專利名稱：一種生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(nvdc-jxa1株)的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及獸用生物制品技術領域，具體地，涉及豬繁殖與呼吸綜合征疫苗技術領域，進一步地，涉及一種生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXAl株)的方法及其應用。
背景技術：
豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，又稱藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的一種高度接觸性傳染病。不同年齡、品種和性別的豬均能感染，但以妊娠母豬和I月齡以內仔豬最易感。該病以母豬流產、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔豬呼吸困難、敗血癥、高死亡率等為主要特征。高致病性豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株引起的一種急性、高致死性傳染病，臨床表現以體溫高、發(fā)病率高和死亡率高“三高”為主要特點。2006年夏季，該病(當時稱“豬無名高熱病”)在我國較大范圍流行，使我國養(yǎng)豬業(yè)遭受了前所未有的慘重的經濟損失。根據基因同源性和血清學差異可將PRRSV分為美洲型和歐洲型，在我國流行的主要是美洲型毒株。由于目前尚無治療該病的特效藥物，因此使用特異性疫苗成為防控PRRS的主要措施。目前國內外已研制出滅活疫苗和弱毒活疫苗兩種類型的疫苗，一般認為弱毒活疫苗免疫效果好，而滅活疫苗安全性更佳。滅活疫苗是較早研制的疫苗，使用后主要刺激豬體產生體液免疫反應。因其是死苗，故最大的優(yōu)點是安全、不散毒、便于儲存和運輸。Bayer公司于1997年首次推出了滅活疫苗PRRomiSetM，目前我國已有20家企業(yè)被農業(yè)部批準生產PRRS滅活疫苗=CH-Ia株(哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司)和NVDC-JXAl株(廣東大華農動物保健品股份有限公司等19家)，主要用于PRRS陰性豬場的免疫，對控制PRRS和降低經濟損失起到一定的重大。在PRRS滅活疫苗制備過程中，涉及制苗用病毒液的制備工藝，這是疫苗制備的關鍵點，而這一工藝傳統(tǒng)的制備方法是通過轉瓶培養(yǎng)細胞的生產方式來實現的，這種生產方式具有以下缺點1)勞動強度大；2)批間差異大；3)細胞密度低，產量低；4)容易污染等。實踐證明，僅僅依靠動物細胞通過轉瓶培養(yǎng)方式生產病毒的量是有限的。為了克服現有PRRS滅活疫苗生產技術所存在的缺陷，尋找簡便、高效的病毒株生長培養(yǎng)條件對提高疫苗質量、降低生產成本具有重大意義。近年來，利用生物反應器和微載體技術培養(yǎng)細胞、繁殖病毒在生物制藥行業(yè)應用廣泛。這一技術具有以下優(yōu)點1)產品批間差異小；2)極大的降低細菌污染的可能性；3)產品質量穩(wěn)定，免疫副反應低；4)易于放大。如果將這一技術應用于PRRS疫苗的生產，則既保持細胞培養(yǎng)的優(yōu)勢又克服了其生產產量有限的缺點。我國在這方面的研究雖然起步較晚，但近年來研究非?；钴S。中國專利公開號為CN101612395A，發(fā)明名稱為一種培養(yǎng)敏感細胞生產藍耳病疫苗的方法的中國專利公開了一種在生物反應器中用微載體培養(yǎng)敏感細胞生產豬藍耳病疫苗的方法，所用的生物反應器為攪拌式生物反應器、氣升式生物反應器、Wave生物反應器和中空纖維反應器，培養(yǎng)方式采用流加培養(yǎng)或灌注培養(yǎng)；專利申請公布號為CN102038942A，發(fā)明名稱為應用生物反應器工業(yè)化生產豬藍耳病疫苗的方法的中國專利提出一種利用Cell Lift型生物反應器，采用生物反應器間逐級放大的倒罐式操作技術，進行細胞的高密度培養(yǎng)以制備疫苗的方法，所用的生物反應器為攪拌式生物反應器，所述載體為Cytodex系列微載體，采用批式、流加或灌注培養(yǎng)方式；專利申請公布號為CN102002482A，發(fā)明名稱為豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒毒的生產方法的中國專利則提出一種應用激流-灌注式生物反應器培養(yǎng)Marc-145細胞生產豬藍耳病病毒的生產工藝，所述載體為聚酯酰胺紙片載體；而專利申請公布號為CN101831412 A，發(fā)明名稱為一種大規(guī)模生產豬藍耳病病毒的方法的中國專利和專利申請公布號為CN101979514 A，發(fā)明名稱為豬藍耳病病毒與疫苗及二者的生產方法的中國專利均提出一種采用潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應器生產豬藍耳病病毒的方法，所述微載體為片狀、球形或網狀，成分為聚酯、明膠或多糖，優(yōu)選的為網狀聚酯纖維。而應用攪拌式生物反應器-球形微載體體系培養(yǎng)細胞生產豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXAl株)，尚未見報道。

發(fā)明內容
為此，本發(fā)明提供了一種生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXA1株)的方法及其應用，該方法生產的疫苗，污染機率低，病毒滴度高(其毒價可提高2 5倍)，批間差異小，產品質量穩(wěn)定，副反應小，能全面提升疫苗質量。本發(fā)明的技術方案如下一種生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXAI株)的方法及其應用，包括如下步驟(I)用微載體培養(yǎng)制苗用細胞選擇生物反應器；選擇球形微載體作為細胞貼附生長的載體；選擇Marc-145細胞作為制苗用細胞；將Marc-145細胞經胰酶消化液消化傳代，用配方為含7% 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、pH調整為7. 2的細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，形成良好單層時，取轉瓶上生長良好的Marc-145細胞，經胰酶消化液消化制備為細胞懸液，細胞計數后按每個微載體添加5 20個細胞的比例接種到含有細胞生長液與微載體的生物反應器中；生物反應器設定如下參數溫度37°C、pH值6. 8 7. 4、溶氧含量40% 60%、攪拌速度30 55rpm、C02通氣量5 10%，進行反應器自動控制培養(yǎng)；(2)制苗用毒液的繁殖與收獲培養(yǎng)后48 72小時待觀察到微載體上細胞基本長滿形成致密單層時，去掉細胞生長液，加入1/4 I工作體積的配方為含2% 5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、pH調整為7. 2的細胞維持液；將豬繁殖與呼吸綜合征病毒NVDC-JXAl株種毒按照感染復數M. 0. I.為0. 0001 I. 0的比例接種生長良好的上述細胞單層，37°C孵育I 10小時，然后向生物反應器中補足生物反應器正常工作所需要的培養(yǎng)基，并設定如下參數溫度37°C、pH值6. 5 7. 2、溶氧40% 60%、攪拌速度30 45rpm、C02通氣量5 10%，進行反應器自動控制培養(yǎng)；接毒后每隔2小時取反應器中微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況，待觀察微載體上細胞基本全部脫落、細胞病變達到80%以上時，停止反應器的攪拌，待微載體全部沉到反應器底部后，分別收獲上清液和微載體；反復凍融2次，經離心或過濾除去細胞碎片，_20°C以下保存作為半成品；按《中國獸藥典》附錄對半成品進行無菌檢驗及病毒含量測定，病毒含量應不低于106_°TCID5(l/ml ；(3)疫苗配制將檢驗合格的病毒液按終濃度為0. 1%比例加入甲醛溶液，混勻，置37°C滅活18小時取出，置2 8°C保存；滅活檢驗合格后，取滅活病毒液96份，加入高壓滅、菌冷卻后的吐溫-804份，充分攪拌，直至吐溫-80完全溶解，制得水相。取注射用白油94份、司本-806份混合后加熱，再加入硬脂酸鋁2份，隨加隨攪拌到透明為止，高壓滅菌，制得油相；取油相I. 5份置乳化灌中攪拌，再緩慢加入水相I份，加完后再以3000r/min攪拌30 60分鐘，使混合物充分乳化，制成豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXAl株)；(4)成品檢驗按農業(yè)部審批通過的《豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXAl株)制造及檢驗試行規(guī)程》要求進行檢驗，各項指標均符合規(guī)定。所述用生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXA1株)的方法，步驟(I)中，生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧和攪拌速度等參數，適用于微載體培養(yǎng)的生物反應器，容積為I. 3L 1500L。所述用生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXA1株)的方法，步驟(I)中，微載體為球形微載體，添加量為2 10g/L，在使用前需清洗、滅菌，方法如下1) 用PBS浸泡微載體三小時以上；2)用PBS清洗微載體3遍；3)用PBS浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌30分鐘。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明所述用生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXA1株)的方法，與傳統(tǒng)的轉瓶生產工藝相比，具有以下優(yōu)點(I)應用本發(fā)明生產的疫苗，污染機率低，病毒滴度高(其毒價可提高2 5倍)，批間差異小，產品質量穩(wěn)定，副反應小，能全面提升疫苗質量；(2)自動化程度高，勞動強度小，節(jié)省人力，且產量大、占地小、生產周期短，能有效降低生產成本；(3)本發(fā)明采用球形微載體作為細胞培養(yǎng)載體，易于快速擴大生產規(guī)模，能克服片狀載體難于放大的特征。
具體實施例方式實施例I :一種生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXAl株)的方法，步驟如下(I)用微載體培養(yǎng)制苗用細胞選擇7. 5L NBS生物反應器，其工作體積為5L ;選擇CytodexI球形微載體作為細胞貼附生長的載體，使用量為4g/L培養(yǎng)基，稱量CytodexI球形微載體，并對其進行清洗、滅菌，方法為1)用適量PBS浸泡3小時；2)用適量PBS清洗微載體3遍；3)加入適量PBS浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌30分鐘；選擇Marc-145細胞作為制苗用細胞；將Marc-145細胞經胰酶消化液消化傳代，用配方為含10%胎牛血清的90%DMEM培養(yǎng)基、PH調整為7. 2的細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，形成良好單層時，取轉瓶上生長良好的Marc-145細胞，經胰酶消化液消化制備為細胞懸液，細胞計數后按每個微載體添加10個細胞的比例接種到含有細胞生長液與微載體的生物反應器中；生物反應器設定如下參數溫度37°C、pH值7. O、溶氧含量50%、攪拌速度45rpm、C02通氣量5%，進行反應器自動控制培養(yǎng)；(2)制苗用毒液的繁殖與收獲培養(yǎng)后48小時待觀察到微載體上細胞基本長滿形成致密單層時，去掉細胞生長液，加入1/4 I工作體積的配方為含2%胎牛血清的98%DMEM培養(yǎng)基、PH調整為7. 2的細胞維持液；將豬繁殖與呼吸綜合征病毒NVDC-JXAl株種毒按照感染復數M.O. I.為0.01的比例接種生長良好的上述細胞單層，37°C孵育4小時，然后向生物反應器中補足生物反應器正常工作所需要的培養(yǎng)基，并設定如下參數溫度37°C、pH值
7.O、溶氧50%、攪拌速度35rpm、C02通氣量5%，進行反應器自動控制培養(yǎng)；接毒后每隔2小時取反應器中微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況，待觀察微載體上細胞基本全部脫落、細胞病變達到80%以上時，停止反應器的攪拌，待微載體全部沉到反應器底部后，分別收獲上清液和微載體；反復凍融2次，經離心或過濾除去細胞碎片，-20°C以下保存作為半成品；按《中國獸藥典》附錄對半成品進行無菌檢驗及病毒含量測定；結果共收獲病毒液101^無菌檢驗合格，病毒含量達107_ 5TCID5tZml。
權利要求
1.一種生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXAl株)的方法及其應用，其特征在于，包括如下步驟 (1)用微載體培養(yǎng)制苗用細胞選擇生物反應器；選擇球形微載體作為細胞貼附生長的載體；選擇Marc-145細胞作為制苗用細胞；將Marc-145細胞經胰酶消化液消化傳代，用配方為含7% 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、pH調整為7. 2的細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，形成良好單層時，取轉瓶上生長良好的Marc-145細胞，經胰酶消化液消化制備為細胞懸液，細胞計數后按每個微載體添加5 20個細胞的比例接種到含有細胞生長液與微載體的生物反應器中；生物反應器設定如下參數溫度37°C、pH值6. 8 7. 4、溶氧含量40% 60%、攪拌速度30 55rpm、C02通氣量5 10%，進行反應器自動控制培養(yǎng)； (2)制苗用毒液的繁殖與收獲培養(yǎng)后48 72小時待觀察到微載體上細胞基本長滿形成致密單層時，去掉細胞生長液，加入1/4 I工作體積的配方為含2% 5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、pH調整為7. 2的細胞維持液；將豬繁殖與呼吸綜合征病毒NVDC-JXAl株種毒按照感染復數M. 0. I.為0. 0001 I. 0的比例接種生長良好的上述細胞單層，37°C孵育I 10小時，然后向生物反應器中補足生物反應器正常工作所需要的培養(yǎng)基，并設定如下參數溫度37°C、pH值6. 5 7. 2、溶氧40% 60%、攪拌速度30 45rpm、C02通氣量5 10%，進行反應器自動控制培養(yǎng)；接毒后每隔2小時取反應器中微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況，待觀察微載體上細胞基本全部脫落、細胞病變達到80%以上時，停止反應器的攪拌，待微載體全部沉到反應器底部后，分別收獲上清液和微載體；反復凍融2次，經離心或過濾除去細胞碎片，_20°C以下保存作為半成品；按《中國獸藥典》附錄對半成品進行無菌檢驗及病毒含量測定，病毒含量應不低于106_°TCID5(l/ml ； (3)疫苗配制將檢驗合格的病毒液按終濃度為0.1%比例加入甲醛溶液，混勻，置37°C滅活18小時取出，置2 8°C保存；滅活檢驗合格后，取滅活病毒液96份，加入高壓滅菌冷卻后的吐溫-80 4份，充分攪拌，直至吐溫-80完全溶解，制得水相；取注射用白油94份、司本-80 6份混合后加熱，再加入硬脂酸鋁2份，隨加隨攪拌到透明為止，高壓滅菌，制得油相；取油相I. 5份置乳化灌中攪拌，再緩慢加入水相I份，加完后再以3000r/min攪拌30 60分鐘，使混合物充分乳化，制成豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXAl株)； (4)成品檢驗按農業(yè)部審批通過的《豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXAl株)制造及檢驗試行規(guī)程》要求進行檢驗，各項指標均符合規(guī)定。
2.如權利要求I所述的用生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXAl株)的方法及其應用，其特征在于，步驟(I)中，生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧和攪拌速度等參數，適用于微載體培養(yǎng)的生物反應器，容積為I. 3L 1500L。
3.如權利要求I所述的用生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXAl株)的方法及其應用，其特征在于，步驟(I)中，微載體為球形微載體，添加量為2 10g/L，在使用前需清洗、滅菌，方法如下1)用PBS浸泡微載體三小時以上；2)用PBS清洗微載體3遍；3)用PBS浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXA1株)的方法及其應用，包括如下步驟(1)用微載體培養(yǎng)制苗用細胞；選擇生物反應器；(2)制苗用毒液的繁殖與收獲；(3)疫苗配制；(4)成品檢驗。該方法生產的疫苗，污染機率低，病毒滴度高(其毒價可提高2～5倍)，批間差異小，產品質量穩(wěn)定，副反應小，能全面提升疫苗質量。
文檔編號A61P31/14GK102727878SQ201210231129
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月4日 優(yōu)先權日2012年7月4日
發(fā)明者周智, 徐家華, 曲萍, 林綺萍, 田克恭, 練炳洲, 翟新驗, 遇秀玲, 鄧小熊, 陳瑞愛 申請人:中國動物疫病預防控制中心, 廣東大華農動物保健品股份有限公司