專利名稱：一種用于燒傷溶痂創(chuàng)面修復的菠蘿蛋白酶膠囊劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于燒傷溶痂創(chuàng)面修復的菠蘿蛋白酶膠囊劑及其制備方法。
背景技術：
迄今為止臨床上祛除燒傷壞死組織的最常用方法仍然是手術削痂。但手術方法除快速有效外，不足之處在于一、徹底的手術清創(chuàng)常以犧牲臨近正常組織為代價，從而導致新創(chuàng)面形成造成病人二次痛苦；二、手術削痂主要是依賴于醫(yī)生的主管判斷，當正常組織與壞死組織無顯著界線時，增大了手術難度與風險特別是功能部位；第三、一般手術削痂都造 成較大量出血，超過10%面積還需準備400——800毫升全血；第四、手術削痂創(chuàng)面愈合恢復期長且較多疤痕難于避免。為了客服上述缺點，業(yè)內(nèi)醫(yī)生一直在尋求使用安全操作方便藥效確定的溶痂藥物。溶痂藥物包括中藥、化學藥物和生化酶制劑三大類。溶痂中藥較常用的有愈創(chuàng)十號、東方一號和水火燙傷膏，因這些藥物無抑菌作用，可使創(chuàng)面感染重，而很少被采用?；瘜W溶痂藥物，即酸性藥物擴散劑，常用的酸性擴散劑有水楊酸、丙酮酸、琥珀酸和檸檬酸等，但因其刺激性給病人帶來痛苦等原因，臨床上早已不被采用。目前臨床上最常用的清創(chuàng)方式仍是手術清創(chuàng)和傳統(tǒng)中藥藥物清創(chuàng)，效果取決于手術醫(yī)師對創(chuàng)面缺血、感染和壞死組織界限的判斷。術后傷口感染因清創(chuàng)不徹底，而徹底清創(chuàng)又易造成鄰近正常組織受損，出現(xiàn)壞疽、缺損、愈合延遲，甚至發(fā)生器官功能障礙。手術脫痂存在著各種風險，不可避免地造成出血，在許多情況下表現(xiàn)出一定局限性。手術造成動脈缺血性潰瘍會因創(chuàng)傷使感染壞死進一步加重。機械性清創(chuàng)對有脆弱肉芽組織生長的傷口造成傷害。菠蘿蛋白酶清創(chuàng)安全、高效、對正常組織無腐蝕作用，有關菠蘿蛋白酶制備溶痂藥物的非專利文獻報道始見于二十世紀七十年代初，專利文獻報道則最早先見于1974年。根據(jù)用中國專利局世界知識產(chǎn)權組織數(shù)據(jù)庫(WIPO DataBase ofChinese Patent Office)的檢索結(jié)果,在已公開的專利中有六篇專科(其中兩篇相同)與本發(fā)明有不同程度的相關，Gerold. K. V. Klein和John. C，Houck在1979年申請的美國專利4，226，854，名稱為用水解酶產(chǎn)品進行失活組織清創(chuàng)(DEBRUDENEBT OF DEVITALIZEDTISSUE WITHHYDROLYTIC ENZYME PRODUCT)專利中，描述了一個等電點為6，至少含有兩個亞基(每個亞基分子量為14，300-15，000道爾頓)的酶混合物的主要特性及其用該酶混合物水溶性制劑進行溶痂的詳細方法。1980年8月25日Klein和Houck 二人又申請了一個專利(專利號為4，307，081)，名稱為酶混合物(ENZYME MIXTURE)，該專利提出，溶痂酶(Escharase)的概念，并在上一個專利的基礎上提出酶混合物的分子量為30，000-50, 000道爾頓，同時提出了一個治療配方(即酶混合物與生理鹽水的配比為1: lhWilliamGalbraith在1981年5月5日提出了一件新的專利申請(美國專利4，361，551)，名稱為酶清創(chuàng)法(METHOD OF ENZYMEDEBRIDEMENT)，該專利詳細描述了酶混合物的分離方法及其特性在半胱氨酸存在條件下的蛋白酶活性為每mgl5-35個酪蛋白活性，0. 5-5個膠原蛋白活性。1991年12月3日Klein和Houck又申請了一件新的美國專利，并于1992年12月2日通過PCT申請了國際專利(PCT/US92/10395)，名稱為含有溶痂酶的蛋白水解酶混合物及該物質(zhì)的分離方法(PROTEOLYTIC MIXTURE CONTAING ESCHARASE AND METHOD OF ISOLATINGSAME)。該專利描述了一種全然不同于以前的分離方法，即以抗壞血酸(Vc)作為抗氧化劑，(NH4) 2S04作為蛋白質(zhì)沉淀劑的分離方法。具體步驟為①將粗酶溶于含有1% Vc的溶液中(4-10°C )—②用HCl調(diào)pH至3. 5-3. 9 ;—③在4-10°C條件下攪拌18小時一④用過濾或離心法去除不溶物一⑤制成40%的(NH4) 2S04飽和溶液(4X10°C )過夜沉淀一⑥離心或過濾，收集沉淀一⑦將沉淀溶于含O.1 % Vc的O. 3M醋酸溶液中(pH3.4，低溫)；一⑧用Amicon DC-30超濾系統(tǒng)過濾一⑨清液凍干稱重即為含有溶痂酶的蛋白水解酶混合物，該混合物中含有1% -1. 5%的溶痂酶(Escharase)，發(fā)明人還給出了溶痂酶的氨基酸組成，并因為該酶缺乏脯氨酸和酪氨酸，發(fā)明人認為它是一種單-蛋白(Unique protein),該酶由三個分子量為15，000道爾頓的亞基組成，總分子量為45，000道爾頓。發(fā)明人認為該專利在收率(25% )，水解酶混合物中溶痂酶的含量(1% -1. 5% )、溶痂時間(4小時)以及混合物的穩(wěn)定性等方面都顯著優(yōu)于以往專利，可以產(chǎn)生更好的植皮床(grafting bed),中心殘余焦痂(central eschar remaing)也更小。并且可以根據(jù)需要通過葡聚糖凝膠SephadexG_75 或等電聚焦方法獲得更純的溶痂酶。上述幾項專利在分離方法或條件以至對溶痂酶的描述上雖有不同，但在以下幾點是相同的①所用的粗酶均是從菠蘿莖中提取的；②酶混合物的分子量均在30，000-50, 000道爾頓范圍內(nèi)；③酶混合物的最高活性為每mg酶制品35個單位(在半胱氨酸存在條件下)；④等電點一般都在6左右；⑤溶痂時間最快為4小時。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有溶痂功能的產(chǎn)品及其制備方法。本發(fā)明所提供的制備具有溶痂功能的產(chǎn)品的方法，包括如下步驟(I)用從菠蘿果實中提取的粗酶為原料；(2)用pH6. 0,0. 002mol/L磷酸緩沖液溶解粗酶，溶解后離心去除不溶性雜質(zhì)，收
集上清液；(3)將上清液用ρΗ6· O的0. 002mol/L磷酸緩沖液透析，(4)透析后再次離心，收集上清液，即得。上述方法中，步驟⑵中，pH6. 0,0. 002mol/L磷酸緩沖液與粗酶的比例為5ml :1g0上述方法中，步驟(2)中，所述溶解的方法為4_10°C條件下磁力攪拌I小時。上述方法中，步驟(3)中，所述透析時間為2-3小時。上述方法中，步驟(3)中，所述透析中截留分子量為3500。上述方法中，所述從菠蘿果實中提取的粗酶按照如下方法獲得(I)將菠蘿果實粉碎榨汁；(2)將果汁調(diào)至PH值為4. O ；(3)每升果汁加入質(zhì)量百分濃度為10%的單寧溶液IOml ；(4)將配置好的溶液攪拌15分鐘；(5)靜置分層；
(6)分離并收集沉淀；(7)干燥，粉碎，得到粗酶。由上述方法制備得到的溶痂產(chǎn)品即為本發(fā)明所要求保護的具有溶痂功能的產(chǎn)品。上述產(chǎn)品中含有菠蘿肽酶A和菠蘿肽酶B，菠蘿肽酶A和菠蘿肽酶B的分子量分別為27，000和30，000道爾頓；菠蘿肽酶A的等電點為9. 4 ；上述產(chǎn)品中菠蘿肽酶A的含量為1524. 70mg/100ml，所述產(chǎn)品中菠蘿肽酶B的含量為 952. 60mg/100ml。本發(fā)明還提供一種具有溶痂功能的膠囊劑。本發(fā)明所提供的具有溶痂功能的膠囊劑，是將上述具有溶痂功能的產(chǎn)品干燥，將 干燥產(chǎn)物與維生素C混合，干燥產(chǎn)物與維生素C的質(zhì)量比為85-90 15-10，即得。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下積極效果(I)采用菠蘿果實中提取的粗酶作原料，精制酶混合物的酶活力比現(xiàn)有技術高出3——5倍，酶活力每克為60萬單位左右(2)具有更高的收率，一般在70%左右。(3)工藝簡化后有利于商品化生產(chǎn)，產(chǎn)品質(zhì)量更易控制，且降低了生產(chǎn)成本，為患者減輕負擔。(4)溶痂時間短，二度燒傷一般2-3小時，臨床上最快的只需六十分鐘，且溶痂徹。(5)臨床應用，未發(fā)現(xiàn)任何毒副作用，十分安全。(6)患者入院，可立即溶痂，可盡早去除病灶，利于傷面早日愈合。(7)可克服手術去痂時的手術痛苦及失血問題，不需麻醉，費用更低，患者樂于接受。(8)利于對燒傷程度的準確診斷，這對四肢功能部位的燒傷治療具有深遠的意義。(9)運輸方便，保存有效期長，冰箱低溫保存一年，其酶活基本沒有損失，室溫下保存一年，其酶活損失僅為5%。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中酶活測定方法如下以酪蛋白為底物，5ml反應液中含有l(wèi)mM EDTA ;5mM維生素C(新配制的)；1%酪蛋白，20ml磷酸緩沖液，pH7. 2 ;20-80 μ g酶制品。將以上溶液在35°C保溫10分鐘，加入5ml10%三氯乙酸終止酶反應，用定量濾紙過濾，測定濾液在275nm的光密度值，實驗對照的條件與以上完全相同，只是在加入底物保溫前先加入三氯乙酸溶液使酶失活(蛋白酶活力單位定義為在pH7. 2，35°C時每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生光密度值等于Iy g/ml酪氨酸在275nm下的光密度值。)實施例一、菠蘿酶的制備1、粗酶的制備
以菠蘿果實為原料，提取酶，具體步驟如下(I)菠蘿果實粉碎榨汁；(2)將果汁調(diào)至PH值為4. O ；(3)每升果汁加入質(zhì)量百分濃度為10%的單寧溶液IOml ；(4)將配置好的溶液攪拌15分鐘；(5)靜置分層；(6)分離并收集沉淀；
(7)干燥，粉碎，得到粗酶。2、精酶的制備①將步驟I所得粗酶產(chǎn)物與pH6. 0,0. 002mol/L磷酸緩沖液混合，pH6. O、
O.002mol/L磷酸緩沖液與粗酶產(chǎn)物的比例為5ml lg，4_10°C條件下磁力攪拌I小時，10，000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，收集上清液；②上清液裝在透析袋(截留分子量3500)中，用ρΗ6·、0· 002mol/L磷酸緩沖液透析2-3小時；③透析后的溶液10，000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取上清；④上清液凍干即可得菠蘿酶精制品，收率為70%左右。將酶溶液制成凍干粉時，采用冷凍干燥或濃縮液用冷丙酮沉淀、離心再低溫自然干燥；二、精酶的性質(zhì)分析精酶的有效成分為蛋白水解酶，經(jīng)聚丙烯酰凝膠電泳測定，其中含有兩個水解蛋白質(zhì)成分，分別稱之為菠蘿肽酶A和菠蘿肽酶B，SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳測定肽酶A和肽酶B的分子量分別為27，000和30，000道爾頓。等電聚焦電泳測定肽酶A的等電點為9. 4。肽酶A和肽酶B的氨基酸組分如下菠蘿肽酶A及菠蘿肽酶B的氨基酸組成
權利要求
1.一種制備具有溶痂功能的產(chǎn)品的方法，包括如下步驟(1)用從菠蘿果實中提取的粗酶為原料；(2)用pH6.0,0. 002mol/L磷酸緩沖液溶解粗酶，溶解后離心去除不溶性雜質(zhì)，收集上清液；(3)將上清液用pH6.O的O. 002mol/L磷酸緩沖液透析，(4)透析后再次離心，收集上清液，即得。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，pH6.0,0. 002mol/L磷酸緩沖液與粗酶的比例為5ml Igo
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述溶解的方法為 4-10°C條件下磁力攪拌I小時。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(3)中，所述透析時間為2-3小時。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(3)中，所述透析中截留分子量為 3500。
6.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述從菠蘿果實中提取的粗酶按照如下方法獲得(1)將菠蘿果實粉碎榨汁；(2)將果汁調(diào)至PH值為4.0；(3)每升果汁加入質(zhì)量百分濃度為10%的單寧溶液IOml；(4)將配置好的溶液攪拌15分鐘；(5)靜置分層；(6)分離并收集沉淀；(7)干燥，粉碎，得到粗酶。
7.由權利要求1-6中任一所述方法制得的溶痂產(chǎn)品。
8.根據(jù)權利要求7所述的產(chǎn)品，其特征在于所述產(chǎn)品中含有菠蘿肽酶A和菠蘿肽酶 B，菠蘿肽酶A和菠蘿肽酶B的分子量分別為27，000和30，000道爾頓；菠蘿肽酶A的等電點為9. 4 ；所述產(chǎn)品中菠蘿肽酶A的含量為1524. 70mg/100ml，所述產(chǎn)品中菠蘿肽酶B的含量為 952.60mg/100ml。
9.一種具有溶痂功能的膠囊劑，是將權利要求7所述產(chǎn)品干燥，將干燥產(chǎn)物與維生素C 混合，干燥產(chǎn)物與維生素C的質(zhì)量比為85-90 15-10，即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于燒傷溶痂創(chuàng)面修復的菠蘿蛋白酶膠囊劑及其制備方法。該制備具有溶痂功能的產(chǎn)品的方法，包括如下步驟(1)用從菠蘿果實中提取的粗酶為原料；(2)用pH6.0、0.002mol/L磷酸緩沖液溶解粗酶，溶解后離心去除不溶性雜質(zhì)，收集上清液；(3)將上清液用pH6.0的0.002mol/L磷酸緩沖液透析，(4)透析后再次離心，收集上清液，即得。本發(fā)明所得產(chǎn)品治療全過程無需麻醉、備血，費用低，無手術痛苦，溶痂十分徹底，對于功能部位的燒傷治療具有更重要的意義。
文檔編號A61K31/375GK103007259SQ201210550559
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月19日 優(yōu)先權日2012年12月19日
發(fā)明者李正 申請人:李正