腸纖維化處理劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞用的物質(zhì)遞送載體和利用了該載體的腸纖維化處理劑，所述載體含有類視黃醇作為靶向劑。
【專利說明】腸纖維化處理劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及以腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞為靶的物質(zhì)遞送用載體、以及使用了該載體的腸纖維化處理用組合物和腸纖維化的處理方法。另外，本發(fā)明還涉及纖維化腸道來源的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞株、其制作方法、使用了所述細(xì)胞株的腸纖維化處理藥的篩選方法、包含所述細(xì)胞株的腸纖維化處理藥的篩選試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]腸纖維化(intestinal fibrosis)是以腸壁中的瘢痕組織的過量蓄積為特征的病理狀態(tài)，繼發(fā)于慢性的腸道炎癥、例如慢性化的炎癥性腸道疾病(IBD)、放射線照射導(dǎo)致的組織損傷等(非專利文獻(xiàn)I)。炎癥性腸道疾病包括克隆氏病和潰瘍性結(jié)腸炎，例如克隆氏病中約25~30%的患者會(huì)發(fā)生腸纖維化。腸纖維化進(jìn)展會(huì)形成腸道狹窄(stricture)，引起食物的通過困難，是損害患病對(duì)象的QOL的很大的原因。但是，現(xiàn)狀是腸纖維化的機(jī)理還沒有弄清楚，因此尚未確立根本性的治療方法。
[0003]以往腸纖維化治療的重點(diǎn)在于治療作為其原因的炎癥，使用各種抗炎藥，例如柳氮磺吡啶、美沙拉嗪、奧沙拉嗪(7 ^ ^ >)、巴柳氮等氨基水楊酸系藥劑、氫化潑尼松、布地奈德等皮質(zhì)類固醇藥、硫唑嘌呤、巰基嘌呤、環(huán)孢菌素、氨甲蝶呤等免疫抑制劑、英夫利昔等TNF α抑制劑、以及甲硝唑(metronidazole)、環(huán)丙沙星等抗生素。但是，這些抗炎藥并不直接治療纖維化，在重癥腸纖維化中，還需要外科除去纖維化了的組織，這對(duì)患者是強(qiáng)加的巨大負(fù)擔(dān)。
[0004]由于此種情況，近年來進(jìn)行了直接治療腸纖維化的一些嘗試。其結(jié)果，報(bào)告了例如TGFii I疫苗(非專利文獻(xiàn)2)、己酮可可堿及其代謝物(非專利文獻(xiàn)3)、磷酸二酯酶4抑制劑(非專利文獻(xiàn)4)、HMG-CoA還原酶抑制劑(非專利文獻(xiàn)5)、大建中湯(非專利文獻(xiàn)6)、普伐他汀(非專利文獻(xiàn)7)、脂氧素A4類似物(專利文獻(xiàn)I)、硫酸基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(專利文獻(xiàn)
2)等藥劑在腸纖維化動(dòng)物模型等中獲得了某種程度的成果。但是，這些藥劑還均不能令人滿意，需要開發(fā)進(jìn)一步的腸纖維化治療劑。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006]專利文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)1:TO2008/022807
[0008]專利文獻(xiàn)2:W02009/084232
[0009]專利文獻(xiàn)3:W02006/068232
[0010]專利文獻(xiàn)4:W02009/036368
[0011]專利文獻(xiàn)5:TO2010/014117
[0012]專利文獻(xiàn)6:W02009/116257
[0013]專利文獻(xiàn)7:TO2010/026766
[0014]非專利文獻(xiàn)
[0015]非專利文獻(xiàn)1:Rieder and Fiocchi,Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2009Apr ；6(4):228-35
[0016]非專利文獻(xiàn)2:Ma et al.，Inflamm Bowel Dis.20IOJun ；16(6):1040-50
[0017]非專利文獻(xiàn)3:Peterson et al., Eur J Pharmacol.201 IJul 15 ;662 (1-3):47-54
[0018]非專利文獻(xiàn)4 =Videla et al.，J Pharmacol Exp Ther.2006Feb ；316(2):940-5
[0019]非專利文獻(xiàn)5:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/pubmed/21909991
[0020]非專利文獻(xiàn)6:Inoue et al.，Biol Pharm Bull.2011 ；34(11):1659-65
[0021]非專利文獻(xiàn)7:Haydont et al., Clin Cancer Res.2007Sepl5 ;13(18Ptl):5331-40

【發(fā)明內(nèi)容】

[0022]發(fā)明所要解決的課題
[0023]本發(fā)明的目的在于提供能夠?qū)⑺幬锏任镔|(zhì)特異性地遞送到腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的載體、使用了該載體的腸纖維化處理劑和腸纖維化的處理方法。
[0024]用于解決課題的手段
[0025]本
【發(fā)明者】們?cè)谔角笮滦偷哪c纖維化治療劑的過程中成功地從纖維化了的腸道組織中分離出細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞，并進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，含有類視黃醇作為靶向劑的載體可將細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生抑制劑以高效率遞送到該細(xì)胞并顯著抑制與細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生相關(guān)的分子的表達(dá)，從而完成了本發(fā)明。
[0026]已知含有維生素A的載體向肝星狀細(xì)胞(專利文獻(xiàn)3、專利文獻(xiàn)4)或肝星狀細(xì)胞株(專利文獻(xiàn)3、專利文獻(xiàn)5)、肺(專利文獻(xiàn)6)和骨髄(專利文獻(xiàn)7)中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞遞送藥物、在該載體上載持有針對(duì)HSP47的siRNA的組合物可使肝纖維化(專利文獻(xiàn)
3)、肺纖維化(專利文獻(xiàn)6)和骨髄纖維化(專利文獻(xiàn)7)得到改善，但是到目前為止對(duì)于其與腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞、腸纖維化的關(guān)系還完全不清楚。
[0027]即，本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案。
[0028](I) 一種針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的物質(zhì)遞送用載體，其含有類視黃醇作為針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑。
[0029](2)根據(jù)上述(I)所述的載體,其中,類視黃醇包含視黃醇。
[0030](3)根據(jù)上述(I)或(2)所述的載體，其含有類視黃醇和除類視黃醇以外的載體構(gòu)成要素，且類視黃醇與除類視黃醇以外的載體構(gòu)成要素的摩爾比為8:1~1:4。
[0031](4) 一種腸纖維化處理用醫(yī)藥組合物，其含有上述(I)~(3)中任一項(xiàng)所述的載體、和對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物。
[0032](5) 一種用于由纖維化腸道組織再生正常腸道組織的醫(yī)藥組合物，其含有上述(I)~(3)中任一項(xiàng)所述的載體、和對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物。
[0033](6)根據(jù)上述⑷或(5)所述的醫(yī)藥組合物，其中，對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物選自抑制細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生/分泌的物質(zhì)、細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物質(zhì)、TMP抑制物質(zhì)以及α I抗胰蛋白酶抑制物質(zhì)。
[0034](7)根據(jù)上述(6)所述的醫(yī)藥組合物，其中，抑制細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生/分泌的物質(zhì)為HSP47的抑制劑。[0035](8)根據(jù)上述⑷~(7)中任一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物，其為用時(shí)制備形態(tài)。
[0036](9)上述(4)~⑶中任一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物的制備試劑盒，其包含I個(gè)或I個(gè)以上的容器，所述容器單獨(dú)或組合地包含對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物、類視黃醇以及根據(jù)需要的除類視黃醇以外的載體構(gòu)成物質(zhì)。
[0037](10) 一種針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的物質(zhì)遞送用載體的制造方法，其包含將類視黃醇作為針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑進(jìn)行配合的工序。
[0038](11) 一種腸纖維化處理用醫(yī)藥組合物或用于由纖維化腸道組織再生正常腸道組織的醫(yī)藥組合物的制造方法，其包含分別將類視黃醇作為針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑、將對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物作為有效成分進(jìn)行配合的工序。
[0039](12) 一種腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞株，其來自由腸纖維化患病對(duì)象采集的纖維化腸組織，并具有波形蛋白陽性、a SMA陰性且GFAP陰性的表現(xiàn)型。[0040](13) 一種分離腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的方法，其包含:
[0041](i)從由腸纖維化患病對(duì)象采集的纖維化腸組織獲得細(xì)胞的工序、和
[0042](ii)從⑴中獲得的細(xì)胞中選擇具有波形蛋白陽性、a SMA陰性且GFAP陰性的表現(xiàn)型的細(xì)胞的工序。
[0043](14) 一種制作腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞株的方法，其包含:
[0044](i)從由腸纖維化患病對(duì)象采集的纖維化腸組織獲得細(xì)胞的工序、和
[0045](ii)從⑴中獲得的細(xì)胞中選擇具有波形蛋白陽性、a SMA陰性且GFAP陰性的表現(xiàn)型的細(xì)胞的工序、
[0046]并且包含在工序(i)或(ii)之后將細(xì)胞永生化的工序。
[0047](15) 一種篩選腸纖維化處理因子的方法，其包含:
[0048](i)使上述(12)所述的細(xì)胞株與受檢因子共存的工序、和
[0049](ii)對(duì)因與受檢因子共存而導(dǎo)致的細(xì)胞株的變化進(jìn)行檢測(cè)的工序。
[0050](16) 一種用于篩選腸纖維化處理因子的試劑盒，其包含上述(12)所述的細(xì)胞株。
[0051]發(fā)明效果
[0052]本發(fā)明的腸纖維化處理用組合物的準(zhǔn)確的作用機(jī)制尚未完全弄清楚，但認(rèn)為是類視黃醇作為針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑發(fā)揮功能，通過將有效成分例如對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物等遞送到這些細(xì)胞，從而起到抗腸纖維化的效果。
[0053]因此，利用含有類視黃醇作為靶向劑的本發(fā)明的載體由于能夠?qū)⒂行С煞指咝У剡f送到作用部位、甚至靶細(xì)胞，因此使到目前為止還沒有根本性治療方法的腸纖維化的治愈、進(jìn)展的抑制或發(fā)病的預(yù)防成為可能，對(duì)人類的醫(yī)療和動(dòng)物的醫(yī)療具有極大的貢獻(xiàn)。
[0054]另外，本發(fā)明的載體由于能夠與任意的藥劑(例如已有的腸纖維化治療藥)組合而提高其作用效率，因此還具有制劑的應(yīng)用范圍廣、能夠簡便地制造有效的處理劑的優(yōu)點(diǎn)。
[0055]此外，本發(fā)明的細(xì)胞株由于能夠用于腸纖維化治療藥物的篩選、腸纖維化的機(jī)理的闡明等，因此還有助于開發(fā)腸纖維化的新型處理劑和/或處理方法。
【專利附圖】

【附圖說明】[0056]圖1為表示SAMPl/Yit小鼠的腸纖維化部位的星狀細(xì)胞樣間質(zhì)細(xì)胞的局部分布的照片圖。(a)表示偶氮卡紅(Asan)染色圖像、(b)表示用抗波形蛋白抗體時(shí)的熒光免疫染色圖像、(C)表示用抗a SMA抗體時(shí)的熒光免疫染色圖像、(d)表示用抗GFAP抗體時(shí)的熒光免疫染色圖像。箭頭表示星狀細(xì)胞樣間質(zhì)細(xì)胞的位置。另外，比例尺在(a)表示100 μ m、在
(b)~(d)表示 50 μ m。
[0057]圖2為表示從SAMPl/Yit小鼠的腸纖維化部位分離的間質(zhì)細(xì)胞系IC10_F2(上一行)和來自其的波形蛋白陽性、a SMA陰性、GFAP陰性細(xì)胞株IC10_F2_E9 (下一行)的波形蛋白和aSMA的表達(dá)的照片圖。比例尺表不50 μ m。
[0058]圖3為表示IC10_F2細(xì)胞和IC10_F2_E9細(xì)胞的波形蛋白、a SMA, ADRP, LRAT和LXRP的相對(duì)表達(dá)的圖。
[0059]圖4為表示將針對(duì)HSP47的siRNA載持于VA結(jié)合脂質(zhì)體并導(dǎo)入IC10_F2_E9細(xì)胞時(shí)的HSP47的相對(duì)表達(dá)的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0060]本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的物質(zhì)遞送用載體，其含有類視黃醇作為針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑。本發(fā)明載體的一個(gè)方式含有用于靶向于腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的有效量的類視黃醇。另外，本發(fā)明載體的一個(gè)方式還涉及利用類視黃醇而靶向化于腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的載體。
[0061 ] 本發(fā)明中，腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞只要是存在于腸道的具有細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生能力的細(xì)胞則沒有特別限定，例如包括存在于腸道的星狀細(xì)胞樣細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞、纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞。存在于腸道的基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞并不僅僅是存在于腸道的細(xì)胞來源的細(xì)胞，也可以包括循環(huán)血液中的纖維細(xì)胞來源的細(xì)胞、或通過內(nèi)皮間質(zhì)分化轉(zhuǎn)化而從上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)I)。
[0062]作為星狀細(xì)胞樣細(xì)胞，可列舉出例如在下文實(shí)施例中鑒定的具有波形蛋白陽性、aSMA(a平滑肌肌動(dòng)蛋白)陰性且GFAP (膠質(zhì)纖維酸性蛋白)陰性的表現(xiàn)型的細(xì)胞。所述細(xì)胞為通過使用了經(jīng)可檢測(cè)地標(biāo)記的抗波形蛋白抗體、抗a SMA抗體和抗GFAP抗體的免疫染色等鑒定的細(xì)胞。該細(xì)胞可以表達(dá)VA (維生素A)儲(chǔ)藏相關(guān)基因，例如ADRP (脂肪分化相關(guān)蛋白)、LRAT(卵磷脂視黃醇酰基轉(zhuǎn)移酶)和/或LXRii (肝X受體β )等。肝星狀細(xì)胞當(dāng)在體外進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)活化，成為a SMA陽性且GFAP陽性，但上述星狀細(xì)胞樣細(xì)胞即使在體外進(jìn)行培養(yǎng)a SMA和GFAP也不會(huì)成為陽性。肌成纖維細(xì)胞以波形蛋白和a SMA的表達(dá)為特征，成纖維細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞特征性的波形蛋白但不表達(dá)a SMA,因此能夠通過波形蛋白和a SMA的二重染色等來鑒定。腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞還可以通過從由腸道組織獲得的細(xì)胞中選擇具有波形蛋白陽性、a SMA陰性且GFAP陰性的表現(xiàn)型的細(xì)胞來得到。
[0063]本發(fā)明中的類視黃醇作為針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑(targeting agent)發(fā)揮功能，其是促進(jìn)針對(duì)該細(xì)胞的特異性的物質(zhì)遞送的物質(zhì)。類視黃醇促進(jìn)物質(zhì)遞送的機(jī)理尚未完全弄清楚，但認(rèn)為例如與RBP(視黃醇結(jié)合蛋白，retinolbinding protein)特異性地結(jié)合的類視黃醇通過位于腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的細(xì)胞表面上的某種受體而被該細(xì)胞攝入。
[0064]類視黃醇是具有4個(gè)類異戊二烯單元頭對(duì)尾式地連接而成的骨架的化合物的組中的 I 員(參照 G.P.Moss, “Biochemical Nomenclature and Related Documents,，，2ndEd.Portland Press, pp.247-251 (1992))，維生素A是定性地表示視黃醇的生物學(xué)活性的類視黃醇的一般性描述因子。作為本發(fā)明中可以使用的類視黃醇，沒有特別限定，可列舉出例如視黃醇(包括全反式視黃醇)、視黃醛、視黃酸(包括維甲酸)、視黃醇與脂肪酸的酯、月旨肪族醇與視黃酸的酯、依曲替酯、異維甲酸、阿達(dá)帕林、阿維a、他扎羅汀、棕櫚酸視黃酯等類視黃醇衍生物、以及芬維A胺(4-HPR)、蓓薩羅丁等維生素A類似物。
[0065]其中，從針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的特異性的物質(zhì)遞送的效率的角度出發(fā)，優(yōu)選視黃醇、視黃醛、視黃酸、視黃醇與脂肪酸的酯(例如乙酸視黃酯、棕櫚酸視黃酯、硬脂酸視黃酯和月桂酸視黃酯等)以及脂肪族醇與視黃酸的酯(例如視黃酸乙酯等)。
[0066]包括類視黃醇的順-反式在內(nèi)的所有異構(gòu)體都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。類視黃醇也可以被I個(gè)或2個(gè)以上的取代基取代。本發(fā)明中的類視黃醇當(dāng)然包括分離狀態(tài)的類視黃醇，也包括溶解或混合于能夠溶解或保持類視黃醇的介質(zhì)的狀態(tài)的類視黃醇。
[0067]本發(fā)明中的類視黃醇還包括包含類視黃醇作為其一部分的化合物(含有類視黃醇部分的化合物)。所述化合物可以包含I個(gè)或2個(gè)以上、例如I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、或多于10個(gè)的類視黃醇部分。在所述化合物中，類視黃醇的RBP結(jié)合部位(例如在視黃醇的情況下為環(huán)己烯環(huán)部分)可以以能夠與RBP結(jié)合的狀態(tài)存在。作為所述化合物，沒有限定，可列舉出I個(gè)或2個(gè)以上類視黃醇與PEG或其衍生物結(jié)合而成的化合物等。在所述類視黃醇-PEG結(jié)合物中，類視黃醇的RBP非結(jié)合部位(例如視黃醇的情況下為除環(huán)己烯環(huán)部分以外的部分，例如OH基等)可以共價(jià)鍵合于PEG或其衍生物。PEG或其衍生物可以具有I~50個(gè)重復(fù)單元(CH2CH2O)。PEG或其衍生物的分子量可以為200~4000g/mol。PEG或其衍生物可以為線狀或分支狀。PEG衍生物在其末端可以具有適合與類視黃醇結(jié)合的基團(tuán)，例如氨基等。PEG衍生物在鏈中可以具有I個(gè)或2個(gè)以上、例如I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、或多于10個(gè)的酰胺基。
[0068]本發(fā)明的載體可以由這些類視黃醇本身構(gòu)成，也可以通過使類視黃醇結(jié)合或包含于另外的載體構(gòu)成成分來構(gòu)成。因此，本發(fā)明的載體可以含有除類視黃醇以外的載體構(gòu)成成分。作為該成分，沒有特別限定，可以使用醫(yī)藥和藥學(xué)領(lǐng)域中已知的任意成分，優(yōu)選可包含類視黃醇或可與類視黃醇結(jié)合的成分。
[0069]作為這種成分，可列舉出脂質(zhì)、例如甘油磷脂等磷脂、鞘磷脂等鞘脂、膽固醇等甾醇、大豆油、罌粟油等植物油、礦物油、蛋黃卵磷脂等卵磷脂類、聚合物等，但并不限定于這些。其中，優(yōu)選可構(gòu)成脂質(zhì)體的物質(zhì)，例如卵磷脂等天然磷脂、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)等半合成磷脂、二油酰磷脂酰膽堿(DOPE)、二亞油酰磷脂酰膽堿(DLPC)、膽固醇等。
[0070]作為特別優(yōu)選的成分，可列舉出可避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕獲的成分、例如Ν-(α-三甲基胺基乙?；?-二(十二烷基)-D-谷氨酰氯(TMAG)、N，N’，N’’，N’’ ’ -四甲基-N，N’，N’ ’，N’ ’ ’ -四棕櫚基精胺(TMTPS)、2，3- 二油烯氧基_N_[2 (精胺甲酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙烯胺三氟乙酸酯(DOSPA)、Ν-[1-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N，N, N-三甲基氯化銨(DOTMA)、二(十八烷基)二甲基氯化銨(DODAC)、二(十二烷基)溴化銨(DDAB)、1，2-二油烯氧基-3-三甲基胺基丙烷(DOTAP)、3β-[N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)胺基甲酰基]膽固醇(DC-Chol)、1，2_二肉豆蘧酰氧基丙基-3-二甲基羥基乙基銨(DMRIE)、O，O’ - 二(十四烷基)-Ν-(α-三甲基胺基乙?；?二乙醇胺氯化物(DC-6-14)等陽離子性脂質(zhì)。
[0071] 本發(fā)明中的載體可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)。作為所述結(jié)構(gòu)，沒有特別限定，可列舉出直鏈狀或分支狀的線狀結(jié)構(gòu)、膜狀結(jié)構(gòu)、球狀結(jié)構(gòu)等。因此，載體沒有特別限定可具有樹形分子(dendrimer)、dendron、膠束、脂質(zhì)體、乳液、微球、毫微球等任意的三維形態(tài)。另外，本發(fā)明中的載體的一個(gè)方式為可通過靶向劑(包含靶向分子、靶向部分等)進(jìn)行主動(dòng)靶向的載體。具有三維形態(tài)的載體、可主動(dòng)靶向的載體在本【技術(shù)領(lǐng)域】中是熟知的(例如參照Marcucci and Lefoulon, Drug Discov Today.2004Marl；9(5):219_28、Torchilin, Eur JPharm Sc1.20000ct ；llSuppl2:S81_91 等)。
[0072]本發(fā)明的類視黃醇與載體的結(jié)合或包含也可以通過下述方法實(shí)現(xiàn):利用化學(xué)和/或物理方法將類視黃醇結(jié)合或包含在載體的其他構(gòu)成成分上?；蛘?，本發(fā)明的類視黃醇與載體的結(jié)合或包含也可以通過下述方法實(shí)現(xiàn):在該載體的制作時(shí)，將類視黃醇與除類視黃醇以外的載體構(gòu)成成分混合。本發(fā)明的載體上的類視黃醇的量可以設(shè)定為:例如0.01~1000nmol/ μ 1、優(yōu)選0.1~IOOnmol/μ I。另外,在含有類視黃醇與除類視黃醇以外的載體構(gòu)成成分的本發(fā)明的載體中，類視黃醇與除類視黃醇以外的載體構(gòu)成成分的摩爾比沒有限定，例如可以為8:1~1:4或4:1~1:2。類視黃醇與載體的結(jié)合或包含也可以在使遞送物載持于該載體之前進(jìn)行，也可以通過將載體、類視黃醇和遞送物等同時(shí)混合等來進(jìn)行，或者通過將處于已載持有遞送物的狀態(tài)的載體與類視黃醇混合等來進(jìn)行。因此，本發(fā)明還涉及一種腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞特異性的制劑的制造方法，其包括將類視黃醇與已知的任意的藥物結(jié)合載體或藥物封入載體例如DaunoXome?、Doxil、Caelyx?、Myocet?等脂質(zhì)體制劑結(jié)合的工序。
[0073]本發(fā)明的載體的形態(tài)只要能夠?qū)⑺Ｍ奈镔|(zhì)或物體搬運(yùn)到作為靶的腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞，則任何形態(tài)均可以，例如，并非是進(jìn)行限定，可以采用聚合物、樹形分子、dendron、高分子膠束、脂質(zhì)體、乳膠、微球、毫微球等中的任意形態(tài)。在本發(fā)明中，從遞送效率高低、能夠遞送的物質(zhì)的選擇范圍的寬窄和制劑的容易性等觀點(diǎn)出發(fā)，這些載體中優(yōu)選脂質(zhì)體形態(tài)，其中特別優(yōu)選含有陽離子性脂質(zhì)的陽離子性脂質(zhì)體。當(dāng)載體為脂質(zhì)體形態(tài)時(shí)，類視黃醇與除類視黃醇以外的脂質(zhì)體構(gòu)成脂質(zhì)的摩爾比為:當(dāng)考慮類視黃醇與載體的結(jié)合或包含的效率性時(shí)，優(yōu)選為8:1~1:4、更優(yōu)選為4:1~1:2。
[0074]本發(fā)明的載體中所含的類視黃醇只要以作為靶向劑發(fā)揮功能的形態(tài)存在，則可以在本發(fā)明的載體的內(nèi)部含有搬運(yùn)物，也可以附著地存在于搬運(yùn)物的外部，另外，還可以與搬運(yùn)物混合。這里，作為靶向劑發(fā)揮功能是指含有類視黃醇的載體比不含類視黃醇的載體更為迅速和/或大量地到達(dá)和/或被攝入到作為靶細(xì)胞的腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞中，這可通過例如將帶有標(biāo)記或含有標(biāo)記的載體添加至靶細(xì)胞的培養(yǎng)物中，在規(guī)定時(shí)間后對(duì)標(biāo)記的存在部位進(jìn)行分析來容易地確認(rèn)。從結(jié)構(gòu)上來說，只要例如類視黃醇最晚在到達(dá)靶細(xì)胞之前、至少部分地露出在載體(例如載體具有三維結(jié)構(gòu)時(shí)等)或含有載體的制劑的外部，則可滿足上述要件。這里，“制劑”是包括后述的本發(fā)明的組合物、并進(jìn)一步具有形態(tài)的概念。類視黃醇是否露出至制劑的外部可以通過使制劑與特異性結(jié)合類視黃醇的物質(zhì)、例如視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)等相接觸、研究在制劑上的結(jié)合來進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0075]使類視黃醇最晚在到達(dá)靶細(xì)胞之前至少部分地露出在載體或制劑的外部，例如可以通過調(diào)節(jié)類視黃醇與除類視黃醇以外的載體構(gòu)成成分的配比等來實(shí)現(xiàn)。另外，載體具有脂質(zhì)體等脂質(zhì)結(jié)構(gòu)體的形態(tài)時(shí)，例如在對(duì)除類視黃醇以外的載體構(gòu)成成分和類視黃醇進(jìn)行復(fù)合物化時(shí)，使用首先將由除類視黃醇以外的載體構(gòu)成成分構(gòu)成的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)體稀釋在水性溶液中、接著使其與類視黃醇相接觸、混合等的方法。此時(shí)，類視黃醇還可是溶解在溶劑、例如DMSO等有機(jī)溶劑中的狀態(tài)。這里，脂質(zhì)結(jié)構(gòu)體是指具有任意的三維結(jié)構(gòu)例如線狀、膜狀、球狀等形狀的含有脂質(zhì)作為構(gòu)成成分的結(jié)構(gòu)體，沒有限定，包含脂質(zhì)體、膠束、脂質(zhì)微小球、脂質(zhì)納米小球、脂質(zhì)乳液等。例如在Zhao and Lee, Adv Drug Deliv Rev.2004 ；56 (8):1193-204>Temming et al.,Drug Resist Updat.2005 ；8 (6):381-402等中記載了也可將與將脂質(zhì)體靶向化而成的載體相同的靶向劑適用于其他藥物載體。
[0076]脂質(zhì)結(jié)構(gòu)體可通過使用例如鹽、或蔗糖、葡萄糖、麥芽糖等糖類、甘油、丙二醇等多元醇等、優(yōu)選使用蔗糖或葡萄糖等滲透壓調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)滲透壓而穩(wěn)定化。另外，可通過加入適度的鹽或緩沖液等PH調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)pH。因此，可在含有這些物質(zhì)的介質(zhì)中進(jìn)行脂質(zhì)結(jié)構(gòu)體的制造、保存等。此時(shí)，滲透壓調(diào)節(jié)劑的濃度優(yōu)選調(diào)節(jié)到與血液等張。例如蔗糖的情況下，介質(zhì)中的濃度沒有限定，可以為3~15重量％、優(yōu)選為5~12重量％、更優(yōu)選為8~10重量％、特別優(yōu)選為9重量％ ;葡萄糖的情況下，介質(zhì)中的濃度沒有限定，可以為I~10重量％、優(yōu)選為3~8重量％、更優(yōu)選為4~6重量％、特別優(yōu)選為5重量％。
[0077]本發(fā)明還涉及一種針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的物質(zhì)遞送用載體的制造方法，其包含將類視黃醇作為針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑進(jìn)行配合的工序。關(guān)于類視黃醇的配合方法，只要類視黃醇在所配合的載體中能夠作為針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑發(fā)揮功能，則沒有特別限定，例如可以采用本說明書中記載的各種方法。因此，關(guān)于類視黃醇的配合，可通過利用化學(xué)和/或物理方法將類視黃醇結(jié)合或包含于載體的其他構(gòu)成成分，或在制作載體時(shí)通過將類視黃醇與除類視黃醇以外的載體構(gòu)成成分混合等來進(jìn)行。類視黃醇的配合量等已在有關(guān)本發(fā)明的載體的內(nèi)容中敘述。
[0078]本載體的遞送物并無特殊限制，優(yōu)選為能夠從給藥部位向著靶細(xì)胞存在的病變部位在生物體內(nèi)物理移動(dòng)的大小。因此，本發(fā)明的載體除了可以搬運(yùn)原子、分子、化合物、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)外，還可以搬運(yùn)載體、病毒顆粒、細(xì)胞、由I個(gè)以上要素構(gòu)成的藥物釋放系統(tǒng)、微型設(shè)備(micromachine)等物體。上述遞送物優(yōu)選具有對(duì)祀細(xì)胞產(chǎn)生某些影響的性質(zhì)，包括例如對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，或?qū)Π屑?xì)胞的活性或增殖(例如增強(qiáng)或抑制其活性或增殖)進(jìn)行控制。
[0079]因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，載體的遞送物是“對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物”。這里，腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性是指腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞所表現(xiàn)出的分泌、攝入、游走等各種活性，在本發(fā)明中，典型地，其中特別是指與腸纖維化的發(fā)病、發(fā)展和/或復(fù)發(fā)等相關(guān)的活性。作為所述活性，例如，沒有限定，可列舉出例如膠原、蛋白聚糖、細(xì)胞粘合素、纖連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、骨橋蛋白、骨粘連蛋白、彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分等的產(chǎn)生、分泌以及這些細(xì)胞外基質(zhì)成分的分解活性的抑制等。
[0080]因此，本說明書中，對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物可以是直接或間接地抑制與腸纖維化的發(fā)病、發(fā)展和/或復(fù)發(fā)相關(guān)的所述細(xì)胞的物理、化學(xué)和/或生理作用等的任何藥物，并不是進(jìn)行限定，包括抑制上述細(xì)胞外基質(zhì)成分等的產(chǎn)生/分泌的物質(zhì)、細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物質(zhì)、TIMP(Tissue inhibitor ofmetalloproteinase)抑制物質(zhì)、α I抗胰蛋白酶抑制物質(zhì)等。
[0081]作為抑制細(xì)胞外基質(zhì)成分等的產(chǎn)生/分泌的物質(zhì)，沒有限定，可列舉出例如抑制膠原、蛋白聚糖、細(xì)胞粘合素、纖連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、骨橋蛋白、骨粘連蛋白、彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分的表達(dá)的RNAi分子、核酶、反義核酸等物質(zhì)、或顯性失活突變體等具有顯性失活效果的物質(zhì)、表達(dá)它們的載體、和用它們進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)化而得到的細(xì)胞等。上述細(xì)胞外基質(zhì)成分中，作為抑制膠原的產(chǎn)生/分泌的藥物，進(jìn)一步可列舉出，并不是進(jìn)行限定，例如針對(duì)作為各種類型的膠原的合成過程中共通的細(xì)胞內(nèi)輸送和分子成熟化所必須的膠原特異性分子伴侶的HSP(熱休克蛋白，heat shockprotein)47的抑制物質(zhì)、例如HSP47的RNAi分子、核酶、反義核酸等HSP47表達(dá)抑制物質(zhì)、或HSP47的顯性失活突變體等具有顯性失活效果的物質(zhì)、表達(dá)它們的載體、和用它們進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)化而得到的細(xì)胞等等。[0082]作為細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)，沒有限定，可列舉出例如異環(huán)磷酰胺、尼莫司汀(例如鹽酸尼莫司汀)、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、美法侖、雷莫司汀等烷化劑，吉西他濱(例如鹽酸吉西他濱)、依諾他濱、阿糖胞苷?十八烷基磷酸鈉、阿糖胞苷制劑、替加氟?尿嘧啶、替加氟.吉莫斯特.氧嗪酸鉀配合劑(例如TS-1)、去氧氟尿苷、羥基脲、氟尿嘧啶、氨甲喋呤、巰基嘌呤等抗代謝劑，依達(dá)比星(例如鹽酸依達(dá)比星)、表柔比星(例如鹽酸表柔比星)、柔紅霉素(例如鹽酸柔紅霉素、檸檬酸柔紅霉素)、阿霉素(例如鹽酸阿霉素)、吡柔比星(例如鹽酸吡柔比星)、博來霉素(例如鹽酸博來霉素)、培洛霉素(例如硫酸培洛霉素)、米托蒽醌(例如鹽酸米托蒽醌)、絲裂霉素C等抗腫瘤性抗生素，依托泊甙、伊立替康(例如鹽酸伊立替康)、長春瑞濱(例如酒石酸長春瑞濱)、多西他賽(例如多西他賽水合物)、紫杉醇、長春新堿(例如硫酸長春新堿)、長春地辛(例如硫酸長春地辛)、長春堿(硫酸長春堿)等生物堿，阿那曲唑、他莫昔芬(例如檸檬酸他莫昔芬)、托瑞米芬(例如檸檬酸托瑞米芬)、比卡魯胺、氟他胺、雌莫司汀(例如磷酸雌莫司汀)等激素療法劑，鉬爾定、順鉬(CDDP)、奈達(dá)鉬等鉬絡(luò)合物，沙利度胺、新伐司他、貝伐單抗等新生血管抑制劑，L -門冬酰胺酶等。
[0083]作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物質(zhì)，并不是進(jìn)行限定，可列舉出例如COmpOUnd861、膠霉毒素(gliotoxin)、阿托伐他汀等。
[0084]作為--ΜΡ (例如--ΜΡ1、--ΜΡ2、--ΜΡ3等)的抑制物質(zhì)，并不是進(jìn)行限定，可列舉出例如抗TIMP的抗體等TIMP活性抑制物質(zhì)、針對(duì)TIMP的RNAi分子、核酸、反義核酸等TIMP產(chǎn)生抑制物質(zhì)、表達(dá)它們的載體、和用它們進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)化而得到的細(xì)胞等。
[0085]作為α I抗胰蛋白酶抑制物質(zhì)，并不是進(jìn)行限定，可列舉出例如抗α I抗胰蛋白酶的抗體等α I抗胰蛋白酶活性抑制物質(zhì)、針對(duì)α I抗胰蛋白酶的RNAi分子、核酸、反義核酸等α I抗胰蛋白酶產(chǎn)生抑制物質(zhì)、表達(dá)它們的載體、和用它們進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)化而得到的細(xì)胞
坐寸ο
[0086]另外，本發(fā)明中的“對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物”可以是直接或間接地促進(jìn)與腸纖維化的發(fā)病、發(fā)展和/或復(fù)發(fā)的抑制直接或間接地相關(guān)的腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的物理、化學(xué)和/或生理作用等的任意藥物。
[0087]本發(fā)明的載體能夠遞送上述藥物中的I種或2種以上。
[0088]本發(fā)明中的RNAi 分子包括 siRNA(小干擾 RNA, small interfering RNA)、miRNA (微小 RNA, micro RNA)、shRNA (短發(fā)夾 RNA, short hairpin RNA)、piRNA (Piwi 蛋白相作用的 RNA, Piw1-1nteracting RNA)、rasiRNA (重復(fù)相關(guān) siRNA, repeat associatedsiRNA)等雙鏈RNA和它們的變體。RNAi分子和表達(dá)RNAi的載體可以按照例如普通的教科書(例如実験醫(yī)學(xué)別冊(cè)改訂R N A i実験口卜-一> 2004年羊土社、RN A i実験々^這t' Q & A 2006年羊土社等)的教導(dǎo)使用。
[0089]關(guān)于這些RNAi的設(shè)計(jì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過參照作為靶的基因的信使RNA序列和已知的RNAi的序列，按照普通的教科書(実験醫(yī)學(xué)別冊(cè)改訂RN A i実験Y π卜-一^ 2004年羊土社、RNAi実験々6 (? t Q & A 2006年羊土社)的教導(dǎo)適當(dāng)進(jìn)行。
[0090]另外，本發(fā)明中的核酸包括RNA、DNA、PNA或它們的復(fù)合物。
[0091]作為本發(fā)明的載體的遞送物，沒有限定，可以是抑制腸纖維化的發(fā)病、進(jìn)展和/或復(fù)發(fā)的除上述藥物以外的藥物，例如，并不是進(jìn)行限定，可列舉出TGFii I抑制劑(包括TGF β I疫苗)、己酮可可堿及其代謝物、磷酸二酯酶4抑制劑、HMG-CoA還原酶抑制劑、大建中湯、普伐他汀、脂氧素A4類似物、硫酸基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、纖維化促進(jìn)因子(例如EGF、bFGF、FGF2、PDGF、IGF-1、IGF-11、CTGF、IL-1β、IL-4、IL-13、MCP_1、MIP_1α ,MIP-1β、ΜΙΡ_3α、NODl配體、TLR2、4和5的配體、半乳糖凝集素3、透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、膠原等)的抑制劑、抑制作為腸纖維化發(fā)病的原因的炎癥的藥物、例如柳氮磺吡啶、美沙拉嗪、奧沙拉嗪、巴柳氮等氨基水楊酸系藥劑、氫化潑尼松、布地奈德等皮質(zhì)類固醇藥、硫唑嘌呤、巰基嘌呤、環(huán)孢菌素、氨甲蝶呤等免疫抑制劑、英夫利昔等TNF α抑制劑、以及甲硝唑(metronidazole)、環(huán)丙沙星等抗生素等。這些藥物還可以與后述的本發(fā)明的組合物并用。這里，“并用”是指將本發(fā)明的組合物與上述藥物實(shí)質(zhì)上同時(shí)給藥、和在相同的處理期間內(nèi)在時(shí)間上隔開間隔地給藥。在前者的情況下，本發(fā)明的組合物可以與上述藥物混合后給藥、也可以不混合而連續(xù)地給藥；在后者的情況下，本發(fā)明的組合物可以在上述藥物之前給藥，也可以在上述藥物之后給藥。
[0092]本發(fā)明的一個(gè)方式中，作為對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物，可列舉出HSP47的抑制劑，例如針對(duì)HSP47的siRNA等。
[0093]本發(fā)明的載體所遞送的物質(zhì)或物體可以被標(biāo)記也可以未被標(biāo)記。通過進(jìn)行標(biāo)記，能夠監(jiān)測(cè)向靶細(xì)胞的遞送是否成功、靶細(xì)胞的增減等，不僅僅在試驗(yàn)、研究水平特別有用，特別是在臨床水平也是有用的。標(biāo)記可以選自本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意標(biāo)記，例如任意的放射性同位素、磁性體、在氣體或生理?xiàng)l件下產(chǎn)生氣體的物質(zhì)、產(chǎn)生核磁共振的元素(例如氫、磷、鈉、氟等)、對(duì)產(chǎn)生核磁共振的元素的弛豫時(shí)間產(chǎn)生影響的物質(zhì)(例如金屬原子或含有其的化合物)、與標(biāo)記化物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)(例如抗體等)、熒光物質(zhì)、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、生物素或其衍生物、抗生物素蛋白或其衍生物和酶等。標(biāo)記還可以附著于載體構(gòu)成成分，也可以作為獨(dú)立的遞送物載持在載體上。
[0094]本發(fā)明中，“腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞用”或“腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞遞送用”是指適于將腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞作為靶細(xì)胞使用，其包括例如能夠向所述細(xì)胞比向其他細(xì)胞例如正常細(xì)胞更迅速、高效和/或大量地遞送物。例如，與向其他細(xì)胞相比，本發(fā)明的載體能夠以1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.5倍以上、2倍以上、進(jìn)而3倍以上的速度和/或效率向腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞遞送物質(zhì)。
[0095]本發(fā)明還涉及含有所述載體和所述對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物的、用于對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的、用于對(duì)腸纖 維化進(jìn)行處理的或用于由纖維化腸道組織再生正常腸道組織的組合物以及所述載體在這些組合物的制造中的用途。本發(fā)明組合物的一個(gè)方式含有用于靶向于腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的有效量的類視黃醇。另外，本發(fā)明組合物的一個(gè)方式為利用類視黃醇靶向于腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞。
[0096]本發(fā)明中的腸纖維化是指以腸壁中的瘢痕組織的過量蓄積為特征的病理狀態(tài)，包括繼發(fā)于慢性的腸道炎癥、例如慢性化的炎癥性腸道疾病(藥劑性腸炎、感染性腸炎等原因確定的特異性炎癥性腸道疾病、和克隆氏病、潰瘍性結(jié)腸炎等原因不明的非特異性炎癥性腸道疾病)、放射線照射導(dǎo)致的組織損傷、伴隨著手術(shù)或外傷的腸道粘連等的腸纖維化。
[0097]本發(fā)明中，“由纖維化腸道組織再生正常腸道組織”是指使因纖維化而變質(zhì)的腸道組織回復(fù)到至少纖維化較為輕度的狀態(tài)。即，隨著腸道纖維化的進(jìn)展，腸道組織被替換成以細(xì)胞外基質(zhì)為代表的纖維組織，將該趨勢(shì)逆轉(zhuǎn)，使增生的纖維組織替換為原來的正常組織即本發(fā)明中的由纖維化腸道組織再生正常腸道組織。因此，本發(fā)明中的由纖維化腸道組織再生正常腸道組織不僅僅包括使纖維化腸道組織完全回復(fù)到原來的狀態(tài)，還包括使纖維化腸道組織部分地回復(fù)到原來的狀態(tài)。正常腸道組織再生的程度可采用試樣活檢等組織學(xué)檢查并基于組織結(jié)構(gòu)的正常化、纖維組織所占的區(qū)域的縮小、正常組織所占的區(qū)域的擴(kuò)大等來進(jìn)行評(píng)價(jià)，當(dāng)在利用本組合物進(jìn)行處理之前可見纖維化所引起的生化學(xué)指標(biāo)等的異常的情況下，也可通過該指標(biāo)等的改善等來進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0098]本發(fā)明的組合物中，只要載體中所含的類視黃醇以作為靶向劑發(fā)揮功能的狀態(tài)存在，則載體可以在其內(nèi)部含有遞送物，也可以附著存在于遞送物的外部，或者也可以與遞送物混合。因此，根據(jù)給藥途徑和藥物釋放模式等的不同，可以將上述組合物用適當(dāng)?shù)牟牧侠缒c溶性包衣劑或定時(shí)崩解性材料包覆，也可以組合到適當(dāng)?shù)乃幬镝尫畔到y(tǒng)中。此外，本發(fā)明的組合物也可以是結(jié)合有類視黃醇的脂質(zhì)體與有效成分的復(fù)合物、即lipoplex的形態(tài)。另外，在載體僅由類視黃醇構(gòu)成的情況下，本發(fā)明的組合物也可以是對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物與類視黃醇的復(fù)合物的形態(tài)。
[0099]本發(fā)明的組合物可以作為醫(yī)藥使用(即醫(yī)藥組合物)，可以通過包括經(jīng)口和非經(jīng)口這兩種在內(nèi)的各種途徑，例如，并不是進(jìn)行限定，可以通過經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、局部、肺內(nèi)、氣道內(nèi)、氣管內(nèi)、支氣管內(nèi)、經(jīng)鼻、經(jīng)胃、經(jīng)腸、直腸內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)、心室內(nèi)、骨髓內(nèi)、淋巴結(jié)內(nèi)、淋巴管內(nèi)、腦內(nèi)、腦脊液腔、腦室內(nèi)、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、腹腔內(nèi)和子宮內(nèi)等途徑給藥，也可以制成適于各給藥途徑的劑型。所述劑型和制劑方法可以適當(dāng)采用任意公知的劑型和制劑方法(例如參照標(biāo)準(zhǔn)薬剤學(xué)、渡邊喜照6編、南江堂、2003年等)。
[0100]例如，作為適于經(jīng)口給藥的劑型，并不是進(jìn)行限定，可列舉出散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、液體制劑、懸浮劑、乳劑、凝膠劑、糖漿劑等，另外，作為適于非經(jīng)口給藥的劑型，可列舉出溶液性注射劑、懸浮性注射劑、乳液性注射劑、用時(shí)制備型注射劑等注射劑。非經(jīng)口給藥用制劑可以為水性或非水性的等滲性無菌溶液或懸浮液的形態(tài)。
[0101]本發(fā)明還涉及一種腸纖維化處理用醫(yī)藥組合物或用于由纖維化腸道組織再生正常腸道組織的組合物的制造方法，其包含分別將類視黃醇作為針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑、將對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物作為有效成分進(jìn)行配合的工序。關(guān)于類視黃醇的配合方法，只要在所配合的組合物中類視黃醇能夠作為針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑發(fā)揮功能，則沒有特別限定，例如可采用本說明書中記載的各種方法。另外，關(guān)于有效成分的配合方法，只要有效成分能夠發(fā)揮規(guī)定的效果，則沒有特別限定，可以采用任意公知的方法。有效成分的配合可以與類視黃醇同時(shí)進(jìn)行，也可以在配合類視黃醇前、或在配合類視黃醇后進(jìn)行。例如在組合物含有除類視黃醇以外的載體構(gòu)成成分的情況下，有效成分的配合可以通過將已配合有類視黃醇作為靶向劑的載體與有效成分混合等來進(jìn)行，也可以將類視黃醇、除類視黃醇以外的載體構(gòu)成成分和有效成分同時(shí)混合等來進(jìn)行，或者也可以通過在將有效成分配合到除類視黃醇以外的載體構(gòu)成成分后，將其與類視黃醇混合等來進(jìn)行。
[0102]類視黃醇的配合量等如在關(guān)于本發(fā)明的載體中已經(jīng)敘述的。此外，關(guān)于有效成分的配合量，在以組合物形式給藥的情況下，可以是能夠抑制腸纖維化的發(fā)病或復(fù)發(fā)、改善病理狀態(tài)、減輕癥狀、或者延緩或使其停止進(jìn)展的量，優(yōu)選是能夠預(yù)防腸纖維化的發(fā)病和復(fù)發(fā)或使其治愈的量，或者是可由纖維化腸道組織再生正常腸道組織的量。另外，優(yōu)選是不會(huì)產(chǎn)生超過給藥所帶來的好處的不良影響的量。所述量是公知的，也可以通過使用了培養(yǎng)細(xì)胞等的體外試驗(yàn)或者通過小鼠、大鼠、狗或豬等動(dòng)物模型的試驗(yàn)來適當(dāng)確定，這樣的試驗(yàn)方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。作為腸纖維化的動(dòng)物模型，可列舉出例如Pizarro etal.,Trends Mol Med.2003May ；9(5):218-22 中記載的動(dòng)物模型(例如 TNBS 誘導(dǎo)模型、DSS誘導(dǎo)模型、噁唑酮誘導(dǎo)模型、⑶4+⑶45RBhigh SCID transfer模型、tg ε 26骨髄嵌合體小鼠、IL-10K0 小鼠、Τ,ΛΑΚΕ 模型、C3H-HeJBir 小鼠、SAMPl/Yit 小鼠、SAMPl/YitFc 小鼠等)。其中，SAMPl/Yit小鼠作為人的克隆氏病的腸纖維化的動(dòng)物模型是有用的。有效成分的配合量可根據(jù)組合物的給藥方式的不同而變化。例如在I次給藥中使用多個(gè)單位的組合物的情況下，I單位組合物中配合的有效成分的量可以設(shè)定為I次給藥所需要的有效成分的量的幾分之一。該配合量的調(diào)整是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠適當(dāng)進(jìn)行的。
[0103]本發(fā)明的載體或組合物可以以任何形態(tài)供給，但從保存穩(wěn)定性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為能夠用時(shí)制備的形態(tài)，例如以在醫(yī)療現(xiàn)場(chǎng)或其附近能夠由醫(yī)生和/或藥劑師、護(hù)士或者其他輔助醫(yī)務(wù)人員等制備的形態(tài)提供。在此情況下，本發(fā)明的載體或組合物以包含這些所必需的構(gòu)成要素中的至少I個(gè)的I個(gè)或2個(gè)以上的容器的形式提供，在使用前，例如使用前24小時(shí)以內(nèi)、優(yōu)選為使用前3小時(shí)以內(nèi)，更優(yōu)選在即將使用前制備。制備時(shí)，可以適當(dāng)使用在進(jìn)行制備的場(chǎng)所通常能夠獲得的試劑、溶劑、調(diào)劑器具等。
[0104]因此，本發(fā)明還涉及所述載體或者所述組合物的制備試劑盒，其包括I個(gè)或2個(gè)以上的容器，所述容器單獨(dú)或組合地含有類視黃醇、和/或遞送物、和/或除類視黃醇以外的載體構(gòu)成物質(zhì)；以及涉及以這種試劑盒的形式提供的所述載體或所述組合物的必要構(gòu)成要素。本發(fā)明的試劑盒，除上述以外，還可以包含有關(guān)本發(fā)明的載體和組合物的制備方法和給藥方法等的指示、例如說明書或CD、DVD等電子記錄介質(zhì)等。另外，本發(fā)明的試劑盒可以包括用于完成本發(fā)明的載體或組合物的全部構(gòu)成要素，但也可以不必包括全部的構(gòu)成要素。因此，本發(fā)明的試劑盒可以不包括在醫(yī)療現(xiàn)場(chǎng)、實(shí)驗(yàn)設(shè)施等通常能夠獲得的試劑或溶劑，例如無菌水、生理鹽水或葡萄糖溶液等。
[0105]本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的、用于對(duì)腸纖維化進(jìn)行處理的、或用于由纖維化腸道組織再生正常腸道組織的方法，其包含將有效量的上述組合物向需要該組合物的對(duì)象進(jìn)行給藥。這里，關(guān)于有效量，例如對(duì)于后者，是指抑制腸纖維化的發(fā)病和復(fù)發(fā)、改善病理狀態(tài)、減輕癥狀或者延遲或使其停止發(fā)展的量，優(yōu)選是可預(yù)防腸纖維化的發(fā)病和復(fù)發(fā)、或使腸纖維化治愈的量，或者是可由纖維化腸道組織再生正常腸道組織的量。另外，優(yōu)選為不會(huì)產(chǎn)生超過給藥所帶來的好處的不良影響的量。所述量可以通過使用了培養(yǎng)細(xì)胞等的體外試驗(yàn)或者通過小鼠、大鼠、狗或豬等動(dòng)物模型的試驗(yàn)來適當(dāng)確定，這樣的試驗(yàn)方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。另外，載體中所含的類視黃醇以及本發(fā)明的方法中使用的藥物的用量對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是公知的，或者可以通過上述試驗(yàn)等來適當(dāng)確定。作為腸纖維化的動(dòng)物模型，如上文所述。
[0106]在本發(fā)明的方法中，進(jìn)行給藥的組合物的具體用量可以考慮與需要處理的對(duì)象相關(guān)的各種條件，例如癥狀的嚴(yán)重程度、對(duì)象的一般健康狀態(tài)、年齡、體重、對(duì)象的性別、飲食、給藥途徑、給藥的時(shí)期和頻率、并用的醫(yī)藥、對(duì)治療的反應(yīng)性以及對(duì)治療的依從性等來確定。
[0107]作為給藥途徑，包括經(jīng)口和非經(jīng)口這兩種在內(nèi)的各種途徑，例如經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、局部、肺內(nèi)、氣道內(nèi)、氣管內(nèi)、支氣管內(nèi)、經(jīng)鼻、經(jīng)胃、經(jīng)腸、直腸內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)、心室內(nèi)、骨髓內(nèi)、淋巴結(jié)內(nèi)、淋巴管內(nèi)、腦內(nèi)、腦脊液腔、腦室內(nèi)、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、腹腔內(nèi)和子宮內(nèi)等途徑。
[0108]給藥頻率根據(jù)所用組合物的性狀和上述那些對(duì)象的條件的不同而不同，例如可以I日多次(即I日2、3、4次或5次以上)、1日I次、每幾日(即每2、3、4、5、6、7日等)、1周幾次(例如I周2、3、4次等)、每周、每幾周(即每2、3、4周等)。
[0109]在本發(fā)明的方法中，詞語“對(duì)象”是指任意的生物個(gè)體，優(yōu)選為動(dòng)物、更優(yōu)選為哺乳動(dòng)物、進(jìn)一步優(yōu)選為人的個(gè)體。在本發(fā)明中，對(duì)象可以是健康的，也可以患有某種疾病，但在希望對(duì)腸纖維化進(jìn)行處理的情況下，典型地是指患有腸纖維化或有患病危險(xiǎn)的對(duì)象。例如當(dāng)希望預(yù)防腸纖維化時(shí)，并不是進(jìn)行限定，典型的例子是患有炎癥性腸道疾病、伴隨著手術(shù)或外傷等的腸道粘連等作為腸纖維化的原因的疾病的對(duì)象。
[0110]另外，詞語“處理”定義為包括以疾病的治愈、暫時(shí)緩解或預(yù)防等為目的的醫(yī)學(xué)上可容許的所有種類的預(yù)防性和/或治療性干預(yù)。例如，詞語“處理”的含義包括腸纖維化的進(jìn)展的延緩或停止、病變的萎縮或消失、腸纖維化發(fā)病的預(yù)防或復(fù)發(fā)的防止等各種目的的醫(yī)學(xué)上可容許的干預(yù)。
[0111]本發(fā)明還涉及利用了上述載體的、針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的藥物遞送方法。該方法，并不是進(jìn)行限定，包括例如使遞送物載持于上述載體的工序、和將載持了遞送物的載體給予或添加到含有腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的生物或介質(zhì)、例如培養(yǎng)用培養(yǎng)基等的工序。這些工序可以按照公知的任意方法或本說明書中記載的方法等來適當(dāng)完成。上述遞送方法還可以與其他的遞送方法、例如以腸道為靶的其他遞送方法等組合。另外，上述方法還包括在體外進(jìn)行的方式、以及以體內(nèi)的腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞為靶的方式。關(guān)于本發(fā)明的可通過載體輸送的物質(zhì)，如上所述。
[0112]本發(fā)明還涉及一種腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞株，其來自由腸纖維化患病對(duì)象采集的纖維化腸組織、并具有波形蛋白陽性、a SMA陰性且GFAP陰性的表現(xiàn)型。
[0113] 作為腸纖維化患病對(duì)象，沒有限定，可列舉出例如被診斷為腸纖維化的對(duì)象、腸纖維化的動(dòng)物模型。腸纖維化的診斷可通過病歷、利用鋇造影等進(jìn)行的腸道狹窄的確認(rèn)、試樣活檢的病理組織檢查等來進(jìn)行。纖維化腸組織的采集可通過外科手術(shù)、或使用了內(nèi)窺鏡等的活檢等任意可能的方法來進(jìn)行。表現(xiàn)型沒有限定，例如可通過利用抗波形蛋白抗體、抗α SM抗體和抗GFAP抗體的免疫染色、或波形蛋白、a SMA和GFAP基因的表達(dá)分析等來確認(rèn)。上述各抗體可以使用市售品，也可以通過用各蛋白對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫等已知的方法來新制作。上述細(xì)胞株可以表達(dá)HSP47或其同源物(例如gp46)、膠原、VA儲(chǔ)藏相關(guān)基因、例如ADRP、LRAT和/或LXR β等。另外，上述細(xì)胞株即使在體外進(jìn)行培養(yǎng)，a SMA和GFAP也不會(huì)變?yōu)殛栃浴Ｉ鲜黾?xì)胞株還可以通過導(dǎo)入永生化基因(例如SV40T、端粒酶基因等)來進(jìn)行永生化。
[0114]上述細(xì)胞株可以在用于間質(zhì)細(xì)胞的通常的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。作為所述條件，沒有限定，可列舉出例如用含有10% FBS的DMEM、在5% C02、37°C下的培養(yǎng)。
[0115]本發(fā)明還涉及一種分離腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的方法，其包含:
[0116](i)從由腸纖維化患病對(duì)象采集的纖維化腸組織獲得細(xì)胞的工序、和
[0117](ii)從(i)中獲得的細(xì)胞中選擇具有波形蛋白陽性、a SMA陰性且GFAP陰性的表現(xiàn)型的細(xì)胞的工序。[0118]從纖維化腸組織獲得細(xì)胞沒有限定，例如可以對(duì)任意地切細(xì)了的組織進(jìn)行培養(yǎng)，從其中獲得游走細(xì)胞，用蛋白分解酶(例如膠原酶、蛋白酶等)對(duì)組織進(jìn)行處置，從其中獲得分離的細(xì)胞。
[0119]細(xì)胞的選擇沒有限定，例如通過有限稀釋法等將細(xì)胞分離成單細(xì)胞，然后通過免疫染色或基因表達(dá)分析等確認(rèn)各克隆的表現(xiàn)型來進(jìn)行，也可以用細(xì)胞儀對(duì)用抗波形蛋白抗體、抗a SMA抗體和/或抗GFAP抗體進(jìn)行了標(biāo)記的單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行處置來進(jìn)行。
[0120]本發(fā)明還涉及一種制作腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞株的方法，其包含:
[0121](i)從由腸纖維化患病對(duì)象采集的纖維化腸組織獲得細(xì)胞的工序、和
[0122](ii)從(i)中獲得的細(xì)胞中選擇具有波形蛋白陽性、a SMA陰性且GFAP陰性的表現(xiàn)型的細(xì)胞的工序，
[0123]并且包含在工序(i)或(ii)之后使細(xì)胞永生化的工序。
[0124]細(xì)胞的永生化可通過導(dǎo)入永生化基因(例如SV40T、端粒酶基因等)等來進(jìn)行。永生化可以在選擇所希望的表現(xiàn)型的細(xì)胞之前進(jìn)行，也可以在選擇后進(jìn)行。關(guān)于除使細(xì)胞永生化的工序以外的構(gòu)成，關(guān)于分離腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的方法，如上所述。
[0125]本發(fā)明還涉及一種篩選腸纖維化處理因子的方法，其包含:
[0126](i)使來自由上述的腸纖維化患病對(duì)象采集的纖維化腸組織、并具有波形蛋白陽性、a SMA陰性且GFAP陰性的表現(xiàn)型的腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞株與受檢因子共存的工序，和
[0127](ii)對(duì)與受檢因子共存所導(dǎo)致的細(xì)胞株的變化進(jìn)行檢測(cè)的工序。
[0128]本發(fā)明中，受檢因子除了化合物等物質(zhì)外，還包括熱、電磁波(例如電波、光線、X射線、Y射線等)、壓力、PH等各種因子。使細(xì)胞株與受檢因子“共存”是指將細(xì)胞株與受檢因子置于同一介質(zhì)中，但并不一定需要使二者相互接觸。細(xì)胞株與受檢因子的共存例如，沒有限定，包括將細(xì)胞株和受檢因子放入同一容器等。細(xì)胞株與受檢因子的共存可以在體內(nèi)進(jìn)行，也可以在體外進(jìn)行。
[0129]作為與受檢因子共存所導(dǎo)致的細(xì)胞株的變化，沒有限定，可列舉出例如細(xì)胞株的活性的抑制或亢進(jìn)(例如基因表達(dá)或物質(zhì)產(chǎn)生的抑制或亢進(jìn))、細(xì)胞株增殖的抑制或增強(qiáng)等。因此，例如因與受檢因子的共存細(xì)胞株的增殖受到抑制或細(xì)胞株的活性受到抑制表示該受檢因子為腸纖維化處理因子。
[0130]本發(fā)明還涉及一種用于篩選腸纖維化處理因子的試劑盒，其包含來自由上述的腸纖維化患病對(duì)象采集的纖維化腸組織并具有波形蛋白陽性、a SMA陰性且GFAP陰性的表現(xiàn)型的腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞株。本試劑盒中除了所述細(xì)胞株外，還可以包含用于檢測(cè)細(xì)胞株的變化的試劑、有關(guān)使用本試劑盒篩選腸纖維化處理因子的方法的指示、例如說明書或⑶、DVD等電子記錄介質(zhì)等。
[0131]實(shí)施例
[0132]用以下例子進(jìn)一步詳細(xì)地對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但這些例子僅僅是示例，并不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定。
[0133]MA克隆氏病小鼠模型SAMPl/Yit的腸道中的星狀細(xì)胞樣細(xì)胞的鑒定
[0134]為了研究克隆氏病的纖維化中相當(dāng)于肝星狀細(xì)胞的細(xì)胞是否參與，使用了作為克隆氏病小鼠模型的SAMPl/Yit。SAMPl/Yit小鼠如下:使AKR/J小鼠的一母所生的小鼠交配24代制作SAMPl小鼠，使SAMPl小鼠中皮膚具有潰瘍的小鼠進(jìn)一步在近親間交配20代以上得到自然發(fā)病小鼠模型，使該自然發(fā)病小鼠模型到20周齡為止自發(fā)地發(fā)生回腸炎(Matsumoto et.al.，Gut.1998Jul ；43 (I):71_8),其在病理組織上具有可觀察到(i)與克隆氏病類似的炎癥好發(fā)于回腸末端、(ii)病變非連續(xù)且全層性分布、(iii)肌層肥厚、隱窩過度形成、絨毛萎縮、炎癥細(xì)胞向粘膜固有層和粘膜下層浸潤、潘氏細(xì)胞和杯細(xì)胞過度形成、肉芽腫、隱窩膿腫等特征(Kosiewicz et al., J Clin Invest.2001Mar ；107 (6):695-702)。幾乎所有的IBD小鼠模型都是發(fā)生結(jié)腸炎的模型，但認(rèn)為具有上述特征的SAMPl/Yit小鼠是現(xiàn)有的動(dòng)物疾病模型中最接近克隆氏病的病理狀態(tài)的小鼠模型(Pizanx)et al.，Trends Mol Med.2003May ；9 (5):218-22)。
[0135]為了在SAMPl/Yit小鼠的腸道組織中進(jìn)行星狀細(xì)胞樣細(xì)胞的鑒定，通過組織免疫染色法對(duì)回腸纖維化部位進(jìn)行了研究。首先，采集SAMPl/Yit小鼠(29周齡、由Yakult中央研究所提供)的回腸組織。將組織用30%中性福爾馬林固定24小時(shí)后，石蠟包埋，制作成薄切切片，作為樣品切片。對(duì)樣品切片進(jìn)行偶氮卡紅染色，觀察纖維化的狀態(tài)，結(jié)果可見肥厚的肌層細(xì)胞間有膠原纖維的蓄積(圖1(a))。此外，對(duì)連續(xù)切片進(jìn)行使用了針對(duì)肝星狀細(xì)胞標(biāo)記物的抗體的免疫組化分析。作為抗體，使用了抗波形蛋白抗體(Ant1-Vimentin, Abeam, clone RV202, cat.N0.ab8978、標(biāo)記:Alexa Fluor488)、抗 a SMA抗體(Ant1-Glial Fibrillary Acidic Protein,Dako,Polyclonal Rabbit,Code N0.Z0334、標(biāo)記:DyLight633)和抗 GFAP 抗體(Ant1-a-Smooth Muscle Actin, SIGMA, clonelA4,cat.N0.A2547、標(biāo)記:Cy3)。按照常規(guī)進(jìn)行突光免疫染色后，用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果在回腸肌層的纖維化病變部位沿著蓄積的膠原纖維可見大量具有波形蛋白(+)/aSMA( —)/GFAP( —)表現(xiàn)型的細(xì)胞的局部分布(參照?qǐng)D1(b)~(山、箭頭)。另一方面，在作為背景小鼠的AKR/J小鼠的回腸肌層部位未見所述細(xì)胞的存在。該結(jié)果啟示靜止型肝星狀細(xì)胞樣的具有波形蛋白(+)/a SMA( — )/GFAP( 一 )表現(xiàn)型的細(xì)胞參與纖維化。
[0136]Ml從SAMPl/Yit小鼠的纖維化小腸組織建立星狀細(xì)胞樣細(xì)胞株
[0137]為了將例I中觀察到的細(xì)胞在體外進(jìn)行功能分析并進(jìn)而利用其進(jìn)行腸纖維化治療法的研究等，從SAMPl/Yit小 鼠的纖維化小腸組織分離、培養(yǎng)了具有波形蛋白(+)/a SMA ( — )/GFAP( 一 )表現(xiàn)型的星狀細(xì)胞樣細(xì)胞，建立了星狀細(xì)胞樣細(xì)胞株。[0138]首先，采集SAMPl/Yit小鼠(21周齡)的回腸組織，用剪刀細(xì)切至Imm長左右后，浸入到EDTA溶液(HBSS (pH為7.5)中的4.5mM EDTA溶液、以下相同)20mL中，輕輕振蕩。在4°C下靜置15分鐘后，除去上清，再懸浮到新鮮的EDTA溶液中。將EDTA溶液交換5次后，將回腸組織片懸浮到含有10% FBS的DMEM中，播種到6孔培養(yǎng)皿中，在5% CO2中、37°C下進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)開始后的第5日，表現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)的細(xì)胞群附著在培養(yǎng)皿上并開始增殖。此時(shí)，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pMFG-tsT-1RES-neo (Kawano et al.,Blood.2003Janl5 ；101(2):532-40)導(dǎo)入永生化基因SV40T，得到IC10_F2細(xì)胞系(圖2上一行)。之后，通過有限稀釋法和利用上述抗α SM抗體、抗GFAP抗體和抗波形蛋白抗體的免疫染色法對(duì)IC10_F2細(xì)胞系嘗試克隆具有波形蛋白(+) / a SMA ( —)/GFAP ( 一 )表現(xiàn)型的細(xì)胞，結(jié)果建立了具有所述表現(xiàn)型的腸道來源的星狀細(xì)胞樣細(xì)胞株IC10_F2_E9(圖2下一行)。
[0139]用實(shí)時(shí)PCR研究建立的IC10_F2_E9是否表達(dá)作為星狀細(xì)胞特征的VA儲(chǔ)藏相關(guān)基因群。首先，使用 RNeasy Mini Kit (QIAGEN, 74104)由 IC10_F2 細(xì)胞和 IC10_F2_E9 細(xì)胞分別制備全 RNA,使其與逆轉(zhuǎn)錄酶(High Capacity RNA-to-cDNA Master Mix, AppliedBiosystems, 4390713)反應(yīng)，制作 cDNA。使用得到的 cDNA、用 LightCycler(K)480 系統(tǒng)(RocheApplied Science)中的實(shí)時(shí)PCR測(cè)定維生素A儲(chǔ)藏相關(guān)基因群(ADRP、LRAT和LXR β )的表達(dá)量。PCR試劑使用 LightCycler(R)480Probes Master (Roche Applied Science, 4707494)。探針使用 Universal ProbeLibrary Probes (Roche Applied Science)中所含的探針(波形蛋白:Probe#79，4689020、a SMA:Probe#lI，4685105、ADRP:Probe#79，4689020、LRAT:Probe#79，4689020、LXRβ:Probe#106,4692250)。
[0140]另外，使用的引物如下(下文，“F”表示正向引物、“R”表示反向引物)。
[0141]波形蛋白:
[0142]F5’TGCGCCAGCAGTATGAAA3’(序列號(hào) I)
[0143]R5’GCCTCAGAGAGGTCAGCAAA3’(序列號(hào) 2)
[0144]aSMA:
[0145]F5’TCACCATTGGAAACGAACG3’(序列號(hào) 3)
[0146]R5，ATAGGTGGTTTCGTGGATGC3’(序列號(hào) 4)
[0147]ADRP:
[0148]F5，CCTCAGCTCTCCTGTTAGGC3’(序列號(hào) 5)
[0149]R5，CACTACTGCTGCTGCCATTT3’(序列號(hào) 6)
[0150]LRAT:
[0151]F5’GAAGGTGGTCTCCAACAAGC3’(序列號(hào) 7)
[0152]R5，TACTGTGTCCACACGGATGC3’(序列號(hào) 8)
[0153]LXR β:
[0154]F5’GCTCTGCCTACATCGTGGTC3’(序列號(hào) 9)
[0155]R5，CTCATGGCCCAGCATCTT3，(序列號(hào) 10)
[0156]其中，ADRP為局部分布于脂滴膜上且與脂滴的生物合成、代謝相關(guān)的ΡΑΤ(脂肪包被蛋白?脂肪分化相關(guān)蛋白.ΤΙΡ47,Perilipin ^adipophilin.ΤΙΡ47)蛋白中的一種(Leeet al., J Cell Physiol.2010Jun ；223(3):648-57)，LRAT 為視黃醇酯化酶，在肝星狀細(xì)胞中局部分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，并與VA的儲(chǔ)藏相關(guān)(Nagatsuma et al., Liver Int.2009Jan ；29(1):47-54),LXR^為與脂質(zhì)代謝、抗炎癥相關(guān)的核內(nèi)受體，在肝星狀細(xì)胞中可見mRNA水平的表達(dá)(Beaven Sff.et al., Gastroenterology.201 IMar ； 140 (3): 1052-62)。其結(jié)果，與母株IC10_F2相比，IC10_F2_E9顯示ADRP為2.4倍、LRAT為27倍、LXRP為2.4倍的基因表達(dá)(圖3)。其結(jié)果顯示IC10_F2_E9具有星狀細(xì)胞的特征。
[0157]M3 含有SiRNA的VA結(jié)合脂質(zhì)體的制備
[0158](l)siRNA
[0159]以膠原(I~IV型)的共通分子伴侶HSP477 (小鼠、GenBank AccessionN0.X60676)的堿基序列為靶的siRNA使用下述siRNA。
[0160]A:GGACAGGCCUGUACAACUA(從小鼠HSP47的堿基序列上的第969個(gè)堿基開始的有義鏈siRNA序列，序列號(hào)11)
[0161 ] B:UAGUUGUACAGGCCUGUCC (反義鏈 siRNA 序列，序列號(hào) 12)
[0162]作為對(duì)照的si RNArandom(有時(shí)也稱為siRNAscramble (簡寫:scr))使用下述siRNArandom。
[0163]C:CCUCCAAACCAAUUGGAGG(有義鏈 siRNA，序列號(hào) 13)
[0164]D:CCUCCAAUUGGUUUGGAGG(反義鏈 siRNA，序列號(hào) 14)
[0165](2) VA-lip-siRNA 的制備
[0166]作為陽離子性脂質(zhì)，從北海道System Science (Sapporo, Japan)購得以4:3:3的摩爾比含有0，O’ - 二(十四烷基)_ N -(α-三甲基胺基乙?；?二乙醇胺氯化物(DC-6-14)、膽固醇和二油酰磷脂酰膽堿(DOPE)的陽離子性脂質(zhì)體(LipoTrust)。使用前通過在攪拌條件下在經(jīng)冷凍干燥的脂質(zhì)混合物中添加再蒸留水(DDW)，從而以lmM(DC-6-14)的濃度制備脂質(zhì)體。為了制備VA結(jié)合脂質(zhì)體，將溶解于DMSO的20nmol的維生素A (視黃醇、Sigma，USA)與脂質(zhì)體懸浮液(以DC-6-14計(jì)為20nmol)在1.5ml試管中一邊攪拌一邊在25°C下混合。為了制備載持有siRNA HSP47的VA結(jié)合脂質(zhì)體(VA-lip-siRNA HSP47)，將siRNA HSP47溶液(DDW中為3nmol/ml) —邊攪拌一邊在室溫下添加到視黃醇結(jié)合脂質(zhì)體溶液中。siRNA與DC-6-14的摩爾比為1:400。為了獲得適于體外使用的用量，用磷酸緩沖生理鹽水(PBS)對(duì)VA-lip-siRNA進(jìn)行再構(gòu)成。
[0167]Mi:向IC_F2_E9細(xì)胞導(dǎo)入siRNA和HSP47表達(dá)的抑制
[0168]在含有10 % FBS的DMEM中以I X IO4個(gè)/孔含有IC_F2_E9細(xì)胞的6孔MULTIDISH(N140675, Nunc?)中添加100 μ I例3中得到的含有siRNA的VA結(jié)合脂質(zhì)體，在37°C、C025%下孵育I小時(shí)后，更換培養(yǎng)基，進(jìn)一步在37°C、C025%下孵育48小時(shí)。之后，回收細(xì)胞，采用與例2同樣的方法制備全RNA。使得到的全RNA與逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，制作cDNA，然后用實(shí)時(shí)PCR對(duì)HSP47的表達(dá)抑制進(jìn)行評(píng)價(jià)。所用的引物如下所述。
[0169]F:5，GAAGGCTGTCGCCATCTC3，(序列號(hào) 15)
[0170]R:5，CCCAGTCCTGCCAGATGT3’ (序列號(hào) 16)
[0171]由圖4所示的結(jié)果可知，IC10_F2_E9細(xì)胞中HSP47基因得到表達(dá)和該基因的表達(dá)僅被含有siRNA的VA結(jié)合脂質(zhì)體抑制。鑒于siRNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，該結(jié)果表示IC10_F2_E9細(xì)胞具有膠原產(chǎn)生能力，并且類視黃醇作為強(qiáng)烈地促進(jìn)物質(zhì)向腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞即IC10_F2_E9細(xì)胞的攝入的靶向劑發(fā)揮作用。
【權(quán)利要求】
1.一種針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的物質(zhì)遞送用載體，其含有類視黃醇作為針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體,其中,類視黃醇包含視黃醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的載體，其含有類視黃醇和除類視黃醇以外的載體構(gòu)成要素，且類視黃醇與除類視黃醇以外的載體構(gòu)成要素的摩爾比為8:1~1:4。
4.一種腸纖維化處理用醫(yī)藥組合物，其含有上述權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的載體、和對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物。
5.一種用于由纖維化腸道組織再生正常腸道組織的醫(yī)藥組合物，其含有上述權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的載體、和對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的醫(yī)藥組合物，其中，對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物選自抑制細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生/分泌的物質(zhì)、細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物質(zhì)、--ΜΡ抑制物質(zhì)以及α 1抗胰蛋白酶抑制物質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的醫(yī)藥組合物，其中，抑制細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生/分泌的物質(zhì)為HSP47的抑制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求4~7中任一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物，其為用時(shí)制備形態(tài)。
9.權(quán)利要求4~8中任一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物的制備試劑盒，其包含I個(gè)或I個(gè)以上的容器，所述容器單獨(dú)或組合地包含對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物、類視黃醇以及根據(jù)需要的除類視黃醇以外的載體構(gòu)成物質(zhì)。
10.一種針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的物質(zhì)遞送用載體的制造方法，其包含將類視黃醇作為針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑進(jìn)行配合的工序。
11.一種腸纖維化處理用醫(yī)藥組合物或用于由纖維化腸道組織再生正常腸道組織的醫(yī)藥組合物的制造方法，其包含分別將類視黃醇作為針對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑、將對(duì)腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的活性或增殖進(jìn)行控制的藥物作為有效成分進(jìn)行配合的工序。
12.一種腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞株，其來自由腸纖維化患病對(duì)象采集的纖維化腸組織，并具有波形蛋白陽性、a SMA陰性且GFAP陰性的表現(xiàn)型。
13.一種分離腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞的方法，其包含: (i)從由腸纖維化患病對(duì)象采集的纖維化腸組織獲得細(xì)胞的工序、和(?)從⑴中獲得的細(xì)胞中選擇具有波形蛋白陽性、a SMA陰性且GFAP陰性的表現(xiàn)型的細(xì)胞的工序。
14.一種制作腸道中的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞株的方法，其包含: (i)從由腸纖維化患病對(duì)象采集的纖維化腸組織獲得細(xì)胞的工序、和(?)從⑴中獲得的細(xì)胞中選擇具有波形蛋白陽性、a SMA陰性且GFAP陰性的表現(xiàn)型的細(xì)胞的工序、 并且包含在工序(i)或(ii)之后將細(xì)胞永生化的工序。
15.一種篩選腸纖維化處理因子的方法，其包含: (i)使權(quán)利要求12所述的細(xì)胞株與受檢因子共存的工序、和 (?)對(duì)因與受檢因子共存而導(dǎo)致的細(xì)胞株的變化進(jìn)行檢測(cè)的工序。
16.一種用于篩選腸纖維化處理因子的試劑盒，其包含權(quán)利要求12所述的細(xì)胞株。
【文檔編號(hào)】A61K31/713GK103917248SQ201280054464
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月18日
【發(fā)明者】綾部時(shí)芳, 中村公則, 味吞憲二郎, 田中康進(jìn) 申請(qǐng)人:日東電工株式會(huì)社