No在制備燒傷后創(chuàng)面修復(fù)藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于創(chuàng)面修復(fù)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及NO在制備燒傷后創(chuàng)面修復(fù)藥物中的用途。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是燒傷后創(chuàng)面修復(fù)提供了一種新選擇。本發(fā)明的技術(shù)方案是燒傷后創(chuàng)面修復(fù)的藥物，其主要成分為NO或NO供體。本發(fā)明還提供了NO在制備燒傷后創(chuàng)面修復(fù)藥物中的用途，NO來自于NO供體。本發(fā)明藥物可用于燒傷后的創(chuàng)面修復(fù)。
【專利說明】NO在制備燒傷后創(chuàng)面修復(fù)藥物中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于創(chuàng)面修復(fù)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及NO在制備燒傷后創(chuàng)面修復(fù)藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]燒創(chuàng)傷是以皮膚損傷為始發(fā)因素的特殊類型創(chuàng)傷，其主要問題是創(chuàng)面問題，如何盡早封閉、修復(fù)創(chuàng)面是燒傷治療的根本任務(wù)。創(chuàng)面修復(fù)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的重要領(lǐng)域，表皮干細(xì)胞是皮膚創(chuàng)面自行或生理性愈合的最重要物質(zhì)基礎(chǔ)?，F(xiàn)有研究表明，殘存、健在的皮膚表皮干細(xì)胞在創(chuàng)面的生理性愈合中起著重要作用。殘存的表皮干細(xì)胞通過脫粘附、離巢遷移、增殖，并向表皮終末細(xì)胞分化，形成表皮角質(zhì)細(xì)胞，向創(chuàng)面爬行，進(jìn)而覆蓋創(chuàng)面，最終封閉修復(fù)創(chuàng)面。另外研究表明，一氧化氮(NitricOxide, NO)是一種作用眾多小分子生物活性介質(zhì)，參與了多種病理及生理過程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是燒傷后創(chuàng)面修復(fù)提供了一種新選擇。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案是燒傷后創(chuàng)面修復(fù)的藥物，其主要成分為NO或NO供體。
[0005]其中，所述的NO供體為SNAP或L-精氨酸。
[0006]進(jìn)一步的，所述的SNAP的濃度為10~500 μ mol/L。
[0007]本發(fā)明還提供了 NO在制備燒傷后創(chuàng)面修復(fù)藥物中的用途，NO來自于NO供體。
`[0008]進(jìn)一步的，所述的NO供體為SNAP或L-精氨酸。
[0009]其中，SNAP的濃度為 10 ~500 μ mol/L。
[0010]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明闡述了一氧化氮對表皮干細(xì)胞(ESC)在燒創(chuàng)傷創(chuàng)面中的作用及用途。本發(fā)明為創(chuàng)面修復(fù)提供了一種新的方法和用途，明確了 NO在創(chuàng)面修復(fù)中的
重要作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為體外人表皮干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定示意圖；其中A為原代培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞第7天時細(xì)胞小克隆形成圖片，B為原代培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞培養(yǎng)14天時細(xì)胞融合圖片，C為角蛋白K19免疫熒光圖片，D為β I整合素免疫熒光圖片，E為角蛋白Κ19和β I整合素雙染免疫熒光圖片；
[0012]圖2為NO對體外培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞遷移的作用示意圖；其中圖A為不同SNAP濃度在不同時相點細(xì)胞在劃痕實驗中的遷移情況，圖B為體外細(xì)胞遷移實驗采用統(tǒng)計學(xué)統(tǒng)計作雙因素方差分析結(jié)果示意圖。
[0013]圖3為NO對體外培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞粘附功能的影響示意圖。
[0014]圖4為NO對體外培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞增殖的作用示意圖。
[0015]圖5為小鼠淺II度燙傷及BrdU (5_溴脫氧尿嘧啶核苷)標(biāo)記在體小鼠表皮干細(xì)胞示意圖。其中圖A為小鼠淺II度燙傷示意圖，圖B為注射BrdU并追蹤7周時BrdU陽性細(xì)胞在皮膚中的定位(如箭頭所示)；
[0016]圖6為NO對在體小鼠表皮干細(xì)胞遷移的作用示意圖。其中圖A~D分別為L-NMMA(一氧化氮合酶抑制劑)組、L-Arg (L-精氨酸)組、Gly (甘氨酸)組、NS (生理鹽水)組中BrdU標(biāo)記的表皮干細(xì)胞在燙傷中的遷移情況。
圖7為采用專業(yè)圖像采集分析后各組BrdU標(biāo)記的表皮干細(xì)胞在燙傷中的遷移情況示意圖。
【具體實施方式】
[0017]目前發(fā)現(xiàn)，NO在創(chuàng)面愈合過程中的炎癥反應(yīng)、肉芽組織增生及創(chuàng)面重塑中均起著重要作用。它既具有收縮創(chuàng)面、擴(kuò)張血管、參與炎癥反應(yīng)、抗感染能力，以及促進(jìn)膠原合成、血管新生、成纖維細(xì)胞增殖、增強(qiáng)創(chuàng)面抗張強(qiáng)度等。
[0018]本發(fā)明闡述了一氧化氮對表皮干細(xì)胞(ESC)在燒創(chuàng)傷創(chuàng)面中的作用及用途。發(fā)明人首先建立ESC分離培養(yǎng)體系，并完成ESC鑒定相關(guān)研究；再通過NO供體SNAP( S-Nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine)于ESC,研究其相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，外源性NO對體外培養(yǎng)人ESC具有脫黏附、促增殖作用，以及適宜濃度的外源性NO對體外培養(yǎng)人ESC的遷移功能有促進(jìn)作用。發(fā)明人還建立了表皮干細(xì)胞遷移模型，在淺二度燙傷下研究一氧化氮對在體表皮干細(xì)胞的作用。在體實驗表明，NO通過促進(jìn)表皮干細(xì)胞增殖、遷移方式，促使創(chuàng)面加速愈合。在體研究中需指出:我們所闡述的表皮干細(xì)胞的遷移的概念是指表皮干細(xì)胞從其固有巢穴發(fā)生逐步分化、增殖并最終分化成角質(zhì)層細(xì)胞的過程，即表皮干細(xì)胞修復(fù)表皮的過程；離體實驗研究的是 傳統(tǒng)意義上的一種物質(zhì)對一種細(xì)胞的作用，而在體研究的是一種物質(zhì)在表皮干細(xì)胞修復(fù)表皮的整個過程。由此本發(fā)明充分闡述述了 NO是通過促進(jìn)表皮干細(xì)胞離巢、脫粘附、增殖，進(jìn)而遷移至創(chuàng)面，最終促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)這一重要發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明為創(chuàng)面修復(fù)提供了一種新的方法和用途，明確了 NO在創(chuàng)面修復(fù)中的重要作用。
[0019]實施例1 一氧化氮對體外培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞粘附、遷移及增殖功能的作用
[0020](I)人表皮干細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定:采用IV型膠原快速黏附法并進(jìn)行改良，分離純化培養(yǎng)人ESC。操作如下:取術(shù)畢棄用包皮消毒后加入中性蛋白酶II于4°C過夜；次日分離表皮、真皮，將表皮剪碎并以2.5g/L胰蛋白酶于37°C消化IOmin ;終止消化后過濾、離心、收集細(xì)胞并計數(shù)。以K-SFM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為(I~2) X IO6個細(xì)胞/25cm2，接種于100 μ g/mL IV型膠原包被過夜的培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)lOmin，吸棄未貼壁細(xì)胞，PBS輕洗2次，更換新的K-SFM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，次日換液，此后每3天換液I次。采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長及形態(tài)變化情況。60~70%細(xì)胞融合時，采用2.5g/L胰蛋白酶消化7min且按1: 4 (即收集的細(xì)胞分4份繼續(xù)培養(yǎng))傳代。取第2代分離培養(yǎng)細(xì)胞完成細(xì)胞免疫熒光染色法檢測分離培養(yǎng)細(xì)胞中人表皮干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)物β I整合素和ckl9蛋白的表達(dá)。結(jié)果見圖1。
[0021]如圖1所示，采取IV型膠原快速黏附法對ESC進(jìn)行分離培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察分離培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài):細(xì)胞均勻分布、牢固貼附于培養(yǎng)瓶底部，細(xì)胞呈圓形，體積較??；培養(yǎng)第7天，細(xì)胞形成小克隆，胞體緊密相靠，胞膜相互銜接，呈典型“鋪路石”樣生長；第14天，可見圓形、橢圓形或不規(guī)則形狀的大克隆形成，細(xì)胞連接成片；細(xì)胞形態(tài)較一致，體積較小，胞核大，核質(zhì)比高，細(xì)胞間連接緊密。激光掃描共聚焦顯微鏡顯示，本實驗分離培養(yǎng)的第2代ESC可同時高表達(dá)表達(dá)人表皮干細(xì)胞標(biāo)志物CK19及整合素β?。由此，本發(fā)明所培養(yǎng)細(xì)胞符合人表皮干細(xì)胞的特性。
[0022](2)劃痕實驗檢測NO對ESC體外遷移功能的影響:將取第2代分離培養(yǎng)細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液1.5 X IO5個/mL，接種于IV型膠原包被過夜的24孔板，每孔接種lmL，常規(guī)培養(yǎng)24h，采用含終濃度為4 μ g/mL絲裂霉素的K-SFM培養(yǎng)液培養(yǎng)2h。用10 μ L槍頭垂直于培養(yǎng)板孔底劃痕，PBS清洗2次，分別加入含終濃度為O (對照)、1、10、100、500 μ mol/LSNAP溶液的K-SFM培養(yǎng)液，置入培養(yǎng)箱中于劃痕后12、24h觀察拍照，各濃度設(shè)定3個復(fù)孔。采用ImageJ圖像分析軟件(美國衛(wèi)生研究所)計算細(xì)胞遷移率=(原劃痕寬度一各時相點劃痕寬度)+原劃痕寬度X 100%。結(jié)果見圖2。
[0023]如圖2所示，倒置相差顯微鏡定時定點拍照每個SNAP濃度下的各復(fù)孔，；采用ImageJ專業(yè)圖像分析軟件定點測量每個SNAP濃度下各復(fù)孔在不同時間的創(chuàng)緣間距離后求其均值和標(biāo)準(zhǔn)差，圖片放大倍數(shù)均為200，如圖2A ;采用統(tǒng)計學(xué)專用spss分析軟件統(tǒng)計作雙因素方差分析。發(fā)現(xiàn)，隨著SNAP濃度的升高(O~100 μ mol/L)，劃痕后12、24h細(xì)胞遷移率均逐漸增加，如圖2B。劃痕后12、24h，100 μ mol/LSNAP作用細(xì)胞的遷移率均顯著高于
Oμ mol/LSNAP作用細(xì)胞的遷移率(P值均小于0.01) ;500 μ mol/LSNAP作用細(xì)胞的遷移率顯著低于O μ mol/LSNAP (P值均小于0.01)。
[0024](3)黏附實驗檢測NO對ESC黏附功能的影響:采用含終濃度為O (對照)、10、100、500 μ mol/LSNAP溶液的K-SFM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5 X IO5個/mL ;于37°C采用3g/LBSA封閉IV型膠原包被過夜的96孔板2h，PBS清洗3次。將細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔200 μ L，各濃度設(shè)6個復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)lh，PBS清洗3次；加入含體積分?jǐn)?shù)10%CCK_8的K-SFM培養(yǎng)基(100 μ L/孔)，常規(guī)培養(yǎng)4h，酶標(biāo)儀測定波長450nm處的吸光度值(代表黏附細(xì)胞數(shù))。細(xì)胞黏附抑制率=(0 μ mol/LSNAP作用細(xì)胞的吸光度值一各濃度SNAP作用細(xì)胞的吸光度值)+0 μ mol/LSNAP作用細(xì)胞的吸光度值X 100%，進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果見圖3。
[0025]如圖3所示，通過NO供體SNAP對表皮干細(xì)胞四型膠原上的粘附作用來檢測NO對表能皮干細(xì)胞粘附功能的影響。O、10、100、500 μ mol/LSNAP作用時，細(xì)胞吸光度值分別為0.31 ±0.03,0.33±0.03,0.23±0.03,0.21 ±0.03，后 3 種濃度 SNAP 對應(yīng)的黏附抑制率分別為-6.45%,25.81%,32.26% ;100、500 μ mol/LSNAP作用時細(xì)胞吸光度值明顯高于O μ mol/LSNAP作用時(t值分別為4.12、0.72，P值均等于0.00)，10 μ mol/LSNAP作用時細(xì)胞吸光度值與 O μ mol/LSNAP 作用時接近(t=0.86，P=0.40)。結(jié)果表明，在(10-1000) μ mol/LSNAP作用24小時對表皮干細(xì)胞具有線性脫粘附作用，且100 μ mol/L、500 μ mol/L、1000 μ mol/LSNAP對表皮干細(xì)胞的脫粘附作用具有顯著性差異(P〈0.05)。
[0026](4)NO對ESC增殖功能的影響:將取第2代分離培養(yǎng)細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液以3 X 103/孔接種于IV型膠原包被過夜的96孔板，培養(yǎng)3d后分別加入含終濃度為O (對照)、10,100,500 μ mol/LSNAP的K-SFM培養(yǎng)液，各濃度設(shè)6個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)；于SNAP作用O (即刻)、12、24、48、72h更換含體積分?jǐn)?shù)10%CCK_8的K-SFM培養(yǎng)基(100 μ L/孔)，常規(guī)培養(yǎng)4h ；酶標(biāo)儀測定波長450nm處的吸光度值(代表孔內(nèi)細(xì)胞數(shù))。
[0027]如圖4所示，不同時相點下，O~500 μ mol/LSNAP對ESC均具有促增殖作用。其中100、500 μ mol/LSNAP作用24、48h時，ESC增殖作用較為明顯(F值為4.38~30.67，P值均小于0.05)。
[0028]實施例2 —氧化氮影響燒傷后在體表皮干細(xì)胞遷移的作用
[0029](1)小鼠淺二度燙傷模型的制備:實驗動物健康7周齡15~18g成年C57bl/6小鼠24只，燙傷儀器采用恒溫恒壓燙傷儀，燙傷時間均為3s，燙傷溫度為65°C，致傷壓力為燙傷棒自重0.5kg，燙頭面積2cm2。致傷部位:小鼠兩后腿中間部背部。燙傷后24h取創(chuàng)面組織行病理組織學(xué)觀察并驗證燙傷深度。
[0030](2)BrdU在體標(biāo)記小鼠表皮干細(xì)胞:新生第3天C57bl/6小鼠消毒后腹腔注射BrdU50mg/kg體重，一天兩次,連續(xù)注射3天；注射BrdU7周后分組腹腔注射:L_精氨酸、L-NMMA、等體積生理鹽水及甘氨酸(每組六只小鼠)；進(jìn)行淺二度燙傷(方法同前)后單籠飼養(yǎng)48h取材并進(jìn)行石蠟包埋；免疫組織化學(xué)檢測BrdU在再表皮(在小鼠背部皮膚經(jīng)燙傷后，表皮就壞死了 ；經(jīng)過48小時，燙傷壞死的表皮就會開始再生，重新長起來的表皮即為再表皮)中陽性數(shù)；BrdU在再表皮中陽性數(shù)代表表皮干細(xì)胞的遷移能力，進(jìn)行統(tǒng)計分析。
[0031 ] 如圖5所示，采用超衡溫燙傷儀建立成年C57bl/6小鼠淺二度燙傷模型，HE切片中整個表皮細(xì)胞和部分真皮乳頭層細(xì)胞核嗜堿性改變，發(fā)生細(xì)胞核溶解現(xiàn)象，符合淺二度燙傷，見圖5A。BrdU滯留實驗中組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BrdU追蹤至7周以后陽性細(xì)胞主要分布于毛囊隆凸部，見圖5B，即表明BrdU成功標(biāo)注在體表皮干細(xì)胞。圖片放大倍數(shù)均為200倍。[0032] 如圖6所示，L-精氨酸為一氧化氮合成底物具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用，與對照組比較L-精氨酸通過促ESC增殖、遷移功能的作用顯著；而NO合成酶抑制劑L-NMMA對ESC增殖、遷移功能的抑制作用顯著。圖片放大倍數(shù)均為400倍。
【權(quán)利要求】
1.燒傷后創(chuàng)面修復(fù)的藥物，其特征在于:其主要成分為NO或NO供體。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于:所述的NO供體為SNAP或L-精氨酸。
3.如權(quán)利要求3所述的藥物，其特征在于:所述的SNAP的濃度為10~500μ mol/L。
4.NO在制備燒傷后創(chuàng)面修復(fù)藥物中的用途，其特征在于:N0來自于NO供體。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于:所述的NO供體為SNAP或L-精氨酸。
6.如權(quán)利要求4所述的用途，其`特征在于:所述的SNAP的濃度為10~500μ mol/L。
【文檔編號】A61K31/198GK103816177SQ201410033303
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月24日
【發(fā)明者】詹日興, 羅高興, 吳軍 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院