一種新型酶法提取海藻中間體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新型酶法提取海藻中間體的方法，屬于生物資源提取領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 海洋面積占地球表面的70%，生長在海水里的海藻是海洋生物資源的一大家族， 有250屬，1500余種，海藻富含多種營養(yǎng)成分，包括維生素、多糖、藻朊酸、甘露醇、甜菜堿、 高度不飽和脂肪酸、抗生素以及多種天然植物激素等。海藻生物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，利于加工提取活 性物質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。海藻肥是指以海藻或海藻提取物為 原料，通過發(fā)酵、酸堿工藝或肥料混配工藝生產(chǎn)出來的生物肥。該肥在歐盟頂0、ECOCERT， 北美0MIR，日本JAS標(biāo)準(zhǔn)和中國有機(jī)食品技術(shù)規(guī)范中被明確認(rèn)定為有機(jī)農(nóng)業(yè)的應(yīng)用產(chǎn)品。
[0003] 海藻中間體是由速生大型海藻經(jīng)特殊方法破碎細(xì)胞壁，釋放內(nèi)容物后形成的有機(jī) 液體肥料，它除保留了海藻中豐富的礦物質(zhì)及微量元素等營養(yǎng)成分外，還含有許多生物活 性物質(zhì)，其中發(fā)現(xiàn)對(duì)植物有產(chǎn)物效應(yīng)的如，酚類化合物、多種生長調(diào)節(jié)劑等，具有促進(jìn)作物 生長、提高作物產(chǎn)量及品質(zhì)的作用，已引起國內(nèi)外的普遍關(guān)注。海藻中間體肥料是以海藻提 取中間體為核心物質(zhì)制成的肥料，利用海藻提取中間體可以與大量元素、微量元素等混配 制作成新型肥料。其作用體現(xiàn)在：增加作物產(chǎn)量，提高作物品質(zhì)，促進(jìn)植物從土壤中吸收無 機(jī)養(yǎng)分，改善土壤結(jié)構(gòu)，提高種子發(fā)芽率，促進(jìn)根系生長，增強(qiáng)植物對(duì)外界脅迫條件的抵抗 能力（抗旱、抗寒、耐鹽、耐熱），還能提高植物自身的免疫力，抵御真菌、害蟲的侵襲，延長 農(nóng)作物收獲后的保質(zhì)期。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，化學(xué)肥料和農(nóng)藥不合理的大量施用造成土壤 結(jié)構(gòu)破壞，肥力下降，農(nóng)作物品質(zhì)降低。海藻中間體肥料能促進(jìn)植物生長發(fā)育，增強(qiáng)植物抗 性，促進(jìn)土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成，對(duì)環(huán)境無污染，符合當(dāng)今國內(nèi)外肥料多元高效化、復(fù)合專用 化、長效多功能化和綠色環(huán)?；l(fā)展的總趨勢(shì)。這類新型肥料在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用是維護(hù)農(nóng)田 生態(tài)平衡、改善農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)、實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效手段。
[0004] 傳統(tǒng)的海藻中間體提取工藝有：堿提取法、酸提取法。其中，堿提取法提取出來的 海藻提取物一般呈堿性，品相粗糙，且除海藻酸外其他功能成分破壞嚴(yán)重，施用過程中需調(diào) 整PH值。酸提取法在高溫高壓下進(jìn)行，對(duì)功效成分包括海藻酸破壞嚴(yán)重。目前國內(nèi)大多數(shù) 廠家主要采用堿提取法，即采用堿性試劑在70-80°C條件下對(duì)海藻進(jìn)行化學(xué)提取，海藻多糖 含量僅為1. 0-2. 5%。
[0005] 本發(fā)明是以生物酶工程技術(shù)為核心，針對(duì)海洋生物肥料需求而設(shè)計(jì)的海藻中間體 無損、綠色、環(huán)保提取新工藝。
[0006] 經(jīng)我方仔細(xì)考察，國內(nèi)目前雖有此類文獻(xiàn)資料報(bào)道，但均處于理論研宄水平，且多 為階段性研宄成果，尚未有報(bào)道復(fù)合酶提取法工業(yè)化生產(chǎn)的完整工藝研宄，更未發(fā)現(xiàn)國內(nèi) 目前有企業(yè)將此技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，因此本項(xiàng)目在同行業(yè)領(lǐng)域內(nèi)具有示范性作用，可以帶來 巨大的經(jīng)濟(jì)利益和行業(yè)影響力。本技術(shù)符合國家綠色農(nóng)業(yè)與可持續(xù)發(fā)展策略，符合國家越 來越重視的資源回收與再利用方針，因此開發(fā)前景廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供了一種新型酶法提取海藻中間體的方法，通 過本發(fā)明制備海藻中間體高效、快速；溫和、全面；且安全，無害。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] 一種新型酶法提取海藻中間體的方法，包括以下步驟：
[0009] (1)稱取100-500份干海帶，用水洗凈后浸泡充分吸水至1000-2000份；
[0010] (2)稱取100-500份水，向其中加入1. 0-4. 5份的有機(jī)或無機(jī)酸，混勻，得酸性溶 液；優(yōu)選的，100份水中加入1. 5-3. 0份的磷酸；
[0011] 所述的有機(jī)或無機(jī)酸選自磷酸、鹽酸、硝酸、亞硝酸、甲酸、醋酸、冰乙酸、硫酸、高 氯酸、過氧乙酸、氫溴酸、高氯酸中的一種或兩種以上的混合物；
[0012] (3)將步驟（1)獲得的1000-2000份的的海帶加入到步驟⑵的酸性溶液中，得混 合物A ;
[0013] (4)稱取1-25份復(fù)合酸性酶、溶于300-600份水中，混合均勻后加入步驟（3)所得 的混合物A中，混合均勻，得混合物B ;
[0014] 所述復(fù)合酸性酶選自酸性α -淀粉酶、酸性β -淀粉酶、酸性纖維素酶、酸性半纖 維素酶、酸性木聚糖酶、酸性羧酸酯酶、酸性糊精水解酶、酸性幾丁質(zhì)酶、酸性殼聚糖酶、酸 性果膠酶、酸性脂肪酶、酸性胃蛋白酶、酸性胰蛋白酶、酸性木瓜蛋白酶、酸性彈性蛋白酶、 酸性核酸外切酶、酸性核酸內(nèi)切酶中的兩種或兩種以上的混合物；優(yōu)選的，所述復(fù)合酸性酶 為酸性木聚糖酶、酸性脂肪酶、酸性胃蛋白酶和酸性核酸外切酶的混合物；其質(zhì)量配比為 3:2:2:1〇
[0015] (5)將混合物B在溫度為40-60°C條件下，攪拌15-90min ;優(yōu)選的溫度為45-55°C;
[0016] (6)將1-80份無機(jī)堿性化合物、1-20份復(fù)合堿性酶溶于1000-2000份水中，混勻 后加入混合物B中，得混合物C ;
[0017] 所述無機(jī)堿性化合物選自氫氧化鉀、氫氧化鈉、硝酸鉀、硝酸鈉、醋酸鈉、醋酸鉀、 碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鎂、硫酸鈉、硫酸鎂中的一種或兩種以上的混合物；
[0018] 所述復(fù)合堿性酶選自堿性α -淀粉酶、堿性β -淀粉酶、堿性纖維素酶、堿性半 纖維素酶、堿性木聚糖酶、堿性羧酸酯酶、糊精水解酶、堿性幾丁質(zhì)酶、堿性殼聚糖酶、堿性 果膠酶、堿性脂肪酶、堿性磷酸酶、堿性胃蛋白酶、堿性胰蛋白酶、堿性木瓜蛋白酶、堿性 彈性蛋白酶、堿性核酸外切酶、堿性核酸內(nèi)切酶中的兩種或兩種以上的混合物。優(yōu)選的， 所述復(fù)合堿性酶為α -淀粉酶、木聚糖酶、胰蛋白酶和核酸外切酶的混合物；其質(zhì)量比為 3:2:1:1 ；
[0019] (7)將混合物C在溫度為40-60°C條件下攪拌15-90min ;優(yōu)選的，溫度為45-55°C;
[0020] (8)將1-100份保藏劑溶于100份的水中，加入混合物C中，40-60°C條件下，攪拌 均勻，冷卻至室溫，即得海藻中間體；
[0021] 所述的保藏劑選自硫酸銅、硫酸鐵、硫酸亞鐵、EDTA、EDDHA、ATMP、三聚磷酸鈉、檸 檬酸鈉、酒石酸鉀鈉、苯甲酸鈉、苯甲酸鉀、山梨酸鉀、山梨酸鈉、丙酸鈣、對(duì)羥基苯甲酸甲 酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、雙乙酸鈉、乳酸鏈球菌素中的一種或兩種以上的混合物；優(yōu)選的，所 述保藏劑為苯甲酸鈉、硫酸銅、EDTA和乳酸鏈球菌素按質(zhì)量比為4:3:3:1的混合物。
[0022] 本發(fā)明中所述的份是指重量份數(shù)。
[0023] 通過本發(fā)明制備的海藻中間體以及海藻中間體在作為或制備肥料方面的應(yīng)用也 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0024] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0025] (1)本發(fā)明制備方法高效、快速。酶提取可以選擇性的快速分解相應(yīng)底物，具有快 速、高效的特點(diǎn)。與傳統(tǒng)酸堿提取工藝相比，本發(fā)明提取效率提高了 50%以上，海藻多糖含 量提高50-100%，海藻酸含量在3. 5-4. 0%之間，海藻中間體產(chǎn)品效果顯著提升。
[0026] (2)通過本發(fā)明制備的海藻中間體溫和、全面。農(nóng)用海藻中間體提取技術(shù)是伴隨海 藻肥在我國市場(chǎng)份額擴(kuò)大及消費(fèi)者認(rèn)同度普遍提高的前提下逐步開發(fā)，其本源大多是借鑒 工業(yè)海藻酸鈉生產(chǎn)工藝衍生而來，因此傳統(tǒng)工藝過分追求海藻酸鈉含量，而忽視了其他有 效成分。研宄發(fā)現(xiàn)，海藻肥效機(jī)制并非單一的由海藻酸所決定，而是由海藻中所含的多種海 洋功能性碳水化合物、氨基酸多肽以及內(nèi)源激素類活性小分子物質(zhì)共同協(xié)作實(shí)現(xiàn)，而這些 功能分子在傳統(tǒng)工藝中幾乎被高溫、酸堿破壞殆盡，導(dǎo)致產(chǎn)品肥效大打折扣；另外，不同領(lǐng) 域?qū)ν划a(chǎn)品的指標(biāo)要求及應(yīng)用方式存在巨大差別，海藻中間體應(yīng)用于肥料生產(chǎn)時(shí)，除噴 灌及滴灌肥要求產(chǎn)品全溶之外，其他肥種對(duì)產(chǎn)品溶解度要求不是非常嚴(yán)格。海藻提取過程 中產(chǎn)生的部分非水溶性碳水化合物及脂類（如纖維素類、脂蛋白類）本身即為非常優(yōu)良的 海洋有機(jī)質(zhì)成分，能夠?qū)ψ魑锷L起到一定的輔助作用，如在提取過程中將這類成分丟棄 既會(huì)造成生產(chǎn)的污染排放、又會(huì)使最終產(chǎn)品肥效大打折扣。本發(fā)明在快速、高效的前提下， 整個(gè)過程均在海藻穩(wěn)定pH及溫度條件下進(jìn)行，真正實(shí)現(xiàn)了 "無損提取"，將海藻中所有有效 成分全部保留在產(chǎn)品中，真正實(shí)現(xiàn)全效添加。
[0027] (3)通過本發(fā)明制備的海藻中間體安全，無害。由于在提取過程中不添加任何有毒 有害物質(zhì)，保證了本發(fā)明所生產(chǎn)產(chǎn)品無殘留、無公害。另外，海藻提取過程中產(chǎn)生的部分非 水溶性碳水化合物及脂類（如纖維素類、脂蛋白類）本身即為非常優(yōu)良的海洋有機(jī)質(zhì)成分， 能夠?qū)ψ魑锷L起到一定的輔助作用，如在提取過程中將這類成分丟棄既會(huì)造成生產(chǎn)的污 染排放、又會(huì)使最終產(chǎn)品肥效大打折扣。因此，本發(fā)明對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行了全回收，不會(huì)造成任何 污染排放。從而達(dá)到節(jié)肥增效、消除污染、保護(hù)環(huán)境的目的。
[0028] (4)采用本發(fā)明所生產(chǎn)的海藻中間體作為海洋生物肥料可以根據(jù)不同的作物及土 壤環(huán)境的改變，啟動(dòng)相應(yīng)的應(yīng)答機(jī)制，達(dá)到自動(dòng)調(diào)節(jié)作物自身代謝調(diào)控途徑、土壤理化性質(zhì) 及微生物菌群結(jié)構(gòu)等作用；有效提高肥料利用率，減少化肥用量達(dá)5-10% ;綜合提高作物 的抗寒、抗旱等抗逆能力，尤其對(duì)細(xì)菌、真菌病害有明顯的預(yù)防和抑制效果，顯著降低重茬、 死棵現(xiàn)象發(fā)生率，有效吸附土壤重金屬，調(diào)節(jié)土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)，消除土壤板結(jié)及酸化問 題，實(shí)現(xiàn)作物持續(xù)高產(chǎn)。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明方法提取海藻中間體HPLC測(cè)定結(jié)果；
[0030] 圖2為通過堿法提供海藻中間體測(cè)定結(jié)果；
[0031] 圖3為本發(fā)明海藻中間體中赤霉素 HPLC測(cè)定結(jié)果；
[0032] 圖4為本發(fā)明海藻中間體中脫落酸HPLC的測(cè)定結(jié)果；
[0033] 圖5為本發(fā)明海藻中間體中吲哚丁酸HPLC的測(cè)定結(jié)果；
[0034] 圖6為本發(fā)明海藻中間體重吲哚乙酸HPLC的測(cè)定結(jié)果；
[0035] 圖7為本發(fā)明海藻中間體對(duì)西紅柿和黃瓜的促生效果；
[0036] 圖8為本發(fā)明對(duì)西紅柿和黃瓜增加精品果實(shí)效果。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行 修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[003