴霧制劑。進(jìn)一步，納米乳液RSV疫苗可被配制成任意藥學(xué)上可接受的劑型，諸如 液體分散體、凝膠、氣溶膠、肺氣溶膠、鼻氣溶膠、軟膏、霜、半固體劑型、或懸浮體。進(jìn)一步， 納米乳液RSV疫苗可以是控釋制劑、緩釋制劑、速釋制劑、或其任意組合。進(jìn)一步，納米乳液 RSV疫苗可以是經(jīng)皮遞送系統(tǒng)，諸如貼劑或經(jīng)加壓或氣動(dòng)裝置（即，"基因槍"）施用。
[0078] A. RSV 毒株 L19
[0079] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，納米乳液RSV疫苗中利用的RSV毒株是RSV毒株 L19。另外，納米乳液RSV毒株中利用的F和/或G蛋白質(zhì)或其抗原片段可來自RSV毒株 L19。
[0080] 令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，與感染RSV A2病毒的細(xì)胞相比，感染RSV L19病毒的細(xì)胞產(chǎn)生 的RSV病毒蛋白質(zhì)的量高3-11倍之間（見下面實(shí)施例6)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中， 存在于本發(fā)明疫苗中的RSV抗原是RSV L19病毒，和更優(yōu)選地，人RSV L19病毒，包括純化 的減毒人呼吸道合胞病毒（HRSV)毒株L19(HRSV-L19)。在本發(fā)明的再另外的實(shí)施方式中， RSV病毒基因組可包括至少一個(gè)減毒突變，包括但不限于，指示減毒表型的核苷酸修飾。另 夕卜，本發(fā)明納米乳液RSV疫苗可包括來自RSV L19病毒的F或G蛋白質(zhì)、或其抗原片段。
[0081] 發(fā)現(xiàn)RSV L19毒株在小鼠中引起感染和加重的呼吸疾?。‥RD)。而且公布的數(shù)據(jù) 顯示其在用納米乳液配制時(shí)給予保護(hù)而不在小鼠中引起ERD。
[0082] RSV毒株L19分離菌于1967年1月3日，在Ann Arbor, Michigan，分離自患有 呼吸疾病的RSV-感染的嬰兒的WI-38細(xì)胞，并在SPAFAS原發(fā)性雞腎細(xì)胞中傳代，然后在 SPAFAS原發(fā)性雞肺細(xì)胞中傳代，然后轉(zhuǎn)移到MRC-5細(xì)胞（Herl〇Cherl999)，隨后轉(zhuǎn)移到Η印2 細(xì)胞（Lukacs2006)。RSV L19基因組（15，191-nt;基因庫登錄號FJ614813)與RSV毒株 △2(15,222-拉；基因庫登錄號174568)的比較顯示，98%的基因組是一致的。1^19和42之 間的大部分編碼差異是在F和G基因中。兩個(gè)毒株的氨基酸比對顯示，F(xiàn)蛋白質(zhì)具有14個(gè) (97%-致）而G蛋白質(zhì)具有20個(gè)（93%-致）氨基酸差異。
[0083] RSV L19毒株已經(jīng)在動(dòng)物模型中被證明通過刺激黏液產(chǎn)生和利用IX 105空斑形成 單位（PFU)/小鼠的接種物經(jīng)氣管內(nèi)施用明顯引起IL-13而模擬人感染（Lukacs2006)。
[0084] 重要的而且獨(dú)特的是，RSV L19病毒毒株是獨(dú)特的，在于其比其它毒株產(chǎn)生明顯更 高產(chǎn)量的F蛋白質(zhì)（每PFU多大約10-30倍）。F蛋白質(zhì)含量可能是免疫原性的關(guān)鍵因子， 并且，L19毒株當(dāng)前引起最強(qiáng)的免疫應(yīng)答。L19毒株的繁殖時(shí)間較短，因而從制造的角度來 看將更有效。
[0085] 最明顯地，納米乳液滅活的和輔助的RSV L19疫苗在普遍接受的棉鼠模型中是高 度免疫原性的。棉鼠在一次免疫后引起抗體滴度升高，并在第二次免疫后引起明顯加強(qiáng) (增加大約10倍）。產(chǎn)生的抗體在中和活病毒中是高度有效的，并且在中和和抗體滴度之 間存在線性關(guān)系。而且，在棉鼠中產(chǎn)生的抗體在經(jīng)RSV L19毒株免疫和被RSV A2毒株攻擊 時(shí)顯示交叉保護(hù)。頂和IN免疫均建立記憶，其在暴露于作為第二次加強(qiáng)的抗原或暴露于活 病毒之后可被提出或回憶。
[0086] 在本發(fā)明的另外實(shí)施方式中，本發(fā)明RSV疫苗針對至少一種不存在于疫苗中的其 它RSV毒株是交叉反應(yīng)性的（或針對一種或多種RSV毒株是交叉反應(yīng)性的）。如本領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員所知道的，交叉反應(yīng)性可通過如下方式測量1)利用ELISA方法來觀察接種 動(dòng)物或個(gè)體的血清是否將產(chǎn)生針對施用的疫苗中未使用的毒株的抗體；2)當(dāng)利用施用的 疫苗中未使用的毒株進(jìn)行體外刺激時(shí)，免疫細(xì)胞將產(chǎn)生細(xì)胞因子。當(dāng)接種一種毒株的動(dòng)物 血清中的抗體將中和施用的疫苗中未使用的另外的病毒的傳染性時(shí)，可在體外測量交叉保 護(hù)。
[0087] II.定義
[0088] 如本文中所用的，"約"將被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解，并將根據(jù)其使用的上下 文而在一定程度上有所變化。如果存在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員考慮到其使用的上下文而不 清楚的術(shù)語的應(yīng)用，"約"將意為上至加或減該具體術(shù)語的10 %。
[0089] 術(shù)語RSV表面抗原的"抗原片段"優(yōu)選指天然產(chǎn)生的或突變RSV F蛋白質(zhì)或RSV G 蛋白質(zhì)的具有至少約5個(gè)連續(xù)氨基酸的肽?？乖慰梢允侨我夂线m的長度，諸如在長度 約5個(gè)氨基酸上至并包括全長F或G蛋白質(zhì)之間。F蛋白質(zhì)長度約為518個(gè)氨基酸和G蛋 白質(zhì)長度約為242個(gè)氨基酸。例如，抗原片段長度也可以是約10、約15、約20、約30、約40、 約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110等上至約242個(gè)氨基酸--對于G蛋白質(zhì)抗 原片段，和上至長度約518個(gè)氨基酸--對于F蛋白質(zhì)抗原片段。
[0090] 如本文中所用的，術(shù)語"納米乳液"包括小的水包油分散體或小滴以及其它脂質(zhì)結(jié) 構(gòu)，脂質(zhì)結(jié)構(gòu)由于疏水性作用力而形成，該疏水性作用力在水不可混容的油相與含水相混 合時(shí)遠(yuǎn)離水驅(qū)使非極性殘基（即，長烴鏈）和朝向水驅(qū)使極性首基。這些其它脂質(zhì)結(jié)構(gòu)包 括、但不限于，單層、稀少層（paucilamellar)和多層脂泡、微囊和層狀相。本發(fā)明考慮，本 領(lǐng)域的技術(shù)人員在有必要理解本文公開的【具體實(shí)施方式】時(shí)將理解該區(qū)別。
[0091] 如本文中所用的，術(shù)語"抗原"是指可含有一個(gè)或多個(gè)能引起免疫應(yīng)答的表位（線 性、構(gòu)象、連續(xù)的、τ-細(xì)胞）的蛋白質(zhì)、多肽、糖蛋白或衍生物或片段?？乖杀环殖煞蛛x的 病毒蛋白質(zhì)或肽衍生物。
[0092] 如本文中所用的，術(shù)語"F蛋白質(zhì)"是指多肽或蛋白質(zhì)，其具有RSV融合蛋白質(zhì)的部 分或全部氨基酸序列。如本文中所用的，F(xiàn)蛋白質(zhì)包括FI、F2或RSV融合蛋白質(zhì)/多肽的 兩個(gè)組分。
[0093] 如本文中所用的，術(shù)語"G蛋白質(zhì)"是指多肽或蛋白質(zhì)，其具有RSV G吸附蛋白質(zhì)/ 多肽的部分或全部氨基酸序列。
[0094] 如本文中所用的，術(shù)語"分離的"是指獨(dú)立于其自然位置的蛋白質(zhì)、糖蛋白、肽衍生 物或片段或多核苷酸。通過重組遺傳學(xué)手段獨(dú)立地獲得的病毒組分通常導(dǎo)致相對純化的產(chǎn) 物。
[0095] 如本文中所用的，術(shù)語"佐劑"是指這樣的劑，其提高對抗原（例如，RSV表面抗原） 的免疫應(yīng)答。如本文中所使用的，術(shù)語"免疫應(yīng)答"是指對象（例如，人或其它動(dòng)物）的免 疫系統(tǒng)對對象免疫系統(tǒng)識別為外源的免疫原（即，抗原）的響應(yīng)。免疫應(yīng)答包括細(xì)胞介導(dǎo) 的免疫應(yīng)答（由抗原-特異性T細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的非特異性細(xì)胞--Thl、Th2、Thl7-- 介導(dǎo)的應(yīng)答）和體液免疫應(yīng)答（由抗體介導(dǎo)的應(yīng)答）。術(shù)語"免疫應(yīng)答"包括最初的對免疫 原（例如，RSV表面抗原）的"先天免疫應(yīng)答"以及由于"獲得免疫性"而造成的記憶應(yīng)答。
[0096] 如本文中所用的，術(shù)語"RSV表面抗原"是指衍生自RSV病毒被膜的蛋白質(zhì)、糖蛋白 和肽片段。優(yōu)選RSV表面抗原是F和G蛋白質(zhì)。RSV表面抗原通常通過感染的細(xì)胞培養(yǎng)物 提取自病毒分離物，或通過合成或利用重組DNA方法產(chǎn)生。RSV表面抗原可通過導(dǎo)致融合蛋 白質(zhì)、肽或片段的化學(xué)、遺傳或酶手段修飾。
[0097] 如本文中所用的，術(shù)語"免疫原"是指這樣的抗原，其能夠在對象中引起免疫應(yīng)答。 在優(yōu)選實(shí)施方式中，在與本發(fā)明納米乳液組合施用時(shí)，免疫原引起針對免疫原（例如，病原 體或病原體產(chǎn)物）的免疫性。
[0098] 如本文中所用的，術(shù)語"增強(qiáng)的免疫性"是指相對于未施用本發(fā)明疫苗時(shí)的獲得免 疫性水平，在施用本發(fā)明疫苗后對給定病原體的獲得免疫性水平提高。
[0099] 如本文中所用的，術(shù)語"病毒體"是指分離的、成熟的呼吸道合胞病毒顆粒，其獲自 感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物。如本文中所用的，病毒體可指RSV-1或RSV-病毒顆粒。
[0100] 如本文中所用的，術(shù)語"多價(jià)疫苗"是指這樣的疫苗，其包括單一病毒劑或多個(gè)毒 株的一個(gè)以上的抗原決定簇。如本文中所用的，多價(jià)疫苗包括多個(gè)RSV病毒表面抗原，F(xiàn)、 F1、F2和G蛋白質(zhì)。多價(jià)疫苗可用衍生自RSV-1和RSV-2的抗原構(gòu)建。
[0101] 如本文中所用的，術(shù)語"滅活的" RSV是指這樣的病毒體顆粒，其不能感染宿主細(xì) 胞，并且在有關(guān)動(dòng)物模型中是沒有傳染性的。
[0102] 如本文中所用的，術(shù)語"亞單位"是指分離的和通常純化的RSV糖蛋白，其是獨(dú)立 的，或進(jìn)一步與包含納米乳液的疫苗組合物混合。亞單位疫苗組合物不含成熟病毒體、細(xì)胞 或細(xì)胞或病毒體的溶胞產(chǎn)物。獲得包括在亞單位疫苗中的病毒表面抗原的方法可利用標(biāo)準(zhǔn) 重組遺傳學(xué)技術(shù)和合成方法以及標(biāo)準(zhǔn)純化方案執(zhí)行。
[0103] III.納米乳液RSV疫苗的特點(diǎn)
[0104] A.穩(wěn)定性
[0105] 本發(fā)明納米乳液RSV疫苗可在約40°C和約75%相對濕度穩(wěn)定至少多至約2天、至 少多至約2周、至少多至約1個(gè)月、至少多至約3個(gè)月、至少多至約6個(gè)月、至少多至約12個(gè) 月、至少多至約18個(gè)月、至少多至約2年、至少多至約2. 5年或至少上多約3年的時(shí)間段。
[0106] 在本發(fā)明的另外實(shí)施方式中，本發(fā)明納米乳液RSV疫苗可在約25°C和約60 %相對 濕度穩(wěn)定至少多至約2天、至少多至約2周、至約1個(gè)月、至少多至約3個(gè)月、至少多至約6 個(gè)月、至少多至約12個(gè)月、至少多至約18個(gè)月、至少多至約2年、至少多至約2. 5年或至少 多至約3年、至少多至約3. 5年、至少多至約4年、至少多至約4. 5年或至少多至約5年的 時(shí)間段。
[0107] 進(jìn)一步，本發(fā)明納米乳液RSV疫苗在約4°C穩(wěn)定至少多至約1個(gè)月、至少多至約3 個(gè)月、至少多至約6個(gè)月、至少多至約12個(gè)月、至少多至約18個(gè)月、至少多至約2年、至少 多至約2. 5年、至少多至約3年、至少多至約3. 5年、至少多至約4年、至少多至約4. 5年、 至少多至約5年、至少多至約5. 5年、至少多至約6年、至少多至約6. 5年或至少多至約7 年的時(shí)間段。
[0108] 本發(fā)明納米乳液RSV疫苗可在約-20°C穩(wěn)定至少多至約1個(gè)月、至少多至約3個(gè) 月、至少多至約6個(gè)月、至少多至約12個(gè)月、至少多至約18個(gè)月、至少多至約2年、至少多 至約2. 5年、至少多至約3年、至少多至約3. 5年、至少多至約4年、至少多至約4. 5年、至 少多至約5年、至少多至約5. 5年、至少多至約6年、至少多至約6. 5年或至少多至約7年 的時(shí)間段。
[0109] 這些穩(wěn)定性參數(shù)也適用于納米乳液佐劑和/或納米乳液RSV疫苗。
[0110] B.免疫應(yīng)答
[0111] 對象的免疫應(yīng)答可在施用納米乳液RSV疫苗之后，通過測定針對RSV免疫原的抗 體的滴度和/或存在而測量，以評價(jià)對免疫原的體液響應(yīng)。血清轉(zhuǎn)換是指針對免疫原的特 異性抗體的形成，并可用于評價(jià)保護(hù)性免疫應(yīng)答的存在。這樣的基于抗體的檢測常常利用 蛋白質(zhì)印跡法或酶聯(lián)免疫吸附（ELISA)試驗(yàn)或血凝抑制試驗(yàn)（HAI)測量。本領(lǐng)域的技術(shù)人 員將容易選擇和利用適當(dāng)?shù)臋z測方法。
[0112] 確定對象的免疫應(yīng)答的另外的方法是確定細(xì)胞免疫應(yīng)答，諸如通過免疫原-特異 性細(xì)胞應(yīng)答，諸如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞或免疫原-特異性淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。另外，經(jīng)病原 體進(jìn)行攻擊可用于在對象中或更可能地在動(dòng)物模型中確定免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì) 掌握確定對象免疫應(yīng)答的方法，并且，本發(fā)明不限于任意具體方法。
[0113] 在開發(fā)本發(fā)明過程中進(jìn)行的試驗(yàn)表明，加入到乙型肝炎表面抗原（HBsAg)和經(jīng)鼻 內(nèi)施用的納米乳液是安全且有效的乙型肝炎疫苗。黏膜疫苗誘導(dǎo)Thl相關(guān)的細(xì)胞免疫應(yīng) 答，同時(shí)伴隨中和抗體產(chǎn)生。HBsAg納米乳液混合物的單一鼻免疫產(chǎn)生血清抗體的快速誘 導(dǎo)--相當(dāng)于當(dāng)前施用的肌肉內(nèi)疫苗。進(jìn)一步，表明在抗體應(yīng)答中存在親和力成熟，其可預(yù) 測疫苗的潛在功效（Makidon等，2008)。
[0114] 最明顯地，如在下面實(shí)施例中詳細(xì)闡述的，配制在納米乳液中并經(jīng)鼻內(nèi)（IN)或肌 肉內(nèi)（IM)施用的所有RSV疫苗均引起預(yù)防免疫動(dòng)物感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答。而且，納米乳 液-滅活的和輔助的RSV疫苗在普遍接受的棉鼠模型中是高度免疫原性的。棉鼠在一次免 疫后引起抗體滴度增加和在第二次免疫后引起明顯加強(qiáng)（大約增加10倍）。產(chǎn)生的抗體在 中和活病毒方面是高度有效的，并且，在中和和抗體滴度之間存在線性關(guān)系。而且，在棉鼠 中產(chǎn)生的抗體在經(jīng)RSV L19毒株免疫和被RSV A2毒株攻擊時(shí)顯示交叉保護(hù)。頂和IN免疫 均建立記憶，其在暴露于作為第二次加強(qiáng)的抗原或暴露于活病毒之后可被提出或回憶。
[0115] 疫苗保護(hù)功效的另外出現(xiàn)的構(gòu)成是對T-輔助-17(Thl7)細(xì)胞因子應(yīng)答的誘導(dǎo)。 對于IL-17有助于對病原體的正常免疫應(yīng)答的證明已經(jīng)被進(jìn)一步用于顯示接種策略中的 相關(guān)性（DeLyrica等，2009 ;Conti等，2009)。在開發(fā)本發(fā)明過程中，用納米乳液進(jìn)行黏膜 免疫在激活Thl和Thl7免疫性中可產(chǎn)生輔助作用。用納米乳液進(jìn)行黏膜免疫導(dǎo)致先天免 疫失活，所述先天免疫直接幫助誘導(dǎo)Thl和Thl7細(xì)胞。結(jié)果進(jìn)一步闡明納米乳液的免疫增 強(qiáng)特征，在接種領(lǐng)域中對于針對滅活RSV病毒體的細(xì)胞免疫性的誘導(dǎo)是重要的（Bielinska 等，2010 ;Lindell 等，2011)。
[0116] C.病毒滅活
[0117] 疫苗需要包括滅活的病毒，尤其在疫苗包括全病毒的情況下，例如確保疫苗不引 起其正在治療和/或預(yù)防的疾病。換言之，滅活病毒確保疫苗不包括有傳染性的顆粒。方 法已經(jīng)包括用福爾馬林滅活病毒。然而，福爾馬林-滅活的疫苗已經(jīng)顯示疾病加重，包括顯 示對預(yù)防疾病加重重要的偏移的免疫應(yīng)答和被成熟的樹突細(xì)胞引發(fā)，其對于保護(hù)性免疫應(yīng) 答是必要的。減毒活疫苗的應(yīng)用已經(jīng)取得有限的成功，因?yàn)橐呙缫呀?jīng)被顯示是最小免疫原 性的。
[0118] 在本發(fā)明方法和組合物中，納米乳液用于滅活和輔助全病毒和/或病毒抗原，以 提供非感染和免疫原性病毒。可選地，病毒（全部或抗原）可在與納米乳液組合前被滅活。 病毒滅活的化學(xué)方法包括、但不限于，福爾馬林或β-丙酸內(nèi)酯（β-PL)，病毒滅活的物理 方法包括利用熱或輻射或通過分子遺傳學(xué)手段來產(chǎn)生非感染顆粒。已經(jīng)顯示簡單混合納米 乳液與候選疫苗同時(shí)產(chǎn)生黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。RSV病毒體顆粒與納米乳液的混合導(dǎo)致小 滴的油核心中離散的抗原顆粒?？乖Y(jié)合到核心中，這使其處于促進(jìn)正?？乖瓨?gòu)象的自由 形式中。
[0119] IV.納米乳液RSV疫苗
[0120] A.RSV 免疫原
[0121] 存在于本發(fā)明納米乳液RSV疫苗中的RSV免疫原是RSV表面抗原，諸如F蛋白質(zhì)、 G蛋白質(zhì)和/或其抗原片段。F蛋白質(zhì)、G蛋白質(zhì)和其抗原片段可獲自任意已知的RSV毒 株。另外，RSV疫苗可包括全RSV病毒，包括RSV的天然、重組和突變毒株，其組合一種或多 種RSV抗原。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，RSV病毒可抵抗一種或多種抗病毒藥物，諸如抵 抗無環(huán)鳥苷。任何已知RSV毒株均可用于本發(fā)明疫苗。納米乳液RSV疫苗可包括來自一個(gè) 以上RSV毒株的RSV全病毒以及來自一個(gè)以上RSV毒株的RSV抗原。
[0122] 有用的RSV毒株的實(shí)例包括、但不限于，任意RSV毒株，包括亞組A和B基因型以及 以保藏在ATCC的RSV毒株，諸如：（1)人RSV毒株A2, ATCC保藏號VR-1540 ; (2)人RSV毒 株長（Long)，ATCC 保藏號 VR-26 ; (3)牛 RSV 毒株 A51908, ATCC 保藏號 VR-794 ; (4)人 RSV 毒株93204了〇：保藏號￥1?-955;(5)牛1?￥毒株375,4了〇：保藏號￥1?-1339;(6)人1?￥毒株 B WV/14617/85，ATCC 保藏號 VR-1400 ;(7)牛 RSV 毒株 Iowa(FSl-l)，ATCC 保藏號 VR-1485 ; (8)山羊 RSV 毒株GRSV，ATCC 保藏號 VR-1486 ;(9)人 RSV 毒株 18537，ATCC 保藏號 VR-1580 ; (10)人 RSV 毒株 A2，ATCC 保藏號 VR-1540P;(11)人 RSV 突變毒株 A2cpts-248，ATCC 保藏 號 VR-2450 ; (12)人 RSV 突變毒株 A2cpts-530/1009，ATCC 保藏號 VR-2451 ; (13)人 RSV 突 變毒株 A2cpts-530, ATCC 保藏號 VR-2452 ; (14)人 RSV 突變毒株 A2cpts-248/955, ATCC 保 藏號 VR-2453 ;(15)人 RSV 突變毒株 A2cpts-248/404，ATCC 保藏號 VR-2454 ;(16)人 RSV 突 變毒株 A2cpts-530/1030, ATCC 保藏號 VR-2455 ; (17) RSV 突變毒株亞組 B cp23 克隆 1A2， ATCC保藏號VR-2579;和（18)人RSV突變毒株亞組B，毒株Bl，cp52克隆2B5，ATCC保藏號 VR-2542。
[0123] 任意合適量的RSV免疫原均可用于本發(fā)明納米乳液RSV疫苗。例如，納米乳液 RSV疫苗可包括小于約100 μ g的RSV免疫原（總RSV免疫原，而不是每一 RSV免疫原）。 在本發(fā)明的另外實(shí)施方式中，納米乳液RSV疫苗可包括小于約90 μ g、小于約80 μ g、小于 約70 μ g、小于約60 μ g、小于約50 μ g、小于約40 μ g、小于約30 μ g、小于約20 μ g、小于約 15 μ g、小于約10 μ g、小于約9 μ g、小于約8 μ g、小于約7 μ g、小于約6 μ g、小于約5 μ g、小 于約4 μ g、小于約3 μ g、小于約2 μ g、或小于約1 μ g的RSV免疫原（總RSV免疫原,而不是 每一 RSV免疫原）。
[0124] 在本發(fā)明的另外實(shí)施方式中，本發(fā)明RSV疫苗包括約1.0X105pfu(空斑形成單 位（pfu)多至約1.0X108pfu以及其間的任意量的RSV病毒或抗原。RSV病毒或抗原通 過納米乳液佐劑的存在而被滅活。例如，RSV疫苗可包括約1.0X105、1. 1X105、1.2X105、 1· 3Χ105、1· 4Χ105、1· 5Χ105、1· 6Χ105、1· 7Χ105、1· 8Χ105、1· 9Χ105、2· 0Χ105、2· 1X105、 2· 2Χ 105、2· 3Χ 105、2· 4Χ 105、2· 5Χ 105、2· 6Χ 105、2· 7Χ 105、2· 8Χ 105、2· 9Χ 105、3· ΟΧ ΙΟ5、 3· IX 105、3· 2Χ 105、3· 3Χ 105、3· 4Χ 105、3· 5Χ 105、3· 6Χ 105、3· 7Χ 105、3· 8Χ 105、3· 9Χ ΙΟ5、 4. ΟΧ 105、4. IX 105、4. 2Χ 105、4. 3Χ 105、4. 4Χ 105、4. 5Χ 105、4. 6Χ 105、4. 7Χ 105、4. 8Χ ΙΟ5、 4· 9Χ 105、5· ΟΧ 105、5· 5Χ 105、6· ΟΧ 105、6· 5Χ 105、7· ΟΧ 105、7· 5Χ 105、8· ΟΧ 105、8· 5Χ ΙΟ5、 9· 0Χ105、9· 5Χ105、1· 0Χ106、1· 5Χ10 6、2· 0Χ106、2· 5Χ106、3· 0Χ106、3· 5Χ10 6、4· ΟΧΙΟ6、 4· 5Χ 106、5· ΟΧ 106、5· 5Χ 106、6· ΟΧ 106、6· 5Χ 106、7· ΟΧ 106、7· 5Χ 106、8· ΟΧ 106、8· 5Χ ΙΟ6、 9· 0Χ106、9· 5Χ106、1· 0Χ107、1· 5Χ107、2· 0Χ107、2· 5Χ107、3· 0Χ107、3· 5Χ107、4· ΟΧΙΟ7、 4· 5Χ 107、5· ΟΧ 107、5· 5Χ 107、6· ΟΧ 107、6· 5Χ 107、7· ΟΧ 107、7· 5Χ 107、8· ΟΧ 107、8· 5Χ ΙΟ7、 9· 0Χ107、9· 5Χ107、1· 0X108pfu 的 RSV 病毒。
[0125] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，RSV疫苗包括RSV毒株的F和/或G蛋白質(zhì)，諸如但 不限于RSV毒株L19的F和/或G蛋白質(zhì)。在另外的實(shí)施方式中，RSV疫苗包括約0. lyg 多至約100 μ g以及其間的任意量的RSV F和/或G蛋白質(zhì)，諸如RSV毒株L19的F和/或 G蛋白質(zhì)。例如，RSV疫苗可包括約0. 1 μ g、約0.2 μ g、約0.3 μ g、約0.4 μ g、約0.5 μ g、 約 0· 6 μ g、約 0· 7 μ g、約 0· 8 μ g、約 0· 9 μ g、約 L 0 μ g、約 L 1 μ g、約 L 2 μ g、約 L 3 μ g、 約 1. 4 μ g、約 1. 5 μ g、約 1. 6 μ g、約 1. 7 μ g、約 1. 8 μ g、約 1. 9 μ g、約 2. 0 μ g、約 2. 1 μ g、 約 2. 2 μ g、約 2. 3 μ g、約 2. 4 μ g、約 2. 5 μ g、約 2. 6 μ g、約 2. 7 μ g、約 2. 8 μ g、約 2. 9 μ g、 約 3. 0 μ g、約 3. 1 μ g、約 3. 2 μ g、約 3. 3 μ g、約 3. 4 μ g、約 3. 5 μ g、約 3. 6 μ g、約 3. 7 μ g、 約 3· 8 μ g、約 3· 9 μ g、約 4· 0 μ g、約 4· 1 μ g、約 4· 2 μ g、約 4· 3 μ g、約 4· 4 μ g、約 4· 5 μ g、 約 4· 6 μ g、約 4· 7 μ g、約 4· 8 μ g、約 4· 9 μ g、約 5· 0 μ g、約 5· 1 μ g、約 5· 2 μ g、約 5· 3 μ g、 約 5· 4 μ g、約 5· 5 μ g、約 5· 6 μ g、約 5· 7 μ g、約 5· 8 μ g、約 5· 9 μ g、約 6· 0 μ g、約 6· 1 μ g、 約 6· 2 μ g、約 6· 3 μ g、約 6· 4 μ g、約 6· 5 μ g、約 6· 6 μ g、約 6· 7 μ g、約 6· 8 μ g、約 6· 9 μ g、 約 7. 0 μ g、約 7. 5 μ g、約 8. 0 μ g、約 8. 5 μ g、約 9. 0 μ g、約 9. 5 μ g、約 10. 0 μ g、約 10. 5 μ g、 約 11. 0 μ g、約 11. 5 μ g、約 12. 0 μ g、約 12. 5 μ g、約 13. 0 μ g、約 13. 5 μ g、約 14. 0 μ g、 約 14. 5 μ g、約 15. 0 μ g、約 15. 5 μ g、約 16. 0 μ g、約 16. 5 μ g、約 17. 0 μ g、約 17. 5 μ g、 約 18. 0 μ g、約 18. 5 μ g、約 19. 0 μ g、約 19. 5 μ g、約 20. 0 μ g、約 21. 0 μ g、約 22. 0 μ g、 約 23. 0 μ g、約 24. 0 μ g、約 25. 0 μ g、約 26. 0 μ g、約 27. 0 μ g、約 28. 0 μ g、約 29. 0 μ g、 約 30. 0 μ g、約 35. 0 μ g、約 40. 0 μ g、約 45. 0 μ g、約 50. 0 μ g、約 55. 0 μ g、約 60. 0 μ g、約 65. 0 μ g、約 70. 0 μ g、約 75. 0 μ g、約 80. 0 μ g、約 85. 0 μ g、約 90. 0 μ g、約 95. 0 μ g 或約 100. Oyg的RSV F蛋白質(zhì)，諸如RSV毒株L19的F蛋白質(zhì)。
[0126] 存在于本發(fā)明疫苗中的RSV免疫原可以是（l)RSV F蛋白質(zhì)；（2)RSV G蛋白質(zhì)；(3) RSV F蛋白質(zhì)的免疫原性片段；(4)RSV G蛋白質(zhì)的免疫原性片段；（5)RSV F蛋白質(zhì)的衍生 物；(6)RSV G蛋白質(zhì)的衍生物；（7)融合蛋白質(zhì)，包括RSV F蛋白質(zhì)或RSV F蛋白質(zhì)的免疫 原性片段；(8)融合蛋白質(zhì)，包括RSV G蛋白質(zhì)或RSV G蛋白質(zhì)的免疫原性片段；(9)或其任 意組合。優(yōu)選地，本發(fā)明RSV疫苗包括至少一種F蛋白質(zhì)免疫原和至少一種G蛋白質(zhì)免疫 原。
[0127] 在本發(fā)明的實(shí)施方式中，G蛋白質(zhì)的免疫原性片段包括RSV G蛋白質(zhì)的至少4個(gè)連 續(xù)氨基酸。在其它實(shí)施方式中，RSV G蛋白質(zhì)片段包括約4、約5、約10、約15、約20、約25、 約 50、約 75、約 100、約 125、約 150、約 175、約 200、約 225、約 250、約 275、約 280、約 285、約 289、約290、約295或約299個(gè)連續(xù)的RSV G蛋白質(zhì)的氨基酸。RSV G糖蛋白具有約289至 約299個(gè)氨基酸（取決于病毒毒株）。保守氨基酸取代可在G免疫原性蛋白質(zhì)片段中進(jìn)行， 以產(chǎn)生G蛋白質(zhì)衍生物。
[0128] 在本發(fā)明的另外實(shí)施方式中，F(xiàn)蛋白質(zhì)的免疫原性片段包括RSV F蛋白質(zhì)的至少 4個(gè)連續(xù)氨基酸。在其它實(shí)施方式中，RSV F蛋白質(zhì)片段包括約4、約5、約10、約15、約20、 約 25、約 50、約 75、約 100、約 125、約 150、約 175、約 200、約 225、約 250、約 275、約 300、約 325、約350、約375、約400、約425、約450、約475或約500個(gè)連續(xù)的RSV F蛋白質(zhì)的氨基 酸。保守氨基酸取代可在F免疫原性蛋白質(zhì)片段中進(jìn)行，以產(chǎn)生F蛋白質(zhì)衍生物。
[0129] 在一些實(shí)施方式中，F(xiàn)蛋白質(zhì)衍生物是免疫原性的，其與F蛋白質(zhì)具有選自下列 的％同一性：99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、 86 %,85 %,84 %,83 %,82 %,81 %,80 %,79 %,78 %,77 %,76 %,75 %,74 %,73 %,72 %, 71 %,70 %,69 %,68 %,67 %,66 %,65 %,64 %,63 %,62 %,61 %,60 %,59 %,58 %,57 %, 56%、55%、54%、53%、52%、51%、或50%。在一些實(shí)施方式中，6蛋白質(zhì)衍生物是免疫原 性的，并且與G蛋白質(zhì)具有選自下列的％同一性：99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、 92 %,91 %,90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %,83 %,82 %,81 %,80 %,79 %,78 %, 77 %,76 %,75 %,74 %,73 %,72 %,71 %,70 %,69 %,68 %,67 %,66 %,65 %,64 %,63 %, 62%、61%、60%、59%、58%、57%、56%、55%、54%、53%、52%、51%、或 50%。
[0130] 在一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗組合物將由分離的病毒表面抗原、F和G蛋白質(zhì)組合分離 的全RSV病毒體顆粒構(gòu)建，所述病毒顆粒與優(yōu)選的水包油納米乳液混合在一起。
[0131] B.納米乳液
[0132] 1.小滴尺寸
[0133] 本發(fā)明納米乳液RSV疫苗包括的小滴的平均直徑尺寸為小于約l，000nm、小于 約950nm、小于約900nm、小于約850nm、小于約800nm、小于約750nm、小于約700nm、小于 約650nm、小于約600nm、小于約550nm、小于約500nm、小于約450nm、小于約400nm、小于 約350nm、小于約300nm、小于約250nm、小于約220nm、小于約210nm、小于約205nm、小于 約200nm、小于約195nm、小于約190nm、小于約175nm、小于約150nm、小于約100nm、大于約 50nm、大于約70nm、大于約125nm或其任意組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，小滴的平均直徑尺寸 大于約125nm并小于或等于約600nm。在不同的實(shí)施方式中，小滴的平均直徑尺寸大于約 50nm或大于約70nm并且小于或等于約125nm。
[0134] 2.含水相
[0135] 含水相可包括任意類型的含水相，包括但不限于，水（例如，H20、蒸餾水、純化水、 注射用水、去離子水、自來水）和溶液（例如，磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)溶液）。在某些實(shí)施 方式中，含水相包括水，其pH為約4至10,優(yōu)選地，約6至8。水可以去離子化（下文稱為 "DiH 20"）。在一些實(shí)施方式中，含水相包括磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)。含水相可進(jìn)一步是消 毒的和無熱原的。
[0136] 3.有機(jī)溶劑
[0137] 本發(fā)明納米乳液RSV疫苗中的有機(jī)溶劑包括、但不限于，醇、二醇、三醇、二 烷基磷酸鹽、三烷基磷酸鹽，諸如三-正-丁基磷酸鹽、其半合成衍生物及其組合。在本發(fā) 明的一個(gè)方面中，有機(jī)溶劑是醇，其選自非極性溶劑、極性溶劑、質(zhì)子溶劑或非質(zhì)子溶劑。
[0138] 適于納米乳液RSV疫苗的有機(jī)溶劑包括、但不限于，乙醇、甲醇、異丙醇、丙醇、辛 醇、甘油、中鏈甘油三酯、二乙基醚、乙基醚、丙酮、二甲亞砜（DMS0)、乙酸、正-丁醇、丁二 醇、香料醇、異丙醇、正-丙醇、甲酸、丙二醇、山梨醇、工業(yè)甲基化酒精、三醋汀、己烷、苯、甲 苯、二乙基醚、氯仿、1，4-二曝烷、四氫呋喃、二氯甲烷、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亞 砜、甲酸、聚乙二醇、有機(jī)磷酸鹽基溶劑、其半合成衍生物、和其任意組合。
[0139] 4.油相
[0140] 本發(fā)明納米乳液RSV疫苗中的油可以是任意美容或藥學(xué)上可接受的油。油可以是 揮發(fā)性的或非揮發(fā)性的，并可選自動(dòng)物油、植物油、天然油、合成油、烴油、硅油、其半合成衍 生物及其組合。
[0141] 合適的油包括、但不限于，礦物油、角鯊烯油、調(diào)味油、硅油、精油、水不溶性維生 素、硬脂酸異丙酯、硬脂酸丁酯、辛基棕櫚酸酯、鯨蠟基棕櫚酸酯、十三烷基山崳酸酯、二異 丙基己二酸酯、二辛基癸二酸酯、鄰氨基苯甲酸薄荷酯、鯨蠟基辛酸酯、辛基水楊酸酯、異 丙基肉豆蘧酸酯、新戊二醇鯨蠟醇二癸酸酯、CeraphyWi、癸基油酸酯、二異丙基己二酸酯、 C12_15烷基乳酸酯、鯨蠟基乳酸酯、月桂基乳酸酯、異硬脂酰新戊酸酯、肉豆蘧基乳酸酯、異 鯨蠟基硬脂酰硬脂酸酯、辛基十二烷基硬脂酰硬脂酸酯、烴油、異鏈烷烴、液體石蠟、異十二 烷、礦脂、Argan油、油菜油、辣椒油、椰子油、玉米油、棉籽油、亞麻籽油、葡萄籽油、芥末油、 橄欖油、棕櫚油、棕櫚仁油、花生油、松子油、罌粟子油、南瓜子油、米糠油、紅花油、茶油、松 露油、植物油、杏（仁）油、霍霍巴油（油錯(cuò)樹（simmondsia chinensis)籽油）、葡萄籽油、澳 洲胡桃（Macadamia)油、小麥胚芽油、杏樹油、油菜籽油、葫蘆油、大豆油、芝麻油、榛子油、 玉米油、向日葵油、麻油、木香（Bois)油、夏威夷果（Kuki nut)油、鱷梨油、胡桃油、魚油、楽 果油、眾香子（allspice)油、刺柏油、種子油、杏仁油、茴芹子油、芹菜子油、孜然子油、肉豆 蘧種子油、葉油、羅勒葉油、月桂葉油、肉桂葉油、普通鼠尾草葉油、桉樹葉油、檸檬草葉油、 白千層油、牛至（oregano)葉油、廣藿香葉油、歐薄荷（peppermint)葉油、松針油、迷迭香葉 油、薄荷油、茶樹葉油、百里香葉油、冬青葉油、花油、春黃菊油、鼠尾草油、丁子香油、天竺葵 花油、海索草（hyssop)花油、茉莉花油、熏衣草花油、纖精澳洲茶樹油、馬郁蘭（Marhoram) 花油、橙花油、玫瑰花油、衣蘭花油、樹皮油、山扁豆皮油、肉桂皮油、黃樟皮油、木油、樟木 油、雪松木油、薔薇木油、檀香木油）、根莖（姜）木油、樹脂油、乳香油、沒藥油、果皮油、香檸 檬果皮油、葡萄柚果皮油、檸檬果皮油、白檸檬果皮油、橙子果皮油、柑橘果皮油、根油、頡草 油、油酸、亞油酸、油醇、異硬脂酰醇、其半合成衍生物及其任意組合。
[0142] 油還可包括硅氧烷組分，諸如揮發(fā)性硅氧烷組分，其可以是硅氧烷組分中的唯一 的油或可組合其它硅氧烷和非硅氧烷、揮發(fā)性和非揮發(fā)性油。合適的硅氧烷組分包括、但不 限于，甲基苯基聚硅氧烷、二甲硅油、聚二甲基硅氧烷、苯基聚三甲基硅氧烷（或其有機(jī)改 性形式）、聚硅氧烷的烷基化衍生物、鯨蠟基聚二甲基硅氧烷、月桂基聚三甲基硅氧烷、聚硅 氧烷的羥基化衍生物，諸如聚二甲基硅氧烷醇、揮發(fā)性硅油、環(huán)狀和線性硅氧烷、環(huán)甲基硅 烷、環(huán)甲基硅烷的衍生物、六甲基環(huán)三硅氧烷、八甲基環(huán)四硅氧烷、十甲基環(huán)五硅氧烷、揮發(fā) 性線性二甲基聚硅氧烷、異十六烷、異二十烷、異二十四烷、聚異丁烯、異辛烷、異十二烷、其 半合成衍生物及其組合。
[0143] 揮發(fā)性油可以是有機(jī)溶劑，或除了有機(jī)溶劑以外還可存在揮發(fā)性油。合適的揮發(fā) 性油包括、但不限于，萜、單萜、倍半萜、驅(qū)風(fēng)劑、甘菊環(huán)、薄荷醇、樟腦、苧酮、百里酚、橙花 醇、里哪醇、苧烯、櫳牛兒醇、紫蘇子醇、橙花叔醇、法呢醇、衣蘭烯、紅沒藥醇、法呢烯、驅(qū)茴 萜、藜油、香茅醛、檸檬醛、香茅醇、母菊奧、蓍草、愈創(chuàng)木奧、春黃菊、半合成衍生物、或其組 合。
[0144] 在本發(fā)明的一個(gè)方面中，硅氧烷組分中的揮發(fā)性油不同于油相中的油。
[0145] 5.表面活性劑
[0146] 本發(fā)明納米乳液RSV疫苗中的表面活性劑可以是藥學(xué)上可接受的離子表面活性 齊IJ、藥學(xué)上可接受的非離子表面活性劑、藥學(xué)上可接受的陽離子表面活性劑、藥學(xué)上可接受 的陰離子表面活性劑或藥學(xué)上可接受的兩性離子表面活性劑。
[0147] 不例性的有用表面活性劑描述在Applied Surfactants:Principles and Applications.Tharwat F.Tadros，Copyright82005WILEY-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA，Weinheim ISBN:3-527-30629-3)中，其通過引用特別被并入本文。
[0148] 進(jìn)一步，表面活性劑可以是藥學(xué)上可接受的離子聚合表面活性劑、藥學(xué)上可接受 的非離子聚合表面活性劑、藥學(xué)上可接受的陽離子聚合表面活性劑、藥學(xué)上可接受的陰離 子聚合表面活性劑或藥學(xué)上可接受的兩性離子聚合表面活性劑。聚合表面活性劑的實(shí)例包 括、但不限于聚（甲基丙烯酸甲酯）骨架與多種（至少一種）聚乙烯氧化物（ΡΕ0)側(cè)鏈的 接枝共聚物、多羥基硬脂酸、烷氧基化烷基苯酚甲醛縮合物、聚亞烷基1，2-乙二醇改性的 聚酯與脂肪酸疏水物、聚酯、其半合成衍生物或其組合。
[0149] 表面活性劑是由附著到極性或離子親水部分的非極性疏水部分組成的兩性分子， 所述非極性疏水部分通常是含8-18個(gè)碳原子的直鏈或分支的烴或碳氟鏈。親水部分可以 是非離子的、離子的或兩性離子的。烴鏈與水分子在含水環(huán)境中相互反應(yīng)弱，而極性或離子 首基（head group)通過偶極或離子-偶極相互作用與水分子相互反應(yīng)強(qiáng)?；谟H水基的 性質(zhì)，表面活性劑被分成陰離子、陽離子、兩性離子、非離子和聚合表面活性劑。
[0150] 合適的表面活性劑包括、但不限于，乙氧基化壬基苯酚--包括9至10單位的乙 二醇、乙氧基化i^一醇--包括8單位的乙二醇、聚氧乙烯（20)失水山梨糖醇單月桂酸 酯、聚氧乙烯（20)失水山梨糖醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯（20)失水山梨糖醇單硬脂酸酯、 聚氧乙烯（20)失水山梨糖醇單油酸酯、失水山梨糖醇單月桂酸酯、失水山梨糖醇單棕櫚 酸酯、失水山梨糖醇單硬脂酸酯、失水山梨糖醇單油酸酯、乙氧基化氫化蓖麻蛋白（ricin) 油、月桂基硫酸鈉、環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的二嵌段共聚物、環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷嵌段共聚 物和基于環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的四官能嵌段共聚物、甘油單酯、甘油癸酸酯、甘油辛酸酯、 甘油椰油酸酯（cocate)、甘油芥酸酯（erucate)、甘油羥基硬脂酸酯、甘油異硬脂酸酯、 甘油羊毛脂酸酯（lanolate)、甘油月桂酸酯、甘油亞油酸酯、甘油肉豆蘧酸酯、甘油油酸 酯、甘油基PABA、甘油棕櫚酸酯、甘油蓖麻醇酸酯（ricinoleate)、甘油硬脂酸酯、甘油基 thiglycolate、甘油二月桂酸酯、甘油二油酸酯、甘油二肉豆蘧酸酯、甘油二硬脂酸酯、甘油 倍半油酸酯、甘油硬脂酸鹽乳酸酯、聚氧乙烯鯨蠟基/十八烷基醚、聚氧乙烯膽留醇醚、聚 氧乙烯月桂酸酯或二月桂酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯或二硬脂酸酯、聚氧乙烯脂肪醚、聚氧乙 烯月桂基醚、聚氧乙烯十八烷基醚、聚氧乙烯肉豆蘧基醚、類固醇、膽留醇、β谷留醇、紅沒 藥醇、醇的脂肪酸酯、異丙基肉豆蘧酸酯、脂肪族-異丙基正-丁酸酯、異丙基正-酸酯、異 丙基正-癸酸酯、異丙基棕櫚酸酯、辛基十二烷基肉豆蘧酸酯、烷氧基化醇、烷氧基化酸、烷 氧基化酰胺、烷氧基化糖衍生物、天然油和蠟的烷氧基化衍生物、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共 聚物、壬苯聚醇-14、PEG-8月桂酸酯、PEG-6可可酰胺（Cocoamide)、PEG-20甲基葡萄糖倍 半硬脂酸酯、PEG40羊毛脂、PEG-40蓖麻油、PEG-40氫化蓖麻油、聚氧乙烯脂肪醚、甘油基二 酯、聚氧乙烯十八烷基醚、聚氧乙烯肉豆蘧基醚、和聚氧乙烯月桂基醚、甘油基二月桂酸酯、 甘油基dimystate、甘油基二硬脂酸酯、其半合成衍生物或其混合物。
[0151] 另外的合適的表面活性劑包括、但不限于，非離子脂質(zhì)，諸如甘油基月桂酸酯、甘 油基肉豆蘧酸酯、甘油基二月桂酸酯、甘油基二肉豆蘧酸酯、其半合成衍生物及其混合物。
[0152] 在另外的實(shí)施方式中，表面活性劑是具有范圍為約2至約100個(gè)基團(tuán)的聚氧乙烯 首基的聚氧乙烯脂肪醚或具有結(jié)構(gòu)R5-(〇CH2CH2)y - OH的烷氧基化醇，其中R5是分支或未 分支的烷基基團(tuán)，具有約6至約22個(gè)碳原子，和y在約4和約100之間，并且優(yōu)選地在約10 和約100之間。優(yōu)選地，烷氧基化醇是這樣的種類，其中R 5是月桂基基團(tuán)和y的平均值為 23〇
[0153] 在不同的實(shí)施方式中，表面活性劑是烷氧基化醇，其是羊毛脂醇的乙氧基化衍生 物。優(yōu)選地，羊毛脂醇的乙氧基化衍生物是羊毛脂醇聚醚-10,其是羊毛脂醇的聚乙二醇醚， 平均乙氧基化值為10。
[0154] 非離子表面活性劑包括、但不限于，乙氧基化表面活性劑、乙氧基化醇、乙 氧基化烷基苯酚、乙氧基化脂肪酸、乙氧基化單鏈烷醇酰胺、乙氧基化失水山梨糖醇 酯、乙氧基化脂肪氨基、環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷共聚物、雙（聚乙二醇雙[咪唑基羰 基])、壬苯聚醇-9、雙（聚乙二醇雙[咪唑基羰基])、Brij K35、BrijK 56、BrijK 72、 BrijK 76、Brij? 92 V、BrijK 97、BrijK 58P、CrcmophorK EL、癸乙二醇單十二燒基 醚、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、正-癸基α-D-批喃葡糖苷、癸基β-D-批喃麥芽糖 苷、正-十二燒醜-正-甲基匍糖醜胺、正-十二燒基 α _D_麥芽糖苷、正-十二燒基 β -D-麥芽糖苷、正-十二烷基β -D-麥芽糖苷、庚乙二醇單癸基醚、庚乙二醇單十二烷 基醚、庚乙二醇單十四烷基醚、正-十六烷基β-D-麥芽糖苷、六甘醇單十二烷基醚、六 甘醇單十六烷基醚、六甘醇單十八烷基醚、六甘醇單十四烷基醚、Igepal CA-630、Igepal CA-630、甲基-6-0-(正-庚基氨基甲?； α-D-吡喃葡糖苷、壬乙二醇單十二烷基 醚、正-壬酰-正-甲基葡糖胺、正-壬酰-正-甲基葡糖胺、辛乙二醇單癸基醚、辛乙 二醇單十二烷基醚、辛乙二醇單十六烷基醚、辛乙二醇單十八烷基醚、辛乙二醇單十四烷 基醚、辛基-β-D-吡喃葡糖苷、五乙二醇單癸基醚、五乙二醇單十二烷基醚、五乙二醇 單十六烷基醚、五乙二醇單己基醚、五乙二醇單十八烷基醚、五乙二醇單辛基醚、聚乙二 醇二環(huán)氧甘油醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚 氧乙烯20異十六烷基醚、聚氧乙烯20油基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬 脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯雙（咪唑基羰基）、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸 酯、來自皂樹皮的皂苷、司盤@ 20、司盤1Sl 40、司盤? 60、司盤gl 65、司盤§1 80、司盤1g' 85、 Tergitol，類型 15-S-12、Tergitol，類型 15-S-30、Tergitol，類型 15-S-5、Tergitol， 類型 15-S-7、Tergitol，類型 15-S-9、Tergitol，類型 NP-10、Tergitol，類型 NP-4、 Tergitol，類型 NP-40、Tergitol，類型 NP-7、Tergitol，類型 NP-9、Tergitol、Tergitol， 類型TMN-10、Tergitol，類型TMN-6、十四烷基-β-D-麥芽糖苷、四乙二醇單癸基 醚、四乙二醇單十二烷基醚、四乙二醇單十四烷基醚、三乙二醇單癸基醚、三乙二醇單 十二烷基醚、三乙二醇單十六烷基醚、三乙二醇單辛基醚、三乙二醇單十四烷基醚、曲 拉通（Triton)CF-21、曲拉通CF-32、曲拉通DF-12、曲拉通DF-16、曲拉通GR-5M、曲 拉通QS-15、曲拉通QS-44、曲拉通X-100、曲拉通X-102、曲拉通X-15、曲拉通X-151、 曲拉通X-200、曲拉通X-207、曲拉通R:lX-l〇〇、曲拉通ΦΧ-114、曲拉通 R:IX-165、曲 拉通lglX-305、曲拉通ΦΧ-405、曲拉通#Χ-45、曲拉通&X-705-70、吐溫（TWEEN) s 20、吐溫&'21、吐溫@40、吐溫g'60、吐溫gl61、吐溫 Sl65、吐溫lgl80、吐溫g'81、 吐溫85、泰洛沙泊、正-i^一烷基β -D-吡喃葡糖苷、其半合成衍生物、或其組合。
[0155] 另外，非離子表面活性劑可以是波洛沙姆。波洛沙姆是由聚氧乙烯嵌段，然后是聚 氧丙烯嵌段，然后是聚氧乙烯嵌段制成的聚合物。聚氧乙烯和聚氧丙烯的單元數(shù)目根據(jù)結(jié) 合聚合物的數(shù)目而不同。例如，最小的聚合物波洛沙姆101由具有平均2單元的聚氧乙烯的 嵌段、具有平均16單元的聚氧丙烯的嵌段、然后是具有平均2單元的聚氧乙烯的嵌段組成。 波洛沙姆范圍從無色液體和糊至白色固體。在美容和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品中，波洛沙姆被用于配 制皮膚清潔劑、沐浴產(chǎn)品、洗發(fā)水、護(hù)發(fā)素、漱口液、眼部卸妝液和其它護(hù)膚和護(hù)發(fā)產(chǎn)品。波 洛沙姆的實(shí)例包括、但不限于，波洛沙姆101、波洛沙姆105、波洛沙姆108、波洛沙姆122、 波洛沙姆123、波洛沙姆124、波洛沙姆181、波洛沙姆182、波洛沙姆183、波洛沙姆184、波 洛沙姆185、波洛沙姆188、波洛沙姆212、波洛沙姆215、波洛沙姆217、波洛沙姆231、波洛 沙姆234、波洛沙姆235、波洛沙姆237、波洛沙姆238、波洛沙姆282、波洛沙姆284、波洛沙 姆288、波洛沙姆331、波洛沙姆333、波洛沙姆334、波洛沙姆335、波洛沙姆338、波洛沙姆 401、波洛沙姆402、波洛沙姆403、波洛沙姆407、波洛沙姆105Ben Z〇ate和波洛沙姆182二 苯甲酸酯。
[0156] 合適的陽離子表面活性劑包括、但不限于，季銨鹽化合物、烷基三甲基氯化銨化合 物、二烷基二甲基氯化銨化合物、含陽離子鹵素的化合物，諸如鯨蠟基氯化吡啶鎗、苯扎氯 銨、苯扎氯銨、芐基二甲基十六烷基氯化銨、芐基二甲基十四烷基氯化銨、芐基十二烷基二 甲基溴化銨、芐基三甲基四氯碘酸銨、二甲基雙十八烷基溴化銨、十二烷基乙基二甲基溴化 銨、十二烷基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨、乙基十六烷基二甲基溴化銨、吉臘德 試劑T、十六烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、Ν，Ν'，Ν' -聚氧乙烯（10)-N-動(dòng) 物脂-1,3-二氨基丙燒、通佐溴胺（Thonzonium bromide)、三甲基（十四燒基）溴化銨、 1，3, 5-三嗪-1，3, 5 (2H, 4H, 6H)-三乙醇、1-癸甲基銨（Decanaminium)、N-癸基-N, N-二甲 基_、氯化物、二癸基二甲基氯化銨、2-(2-(對-(二異丁基）甲苯氧基）乙氧基）乙基二甲 基節(jié)基氯化銨、2 -(2_(對-(二異丁基）苯氧基）乙氧基）乙基二甲基節(jié)基氯化銨、燒基1 或3芐基-1-(2-羥乙基）-2-氯化咪唑啉.輸鹽、烷基雙（2-羥乙基）芐基氯化銨、烷基脫 甲基芐基氯化銨、烷基二甲基3, 4-二氯芐基氯化銨（100% C12)、烷基二甲基3, 4-二氯芐基 氯化銨（50% C14、40% C12、10% C16)、烷基二甲基 3, 4-二氯芐基氯化銨（55% C14、23% C12、 20% C16)、烷基二甲基芐基氯化銨、烷基二甲基芐基氯化銨（100% C14)、烷基二甲基芐基氯 化銨（100% C16)、烷基二甲基芐基氯化銨（41% C14、28% C12)、烷基二甲基芐基氯化銨（47% C12、18% C14)、烷基二甲基芐基氯化銨（55% C16、20% C14)、烷基二甲基芐基氯化銨（58% C14、 28% C16)、烷基二甲基芐基氯化銨（60% C14、25% C12)、烷基二甲基芐基氯化銨（61% Cn、 23% C14)、烷基二甲基芐基氯化銨（61% C12、23% C14)、烷基二甲基芐基氯化銨（65% C12、 25% C14)、烷基二甲基芐基氯化銨（67% C12、24% C14)、烷基二甲基芐基氯化銨（67% C12、 25% C14)、烷基二甲基芐基氯化銨（90% C14、5% C12)、烷基二甲基芐基氯化銨（93% C14、4% C12)、烷基二甲基芐基氯化銨（95% C16、5% C18)、烷基二甲基芐基氯化銨、烷基二癸基二甲 基氯化銨、烷基二甲基芐基氯化銨、烷基二甲基芐基氯化銨（C 12_16)、烷基二甲基芐基氯化 銨（C12_18)、烷基二甲基芐基氯化銨、二烷基二甲基芐基氯化銨、烷基二甲基二甲基芐基氯化 銨、烷基二甲基乙基溴化銨（90% C14、5% C16、5% C12)、烷基二甲基乙基溴化銨（混合的烷基 和鏈烯基基團(tuán)，如在大豆油脂肪酸中一樣）、烷基二甲基乙基芐基氯化銨、烷基二甲基乙基 芐基氯化銨（60% C14)、烷基二甲基異丙基芐基氯化銨（50% C12、30% C14、17% C16、3% C18)、 烷基三甲基氯化銨（58% C18、40% C16、l% C14、l% C12)、烷基三甲基氯化銨（90% C18、10% C16)、烷基二甲基-(乙基芐基）氯化銨（C12_18)、二-(C 8_1Q)-烷基二甲基氯化銨、二烷基二甲 基氯化銨、二烷基甲基芐基氯化銨、二癸基二甲基氯化銨、二異癸基二甲基氯化銨、二辛基 二甲基氯化銨、十二烷基雙（2-羥乙基）辛基氯化氫銨、十二烷基二甲基芐基氯化銨、十二 烷基甲氨酰甲基二甲基基芐基氯化銨、十七烷基羥乙基咪唑啉輪鹽氯化物、六氫-1，3, 5 - 三（2-羥乙基）-仲-三嗪、六氫-1，3, 5-三（2-羥乙基）-仲-三嗪、十四烷基二甲基芐基 氯化銨（Myristalkonium chloride)(和）Quat RNIUM14、N，N_ 二甲基 _2_ 輕丙基氯化銨聚 合物、正-十四烷基二甲基芐基氯化銨一水合物、辛基癸基二甲基氯化銨、辛基十二烷基二 甲基氯化銨、辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基芐基氯化銨、氧聯(lián)二乙基雙（烷基二甲基氯化 銨）、季銨化合物、二椰油烷基二甲基、氯化物、三甲氧基甲硅烷基丙基二甲基十八烷基氯化 銨、三甲氧基甲硅烷季銨化合物、三甲基十二烷基芐基氯化銨、其半合成衍生物及其組合。
[0157] 示例性含陽離子鹵素的化合物包括、但不限于，鯨蠟基鹵化吡啶像、鯨蠟基三甲 基鹵化銨、鯨蠟基二甲基乙基鹵化銨、鯨蠟基二甲基芐基鹵化銨、鯨蠟基三丁基鹵化膦、 十二烷基三甲基鹵化銨或十四烷基三甲基鹵化銨。在一些【具體實(shí)施方式】中，合適的含陽離 子鹵素的化合物包括、但不限于鯨蠟基氯化吡啶輪（CPC)、鯨蠟基三甲基氯化銨、鯨蠟基芐 基二甲基氯化銨、鯨蠟基溴化吡啶輪（CPB)、鯨蠟基三甲基溴化銨（CTAB)、鯨蠟基二甲基 乙基溴化銨、鯨蠟基三丁基溴化膦、十二烷基三甲基溴化銨和十四烷基三甲基溴化銨。在具 體的優(yōu)選實(shí)施方式中，含陽離子鹵素的化合物是CPC，盡管本發(fā)明組合物不限于具有含特定 陽離子的化合物的制劑。
[0158] 合適的陰離子表面活性劑包括、但不限于，羧酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、鵝脫 氧膽酸、鵝脫氧膽酸鈉鹽、膽酸、?；蜓蚰懼⒚摎淠懰?、脫氧膽酸、脫氧膽酸、脫氧膽酸甲基 酯、毛地黃皂苷、毛地黃毒苷配基、N，N-二甲基十二烷基胺N-氧化物、多庫酯鈉鹽、甘氨鵝 脫氧膽酸鈉鹽、甘氨膽酸水合物、合成的、甘氨膽酸鈉鹽水合物、合成的、甘氨脫氧膽酸一水 合物、甘氨脫氧膽酸鈉鹽、甘氨脫氧膽酸鈉鹽、甘氨石膽酸3-硫酸二鈉鹽、甘氨石膽酸乙 基酯、N-月桂酰肌氨酸鈉鹽、N-月桂酰肌氨酸溶液、N-月桂酰肌氨酸溶液、十二烷基硫酸 鋰、十二烷基硫酸鋰、十二烷基硫酸鋰、路戈?duì)柕庖骸iapr 〇〇f4,類型4、1-辛烷磺酸鈉鹽、 1- 丁烷磺酸鈉、1-癸烷磺酸鈉、1-癸烷磺酸鈉、1-十二烷磺酸鈉、無水1-庚烷磺酸鈉、無水 1-庚烷磺酸鈉、1-壬烷磺酸鈉、1-丙磺酸鈉一水合物、2-溴乙烷磺酸鈉、膽酸鈉水合物、膽 酸鈉、脫氧膽酸鈉、脫氧膽酸鈉一水合物、十二烷基硫酸鈉、無水己烷磺酸鈉、辛基硫酸鈉、 無水戊烷磺酸鈉、?；悄懰徕c、?；蛆Z脫氧膽酸鈉、?；敲撗跄懰徕c一水合物、Taurohyo脫 氧膽酸鈉水合物、?；鞘懰?-硫酸二鈉、?；切苊撗跄懰徕c、TrizmaK十二烷基硫酸鹽、 吐溫? 80、熊脫氧膽酸、其半合成衍生物、和其組合。
[0159] 合適的兩性離子表面活性劑包括、但不限于，N-烷基甜菜堿、月桂基酰氨基丙基二 甲基甜菜堿、烷基二甲基氨基乙酸酯、N-烷基氨基丙酸酯、CHAPS、最小98% (TLC)、CHAPS、 SigmaUltra、最小 98 % (TLC)、CHAPS，用于電泳，最小 98 % (TLC)、CHAPS0、最小 98 %、 CHAPSO、SigmaUltra、CHAPSO,用于電泳，3-(癸基二甲基銨）丙磺酸鹽內(nèi)鹽、3-十二烷基二 甲基-銨）丙磺酸鹽內(nèi)鹽、SigmaUltra、3-(十二烷基二甲基銨）-丙磺酸鹽內(nèi)鹽、3-(N，N-二 甲基肉豆蘧基銨）丙磺酸鹽、3-(N，N-二甲基十八烷基銨）丙磺酸鹽、3-(N，N-二甲基辛 基-銨）丙磺酸鹽內(nèi)鹽、3-(N，N-二甲基棕櫚基銨）-丙磺酸鹽、其半合成衍生物、和其組合。
[0160] 在一些實(shí)施方式中，納米乳液RSV疫苗包括陽離子表面活性劑，其可以是鯨蠟基 氯化吡啶輸。在本發(fā)明其它實(shí)施方式中，納米乳液RSV疫苗包括陽離子表面活性劑，陽離子 表面活性劑濃度小于約5. 0%并且大于約0. 001%。在本發(fā)明再另外的實(shí)施方式中，納米乳 液RSV疫苗包括陽離子表面活性劑，陽離子表面活性劑濃度選自小于約5 %、小于約4. 5 %、 小于約4. 0%、小于約3. 5%、小于約3. 0%、小于約2. 5%、小于約2. 0%、小于約1. 5%、小 于約1. 0%、小于約0. 90%、小于約0. 80%、小于約0. 70%、小于約0. 60%、小于約0. 50%、 小于約0. 40%、小于約0. 30%、小于約0. 20%或小于約0. 10%。進(jìn)一步，納米乳液疫苗中 的陽離子劑濃度為大于約〇. 002 %、大于約0. 003 %、大于約0. 004%、大于約0. 005 %、大 于約0. 006%、大于約0. 007%、大于約0. 008%、大于約0. 009%、大于約0. 010%或大于約 0. 001%。在一個(gè)實(shí)施方式中，納米乳液疫苗中的陽離子劑濃度為小于約5. 0%且大于約 0. 001%。
[0161] 在本發(fā)明的另外實(shí)施方式中，納米乳液疫苗包括至少一種陽離子表面活性劑和至 少一種非陽離子表面活性劑。非陽離子表面活性劑是非離子表面活性劑，諸如聚山梨醇酯 (吐溫（Tween))，諸如聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20。在一個(gè)實(shí)施方式中，非離子表面活 性劑以約0. 01%至約5. 0%的濃度存在或非離子表面活性劑以約0. 1%至約3%的濃度存 在。在本發(fā)明再另外的實(shí)施方式中，納米乳液疫苗包括以約0. 01 %至約2 %濃度存在的陽 離子表面活性劑，并組合非離子表面活性劑。
[0162] 在某些實(shí)施方式中，納米乳液還包括含陽離子鹵素的化合物。本發(fā)明不限于具體 的含陽離子鹵素的化合物。各種含陽離子鹵素的化合物均被考慮，包括、但不限于，鯨蠟基 鹵化吡啶鐵、鯨蠟基三甲基鹵化銨、鯨蠟基二甲基乙基鹵化銨、鯨蠟基二甲基芐基鹵化銨、 鯨蠟基三丁基鹵化膦、十二烷基三甲基鹵化銨和十四烷基三甲基鹵化銨。本發(fā)明納米乳液 還不限于具體的鹵化物。各種鹵化物均被考慮，包括、但不限于，選自氯化物、氟化物、溴化 物和碘化物的鹵化物。
[0163] 在再另外的實(shí)施方式中，納米乳液還包括含季銨化合物。本發(fā)明不限于具體的含 季銨化合物。各種含季銨化合物均被考慮，包括、但不限于烷基二甲基芐基氯化銨、二烷基 二甲基氯化銨、正-烷基二甲基芐基氯化銨、正-烷基二甲基乙基芐基氯化銨、二烷基二甲 基氯化銨和正-烷基二甲基芐基氯化銨。
[0164] 在一個(gè)實(shí)施方式中，納米乳液和/或納米乳液疫苗包括陽離子表面活性劑，其是 鯨蠟基氯化吡啶德（CPC)。CPC在納米乳液RSV疫苗中的濃度可以為小于約5. 0 %并且大于 約0. 001 %，或進(jìn)一步，濃度可以為小于約5%、小于約4. 5%、小于約4. 0%、小于約3. 5%、 小于約3. 0%、小于約2. 5%、小于約2. 0%、小于約1. 5%、小于約1. 0%、小于約0· 90%、 小于約〇· 80 %、小于約0· 70 %、小于約0· 60 %、小于約0· 50 %、小于約0· 40 %、小于約 0. 30%、小于約0. 20%、小于約0. 10%、大于約0. 001 %、大于約0. 002%、大于約0. 003%、 大于約0. 004%、大于約0. 005%、大于約0. 006%、大于約0. 007%、大于約0. 008%、大于約 0· 009%、和大于約 0· 010%。
[0165] 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，納米乳液RSV疫苗包括非離子表面活性劑，諸如聚山梨 醇酯表面活性劑，其可以是聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20,并且濃度可以為約0.01%至約 5.0%，或約0. 1 %至約3%的聚山梨醇酯80。納米乳液RSV疫苗還可包括至少一種防腐劑。 在本發(fā)明的另外實(shí)施方式中，納米乳液RSV疫苗包括螯合劑。
[0166] 6.另外的成分
[0167] 合適用于本發(fā)明納米乳液RSV疫苗的另外的化合物包括、但不限于，一種或多種 溶劑，諸如基于有機(jī)磷酸鹽的溶劑、膨脹劑、著色劑、藥學(xué)上可接受的賦形劑、防腐劑、pH調(diào) 節(jié)劑、緩沖液、螯合劑等。另外的化合物可混合到之前乳化的納米乳液疫苗中或另外的化合 物可加入至待被乳化的最初混合物中。在某些這些實(shí)施方式中，一種或多種另外的化合物 被混合到現(xiàn)有納米乳液組合物中后即被應(yīng)用。
[0168] 本發(fā)明納米乳液RSV疫苗中的合適的防腐劑包括、但不限于，鯨蠟基氯化吡啶輸、 苯扎氯銨、芐基醇、雙氯苯雙胍己烷（chlorhexidine)、咪唑烷基脲、苯酚、山梨酸鉀、苯甲 酸、bronopo 1、氯甲酚、對羥基本甲酸酯、苯氧基乙醇、山梨酸、α -生育酚、抗壞血酸、棕櫚酸 抗壞血酸酯、叔丁對甲氧酚、丁羥甲苯、抗壞血酸鈉、焦亞硫酸鈉、檸檬酸、依地酸、其半合成 衍生物及其組合。其它合適的防腐劑包括、但不限于、芐基醇、雙氯苯雙胍己烷（雙（對-氯 苯基二胍基）己燒）、氯苯甘醚（chlorphenesin) (3-(-4-氯苯氧基）-丙燒-1，2-二醇）、 Kathon CG(甲基和甲基氯異噻唑啉酮）、對羥基本甲酸酯（甲基、乙基、丙基、丁基氫化苯 甲酸酯）、苯氧基乙醇（2-苯氧基乙醇）、山梨酸（山梨酸鉀、山梨酸）、Phenonip(苯氧基 乙醇、甲基、乙基、丁基、丙基對羥基本甲酸酯）、Phenoroc (苯氧基乙醇0. 73%、對羥基本 甲酸甲酯〇. 2%、對輕基本甲酸丙酯0. 07% )、Liquipar油（異丙基、異丁基、丁基對輕基 本甲酸酯）、Liquipar PE(70%苯氧基乙醇、30%liquipar 油）、Nipaguard MPA(節(jié)基醇 (70% )、甲基&丙基對輕基本甲酸醋）、Nipaguard MPS (丙_醇、甲基&丙基對輕基本甲酸 醋）、Nipasept (甲基、乙基和丙基對輕基本甲酸醋）、Nipastat (甲基、丁基、乙基和丙基對 羥基本甲酸酯）、Elestab388(丙二醇中的苯氧基乙醇加氯苯甘醚和對羥基本甲酸甲酯）和 Killitol (7. 5%氯苯甘醚和7. 5%對羥基本甲酸酯）。
[0169] 納米乳液RSV疫苗還可包括至少一種pH調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明納米乳液疫苗中合適的 pH調(diào)節(jié)劑包括、但不限于，二乙醇胺、乳酸、單乙醇胺、三乙醇胺、氫氧化鈉、磷酸鈉、其半合 成衍生物、和其組合。
[0170] 另外，納米乳液RSV疫苗可包括螯合劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，螯合劑以約 0.0005%至約1 %的量存在。螯合劑的實(shí)例包括、但不限于，乙二胺、乙二胺四乙酸（EDTA)、 肌醇六磷酸、多聚磷酸、檸檬酸、葡糖酸、乙酸、乳酸和二巰基丙醇，并且，優(yōu)選螯合劑是乙二 胺四乙酸。
[0171] 納米乳液RSV疫苗可包括緩沖劑，諸如藥學(xué)上可接受的緩沖劑。緩沖劑的實(shí)例包 括、但不限于，2-氨基-2-甲基-1，3-丙烷二醇，彡99. 5% (NT)、2_氨基-2-甲基-1-丙醇， 彡99·0%(GC)、L-(+)-酒石酸，彡99·5%(T)、ACES，彡99·5%(T)、ADA，彡99·0%(T)、乙 酸，彡99.5% (GC/T)、乙酸，用于發(fā)光、彡99.5% (GC/T)、醋酸銨溶液，用于分子生物學(xué)，? 5皿于!120中、醋酸銨，用于發(fā)光，彡99.0% (以干物質(zhì)計(jì)算，NT)、碳酸氫銨，彡99.5% (T)、 檸檬酸氫二銨，彡99. 0% (T)、甲酸銨溶液，10M于H20中、甲酸銨，彡99. 0% (以干物質(zhì)計(jì) 算，NT)、草酸銨一水合物，> 99. 5 % (RT)、磷酸氫二銨溶液，2. 511于!120中、磷酸氫二銨， 彡99. 0% (T)、磷酸氫銨溶液，2. 5M于H20中、磷酸氫銨，彡99. 5% (T)、磷酸氫二銨鈉四水 合物，彡99. 5% (NT)、硫酸銨溶液，用于分子生物學(xué)、3. 2M于H20中、酒石酸氫二銨溶液，2M 于4〇中（在20°C為無色溶液）、酒石酸氫二銨，彡99.5% (T)、BES緩沖鹽水，用于分子生 物學(xué)、2X濃縮、BES，彡99. 5% (T)、BES，用于分子生物學(xué)，彡99. 5% (T)、BICINE緩沖液溶 液，用于分子生物學(xué)，1M 于 H20 中、BICINE，彡 99. 5% (T)、BIS-TRIS，彡 99. 0% (NT)、碳酸 氫鹽緩沖液溶液、>〇. 1M Na2C03、>0. 2M NaHC03、硼酸，彡99. 5% (T)、硼酸，用于分子生物學(xué)， 彡 99. 5% (T)、CAPS，彡 99. 0% (TLC)、CHES，彡 99. 5% (T)、醋酸鈣水合物，彡 99. 0% (以 干物質(zhì)計(jì)算，KT)、碳酸鈣，沉淀的，>99.0% (KT)、檸檬酸氫三鈣四水合物，>98.0% (以干 物質(zhì)計(jì)算，KT)、檸檬酸鹽濃縮溶液，用于分子生物學(xué)、1M于H20中、檸檬酸，無水，彡99. 5% (T)、檸檬酸，用于發(fā)光，無水，彡99·5%(T)、二乙醇胺，彡99·5%(GC)、EPPS，彡99·0% (T)、乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物，用于分子生物學(xué)，彡99. 0 % (T)、甲酸溶液，1. 0M于 H20中、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸，彡99. 0 % (NT)、甘氨酸-甘氨酸，彡99. 5 % (NT)、甘氨 酸，彡99.0% (NT)、甘氨酸，用于發(fā)光，彡99.0% (NT)、甘氨酸，用于分子生物學(xué)，彡99.0% (NT)、HEPES緩沖鹽水，用于分子生物學(xué)，2X濃縮、HEPES，彡99. 5% (T)、HEPES，用于分子生 物學(xué)，彡99. 5% (T)、咪唑緩沖液溶液，說于!120中、咪唑，彡99. 5% (GC)、咪唑，用于發(fā)光， 彡99.5% (GC)、咪唑，用于分子生物學(xué)，彡99.5% (GC)、脂蛋白再折疊緩沖液、醋酸鋰二水 合物，彡99. 0% (NT)、檸檬酸氫三鋰四水合物，彡99. 5 % (NT)、MES水合物，彡99. 5 % (T)、 MES -水合物，用于發(fā)光，彡99. 5% (T)、MES溶液，用于分子生物學(xué)，0. 5M于H20中、MOPS， 彡99. 5% (T)、MOPS，用于發(fā)光，彡99. 5% (T)、MOPS，用于分子生物學(xué)，彡99. 5% (T)、醋酸 鎂溶液，用于分子生物學(xué)，?說于!120中、醋酸鎂四水合物，彡99.0% (KT)、檸檬酸氫三鎂 九水合物，> 98. 0% (以干物質(zhì)計(jì)算，KT)、甲酸鎂溶液，0. 5M于H20中、磷酸氫二鎂三水合 物，彡98. 0% (KT)、用于原位雜交的中和溶液，用于分子生物學(xué)、草酸二水合物，彡99. 5% (RT)、PIPES，彡99. 5 % (T)、PIPES，用于分子生物學(xué)，彡99. 5 % (T)、磷酸鹽緩沖鹽水，溶液 (高壓滅菌的）、磷酸鹽緩沖鹽水、蛋白質(zhì)印跡法中用于過氧化物酶結(jié)合物的洗滌緩沖液、 10x濃縮、哌嗪，無水的，彡99.0% (T)、D-酒石酸氫鉀，彡99.0% (T)、醋酸鉀溶液，用于 分子生物學(xué)、醋酸鉀溶液，用于分子生物學(xué)、5M于H20中、醋酸鉀溶液，用于分子生物學(xué)，? 說于!1 20中、醋酸鉀，彡99.0% (NT)、醋酸鉀，用于發(fā)光，彡99.0% (NT)、醋酸鉀，用于分子 生物學(xué)，彡99.0% (NT)、碳酸氫鉀，彡99. 5% (T)、碳酸鉀，無水的，彡99.0% (T)、氯化鉀， 彡99. 5% (AT)、朽1檬酸氫鉀，彡99. 0% (干物質(zhì)，NT)、朽1檬酸氫三鉀溶液，說于!120中、甲 酸鉀溶液，14M于H 20中、甲酸鉀，彡99. 5% (NT)、草酸鉀一水合物，彡99. 0% (RT)、磷酸氫 二鉀，無水的，>99.0% (T)、磷酸氫二鉀，用于發(fā)光，無水的，>99.0% (T)、磷酸氫二鉀， 用于分子生物學(xué)，無水的，彡99.0% (T)、磷酸氫鉀，無水的，彡99.5 % (T)、磷酸氫鉀，用于 分子生物學(xué)，無水的，>99.5% (T)、磷酸氫三鉀一水合物，>95% (T)、鄰苯二甲酸氫鉀， 彡99. 5% (T)、酒石酸鉀鈉溶液，1.511于!120中、酒石酸鉀鈉四水合物，彡99. 5% (NT)、四 硼酸鉀四水合物，彡99. 0% (T)、四草酸鉀二水合物，彡99. 5% (RT)、丙酸溶液，1. 0M于H20 中、STE緩沖液溶液，用于分子生物學(xué)，pH7. 8、STET緩沖液溶液，用于分子生物學(xué)、pH8. 0、 5, 5-二乙基巴比妥酸鈉，彡99. 5 % (NT)、醋酸鈉溶液，用于分子生物學(xué)，?3M于中H20、醋 酸鈉三水合物，>99. 5% (NT)、醋酸鈉，無水的，>99. 0 % (NT)、醋酸鈉，用于發(fā)光，無水 的，彡99. Ο % (NT)、醋酸鈉，用于分子生物學(xué)，無水的，彡99. Ο % (NT)、碳酸氫鈉，彡99. 5 % (T)、酒石酸氫鈉一水合物，> 99. 0% (T)、碳酸鈉十水合物，> 99. 5% (T)、碳酸鈉，無水的， >99.5% (以干物質(zhì)計(jì)算，T)、檸檬酸氫鈉，無水的，>99.5% (T)、檸檬酸氫三鈉二水合物， 彡99.0 % (NT)、朽1檬酸氫三鈉二水合物二水合物，用于發(fā)光、>99.0 % (NT)、朽1檬酸氫三 鈉二水合物，用于分子生物學(xué)，彡99. 5 % (NT)、甲酸鈉溶液，8M于H20中、草酸鈉，彡99. 5% (RT)、磷酸氫二鈉二水合物，> 99. 0% (T)、磷酸氫二鈉二水合物，用于發(fā)光，> 99. 0% (T)、 磷酸氫二鈉二水合物，用于分子生物學(xué)，> 99. 0% (T)、磷酸氫二鈉十二水合物，> 99. 0% (T)、磷酸氫二鈉溶液，0. 511于!120中、磷酸氫二鈉，無水的，> 99. 5% (T)、磷酸氫二鈉，用 于分子生物學(xué)，>99.5% (T)、磷酸氫鈉二水合物，>99.0% (T)、磷酸氫鈉二水合物，用于 分子生物學(xué)，>99.0% (T)、磷酸氫鈉一水合物，用于分子生物學(xué)，>99.5% (T)、磷酸氫鈉 溶液，511于!120中、焦磷酸氫二鈉，彡99.0% (T)、焦磷酸氫四鈉十水合物，彡99. 5% (T)、 酒石酸氫二鈉二水合物，>99.0% (NT)、酒石酸氫二鈉溶液，1.511于!120中（在20°C，下 無色溶液）、四硼酸鈉十水合物，彡99.5%⑴、TAPS，彡99.5% (T)、TES，彡99. 5% (以 干物質(zhì)計(jì)算，T)、TM緩沖液溶液，用于分子生物學(xué)，pH7. 4、TNT緩沖液溶液，用于分子生物 學(xué)，pH8.0、TRIS甘氨酸緩沖液溶液，10X濃縮，TRIS乙酸-EDTA緩沖液溶液，用于分子 生物學(xué)、TRIS緩沖鹽水，10X濃縮、TRIS甘氨酸SDS緩沖液溶液，用于電泳，10X濃縮、 TRIS磷酸鹽-EDTA緩沖液溶液，用于分子生物學(xué)、濃縮，10X濃縮、麥黃酮（Tricine)， 彡99. 5% (NT)、三乙醇胺，彡99. 5% (GC)、三乙胺，彡99. 5% (GC)、三乙基醋酸銨緩沖液， 揮發(fā)性緩沖液，?1. 0M于H20中、三乙基磷酸銨溶液，揮發(fā)性緩沖液，?1. 0M于H20中、三 甲基醋酸銨溶液，揮發(fā)性緩沖液，?1. 0M于H20中、三甲基磷酸銨溶液，揮發(fā)性緩沖液，? 1M于H20中、Tris-EDTA緩沖液溶液，用于分子生物學(xué)、濃縮、100X濃縮、Tris-EDTA緩沖 液溶液，用于分子生物學(xué)，PH7. 4、Tris-EDTA緩沖液溶液，用于分子生物學(xué)，pH8. 0、Trizma? 乙酸鹽，> 99. 0% (NT)、Trizma8'械，> 99. 8% (T)、TrizmallE，> 99. 8% (T)、Trizma8'喊， 用于發(fā)光，> 99. 8 % (T)、Trizma?堿，用于分子生物學(xué)，> 99. 8 % (T)、Trizma5碳酸鹽， 彡98. 5% (T)、Trizma?氫氯化物緩沖液溶液，用于分子生物學(xué)，PH7. 2、Trizma?氫氯化物緩 沖液溶液，用于分子生物學(xué)，pH7. LTrizma"氫氯化物緩沖液溶液，用于分子生物學(xué)，pH7. 6、 Trizma81氫氯化物緩沖液溶液，用于分子生物學(xué)，pH8. 0、Trizma?氫氯化物，彡99. 0 % (AT)、Trizma8'氫氯化物，用于發(fā)光，彡99. 0 % (AT)、TrizmaSl氫氯化物，用于分子生物學(xué)， 彡 99. 0% (AT)和 Trizma?馬來酸鹽，彡 99. 5 % (NT)。
[0172] 納米乳液RSV疫苗可包括一種或多種乳化劑，以幫助形成乳液。乳化劑包括這樣 的化合物，其在油/水界面聚集，以形成防止兩個(gè)鄰近小滴直接接觸的連續(xù)膜。本發(fā)明的某 些實(shí)施方式以納米乳液疫苗為特征，該疫苗可容易用水或另外的含水相稀釋至期望的濃度 而不損害其期望的性質(zhì)。
[0173] 7.免疫調(diào)節(jié)劑
[0174] 如上所述，RSV疫苗還可包括一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑。免疫調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括、 但不限于脫乙酰殼多糖和葡聚糖。免疫調(diào)節(jié)劑在疫苗組合物中以藥學(xué)上可接受的任意量 存在，所述量包括、但不限于，約0.001 %上至約10%和其間的任意量，諸如約0.01 %、約 0. 02 %、約 0. 03 %、約 0. 04 %、約 0. 05 %、約 0. 06 %、約 0. 07 %、約 0. 08 %、約 0. 09 %、約 0. 1 %、約 0. 2%、約 0. 3%、約 0. 4%、約 0. 5%、約 0. 6%、約 0. 7%、約 0. 8%、約 0. 9%、約 1 %、約 2%、約 3%、約 4%、約 5%、約 6%、約 7%、約 8%、約 9%、或約 10%。
[0175] V.藥物組合物
[0176] 本發(fā)明納米乳液RSV亞單位疫苗可被配制成藥物組合物，其包括治療有效量的納 米乳液RSV疫苗和適當(dāng)?shù)?、藥學(xué)上可接受的賦形劑，用于藥學(xué)上可接受的遞送。這樣的賦形 劑在本領(lǐng)域中是悉知的。
[0177] 短語"治療有效量"意為有效預(yù)防、治療或改善由包含納米乳液RSV疫苗的組合物 中施用的免疫原相關(guān)的RSV病原體引起的疾病的的任意量的納米乳液RSV疫苗。"保護(hù)性 免疫應(yīng)答"意為免疫應(yīng)答與疾病的預(yù)防、治療或改善相關(guān)。不要求完全預(yù)防，盡管本發(fā)明也 考慮完全預(yù)防。免疫應(yīng)答可利用本文所述的方法或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn) 行評估。
[0178] 鼻內(nèi)施用包括通過鼻施用--施用過程中伴隨或不伴隨吸入。這樣的施用通常通 過包含納米乳液RSV疫苗的組合物與鼻粘膜、鼻甲或鼻竇腔的接觸。通過吸入進(jìn)行施用包 括鼻內(nèi)施用或可包括口服吸入。這樣的施用也可包括與口腔粘膜、支氣管粘膜和其它上皮 的接觸。
[0179] 用于藥學(xué)施用的示例性劑型在本文中進(jìn)行描述。實(shí)例包括但不限于，液體、軟膏、 霜、乳液、洗劑、凝膠、生物粘合劑凝膠、噴霧、氣溶膠、糊、泡沫、遮光劑、膠囊、微膠囊、懸浮 齊IJ、子宮托、粉劑、半固體劑型等。
[0180] 藥物納米乳液RSV疫苗可被配制用于速釋、緩釋、控釋、延遲釋放或其任意組合至 表皮或真皮中。在一些實(shí)施方式中，制劑可包括滲透增強(qiáng)劑。合適的滲透增強(qiáng)劑包括、但不 限于，醇諸如乙醇、甘油三酯和蘆薈組合物。滲透增強(qiáng)劑的量可占按重量計(jì)制劑的約0. 5% 至約40%。
[0181] 本發(fā)明納米乳液RSV疫苗可利用電泳遞送/電泳被應(yīng)用和/或遞送。進(jìn)一步，組 合物可以是經(jīng)皮遞送系統(tǒng)，諸如貼劑或通過加壓或氣動(dòng)裝置（即，"基因槍"）被施用。包括 應(yīng)用電流的這樣的方法在本領(lǐng)域中是悉知的。
[0182] 用于施用的藥學(xué)納米乳液RSV疫苗可在單一施用或在多重施用中被應(yīng)用。
[0183] 如果被局部應(yīng)用，則納米乳液RSV疫苗可被封閉或半封閉。封閉或半封閉可通過 覆蓋繃帶、聚烯烴膜、服裝制品、不滲透性襯墊或半滲透性襯墊于局部制劑上來實(shí)施。
[0184] 根據(jù)本發(fā)明的示例性納米乳液佐劑組合物被命名為"W8(I5EC"佐劑。W 8(I5EC佐劑組 合物顯示于下面表（表1)中。W8(I5EC佐劑的平均小滴尺寸為?400nm。納米乳液的所有組 分均包括在FDA批準(zhǔn)藥物產(chǎn)品的非活性成分清單上。
[0185]
【權(quán)利要求】
1. 疫苗組合物，包括： (a) 至少一種呼吸道合胞病毒（RSV)表面抗原或其抗原片段；和 (b) 免疫增強(qiáng)型納米乳液或其稀釋物，包括小滴，其平均大小為約lOOOnm或更小，和： (i) 含水相； (ii) 至少一種油； (iii) 至少一種表面活性劑；和 (iv) 至少一種有機(jī)溶劑； 其中所述至少一種RSV表面抗原包括在所述納米乳液中。
2. 權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中所述表面抗原是RSV F蛋白質(zhì)、RSVG蛋白質(zhì)、 RSV F蛋白質(zhì)的抗原片段、RSV G蛋白質(zhì)的抗原片段、或其任意組合。
3. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其中所述RSV表面抗原來自人呼吸道 合胞病毒，其以HRSV-L19保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)。
4. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述疫苗組合物，其中所述RSV表面抗原還包括至少一種指示 減毒表型的核苷酸修飾。
5. 權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述疫苗組合物，其中所述RSV表面抗原或其抗原片段存在于 融合蛋白質(zhì)中。
6. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述疫苗組合物，其中所述RSV表面抗原是RSV F蛋白質(zhì)的肽 片段、RSV G蛋白質(zhì)的肽片段、或其任意組合。
7. 權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述疫苗組合物，其中所述RSV表面抗原是多價(jià)的。
8. 權(quán)利要求7所述組合物，其中所述多價(jià)表面抗原是RSV F蛋白質(zhì)、RSV G蛋白質(zhì)、RSV F蛋白質(zhì)的抗原片段、RSV G蛋白質(zhì)的抗原片段、或其任意組合。
9. 權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述疫苗組合物，其中所述免疫增強(qiáng)型納米乳液能夠誘發(fā)Thl 免疫應(yīng)答、Th2免疫應(yīng)答、Th 17免疫應(yīng)答、或其任意組合。
10. 權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述疫苗組合物，還另外包括佐劑。
11. 權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述疫苗組合物，還包括至少一種藥學(xué)上可接受的載體。
12. 權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述疫苗組合物，其中所述疫苗組合物被配制，用于經(jīng)腸胃 夕卜、口服、鼻內(nèi)或直腸施用。
13. 權(quán)利要求12所述疫苗組合物，其中所述腸胃外施用是通過皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌 肉內(nèi)注射。
14. 權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述疫苗組合物，還包括分離的RSV病毒體顆粒。
15. 權(quán)利要求14所述疫苗組合物，其中所述RSV病毒體顆粒來自人呼吸道合胞病毒，其 以HRSV-L19保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)。
16. 權(quán)利要求14或權(quán)利要求15所述疫苗組合物，其中所述RSV病毒體顆粒通過所述納 米乳液失活。
17. 權(quán)利要求14-16任一項(xiàng)所述疫苗組合物，其中所述RSV病毒基因組包括至少一個(gè)減 毒突變。
18. 權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)所述疫苗組合物，其中所述疫苗組合物： (a) 對于對象不是全身毒性的； (b) 在施用后廣生最小炎癥或不廣生炎癥；或 (C)其任意組合。
19. 權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述疫苗組合物，其中所述納米乳液小滴的平均直徑選自小 于約lOOOnm、小于約950nm、小于約900nm、小于約850nm、小于約800nm、小于約750nm、小 于約700nm、小于約650nm、小于約600nm、小于約550nm、小于約500nm、小于約450nm、小于 約400nm、小于約350nm、小于約300nm、小于約250nm、小于約200nm、小于約150nm、小于約 lOOnm、大于約50nm、大于約70nm、大于約125nm、大于約125nm并且小于約600nm，和其任意 組合。
20. 權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述疫苗組合物，其中所述納米乳液包括： (a) 含水相； (b) 約1%油至約80%油； (b) 約0. 1 %有機(jī)溶劑至約50 %有機(jī)溶劑；和 (c) 約0. 001 %表面活性劑至約10%表面活性劑。
21. 權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)所述疫苗組合物，其中所述納米乳液包括： (a) 含水相； (b) 約1%油至約80%油； (c) 約.01 %有機(jī)溶劑至約50 %有機(jī)溶劑； (d) 約0. 001 %至約10%的一種或多種非離子表面活性劑；和 (3)陽離子表面活性劑。
22. 權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)所述的疫苗組合物，其中在施用給對象之后，所述對象在單 一施用所述疫苗后經(jīng)歷血清轉(zhuǎn)換。
23. 權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)所述的疫苗組合物在制備藥物中的用途。
24. 權(quán)利要求23所述的用途，其中所述藥物用于治療嬰兒。
25. 權(quán)利要求23所述的用途，其中所述藥物用于治療老年對象、移植對象、患有慢性阻 塞性肺疾?。–0PD)的對象、或其任意組合。
【文檔編號】A61K39/155GK104093421SQ201280054495
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月9日
【發(fā)明者】V·畢緹寇, T·韓繆達(dá) 申請人:納諾碧歐公司