專(zhuān)利名稱(chēng)：一種預(yù)防及治療瘢痕的疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種疫苗，特別是一種預(yù)防及治療瘢痕的疫苗及制備方法，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞介素10 (IL-10)是多種細(xì)胞產(chǎn)生的重要免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，包括免疫抑制、抗炎及免疫調(diào)節(jié)特性，主要生物學(xué)功能是限制和終止炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的分化和増殖。體內(nèi)外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明IL-10在炎癥、惡變和自身免疫性疾病方面都發(fā)揮了重要功能。在臨床上應(yīng)用于治療急、慢性炎癥疾病、自身免疫性疾病如炎性腸炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆病、多發(fā)性硬化癥、銀屑病等。IL-10作為ー種炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)抑制因子，具有①調(diào)整炎癥細(xì)胞的募集和分化，減 少前炎癥細(xì)胞因子的分泌減少胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)生，上調(diào)蛋白水解酶(如基質(zhì)金屬酶)増加ECM的降解；③下調(diào)TGF-β I的活性及表達(dá)，拮抗瘢痕增生的作用。Renovo公司利用重組hIL-ΙΟ作為治療瘢痕增生，改善瘢痕外觀的候選藥物已進(jìn)入III期臨床研究，但存在著缺乏對(duì)病理部位的特異性、用藥次數(shù)多、時(shí)間長(zhǎng)及純化工藝繁雜等缺點(diǎn)。膠原蛋白過(guò)度沉積是瘢痕組織的重要特征，而CBD多肽(TKKTLRT，7肽)是能夠特異結(jié)合膠原蛋白的多肽序列。將編碼人hIL-ΙΟ基因、CBD基因與真核表達(dá)載體pcDNA3. I (+)在基因水平融合，構(gòu)建了預(yù)防和治療瘢痕的核酸疫苗。經(jīng)Balb/C小鼠傷ロ愈合模型試驗(yàn)證實(shí)，該疫苗在一定時(shí)間內(nèi)能夠誘導(dǎo)小鼠合成分泌hIL-10-CBD，分泌的hIL-10-CBD蛋白能夠與傷ロ愈合過(guò)程中細(xì)胞產(chǎn)生的膠原蛋白特異結(jié)合，既可以降低疫苗量及治療成本，又能夠在瘢痕部位有效地發(fā)揮藥理作用，從而達(dá)到預(yù)防及治療瘢痕的形成，改善瘢痕外觀的療效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防及治療瘢痕的疫苗及制備方法，該疫苗是ー種核酸疫苗，是由編碼人白細(xì)胞介素10 (human interlenkin 10，hIL_10)基因、膠原特異結(jié)合的多肽CBD基因與真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)在基因水平融合后構(gòu)成。經(jīng)Balb/C小鼠傷ロ愈合模型試驗(yàn)證實(shí)，該疫苗在一定時(shí)間內(nèi)能夠誘導(dǎo)小鼠合成分泌hIL-10-CBD，分泌的hIL-10-CBD蛋白能夠與傷ロ愈合過(guò)程中細(xì)胞產(chǎn)生的膠原蛋白特異結(jié)合，從而阻止了胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積而造成的纖維化。該疫苗用于預(yù)防及治療瘢痕的形成，改善瘢痕的外觀的作用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種預(yù)防及治療瘢痕的疫苗，其特征是它是由編碼人白細(xì)胞介素10基因、膠原特異結(jié)合的多肽CBD基因與真核表達(dá)載體pcDNA3. I (+)在基因水平融合后構(gòu)成，其中，編碼人白細(xì)胞介素10基因簡(jiǎn)稱(chēng)hIL-ΙΟ基因；融合后的hiL-10-CBD重組基因的核酸序列Nol 5，atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaacggtggtggtggttctaccaagaagac c ctccgcacc3’，其中 3’，5’ 分別代表重組核酸鏈的3，，5，端。所述的hIL-ΙΟ基因，其相應(yīng)的核酸序列No2 5’ atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaag ctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaac3’其中，3’，5’分別代表核酸鏈的3’，5’端。所述膠原特異結(jié)合的多肽CBD基因，其核酸序列No3 5’ accaagaagaccctccgcacc3’，其中 3’ , 5’ 分別代表核酸鏈的 3’ , 5’ 端。所述的融合后的hIL-10-CBD重組基因在制備用于預(yù)防或治療瘢痕的疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過(guò)基因工程手段把人白細(xì)胞介素10 (humaninterlenkin 10，hIL-10)與膠原特異結(jié)合的CBD多肽在基因水平融合與真核表達(dá)載體pcDNA3. I (+)在基因水平融合后組成。經(jīng)Balb/C傷ロ愈合模型試驗(yàn)證實(shí)，該疫苗在一定時(shí)間內(nèi)能夠持續(xù)誘導(dǎo)小鼠合成分泌hIL-10-CBD，分泌的hIL-10-CBD能夠與傷ロ愈合過(guò)程中產(chǎn)生的膠原特異結(jié)合，既可以降低疫苗的用量、減少毒副作用，同時(shí)更為重要的是該疫苗能夠特異地在瘢痕部位發(fā)揮藥理作用，最大程度地預(yù)防及治療瘢痕的形成，改善瘢痕的外觀。


下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定圖I是愈合切ロ及愈合組織中膠原分布(A-C為疫苗治療組；D_F為空白對(duì)照組；箭頭示意創(chuàng)緣大小)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過(guò)基因工程手段把人白細(xì)胞介素10 (human interlenkin 10, hIL-10)基因與膠原特異結(jié)合多肽CBD在基因水平融合后的重組基因hIL-10-CBD核酸序列。所述的hIL-ΙΟ基因，其相應(yīng)的核酸序列No2 5，atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactt
taagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgaga
accaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgc
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gaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatac
gaaac3’其中，3’，5’分別代表核酸鏈的3’，5’端。所述膠原蛋白特異結(jié)合多肽CBD (TKKTLRT，7肽)，其核酸序列No3 5’ accaagaagaccctccgcacc3’，其中 3’，5’ 分別代表核酸鏈的 3’，5’ 端。融合后的hIL-10-CBD重組基因的核酸序列Nol 5’ atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaacggtggtggtggttctaccaagaagacc ctccgcacc3’其中，3’，5’分別代表重組核酸鏈的3’，5’端。所述的融合后的hIL-10-CBD重組基因真核表達(dá)載體在制備用于預(yù)防或治療瘢痕疫苗中的應(yīng)用。實(shí)施例I :hIL-10_CBD重組基因的獲得(一)hIL-10cDNA 的獲得I.總RNA的提取人外周血經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗滌2次，重懸于10%RPMI 1640培養(yǎng)液，加入終濃度為10g/l的ConA，置5%C02培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞。參照RNA抽提試劑盒的方法，抽提總RNA，_80°C保存?zhèn)溆谩?.總RNA的提取及hIL-10cDNA的擴(kuò)增用Takara公司RNA提取及反轉(zhuǎn)試劑盒，按說(shuō)明抽提總RNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng) 總RNA 500ng，5X 逆轉(zhuǎn)錄Buffer2y l，oligo dT O. 5 μ l,6mer O. 5 μ 1，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 O. 5 μ 1，DEPC 水加至 10 μ I。37°C溫育 30min，后 85°C溫育 3min，得 cDNA。(ニ)載體的構(gòu)建及鑒定I. pMD18-T克隆載體的構(gòu)建按真核細(xì)胞慣用密碼子設(shè)計(jì)含CBD基因序列、相應(yīng)的酶切位點(diǎn)(Nhel/EcoRI)以及l(fā)inker (G4S)的堿基序列,合成如下2條引物Pf、Pr。所述膠原蛋白特異結(jié)合多肽CBD (TKKTLRT，7肽)，其核酸序列No3 5’ accaagaagaccctccgcaccj’ ；引入的linker(G4S)核酸序列 No4 5' ggtggtggtggtagc3> ；Pf :5’ gctagcatgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcac3’ (77mer, 5’ -3’ )Pr:5 ’ gaattctcaggtgcggagggtcttcttggtgctaccaccaccaccgtttcgtatcttcattgtc3，(64mer, 5’ -3，)以Pf、Pr 為引物，以 cDNA 為模板，隨之按 95°C 30s，58°C 30s，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)后72°C進(jìn)行延伸12min，得到PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物回收連入pMD18_T載體，進(jìn)行酶切鑒定和序列測(cè)定，得到pMD18T-hIL10-CBD重組克隆載體。2. pcDNA-hIL10-CBD真核表達(dá)載體的構(gòu)建測(cè)序正確的pMD18T-IL10-CBD重組克隆載體及原核pcDNA3. I (+)表達(dá)載體，分別經(jīng)Nhel/EcoRI雙酶切，回收目的片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，挑取克隆，同樣回收質(zhì)粒，酶切鑒定，進(jìn)ー步經(jīng)核酸測(cè)序鑒定，構(gòu)建成pcDNA-hIL10-CBD真核表達(dá)載體，即本專(zhuān)利所述的核酸疫苗。 實(shí)施例2 :核酸疫苗的制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制(一)疫苗的制備I.疫苗的擴(kuò)增上述pcDNA-hIL10_CBD/DH5 α菌接種于含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)7-8h，次日以2%的接種量接種到同樣的培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37°C過(guò)夜培養(yǎng)。2.疫苗的制備按照北京康為生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的“金牌超量無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒”使用說(shuō)明操作。制備提取無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒ー即核酸疫苗，具體操作步驟如下①取150ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，IOOOOrpm離心2_3min收集細(xì)菌，盡量吸棄全部上清。②向菌體沉淀的離心管中加入12ml Buffer Pl使用移液器或振蕩器充分混勻，懸浮細(xì)菌沉淀。③向離心管中加入12ml Buffer P2，溫和地上下顛倒混勻6_8次，使菌體充分裂解，室溫放置3-5min。此時(shí)溶液應(yīng)變得清亮粘稠。④向離心管中加入12ml Buffer E3，立即上下顛倒混勻6_8次，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，室溫放置5min。IOOOOrpm離心lOmin。將上清全部倒入除內(nèi)毒素過(guò)濾器中，濾液收集在潔凈的50ml離心管中。⑤向?yàn)V液中加入Ilml異丙醇，上下顛倒混勻。將混合液轉(zhuǎn)移到平衡好的吸附柱中(向已裝入收集管中的吸附柱加入2ml Buffer PS, IOOOOrpm離心2min即可)。6000-10000rpm離心2min,棄收集管中的廢液。⑥向吸附柱中加入IOml Buffer PW, 6000-10000rpm離心2min,棄收集管中的廢
液，重復(fù)操作I次。⑦將吸附柱重新放回收集管中，IOOOOrpm離心5min，棄廢液，將吸附柱置于室溫干燥IOmin。⑧將吸附柱置于ー個(gè)新的收集管中，向吸附膜的中間部位加入l-3mlEndo_freeBufer EB,室溫放置2_5min, IOOOOrpm離心5min,將質(zhì)粒溶液收集到收集管中。(ニ)制備疫苗的質(zhì)量控制I.疫苗的純度及含量測(cè)定
取純化好的疫苗溶液5 μ 1，加入95 μ I純水(即按20倍稀釋)。應(yīng)用DU800Nucleicacid/Protein analyzer,利用軟件中的程序測(cè)定分析稀釋樣品中疫苗DNA在波長(zhǎng)260nm、280nm、320nm的OD值，分析測(cè)定出稀釋樣品中疫苗DNA的純度(260nm/280nm)及濃度含量，并計(jì)算出所制備疫苗的濃度(μ g/ml)。2.疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)樣品中疫苗溶液的濃度應(yīng)彡500μ g/ml,260nm/280nm的比值在I. 8左右。實(shí)施例3 Balb/C小鼠傷ロ愈合模型的建立(一)Balb/C小鼠傷ロ愈合模型的建立
I. Balb/C小鼠的預(yù)處理及第一次疫苗的注射7周齡，18只Balb/C雄性小鼠，利用電推剪及強(qiáng)效脫毛膏去除背部軟毛，均分為3組。在小鼠背部正中用印度墨水畫(huà)出O. 4cmXlcm長(zhǎng)方形區(qū)域。24h后沿區(qū)域兩側(cè)皮下分別注射①空白對(duì)照組注射50 μ I體積的生理鹽水；②陰性對(duì)照組注射50 μ g/50 μ I (用生理鹽水稀釋制備的空載體PCDNA3. I (+))的PCDNA3. I (+)空載體實(shí)驗(yàn)組注射50 μ g/50 μ I(用生理鹽水稀釋制備的核酸疫苗pcDNA3. l-hIL10-CBD)的核酸疫苗。2.小鼠傷ロ的制備及再次疫苗的注射24h后，全層切除小鼠背部畫(huà)出的O. 4cmX Icm區(qū)域，傷ロ暫時(shí)應(yīng)用無(wú)菌油紗包扎。三天后打開(kāi)包扎傷ロ的油紗，露出創(chuàng)面，同上再次分別注射相同劑量的生理鹽水、空載體及疫苗。分別于7，14，21，28d采集傷ロ處組織及血清樣品。(ニ)小鼠傷ロ愈合過(guò)程中hIL-ΙΟ的測(cè)定血清樣品應(yīng)用新博盛生物技術(shù)有限公司“人IL-10 ELISA試劑盒”說(shuō)明書(shū)測(cè)定。測(cè)定后IL-10標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=42. 04χ-5. 23 (r = O. 9863)，按說(shuō)明書(shū)測(cè)定樣品的OD45tol值，井根據(jù)曲線方程計(jì)算出核酸疫苗的濃度，如表I所示。表I疫苗治療后小鼠血清中hIL-ΙΟ的產(chǎn)生及變化(ng/ml)
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防及治療瘢痕的疫苗，其特征是它是由編碼人白細(xì)胞介素10基因、膠原特異結(jié)合的多肽CBD基因與真核表達(dá)載體PCDNA3. 1(+)在基因水平融合后構(gòu)成，其中，編碼人白細(xì)胞介素10基因簡(jiǎn)稱(chēng)hIL-ΙΟ基因；融合后的hIL-10-CBD重組基因的核酸序列Nol 5’ atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaacggtggtggtggttctaccaagaagacc ctccgcacc3’，其中 3’，5’ 分別代表重組核酸鏈的 3’，5’端。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種預(yù)防及治療瘢痕的疫苗，其特征是所述的hIL-ΙΟ基因，其相應(yīng)的核酸序列No2:5’ atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaac3， 其中，3’，5’分別代表核酸鏈的3’，5’端。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種預(yù)防及治療瘢痕的疫苗，其特征是所述膠原特異結(jié)合的多肽CBD基因，其核酸序列No3 :5’ accaagaagaccctccgcacc3’，其中3’，5’分別代表核酸鏈的3’，5’端。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種預(yù)防及治療瘢痕的疫苗，其特征是所述的融合后的hIL-10-CBD重組基因在制備用于預(yù)防或治療瘢痕疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預(yù)防及治療瘢痕的疫苗及制備方法，該疫苗由編碼人白細(xì)胞介素10(human interlenkin 10,hIL-10)基因、膠原特異結(jié)合的多肽CBD基因與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)在基因水平融合后構(gòu)成。經(jīng)Balb/C小鼠傷口愈合模型試驗(yàn)證實(shí)，該疫苗在一定時(shí)間內(nèi)能夠持續(xù)誘導(dǎo)小鼠合成分泌hIL-10-CBD。分泌的hIL-10-CBD蛋白能夠與傷口愈合過(guò)程中細(xì)胞產(chǎn)生的膠原蛋白特異結(jié)合，既可以降低疫苗量、毒副作用及治療成本，又能夠在瘢痕部位特異有效地發(fā)揮藥理作用，從而阻止了胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積而造成的纖維化，達(dá)到了預(yù)防及治療瘢痕的形成，改善瘢痕外觀的療效。本發(fā)明通過(guò)基因工程手段把人白細(xì)胞介素10(human interlenkin 10，hIL-10)與膠原特異結(jié)合的CBD多肽在基因水平融合與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)在基因水平融合后組成。
文檔編號(hào)A61P17/02GK102836424SQ201210361718
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者胡大海, 石繼紅, 朱雄翔, 韓軍濤, 胡曉龍, 方小兵, 白曉智, 蔡維霞, 湯朝武 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)