專利名稱：從海藻提取物中純化巖藻依聚糖的工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及巖藻依聚糖(本文也稱為AV513)的生產(chǎn)。更具體地說，本發(fā)明涉及純化巖藻依聚糖提取物以除去重金屬離子、細菌和內(nèi)毒素污染物以及其他雜質(zhì)但不影響期望的生物學活性的方法。
背景技術(shù)：
正常的凝血是一個復雜的生理和生化過程，其在幾個水平上受到調(diào)節(jié)。凝血過程涉及凝血因子級聯(lián)系統(tǒng)的激活，產(chǎn)生纖維蛋白和導致血小板聚集以及血管收縮(Davie等人的綜述，Biochemistry30 :10363，1991)。凝結(jié)級聯(lián)系統(tǒng)由“外源性”途徑和“內(nèi)源性”途徑構(gòu)成，外源性途徑被認為是引發(fā)正常凝血的主要手段，內(nèi)源性途徑則擴展凝血反應。出血損害的正常反應包括激活外源性途徑。當血液接觸受傷后被暴露于組織上或在組織上表達的組織因子(TF)-因子VII的輔因子時，引發(fā)外源性途徑的激活。TF與促進產(chǎn)生FVIIa的FVII形成復合體。FVIIa接著結(jié)合TF將FX轉(zhuǎn)化為絲氨酸蛋白酶FXa，這是凝血酶原復合物的關(guān)鍵成分。通過FXa/FVa/鈣/磷脂復合物將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶刺激了纖維蛋白的形成和血小板的活化，所有這些都是正常凝血所必需的。內(nèi)源性的途徑因子IXa和VIIIa進一步增強正常的止血，這兩個因子也可以將FX轉(zhuǎn)化為FXa。也可以見Weitz，J. I.，等人，Chest, 126 (3)，September2004 (Suppl)，265S。硫酸多糖是一類動物和人類中以許多生物學活性為特征且具有良好耐受性的分子。這些聚陰離子分子通常來自植物和動物組織，并且包括廣范圍的亞類，包括肝素、葡糖氨基聚糖、巖藻依聚糖、交叉菜聚糖、多硫酸戍聚糖(pentosanpolysulfates)和硫酸皮膚素或硫酸葡聚糖。肝素樣的硫酸多糖顯示通過抗凝血酶III和/或肝素輔因子II相互作用介導的不同抗凝血活性(Toida TC, Linhardt, RJ.，Trends in Glycoscience andGlycotechnology2003 ； 15 :29-46)。盡管有這樣的一種硫酸多糖-口服肝素已被考慮作為一種抗凝血劑開發(fā)(ADunn，Idrugs, 3 =817-824, 2000)，但是只有肝素是不夠的，因為其具有嚴重的并發(fā)癥，這些并發(fā)癥包括術(shù)中和術(shù)后出血、骨質(zhì)疏松、脫發(fā)、肝素抗性、肝素反跳、肝素誘導的血小板減少癥(HIT)、肝素誘導的血小板減少癥血栓形成綜合癥(HITTS)以及其他的缺點，包括中斷給藥幾天后抗凝血作用衰減(Iqbal O 等人，F(xiàn)areedJ, Expert Opin Emerg Drugs6 :111-135,2001 ；Roberts, HR, AnesthesiologylOO =722-730, 2004)。肝素通常胃腸外給藥，其口服吸收水平只有大約 I % (Fitton, J. H. , Glycoscience, The Nutrition Science Site,modified JanuaryOI,2005)。與肝素相反，另一種硫酸多糖，巖藻依聚糖，其從海藻分離出來，已經(jīng)證明能夠調(diào)節(jié)(即加速)凝血(美國專利號2005/0282771)。具體地說，當在體外以低濃度給藥或在體內(nèi)以低的皮下劑量給藥時，巖藻依聚糖通過外源性途徑途徑激活血友病情形下的凝血(Liu, T 等人，和 Johnson, K. ff.，Thrombosis andHaemostasis, 95 :68-76, 2006),這證實了其促凝血活性。更高劑量的巖藻依聚糖能夠具有與肝素相似的抗凝血活性。鑒于目前的抗凝血劑如肝素或芐丙酮香豆素(warfarin)的相關(guān)問題，因此明確地需要能夠克服與目前存在的抗凝血治療相關(guān)的一個或多個問題的藥物如巖藻依聚糖。由此，需要一種改進的方法，以經(jīng)濟劃算和有效地生產(chǎn)具有最佳活性的富含巖藻依聚糖的提取物，用于促凝血劑或用于抗凝血治療應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于從海藻提取物純化巖藻依聚糖的方法中獲得的發(fā)現(xiàn)。該方法提供高產(chǎn)率的巖藻依聚糖，該巖藻依聚糖基本不含有重金屬離子、細菌和內(nèi)毒素污染物以及其他雜質(zhì)。因此，本發(fā)明包括從非均相混合物富集巖藻依聚糖的方法，所述方法包括 (a)提供巖藻依聚糖源；(b)通過用螯合劑處理除去上述源中的重金屬離子，產(chǎn)生第一巖藻依聚糖混合物；(C)選擇性沉淀所述第一巖藻依聚糖混合物中的巖藻依聚糖，除去污染物；(d)在水溶液中重懸含有巖藻依聚糖的沉淀物，獲得第二巖藻依聚糖混合物；(e)重復步驟(C)和(d) —次或多次；和(f)過濾包括巖藻依聚糖的水溶液，除去細菌和內(nèi)毒素污染物，產(chǎn)生純化的巖藻依聚糖提取物。在一個實施方案中，所述巖藻依聚糖具有5到25重量百分比的硫。在另一個實施方案中，巖藻依聚糖來自藻類。在一個優(yōu)選的實施方案中，巖藻依聚糖來自墨角藻屬或昆布屬(Laminaria)。代表性的巖藻依聚糖來自墨角藻或海帶或其他來源,包括但不限于裙帶菜和泡葉藻。在一些實施方案中，螯合劑選自下組乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙-(β -氨乙醚)N，N，N'，N'-四乙酸(EGTA) ,2,3- 二巰基丙醇-I-磺酸(DMPS)和2，3- 二巰基琥珀酸(DMSA)。在一個優(yōu)選的實施方案中，螯合劑是EDTA。在一些實施方案中，螯合劑固定在固體載體上。在一個實施方案中，螯合劑是亞氨基二乙酸螯合樹脂。在一些實施方案中，用乙醇選擇性地沉淀巖藻依聚糖一次或多次，其中乙醇在巖藻依聚糖混合物中的濃度為約40%到50% (ν/ν)。在一些實施方案中，其pH保持在約5. 7到6. O之間。在一個優(yōu)選的實施方案中，pH被調(diào)節(jié)到約5.95。在一些實施方案中，向巖藻依聚糖混合物中加入NaCl，濃度約為20-24g/升。在另一個方面中，本發(fā)明提供了包括巖藻依聚糖的組合物，巖藻依聚糖通過本文所述的方法產(chǎn)生。在一個實施方案中，巖藻依聚糖具有5到25重量百分比的硫。在另一個實施方案中，巖藻依聚糖來自海藻。在一個優(yōu)選的實施方案中，巖藻依聚糖來自墨角藻屬或昆布屬。代表性的巖藻依聚糖來自墨角藻或海帶或R村枝管藻(Cladosiphon okamuranus)、裙帶菜(Undaria pinnatifida)、粘膜藻(Leathesia difformis)、泡葉藻(Ascophyllumnodosum)、昆布(Ecklonia kurome)、鹿角藻(Pelvetia fastigiata)、單純性褐條藻(Saundersella simplex)、長松藻(Chordariaflagelliformis)或任何其他種類的含有巖藻依聚糖的海洋植物或動物。在優(yōu)選的實施方案中，巖藻依聚糖具有生物學活性，例如具有促凝血活性。在一些實施方案中，所述組合物還可以包括藥學上可接受的賦形劑。在另一個方面，本發(fā)明提供了治療需要增強凝血的受治療者的方法，其包括向所述受治療者給予治療有效量的包括用本文所述的任何方法產(chǎn)生的巖藻依聚糖的組合物。在一些實施方案中，所述受治療者具有選自以下的出血疾病慢性或急性出血疾病、血液因子缺乏導致的先天性凝血疾病和獲得性凝血疾病。在其它的實施方案中，需要凝血的原因是先前使用了抗凝血劑、手術(shù)或其 他侵入性的操作。在一些實施方案中，以約O. Olmg/kg到約I O O mg/kg的劑量給予巖藻依聚糖。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本發(fā)明后容易實施本發(fā)明的這些和其他的實施方案。


圖I顯示了在活化部分促凝血酶原激酶時間(APTT)分析中處理對巖藻依聚糖(AV513)活性的影響。圖2顯示了在稀釋的凝血酶原(dPT)分析中處理對巖藻依聚糖活性的影響。圖3顯示了凝血彈性描記器(TEG)分析中處理對巖藻依聚糖活性的影響。
具體實施例方式除非另有說明，本發(fā)明的實施采用了蛋白化學、生物化學、分子生物學和藥物學的常規(guī)方法，這些都在本領(lǐng)域的技術(shù)人員技能范圍內(nèi)。這些技術(shù)都在文獻中有充分的描述° 例如，見 Protein Purification Methods A Practical Approach, (E. L. V. Harrisand S. Angal,Eds. ,1989) ；Protein Purification Applications APractical Approach,(E.L.V.Harris and S. Angal, Eds. ,1990) ；T.E.Creighton, Proteins !Structuresand Molecular Properties (ff. H. Freeman and Company,1993) ；A.L.Lehninger,Biochemistry (Worth Publishers, Inc.,最新增補)；Methods InEnzymology (S. Colowickand N. Kaplan 編輯,Academic Press, Inc.) ；Morrison andBoyd, Organic Chemistry (Al Iynand Bacon, Inc.,最新增補)；J. March, AdvancedOrganic Chemistry (McGraw Hill,最新增補)；Remington :The Science andPractice of Pharmacy, A. Gennaro,編輯，第 20 版；和 Goodman&Gilman ThePharmacological Basis of Therapeutics,J. Griffith Hardman,L. L. Limbird, A. Gilman,第 10 版。本文所述的所有出版物、專利和專利申請，不論是上文提到的還是下文將要提及的,其全部內(nèi)容都通過參考并入本文。在全文中使用了以下氨基酸縮寫。丙氨酸Ala (A)精氨酸Arg (R)天冬酰胺Asn (N)天門冬氨酸Asp⑶半胱氨酸Cys (C)谷氨酰胺GIn (Q)谷氨酸GIu (E)甘氨酸GIy (G)組氨酸His⑶異亮氨酸=He⑴亮氨酸Leu (L)賴氨酸Lys⑷蛋氨酸Met(M)苯丙氨酸Phe(F)脯氨酸Pro(P)絲氨酸Ser⑶蘇氨酸Thr⑴色氨酸Trp (W)酪氨酸Tyr⑴纈氨酸VaI (V)I.定義
在描述本發(fā)明時，使用了以下術(shù)語，如下所述對它們進行了定義。必須指出的是，如在說明書和后附權(quán)利要求中所用，除非另外明確指出，否則單數(shù)形式“一”、“所述”和“這”包括復數(shù)指代。因此，例如指代“巖藻依聚糖”包括兩種或以上的巖藻依聚糖的混合物等。如本文所用，術(shù)語“大約”表示其修飾的值的大約±10%。術(shù)語“生物學活性的”指蛋白具有天然存在的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的、功能的或生化的功倉泛。本文所用的術(shù)語“巖藻依聚糖”指存在于許多海洋植物和動物中的硫酸a -L-巖藻聚糖。巖藻依聚糖在褐藻的細胞壁中特別豐富，其包括來自墨角藻屬(例如，墨角藻、枯墨角藻、Fucus distichus和齒緣墨角藻)或昆布屬(海帶、皺海帶和Iaminariaabyssalis)的巖藻依聚糖。巖藻依聚糖也包括來自繩藻、R村枝管藻、裙帶菜、粘膜藻(Leathesia difformis)、泡葉藻、昆布、鹿角藻、單純性褐條藻、長松藻或任何其他種類的含有巖藻依聚糖的海洋植物或動物的巖藻依聚糖。另外，術(shù)語巖藻依聚糖包括其生物學活性片段、衍生物或其類似物。巖藻依聚糖包括通過降解(如水解)較大的巖藻依聚糖分子產(chǎn)生的巖藻依聚糖片段。降解可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法實現(xiàn)，包括用酸、堿、熱或酶處理產(chǎn)生降解的巖藻依聚糖。巖藻依聚糖也可以被化學改造并可以具有修飾作用，包括但不限于硫酸化、多硫酸化、乙酰化、酯化和甲基化。“基本上純化” 一般指分離物質(zhì)(如巖藻依聚糖)，使得該物質(zhì)在其所在的樣品·中占有絕大部分百分數(shù)。典型地，在一個樣品中，基本純化的組分占該樣品的50%、優(yōu)選80% -85%,更優(yōu)選 90-95%。當在組合物中A+B之和重量的至少約80%為A時，含有A的組合物“基本上不含有B”。優(yōu)選的，在組合物中A占A+B之和的重量的至少85%到95%。本文所用的“抗凝(血)劑”指能夠阻止或減慢形成凝塊的任何藥劑。本文所用的“促凝(血)劑”指能夠加速形成凝塊的任何藥劑。本文所用的“螯合劑”指能夠結(jié)合金屬的化合物、肽或蛋白。螯合劑的實例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙-(β-氨乙醚)N，N，K , Ni -四乙酸(EGTA)、2，3-二巰基丙醇-I-磺酸(DMPS)和2，3_ 二巰基琥珀酸(DMSA)等。螯合劑可以固定在載體上(如亞氨基二乙酸螯合樹脂)。本文使用術(shù)語“來自”表明一個分子的最初來源，但是不用來限定該分子的制備方法，例如化學合成或重組方法?！把苌敝笇δ繕酥复肿踊蚱漕愃莆锏娜魏魏线m的修飾作用，諸如硫酸化、乙?；?、糖基化、磷酸化、聚合物綴合(如用聚乙二醇)或其它的外源部分的加入，只要能夠保持所述分子的期望生物學活性(如凝血活性)就行。例如，可以化學改變巖藻依聚糖以改善其促凝血功能。這樣的修飾作用可以包括但不限于硫酸化、酯化和甲基化。制備類似物和衍生物的方法一般為本領(lǐng)域所知?！捌巍敝竷H有完整全長序列和結(jié)構(gòu)的一部分組成的分子。巖藻依聚糖的片段可以通過降解(如水解)大的巖藻依聚糖多糖產(chǎn)生。巖藻依聚糖活性片段一般包括全長多糖的
2-20個糖單位，優(yōu)選地全長分子的至少大約5-10個單位，或者在2個糖單位和全長分子之間的任何整數(shù)的糖單位，條件是所述片段保留生物學活性如促凝血活性。
“藥學上接受的賦形劑或載體”指可任選地包括在本發(fā)明的組合物中的賦形劑，其對患者不產(chǎn)生顯著的不良毒性作用。“藥學上可接受的鹽”包括但不限于氨基酸鹽、用無機酸制成的鹽如鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、氫溴酸鹽和硝酸鹽或用有機酸制成的鹽如蘋果酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、乙基琥珀酸、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、甲磺酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、對甲苯磺酸鹽、棕櫚酸鹽、水楊酸鹽和硬脂酸鹽以及依托紅霉素鹽、葡庚糖酸鹽和乳糖酸鹽。含有藥學上可接受的陽離子的類似鹽包括但不限于鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋁鹽、鋰鹽和銨鹽(包括取代的銨鹽)。本文所述的“活性分子”或“活性劑”指能夠提供在體內(nèi)或體外顯示一些藥學效應通常是有利效應的任何藥劑、藥物、化合物、物質(zhì)的組合物或混合物。其包括食品、食品增補齊U、營養(yǎng)品、營養(yǎng)保健品、藥物、疫苗、抗體、維生素和其他的有益物質(zhì)。如本文所用，該術(shù)語還包括能夠在患者中產(chǎn)生局部或全身作用的任何生理活性的或藥物活性的物質(zhì)。“任選的”或“任選地”表示在其后描述的情形可能發(fā)生或可能不發(fā)生，因此該描述 包括所述情形發(fā)生或不發(fā)生的情況。術(shù)語“受治療者”、“個體”或“患者”在本文中可以交換使用，指脊椎動物。優(yōu)選地指哺乳動物。哺乳動物包括但不限于鼠、嚙齒動物、猴、人類、家畜、體育動物和寵物。2.實施本發(fā)明的方式在具體描述本發(fā)明前，應該理解的是，本發(fā)明不限于特定的制劑或方法參數(shù)，它們當然會改變。也應該理解，本文所用的術(shù)語只是為了描述本發(fā)明的具體實施方式
，不是為了限定本發(fā)明。雖然本文描述了優(yōu)選的材料和方法，但是與本文描述的這些材料和方法類似或相當?shù)姆椒ê筒牧弦材軌蛴糜趯嵤┍景l(fā)明。A.巖藻依聚糖的生產(chǎn)本發(fā)明是建立在分離巖藻依聚糖使其基本不含有重金屬離子、細菌和內(nèi)毒素污染物和其他雜質(zhì)的純化程序的基礎(chǔ)之上的。所述方法包括一系列的分離步驟，包括用螯合劑處理除去重金屬離子、一次或多次選擇性沉淀以除去雜質(zhì)和過濾除去細菌和內(nèi)毒素污染物。為了進一步理解本發(fā)明，以下提供了關(guān)于純化巖藻依聚糖提取物方法的更詳細的描述。巖藻依聚糖純化可以使用任何來源的巖藻依聚糖提取物。在許多海洋植物和動物中發(fā)現(xiàn)了巖藻依聚糖，其在褐藻(褐藻綱)的細胞壁中特別豐富。例如，純化可以使用來自墨角藻屬(例如，墨角藻、枯墨角藻、Fucus distichus和齒緣墨角藻)或昆布屬(海帶、皺海帶和laminaria abyssalis)的褐藻。或者，也可以使用來自其他來源的巖藻依聚糖來實施本發(fā)明，這些來源包括但不限于繩藻、R村枝管藻、裙帶菜、粘膜藻、泡葉藻、昆布、鹿角藻、單純性褐條藻、長松藻或任何其他種類的含有巖藻依聚糖的海洋植物或動物。螯合劑可以使用能夠結(jié)合金屬離子的任何螯合劑除去含有巖藻依聚糖的非均相混合物中的金屬離子污染物。螯合劑的實例包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙-(β-氨乙醚)N，N，N'，N'-四乙酸(EGTA)，2，3-二巰基丙醇-I-磺酸(DMPS)和2，3_ 二巰基琥珀酸(DMSA)等?？蛇x地，也可以使用含有固定螯合基團的金屬螯合樹脂除去含有巖藻依聚糖的樣品中的金屬離子。例如，可以使用購買的含有螯合配體亞氨基二乙酸的螯合樹脂(例如 CHELEXI O O (Bio-Rad)，DOffEXAl (Doff Chemical Co.)和螯合樹脂(Hampton Research))。螯合樹脂可以分批加入巖藻依聚糖樣品中，并且通過離心除去?？蛇x地，可以通過含有螯合樹脂的柱子用層析根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法除去巖藻依聚糖樣品中的金屬離子。選擇性沉淀巖藻依聚糖通過乙醇的選擇性沉淀進一步純化巖藻依聚糖提取物。選擇性沉淀除去巖藻依聚糖混合物中的一些螯合劑和其他的污染物。在一些實施方案中，用濃度為大約40%到50%
的乙醇選擇性沉淀巖藻依聚糖一次或多次。在向巖藻依聚糖混合物加入乙醇前，將巖藻依聚糖混合物的pH調(diào)節(jié)到5. 7-6. O之間。向巖藻依聚糖混合物中加入NaCl，濃度為20_24g/升。沉淀巖藻依聚糖后，除去上清液并將沉淀的巖藻依聚糖重懸于水溶液中。重復上述循環(huán)能夠提高巖藻依聚糖的純度。討濾通過O. 2 μ m的濾器過濾巖藻依聚糖除去細菌和內(nèi)毒素污染物。用凍干或噴霧干燥法干燥過濾的產(chǎn)物。通常巖藻依聚糖的產(chǎn)率為大約50%或以上，更優(yōu)選地為大約60%到約 80%。分析純化的巖藻依聚糖分析巖藻依聚糖樣品的純度和各種性質(zhì)，如分子量、包括巖藻糖和木糖的碳水化合物的含量，重金屬污染、硫酸鹽和水。可以使用一些分析技術(shù)表征巖藻依聚糖樣品，包括但不限于高效液相色譜(HPLC)、元素成分分析、激光散射(LLS)、電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)和 GC-MS。B藥物組合物純化的巖藻依聚糖可以配制成任選含有一種或多種藥學上接受的賦形劑的藥物組合物。代表性的賦形劑包括但不限于碳水化合物、無機鹽、抗微生物劑、抗氧化劑、表面活性劑、緩沖劑、酸、堿和它們的組合。適用于注射組合物的賦形劑包括水、醇、多元醇、甘油、植物油、磷脂和表面活性劑。碳水化合物如糖、衍生糖如糖醇、醛糖酸、酯化糖和/或糖聚合物可以作為賦形劑存在。具體的糖水化合物賦形劑包括，例如單糖諸如巖藻糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維素二糖等；多糖如棉子糖、松三糖、麥芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、山梨醇(葡萄糖醇)、吡喃山梨醇、肌醇等。賦形劑可以包括無機鹽或緩沖劑如檸檬酸、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硝酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和它們的組合。本發(fā)明的組合物也包括阻止微生物生長的抗微生物劑。適合于本發(fā)明的抗微生物劑的非限定性的實例包括苯扎氯銨、芐索氯胺、芐醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯基乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞和它們的組合。組合物中也可以存在抗氧化劑。抗氧化劑可以用于防止氧化，由此阻止巖藻依聚糖或制劑中的其它組分的破壞。本發(fā)明使用的合適的抗氧化劑包括例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚、丁基羥基甲苯、次磷酸、沒食子酸丙酯、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉和它們的組合。表面活性劑可以作為賦形劑存在。代表性的表面活性劑包括聚山梨醇酯，如"Tween20"和"Tween80，"和普郎尼克類聚合物如 F68 和 F88 (BASF，Mount01ive，NewJersey);脫水山梨醇酯；脂類如磷脂(如卵磷脂)和其他的磷脂酰膽堿類，磷脂酰乙醇胺(但是優(yōu)選地為非脂質(zhì)體形式)，脂肪酸和脂肪酸酯；類固醇，如膽固醇；螯合劑如EDTA ;鋅和其他的這類陽離子。酸和堿可以作為賦形劑存在于組合物中?？梢允褂玫乃岬姆窍薅ㄐ詫嵗ㄟx自下組的酸鹽酸、乙酸、磷酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、硫酸、延胡索酸和它們的組合。合適的堿基的實例包括但不限于選自下組的堿氫氧化鈉、乙酸鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀、乙酸銨、乙酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸鈉、甲酸鈉、硫酸鈉、硫酸鉀、延胡索酸鉀和它們的組合。
根據(jù)一些因素，組合物中的巖藻依聚糖的量(例如當在給藥系統(tǒng)中含有時)會不同，但是當所述組合物是以單位劑量形式或在容器中(如小瓶)時，最優(yōu)地為治療有效量。通過重復的施用逐漸加大量的組合物，確定產(chǎn)生臨床期望終點的量，可以實驗決定治療有效量的劑量。組合物中單個賦形劑的量會不同，這取決于賦形劑的性質(zhì)和功能以及組合物的特定需要。典型地，任何單個賦形劑的最優(yōu)量可以通過常規(guī)實驗確定，即通過制備含有不同量的賦形劑的組合物(從低到高)，檢測穩(wěn)定性和其他參數(shù)，然后獲得最佳性能且沒有顯著不良作用的范圍。然而，通常，組合物中賦形劑的劑量按重量計為約1%到約99%，優(yōu)選為約5 %到約98 %，更優(yōu)選為約15 %到約95 %，最優(yōu)選為按重量計濃度小于30 %。上述的這些賦形劑以及其他的賦形劑在下述文獻中描述"Remington The Science&Practiceof Pharmacy ",第 19 版，Williams&Williams，(1995), the " Physician，s DeskReference ",第 52 版,Medical Economics, Montvale, NJ (1998)和 Kibbe, A. H. , HandbookofPharmaceutical Excipients, 第 3 版，American Pharmaceutical Association,Washington, D.C. ,2000。組合物包括所有類型的制劑，尤其是適于注射的制劑(例如粉末和凍干物，它們在使用前能夠與溶劑重構(gòu))，以及易于用于注射溶液或懸浮液的制劑，干燥的不溶性組合物(其在使用前與載體組合)和乳劑及液體濃縮液(使用前稀釋)。在注射前用于重構(gòu)固體組合物的合適的稀釋劑的實例包括抑菌注射用水、5%葡萄糖水溶液、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏溶液、鹽水、無菌水、去離子水和他們的組合。就液體藥物組合物而言，可以使用溶液和懸浮液。其他的優(yōu)選的組合物包括用于口服給藥、眼部給藥或局部給藥的組合物。本文所述的藥物制劑也可以放在注射器、移植器具等中，這取決于期望的給藥和使用方式。優(yōu)選地，本文所述的巖藻依聚糖組合物為單位劑量的形式，單位劑量表示預先定量的或預先包裝的、用于單次劑量的本發(fā)明的綴合物或組合物的量。本文所述的巖藻依聚糖組合物可任選地包括一種或多種附加藥劑，如止血劑、凝血因子或其他的治療受治療者病癥或疾病的藥物。特別優(yōu)選的是包括諸如以下一種或多種凝血因子的復合制劑因子XI、因子XII、前激肽釋放酶、高分子量的激肽原(HMWK)、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子II、因子VIIa和馮維勒布蘭德氏因子。巖藻依聚糖組合物也可以包括其他的促凝血劑，如內(nèi)源性途徑的激活因子，包括但不限于因子Xa、因子Ixa、因子XIa、因子XIIa和Villa、前激肽釋放酶、高分子量的激肽原或外源性途徑的激活因子，包括但不限于組織因子、因子Vila、因子Va和因子Xa。巖藻依聚糖組合物可以包括天然的、合成的或重組的凝血因子或它們的保留生物學活性(即促凝血)的片段、變體或共價修飾的衍生物。可選地，這樣的藥劑包含在來自巖藻依聚糖的單個組合物中，并且在與本發(fā)明的巖藻依聚糖的組合物施用的同時、之前或之后共同施用。
C 施用向受治療者施用至少一個巖藻依聚糖的治療有效的治療循環(huán)。“治療有效的治療循環(huán)”指這樣的一個循環(huán)當給個體給藥時，對出血疾病的治療產(chǎn)生積極的治療反應。增強凝血的施用巖藻依聚糖的治療循環(huán)是特別值得關(guān)注的。“積極的治療反應”指根據(jù)本發(fā)明進行治療的個體顯示出血病癥的一個或多個癥狀的改善，包括如凝血時間變短和出血減少和/或減少對凝血因子置換治療的需要。。其它使用巖藻依聚糖的治療有效的治療循環(huán)將會作為抗凝血劑向患有以下疾病的受治療者施用血栓形成前疾病如深靜脈血栓形成、動脈血栓形成和其他的心血管和癌癥疾病，以作為預防性的和/或維持性的治療。在一些實施方案中，施用多個治療有效劑量的組合物，所述組合物包括巖藻依聚糖和/或一種或多種其他的治療藥物，如止血劑、凝血因子或其他的藥物。本發(fā)明的組合物通常但不是必須地通過口服、注射(皮下、靜脈或肌內(nèi))、灌注或局部給藥。本發(fā)明的制劑在給藥前可以為液體溶液或懸浮液的形式，但是也可以采用其他的形式，如漿液、乳液、膏、片齊U、膠囊、粉末、凝膠、基質(zhì)、栓劑等。也可以考慮其他的給藥方式，如肺內(nèi)、直腸內(nèi)、經(jīng)皮、透粘膜、鞘內(nèi)、心包、動脈內(nèi)、腦內(nèi)、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)等?？梢允褂门c本領(lǐng)域已知的任何醫(yī)學上接受的相同或不同的給藥方法施用包括巖藻依聚糖和其他藥劑的藥物組合物。在具體的實施方案中，本發(fā)明的組合物可以用于局部給藥巖藻依聚糖，例如用于治療損傷、傷害或手術(shù)造成的出血。根據(jù)本發(fā)明的制劑也可以用于局部治療。例如，可以通過在出血部位注射或優(yōu)選地經(jīng)膠帶或傷口覆蓋方式局部涂敷固體、液體或膏來施用巖藻依聚糖。也可以使用栓劑、膠囊(尤其是耐胃液的膠囊)、點滴或噴霧。選擇特定的制劑和合適的給藥方法以靶向出血部位。在另一個實施方案中，例如在計劃手術(shù)前預防性施用包括巖藻依聚糖和/或其他藥劑的藥物組合物。這種預防性施用對于患有已知的已存在的凝血疾病的受治療者具有特別的價值。在本發(fā)明的另一個實施方案中，包括巖藻依聚糖和/或其他藥劑的藥物組合物存在于緩釋制劑中或者存在于使用緩釋器具給藥的制劑中。這樣的器具是本領(lǐng)域已知的，包括例如透皮貼劑和微型植入泵，它們能夠隨時間以連續(xù)穩(wěn)定的方式以不同的劑量釋放藥物，使非緩釋藥物組合物獲得持續(xù)釋放的作用。本發(fā)明也提供了向患有疾病的患者施用包括本文提供的巖藻依聚糖的綴合物的方法，其中所述疾病對用包含在綴合物或組合物中的巖藻依聚糖的治療產(chǎn)生反應。所述方法包括通過本文所述的任何方式施用治療有效量的綴合物或給藥系統(tǒng)，它們優(yōu)選作為藥物組合物的一部分給予。所述給藥方法可以用于治療對使用巖藻依聚糖的治療產(chǎn)生反應的任何疾病。更具體地說，本文的組合物能夠有效地治療出血疾病，疾病包括血友病A、血友病B、馮維勒布蘭德氏病、特發(fā)性血小板減少癥、缺乏一個或多個接觸因子(如因子XI，因子XII，前激肽釋放酶，高分子量的激肽原(HMWK))、缺少一個或多個與臨床大出血相關(guān)的因子(如因子V，因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子II (低凝血酶原血癥)和馮維勒布蘭德氏因子)、維生素K缺乏、纖維蛋白原疾病，包括無纖維蛋白原血癥、低纖維蛋白原血癥和異常纖維蛋白原血癥、α 2-抗纖溶酶缺乏和由以下原因?qū)е碌某鲅^度肝病、腎病、血小板減少、血小板功能障礙、血腫、內(nèi)出血、關(guān)節(jié)積血、手術(shù)、創(chuàng)傷、低溫、月經(jīng)和妊娠。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道特定巖藻依聚糖能夠有效治療的條件。給藥的實際劑量會不同，這取決于受治療者的年齡、重量和一般狀況以及要治療的疾病的嚴重性、衛(wèi)生保健人員的判斷和施用的綴合物。治療有效量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，并根據(jù)每個特定的病例的具體需要調(diào)節(jié)。一般，治療有效量的巖藻依聚糖范圍為約O. 01mg/kg-200mg/kg/天，更優(yōu)選地為約O. 01mg/kg-20mg/kg/天，更優(yōu)選地為O. 02mg/kg-2mg/kg/天。優(yōu)選地，這些劑量范圍為O. 01-50mg/kg4 次 / 天(QID)、0· Ol-lOmg/kg QID,O. 01_2mg/kgQID、0· 01-0. 2mg/kg QID、0.01-50mg/kg3 次 / 天(TID)、0.01-10mg/kg TID、0. 01_2mg/kg TID、0. 01-0. 2mg /kg TID、0. 01-100mg/kg2 次 / 天(BID)、0· Ol-lOmg/kgBID，0. 01_2mg/kg BID 或 0. 01-0. 2mg/kg BID和每天局部施用一次或多次的0. 1-10%的濃度。給藥的化合物的量將取決于特定的巖藻依聚糖的效價和以及期望的效應大小或促凝血作用及給藥途徑。純化的巖藻依聚糖提取物(其再次作為藥物制劑的部分提供)可以單獨施用或與其它的巖藻依聚糖或諸如以下的治療劑組合施用止血劑、凝血因子或用于治療特定疾病或病癥的其它藥物，給藥要根據(jù)劑量方案由醫(yī)師的判斷、病人的需要等決定。具體的劑量方案為本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員公知或通過常規(guī)方法由實驗確定。代表性的給藥方案包括但不限于每天5次、每天4次、每天3次、每天2次、每天I次、每周3次、每周2次、每周I次、每月2次、每月I次給藥或它們的任何組合。優(yōu)選的組合物是那些每天給藥只有I次的組合物。巖藻依聚糖可以在給藥其它藥物前、同時或之后給予。如果與其它的藥物同時給藥，巖藻依聚糖可以存在于同一種組合物或不同的組合物中。因此，可以通過同時治療的方式給予個體巖藻依聚糖和其它的藥物?！巴瑫r治療”指給予受治療者藥物，使得在接受治療的受治療者中產(chǎn)生所述物質(zhì)組合的療效。例如，同時治療可以根據(jù)特定的給藥方案通過給予一個劑量的包括巖藻依聚糖的藥物組合物和一個劑量的包括至少一種其它藥劑如止血劑或凝血因子(例如FVIII或FIX)實現(xiàn)，在組合中它們含有治療有效的劑量。同樣，可以至少一個治療劑量來施用巖藻依聚糖和一個或多個其它的治療劑?？梢酝瑫r或在不同時間(即，以任意的順序在同一天或在不同的日期)施用單獨的藥物組合物，條件是能夠在接受治療的受治療者中產(chǎn)生這些物質(zhì)組合的治療效應。F.應用純化后，巖藻依聚糖可以用于多種用途。在這方面，巖藻依聚糖可以用作如促凝血劑促進凝血、減少出血、抵消用抗凝血劑治療受治療者的效應，用作抗炎劑，用作抗癌劑，用作抗病毒劑或用作造血(祖)細胞動員劑。用不同的體外凝血分析(例如dPT和aPTT分析)和活體出血模型(例如在血友病小鼠或狗中進行剪斷尾巴或角質(zhì)層的出血時間測定)容易確定純化的巖藻依聚糖提取物促進凝血和減少出血的能力。例如見F1DR Staff.Physicians ' Desk Reference. 2004, Anderson 等人(1976)Thromb. Res. 9 :575-580 ;Nordfang 等人(1991)ThrombHaemost. 66 :464-467 ;Welsch 等人(1991)ThrombosisRes earch64 :213-222 ；Broze 等人(2() ()I)Thromb Haemost85 :747-748 ；Scallan 等人(2003)Blood. 102 :2031-2037 ；Pijnappels 等人(1986)Thromb. Haemost. 55 :70-73 和Giles等人(1982)Blood60 :727_730，它們通過參考并入本文。在一個方面，巖藻依聚糖提取物可以用于本發(fā)明的方法中，改善在治療出血疾病中的止血，特別是增強與缺乏凝血因子相關(guān)的出血的疾病中的止血，或逆轉(zhuǎn)受治療者中的抗凝血劑的效應。給予受治療者巖藻依聚糖以治療出血疾病，所述出血疾病包括先天性的凝血障礙、獲得性的凝血障礙和創(chuàng)傷引起的出血狀況?？梢杂脦r藻依聚糖治療的出血疾病的實例包括但不限于血友病A、血友病B、馮維勒布蘭德氏病、特發(fā)性血小板減少癥、缺乏一個或多個接觸因子(如因子XI，因子XII、前激肽釋放酶、高分子量的激肽原(HMWK))、缺少一個或多個與臨床大出血相關(guān)的因子(如因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子II (低凝血酶原血癥)和馮維勒布蘭德氏因子)、維生素K缺乏、纖維蛋白原疾病，包括無纖維蛋白原血癥、低纖維蛋白原血癥和異常纖維蛋白原血癥、α 2-抗纖溶酶缺乏和由以下原因?qū)е碌某鲅^度肝病、腎病、血小板減少、血腫、血小板功能障礙、內(nèi)出血、關(guān)節(jié)積血、手術(shù)、創(chuàng)傷、低溫、月經(jīng)和妊娠。在一些實施方案中，用巖藻依聚糖治療的先天性凝血疾病包括血友病Α、血友病B和馮維勒布蘭德氏病。在其它的實施方案中，用巖藻依聚糖治療的獲得性凝血疾病包括缺乏因子VIII、馮維勒布蘭德氏因子IX、因子V、因子XI、因子XII和因子XIII，尤其是那些由抑制劑或抗自身免疫引起的疾病或由導致凝血因子合成減少的疾病或病癥引起的止血疾病?；颊叩男枰Q于要治療的特定的出血疾病。例如，可以在一段連續(xù)的時間以多個劑量給予巖藻依聚糖來治療慢性疾病(例如先天性的或獲得性的凝血因子缺乏)。可選地，可以在相對短的時間內(nèi)例如一到兩周以單個或多個劑量給予巖藻依聚糖來治療急性疾病(由手術(shù)或創(chuàng)傷引起的出血或在接受凝血置換治療的受治療者中由凝血因子抑制劑/自身免疫發(fā)作引起的出血)。另外，巖藻依聚糖可以與其它的止血劑、凝血因子和藥物組合使用。可以給予受治療者治療有效量的一種或多種選自下組的因子因子XI、因子XII、前激肽釋放酶、高分子量的激肽原(HMWK)、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子II、因子VIIa和馮維勒布蘭德氏因子。治療也可以包括施用促凝血劑，如內(nèi)源性途徑的激活因子，包括因子Xa、因子IXa、因子XIa、因子XIIa和Villa、前激肽釋放酶、高分子量的激肽原或外源性途徑的激活因子，包括組織因子、因子Vila、因子Va和因子Xa。另外需要輸入血液制品以補充大量出血患者的血液流失，并且在受傷的情況下，進行手術(shù)修復以阻止出血是適宜的。本發(fā)明也提供了逆轉(zhuǎn)受治療者中抗凝血劑效應的方法，所述方法包括給予受治療者治療有效量的包括純化的巖藻依聚糖的組合物。在一些實施方案中，受治療者已經(jīng)用抗凝血劑進行了治療，這些抗凝血劑包括但不限于肝素、香豆素衍生物如芐丙酮香豆素或雙香豆素、TFPI, AT III、狼瘡抗凝血劑、線蟲抗凝肽(NAPc2)、活性位點阻斷因子VIIa(因子VIIai)、因子IXa抑制劑、因子Xa抑制劑(包括磺達肝癸(fondaparinux)、艾屈肝素(idraparinux)、DX_9065a 和雷扎沙班(razaxaban) (DPC906)、因子 Va 和 VIIIa 的抑制劑(包括活化的蛋白C(APC)和可溶的凝血調(diào)制蛋白、凝血酶抑制劑(包括水蛭素、比伐盧定(bivalirudin)、阿加曲班(argatroban)和希美加群(ximelagatran)。在一些實施方案中，受治療者中的抗凝血劑可以是結(jié)合凝血因子的抗體，包括但不限于結(jié)合因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子II、因子XI、因子XII、馮維勒布蘭德氏因子、前激肽釋放酶或高分子量的激肽原(HMWK)的抗體。在一些實施方案中，純化的巖藻依聚糖提取物可以單獨施用或與一種或多種不同的巖藻依聚糖共同施用和/或一種或多種其他的逆轉(zhuǎn)受治療者中的抗凝血劑效應的治療劑組合施用。例如可以給予受治療者治療有效量的包括巖藻依聚糖和一種或多種選自以下因子的組合物因子XI、因子XII、前激肽釋放酶、高分子量的激肽原(HMWK)、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子II、因子VIIa和馮維勒布蘭德氏因子。治療還可以包括施用促凝血劑，如內(nèi)源性途徑的激活因子，包括因子Xa、因子IXa、因子XIa、因子XIIa和Villa、前激肽釋放酶、高分子量的激肽原或外源性途徑的激活因子，包括組織因子、因子Vila、因子Va和因子Xa。在另一方面，本發(fā)明提供了增強正在進行手術(shù)和侵入性操作的受治療者的方法， 所述方法包括給予受治療者治療有效量的包括純化的巖藻依聚糖的組合物。在一些實施方案中，巖藻依聚糖可以單獨向正在接受外科手術(shù)或侵入性操作的受治療者給藥或與一種或多種不同的巖藻依聚糖共同施用和/或與一種或多種其他的治療劑組合施用。例如可以給予受治療者治療有效量的一種或多種選自下組的因子因子XI、因子XII、前激肽釋放酶、高分子量的激肽原(HMWK)、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子II、因子VIIa和馮維勒布蘭德氏因子。治療還可以包括施用促凝血劑，如內(nèi)源性途徑的激活因子，包括因子Xa、因子IXa、因子XIa、因子XIIa和Villa、前激肽釋放酶、高分子量的激肽原或外源性途徑的激活因子，包括組織因子、因子Vila、因子Va和因子Xa。在另一個方面，本發(fā)明提供了抑制TFPI活性的方法，包括將包括TFPI的組合物與足量的巖藻依聚糖結(jié)合來抑制TFPI活性。在一些實施方案中，通過包括向受治療者給予治療有效量的含有純化巖藻依聚糖提取物的組合物的方法抑制受治療者中TFPI活性。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了抑制生物樣品中TFPI活性的方法，所述方法包括結(jié)合生物樣品(例如血液和血漿)和足量的純化巖藻依聚糖提取物來抑制TFPI活性。3.實驗以下是實施本發(fā)明的具體實施方式
的實施例。提供以下實施例只是為了說明的目的，而不是意欲以任何方式限制本發(fā)明的范圍。雖然已經(jīng)努力確保所用數(shù)據(jù)(例如量、溫度等)的準確性，但是一些實驗誤差和偏差應該是允許的。實施例I純化巖藻依聚糖實驗I第I 天將巖藻依聚糖提取物(50克，NPNutra批號050316-FU-85)溶于1，OOOmL的高純水(NERL，批號#0808036)，在40_45°C的水浴中攪拌45分鐘。溶液的pH為5. 82，溫度為41 °C，此時攪拌加入2. 5克EDTA 二鈉(2. 5% w EDTA/w巖藻依聚糖提取物，EDTA批號006139，來自Fisher)。EDTA溶解后溶液的pH降到4. 70，然后用O. IM NaOH將pH上調(diào)到6. 02?；旌显摲磻锊⒃?0-45°C和pH6. 0(±0. 2)維持I小時。I小時后，加入24克的氯化鈉(2%w/v，F(xiàn)isher批號#010166)并除去水套。然后用O. IM NaOH將pH從5. 7調(diào)到5. 95。摻加大約I體積的無水乙醇(I. I升,Sigma-Aldrich批號06563JE)沉淀巖藻依聚糖,使其在環(huán)境溫度下沉淀過夜。第2天通過抽吸除去多糖沉淀中的上清液。加入I升(1，OOOmL)的室溫高純水再溶解沉 淀物，接著進行30-60分鐘的劇烈攪拌。沉淀物成為溶液后，通過連續(xù)混合溶液溶解20克(2% w/v)氯化鈉。將第一天的重溶再鹽潰化的沉淀與SOOmL的無水乙醇混合將多糖再次沉淀。第3天再次除去第2天沉淀的上清液，在第3天重復重溶(1，OOOmL NERL水)-再鹽潰化(20克NaCl)-沉淀(800mL的無水ΕΤ0Η)整個過程。再次過夜沉淀巖藻依聚糖。第4天在第4天,通過抽吸除去多糖沉淀的上清液。接著通過用900ml的高純水在22°C混合1-1. 5小時溶解沉淀。其pH測定為6. 85，通過加入6N HCl調(diào)節(jié)到ρΗ5· 8。通過O. 2 μ mKLEENPAK N66P0SIDYNE濾囊(Pall，批號IJ7287)過濾整個溶液。接著將燒瓶和濾器用IOOmL高純水沖洗，高純水接著通過P0SIDYNE濾器并加入到多糖溶液中。接著將全部的過濾溶液( I. 05升)裝到單個凍干盤里并在-40°C冷凍3小時。隨后使用以下程序凍干48小時前4小時，擱板溫度10°C，接下來的20小時，擱板溫度為20°C，最后的24小時擱板溫度為50°C。將凍干的產(chǎn)物從干燥儀和盤上轉(zhuǎn)移到預稱重的塑料容器中。產(chǎn)物的產(chǎn)量為26. 4克(52. 8%重量產(chǎn)率)。產(chǎn)物標記為批次/實驗I并放入兩個塑料袋中貯存。實施例2純化巖藻依聚糖實驗2第I 天通過在40-45 °C的水浴中攪拌30-45分鐘將巖藻依聚糖提取物(50克，NPNutra批號050316-FU-85)溶于I, OOOmL的高純水(NERL，批號#0808036)。溶液的pH為5. 83，溫度為42. 5°C，此時攪拌加入I. 25克EDTA 二鈉(I. 25% wEDTA/w巖藻依聚糖提取物，EDTA批號006139，來自Fisher)。EDTA溶解后溶液的pH降到4. 90，然后用O. IM NaOH將pH上調(diào)到6. 04?；旌显摲磻锊⒃?0-45°C和pH6. 0(±0. 2)下維持I小時。I小時溫育后，溶液的pH為6. 15，此時向溶液中加入22克的氯化鈉。溶液的pH輕微降到5. 72，然后用O. IMNaOH將pH調(diào)到6. 08。摻加大約I升(IOOOmL)無水乙醇沉淀巖藻依聚糖，使其在室溫下沉淀過夜。第2天通過抽吸除去多糖沉淀中的上清液。加入I升(1，OOOmL)的室溫高純水再溶解沉淀物，接著進行30-60分鐘的劇烈攪拌。沉淀物成為溶液后，通過連續(xù)混合溶液溶解20克(2% w/v)氯化鈉。將第一天的重溶再鹽潰化的沉淀與750mL的無水乙醇混合將多糖再次沉淀。第3天再次除去第2天沉淀的上清液，在第3天重復重溶(1，OOOmL NERL水)，再鹽潰化(20克NaCl)和沉淀(750mL的無水ΕΤ0Η)整個過程。再次過夜沉淀巖藻依聚糖。第4天
在第4天，通過抽吸除去多糖沉淀的上清液。接著通過用900ml的高純水在22°C混合1-2小時溶解沉淀。其pH測定為6. 81，通過加入6N HCl調(diào)節(jié)到ρΗ5· 82。通過O. 2 μ mKLEENPAK N66P0SIDYNE濾囊(Pall，批號IJ7287)過濾整個溶液。接著將燒瓶和濾器用IOOmL高純水沖洗，高純水接著通過P0SIDYNE濾器并加入到多糖溶液中。接著將全部的過濾溶液( I. I升)裝到單個凍干盤里并在-40°c冷凍3小時。隨后使用以下程序凍干48小時前4小時，擱板溫度10°C，接下來的20小時，擱板溫度為20°C，最后的24小時擱板溫·度為50°C。將凍干的產(chǎn)物從干燥儀和盤上轉(zhuǎn)移到預稱重的塑料容器中。產(chǎn)物的產(chǎn)量為25. 4克(50. 8%的重量產(chǎn)率)。產(chǎn)物標記為批次/實驗2并放入兩個塑料袋中貯存。實施例3表征來自實驗I (實施例I)和實驗2 (實施例2)的純化的巖藻依聚糖提取物的樣品并與粗巖藻依聚糖提取物(NPNutra批號050316-FU-85)比較。由BayBioanalyticalLaboratory, Inc. (BBL, Hercules, CA)進行樣品分析。巖藻依聚糖的表征分析包括用具有激光散射(LLS)的大小排阻色譜檢測、巖藻糖和木糖含量分析、水含量分析、重金屬分析、硫酸鹽分析和元素分析。使用具有LLS的大小排阻色譜測量平均分子量。通過水解巖藻依聚糖并用設(shè)計成分離小碳水化合物的柱子通過HPLC測定巖藻糖和木糖的含量。也可以使用酚-硫酸分析以巖藻糖作為標準估計總碳水化合物的含量。使用卡爾費休(Karl Fischer)(KF)分析測定水的含量。硫酸鹽由離子交換色譜測定。陽離子(主要是鈉、鉀和其他的重金屬)通過ICP-MS測定。另外,對樣品進行兀素成分分析(CHNS)。由ComplexCarbohydrateResearch Center (喬治亞大學,喬治亞州雅典城)通過從樣品制備per_0_三甲基甲娃燒化的甲苷然后進行GC/MS來進行單糖分析。在Avigen對內(nèi)毒素通過LAL進行測定。結(jié)果匯總于表I中。表I巖藻依聚糖提取物的表征結(jié)果匯總
權(quán)利要求
1.從非均相混合物中純化巖藻依聚糖的方法，所述方法包括 (a)提供巖藻依聚糖源； (b)通過用螯合劑處理除去上述源中的重金屬離子，產(chǎn)生第一巖藻依聚糖混合物； (C)選擇性沉淀所述第一巖藻依聚糖混合物中的巖藻依聚糖，除去污染物； (d)在水溶液中重懸含有巖藻依聚糖的沉淀物，獲得第二巖藻依聚糖混合物； (e)重復步驟(C)和⑷一次或多次；和 (f)過濾含有巖藻依聚糖的水溶液，除去細菌和內(nèi)毒素污染物，產(chǎn)生純化的巖藻依聚糖。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述純化的巖藻依聚糖含有5到25百分重量的硫。
3.權(quán)利要求I或2所述的方法，其中巖藻依聚糖來源于藻類。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中巖藻依聚糖來源于墨角藻屬或昆布屬。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中巖藻依聚糖來源于墨角藻或海帶。
6.權(quán)利要求I所述的方法，其中螯合劑選自下組乙二胺四乙酸、乙二醇-雙-(β-氨乙醚)N，N，N'，Ν'-四乙酸、2，3-二巰基丙醇-I-磺酸和2，3-二巰基琥珀酸。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中螯合劑是乙二胺四乙酸。
8.權(quán)利要求I所述的方法，其中螯合劑固定在固體載體上。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中螯合劑是亞氨基二乙酸螯合樹脂。
10.權(quán)利要求I所述的方法，其中在所述第一巖藻依聚糖混合物中的巖藻依聚糖用乙醇選擇性地沉淀。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中乙醇的濃度為40%到50%(ν/ν)。
12.權(quán)利要求10所述的方法，其中pH保持在5.7到6. O之間。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中pH調(diào)節(jié)到5.95。
14.權(quán)利要求10所述的方法，其中向所述第一巖藻依聚糖混合物或所述第一巖藻依聚糖混合物和第二巖藻依聚糖混合物中加入NaCl，濃度為20-24g/升。
15.權(quán)利要求I所述的方法，其包括重復步驟(c)和(d)三次。
16.權(quán)利要求I所述的方法，進一步包括凍干純化的巖藻依聚糖。
17.—種組合物，其包括權(quán)利要求1-16任一項所述的方法產(chǎn)生的純化的巖藻依聚糖，其中所述純化的巖藻依聚糖具有通過電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測的檢測不到水平的砷、漠、鋪、鉆、鉛、裡、鑰、錫、鶴和f凡。
18.權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述巖藻依聚糖有生物學活性。
19.權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述巖藻依聚糖有促凝血活性。
20.權(quán)利要求17-19任一項所述的組合物，還包括藥學上可接受的賦形劑。
21.權(quán)利要求17-20任一項的組合物在制造用于治療需要增強凝血的受治療者的藥物中的用途。
22.權(quán)利要求21所述的用途,其中巖藻依聚糖以O(shè).Olmg/kg到100mg/kg的劑量給藥。
23.權(quán)利要求21或22所述的用途，其中受治療者患有選自下組的出血疾病慢性或急性出血疾病、血液因子缺乏導致的先天性凝血疾病和獲得性凝血疾病。
24.權(quán)利要求21或22所述的用途，其中受治療者在急性受傷或受傷情況下需要增強止血。
25.權(quán)利要求21或22所述的用途，其中需要增強凝血的原因是先前使用了抗凝血劑、手術(shù)或其他侵入性的操作。
26.權(quán)利要求21或22所述的用途，其中需要增強凝血的原因是用作抗炎劑、抗癌劑、抗病毒劑或用于造血祖細胞動員。
27.權(quán)利要求1-16任一項的方法產(chǎn)生的巖藻依聚糖在制造用于治療需要增強凝血的受治療者的藥物中的用途。
全文摘要
本申請公開了從褐藻提取物中純化巖藻依聚糖的方法。具體地說，公開了純化提取物中的巖藻依聚糖以除去重金屬離子、細菌和內(nèi)毒素污染物以及其他雜質(zhì)的方法。所述方法應用了螯合劑、選擇性沉淀和過濾等手段。
文檔編號A61P7/04GK102911281SQ20121041776
公開日2013年2月6日 申請日期2008年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月23日
發(fā)明者帕特里克·N·嘉康利, 詹尼弗·巴哈-戴維森, 斯里尼瓦莎·普拉薩德, 科克·約翰遜 申請人:巴克斯特國際公司, 巴克斯特健康護理股份有限公司