專利名稱：一種脫細(xì)胞心包材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于心包材料的制備領(lǐng)域，特別涉及一種脫細(xì)胞心包材料的制備方法。
背景技術(shù)：
組織工程研究是制造人體器官和組織的科學(xué)，由于其廣闊的應(yīng)用前景和逐年以幾何級數(shù)遞增的產(chǎn)業(yè)效益，各國政府和產(chǎn)業(yè)界都投入 巨資進行研究和產(chǎn)業(yè)建設(shè)。世界毎年的研究經(jīng)費都在幾十億美元以上。組織工程研究包括兩個主要方面一方面是用來構(gòu)建成器官和組織形態(tài)的支架；另一方面是種植在支架上可以生長并發(fā)揮生 理作用的細(xì)胞。而對于組織工程支架，它必須具備兩個特點(I)對細(xì)胞具有良好的親和性；(2)對人體無毒害、無免疫反應(yīng)，可在人體內(nèi)降解。細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)是各種組織器官的主要組成成分,構(gòu)成了各種組織器官的三維空間結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)物質(zhì)的儲存，其三維結(jié)構(gòu)與體內(nèi)細(xì)胞生長的天然環(huán)境接近，不僅可以起著支架材料的作用，而且包含的多種生長因子在組織修復(fù)和重建中有重要促進作用，即使經(jīng)過脫細(xì)胞處理仍有活性，是細(xì)胞生長的理想環(huán)境，這是其他人エ聚合物(如膠原、殼聚糖、聚乳酸和聚羥基こ酸等)所不能比擬的。心包是包裹心和出入心大血管根部的纖維漿囊膜，可分為纖維層、漿膜層和外結(jié)締組織層，主要由細(xì)胞和ECM組成，其中的細(xì)胞成分作為抗原被宿主識別后會引發(fā)炎癥或免疫排斥反應(yīng)，需要通過脫細(xì)胞處理來去除抗原物質(zhì)，ECM由I、111型纖維膠原蛋白構(gòu)成，含有少量的弾性纖維、氨基聚糖和糖蛋白等，其組分在不同物種間通常是受保護的而且耐受性良好，是ー種理想的組織工程生物支架材料。目前脫細(xì)胞處理方法主要包括物理法、化學(xué)法和酶處理法。物理的處理方法有很多，主要是通過物理的作用如凍融、液體高壓、超聲波和電擊等脫除細(xì)胞，但物理方法對ECM的破壞作用較大?；瘜W(xué)方法就是使用ー些特定的化學(xué)試劑如酸、堿和去污劑等破碎細(xì)胞達到去除細(xì)胞的目的，但化學(xué)試劑的殘留會對機體產(chǎn)生毒害作用。酶處理方法主要是指用酶試劑來裂解細(xì)胞，例如脫細(xì)胞方法中通常會用到胰蛋白酶，但胰蛋白酶對ECM有降解的作用。且這些脫細(xì)胞方法過程繁瑣，處理時間長，不利于批量生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種脫細(xì)胞心包材料的制備方法，該方法筒單，成本低，徹底脫除存在于組織表面和內(nèi)部的細(xì)胞及細(xì)胞碎片，制備出具有較好的力學(xué)性能和生物學(xué)特性的生物支架材料。本發(fā)明的一種脫細(xì)胞心包材料的制備方法，包括(I)前置處理取健康成年動物的心臟，割取心包膜，熱缺血時間小于I小時；然后在0-37°C下用無菌的生理鹽水或pH值為6. 8-8. 6的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗所得心包膜，以去除血凝塊后，在無菌條件下剝離外周脂肪，取無損傷、厚度均勻的前壁部分修剪為片狀，用無菌的生理鹽水或PH值為6. 8-8. 6的磷酸鹽緩沖液充分漂洗，得到處理后的包心組織；
(2)脫細(xì)胞處理及清洗將上述處理后的包心組織加入到含有烷基糖苷APG的溶液中，然后通過低滲處理或高滲處理，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和抽提細(xì)胞膜的脂質(zhì)和膜蛋白；再經(jīng)過核酶處理，以降解細(xì)胞中各類DNA和/或RNA成分，最后清洗即可。步驟(I)中所述的成年動物為豬或牛。步驟(I)所述的片狀的尺寸為6cmX8cm。步驟(I)得到的處理后的包心組織于4°C下保存在含雙抗溶液的無菌的生理鹽水中。上述的雙抗溶液為100倍工作濃度的青霉素和硫酸鏈霉素溶液(配制的雙抗溶液為100倍的濃縮液，實際工作濃度為稀釋100倍后的濃度，青霉素的工作濃度范圍為50-5000U/ml，硫酸鏈霉素的工作濃度范圍為1-lOOmg/ml)。 步驟(2)中所述的含有烷基糖苷APG的溶液中APG的體積濃度小于50%。上述的烷基糖苷(也稱為烷基葡萄糖苷、烷基多糖甘)通常為50%含量的水溶液，有0810、0814、1214、0816、1216、1618等型號，可以是烷基糖苷系列中的任ー種或ー種以上。步驟(2)中所述的低滲處理為采用濃度為O. OlM且pH值為6. 8_8. 6的無菌的Tris-HCI緩沖液，在1°C _25°C中振蕩處理1_96小時，振蕩速率為80_360rpm。步驟(2)中所述的高滲處理為采用濃度為0.05M且pH值為6. 8-8. 6的無菌的Tris-HCI緩沖液，在1°C _25°C中振蕩處理1_96小時，振蕩速率為80_360rpm。步驟(2)中所述的核酶處理為在37°C下，在含有l(wèi)OO-lOOOOu/ml的脫氧核糖核酸酶(DNase)、100-10000u/ml 核糖核酸酶(RNase)、0. 15M NaCl、l_5mM MgCl2 的無菌的 0. 05MTris-HCl緩沖液(pH 6. 8-8. 6)中，于60_360rpm轉(zhuǎn)速下振蕩處理6_72小時；其中所述的雙抗為青霉素和硫酸鏈霉素。步驟(2)中所述的清洗是指用無菌的生理鹽水或pH值為6. 8-8. 6的磷酸鹽緩沖液在1°C -25°C條件下對所得脫細(xì)胞基質(zhì)進行清洗，清洗時間為6-48小吋。上述的無菌的生理鹽水或pH值為6. 8-8. 6的磷酸鹽緩沖液中含有抗生素。經(jīng)過ー下多項實驗證實，本發(fā)明得到的脫細(xì)胞心包材料效果好，達到了發(fā)明的目的I.殘留細(xì)胞脫細(xì)胞豬心包經(jīng)常規(guī)蘇木素一伊紅染色，證實無細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在。(圖2)2.基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)脫細(xì)胞豬心包經(jīng)Weigert染色，可觀察到經(jīng)本發(fā)明的脫細(xì)胞方法處理后，豬心包組織中的膠原纖維排列整齊，無明顯斷裂，仍呈波浪狀平行排列，結(jié)構(gòu)緊湊，弾性纖維結(jié)構(gòu)清晰。(圖4)3.脫細(xì)胞基質(zhì)DNA含量的測定經(jīng)DNA檢測試劑盒測得未脫細(xì)胞的豬心包DNA含量是607. 34±47. 26ng/mg干重組織，經(jīng)過本發(fā)明的脫細(xì)胞處理后的DNA含量為
8.24±1. 31ng/mg干重組織，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著差異，證實本發(fā)明的脫細(xì)胞方法能顯著降低組織核酸含量，進ー步說明該方法能完全去除細(xì)胞。4.脫細(xì)胞基質(zhì)含水量的測定新鮮豬心包組織的含水量是77. 75±0. 57%，經(jīng)脫細(xì)胞處理后的豬心包組織的含水量是83. 98±1.64%，統(tǒng)計學(xué)處理無顯著差異。5.膠原蛋白含量測定由測得羥脯氨酸換算得未脫細(xì)胞的豬心包組織的膠原蛋白含量是48. 34±1. 01%，經(jīng)脫細(xì)胞處理的豬心包組織的膠原蛋白含量是47. 6±0. 67%，統(tǒng)計學(xué)處理無顯著差異。6.弾性蛋白含量測定由豬a_弾性蛋白試劑盒測定的未脫細(xì)胞的豬心包組織的彈性蛋白含量是O. 233±0. 0128 μ g/g,經(jīng)脫細(xì)胞處理的豬心包組織的彈性蛋白含量是
O.129±0. 0132 μ g/g,統(tǒng)計學(xué)處理無顯著差異。7.力學(xué)性能檢測(1)拉伸強度的測定在萬能材料試驗機上測得基質(zhì)材料的拉伸強度，新鮮豬心包的最大拉伸強度為19. 92±1. 94MPa，經(jīng)脫細(xì)胞處理的豬心包的最 大拉伸強度為15.9±0.81MPa，統(tǒng)計學(xué)處理無顯著差異。(2)斷裂伸長率的測定在萬能材料試驗機上測得基質(zhì)材料的斷裂伸長率，新鮮豬心包的斷裂伸長率為65. 54±3. 96%，經(jīng)脫細(xì)胞處理的豬心包的斷裂伸長率為76. 48±1. 23%，統(tǒng)計學(xué)處理有顯著差異。(3)彈性模量的測定在萬能材料試驗機上測得基質(zhì)材料的彈性模量，新鮮豬心包的弾性模量為77. 17±4. 77MPa，經(jīng)脫細(xì)胞處理的豬心包的彈性模量為73. 56±3. 8MPa，統(tǒng)計學(xué)處理無顯著差異。由此證實本發(fā)明的脫細(xì)胞方法對基質(zhì)的力學(xué)性能影響較小，能夠保持支架材料的機械性能。8.體外細(xì)胞毒性檢測根據(jù)浸提液和MTT的方法測得未脫細(xì)胞的豬心包組織的相對增值率是97. 23±4. 5%，細(xì)胞毒性級別為I級，經(jīng)培養(yǎng)后加入染料在倒置顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞生長狀況，如圖5所示，細(xì)胞生長良好，無細(xì)胞毒性；經(jīng)脫細(xì)胞處理的豬心包組織的相對增值率是97. 03±3. 45%，細(xì)胞毒性級別為I級，統(tǒng)計學(xué)處理無顯著差異，經(jīng)培養(yǎng)后加入染料在倒置顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞生長狀況，如圖6所示，細(xì)胞生長良好，無細(xì)胞毒性。由此可證實經(jīng)本發(fā)明的脫細(xì)胞方法對支架材料無明顯毒性。本發(fā)明選用烷基糖苷對所用組織器官進行脫細(xì)胞處理，其優(yōu)點在于，烷基糖苷是由可再生資源天然脂肪醇和葡萄糖合成的，是ー種性能較全面的新型非離子表面活性剤，且易于生物降解不會造成對環(huán)境的污染，具有無毒易降解的特點，對人體無害。性能溫和，對細(xì)胞外基質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)和功能蛋白幾乎沒有損傷。為進一歩增強烷基糖苷脫細(xì)胞效果，可以聯(lián)合物理方法共同處理待用的組織器官。本發(fā)明中主要采用物理法中的低滲和高滲溶液浸泡，振蕩和調(diào)節(jié)溫度的方式，增加烷基糖苷的脫細(xì)胞效果。本發(fā)明首先對異種生物組織進行前置處理，然后通過含有烷基糖苷的低滲和高滲的進行脫細(xì)胞，再以核酸酶降解細(xì)胞中的核酸，最后用等滲溶液清洗。本發(fā)明使用的燒基糖苷(alkyl polyglucoside,APG)是ー種新型無毒無刺激可生物降解且降解產(chǎn)物無毒的試劑，脫細(xì)胞方法簡單，成本低，克服傳統(tǒng)上化學(xué)毒性試劑殘留等問題，在生物支架材料的制備中有重要的應(yīng)用意義。有益效果( I)本發(fā)明的制備方法簡單，原料來源廣泛，成本低，便于批量生產(chǎn)，所用的表面活性劑烷基糖苷無毒無害，且能徹底脫除存在于組織表面和內(nèi)部的細(xì)胞及細(xì)胞碎片；(2)本發(fā)明得到的脫細(xì)胞基質(zhì)的免疫原性大幅降低且細(xì)胞毒性低，生物相容性好，具有較好的力學(xué)性能和生物學(xué)特性，是ー種良好的組織工程支架材料。


圖I為含有細(xì)胞的新鮮豬心包組織的顯微鏡照片(HEx200)；圖2為經(jīng)脫細(xì)胞處理后的豬心包組織的顯微鏡照片(HEx200)；
圖3為新鮮豬心包組織的顯微鏡照片(Weigert x400)；圖4為經(jīng)脫細(xì)胞處理后的豬心包組織的顯微鏡照片(Weigert x400)；圖5為新鮮豬心包組織的細(xì)胞毒性實驗倒置顯微鏡照片(200x)；圖6為經(jīng)脫細(xì)胞處理后的豬心包組織的細(xì)胞毒性實驗倒置顯微鏡照片(200x)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。 實施例I一種制備細(xì)胞外基質(zhì)支架材料的脫細(xì)胞方法(I)前置處理豬心包取自當(dāng)?shù)赝涝讖S，健康成年豬宰殺后取出心臟，割取心包膜，熱缺血時間小于I小吋。磷酸緩沖液(PBS) (pH值為7. 3)反復(fù)沖洗去除血凝塊后置于保存液中，帶回實驗室，無菌條件下剔除外周脂肪，取無損傷、厚度均勻的前壁部分修剪為6cmX8cm的片狀，PBS溶液(pH值為7. 3)充分漂洗，4°C保存含抗生素的無菌的PBS溶液中。(2)豬心包的脫細(xì)胞處理將4片6cmX8cm的心包分別放入4瓶1%烷基糖苷(APG0810)的含雙抗的O. OlM Tris-HCl緩沖溶液中進行振蕩消化24h，4°C，150rpm/min。之后在無菌的PBS (pH7. 30)進行清洗，清洗完后依次將心包放在核酸消化溶液中37°C振蕩消化24h。核酸消化溶液為2. OKU/ml DNase I、7· OKU/ml RNase、0. 15M NaCl、5mMMgCl2 ·6Η20和1%雙抗的無菌的O. 05Μ Tris-HCl緩沖液(ρΗ7. 60)。(3)清洗在無菌的含雙抗的PBS緩沖液(ρΗ7· 30)進行振蕩清洗24h，轉(zhuǎn)速為150rpm，清洗完后依次將心包在4°C保存含雙抗的無菌的PBS溶液中。實施例2按上述前處理豬心包組織后，將4片6cmX8cm的心包分別放入4瓶2%烷基糖苷(APG0810)的含雙抗的O. OlM Tris-HCl緩沖溶液中進行振蕩消化16h，4°C，150rpm/min。之后在無菌的PBS (pH7. 30)進行清洗，清洗完后依次將心包放在核酸消化溶液中37°C振蕩消化 24h。核酸消化溶液為2. OKU/ml DNase I、7· OKU/ml RNase、O. 15M NaCl、5mMMgCl2 ·6Η20和1%雙抗的無菌的O. 05Μ Tris-HCl緩沖液(ρΗ7. 60)。在無菌的含雙抗的PBS緩沖液(ρΗ7. 30)進行振蕩清洗24h，轉(zhuǎn)速為150rpm，清洗完后依次將心包在4°C保存含雙抗的無菌的PBS溶液中。實施例3按實施例I方法制取豬心包組織后，將4片6cmX8cm的心包分別放入4瓶1%(ν/ν)烷基糖苷(APG1214)的含雙抗的O. OlM Tris-HCl緩沖溶液中進行振蕩消化24h，4°C，150rpm/min,之后在無菌的PBS(pH7. 30)進行清洗，清洗完后依次將心包放在核酸消化溶液中 37°C振蕩消化 24h。核酸消化溶液為2. 5KU/ml DNase I、7· 5KU/ml RNase、0. 15MNaCl、2mM MgCl2 · 6H20和1%雙抗的無菌的0. 02M Tris-HCl緩沖液(pH7. 60)。在無菌的含雙抗的PBS緩沖液(ρΗ7· 30)進行振蕩清洗24h，轉(zhuǎn)速為150rpm，清洗完后依次將心包在4°C保存含雙抗的無菌的PBS溶液中。 ·
權(quán)利要求
1.一種脫細(xì)胞心包材料的制備方法，包括 (1)取健康成年動物的心臟，割取心包膜，熱缺血時間小于I小時；然后在0-37°C下用無菌的生理鹽水或PH值為6. 8-8. 6的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗所得心包膜，在無菌條件下剝離外周脂肪，取無損傷、厚度均勻的前壁部分修剪為片狀，用無菌的生理鹽水或PH值為6.8-8. 6的磷酸鹽緩沖液充分漂洗，得到處理后的包心組織； (2)將上述處理后的心包組織加入到含有烷基糖苷APG的溶液中，然后通過低滲處理或高滲處理，再經(jīng)過核酶處理，最后清洗即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種脫細(xì)胞心包材料的制備方法，其特征在于步驟(I)中所述的成年動物為豬或牛。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種脫細(xì)胞心包材料的制備方法，其特征在于步驟(I)所述的片狀的尺寸為6cmX8cm。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種脫細(xì)胞心包材料的制備方法，其特征在于步驟(I)得到的處理后的包心組織于4°C下保存在含雙抗溶液的無菌的生理鹽水中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的ー種脫細(xì)胞心包材料的制備方法，其特征在于所述的雙抗溶液為100倍工作濃度的青霉素和硫酸鏈霉素溶液,其中青霉素的工作濃度范圍為50-5000U/ml，硫酸鏈霉素的工作濃度范圍為l-100mg/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種脫細(xì)胞心包材料的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的含有烷基糖苷APG的溶液中APG的體積濃度小于50% ;所述的烷基糖苷為0810、0814、1214、0816、1216、1618 中的ー種或幾種。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種脫細(xì)胞心包材料的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的低滲處理為采用濃度為O. OlM且pH值為6. 8-8. 6的無菌的Tris-HCI緩沖液，在TC _25°C中振蕩處理1-96小時，振蕩速率為80-360rpm;所述的高滲處理為采用濃度為O.05M且pH值為6. 8-8. 6的無菌的Tris-HCI緩沖液，在1°C _25°C中振蕩處理1_96小時，振蕩速率為80-360rpm。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種脫細(xì)胞心包材料的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的核酶處理為在37°C下，在含有100-10000u/ml的脫氧核糖核酸酶、100-10000u/ml核糖核酸酶、O. 15M NaCl、l-5mM MgCl2 的無菌的 pH 值 6. 8-8. 6 為 O. 05M Tris-HCl 緩沖液中，于60-360rpm轉(zhuǎn)速下振蕩處理6_72小時；其中所述的雙抗為青霉素和硫酸鏈霉素。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種脫細(xì)胞心包材料的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的清洗是指用無菌的生理鹽水或PH值為6. 8-8. 6的磷酸鹽緩沖液在1°C _25°C條件下進行清洗，清洗時間為6-48小吋。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的ー種脫細(xì)胞心包材料的制備方法，其特征在于所述的無菌的生理鹽水或pH值為6. 8-8. 6的磷酸鹽緩沖液中含有抗生素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種脫細(xì)胞心包材料的制備方法，包括(1)取健康成年動物的心臟，割取心包膜，然后反復(fù)沖洗所得心包膜，在無菌條件下剝離外周脂肪，取無損傷、厚度均勻的前壁部分修剪為片狀，充分漂洗后得到處理后的包心組織；(2)將上述處理后的心包組織加入到含有烷基糖苷APG的溶液中，然后通過低滲處理或高滲處理，再經(jīng)過核酶處理，最后清洗即可。本發(fā)明的制備方法簡單，原料來源廣泛，成本低，便于批量生產(chǎn)，所用的表面活性劑烷基糖苷無毒無害，且能徹底脫除存在于組織表面和內(nèi)部的細(xì)胞及細(xì)胞碎片；本發(fā)明得到的脫細(xì)胞基質(zhì)的免疫原性大幅降低且細(xì)胞毒性低，生物相容性好，具有較好的力學(xué)性能和生物學(xué)特性，是一種良好的組織工程支架材料。
文檔編號A61L27/36GK102671242SQ201210165409
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月24日
發(fā)明者李 雨, 莫秀梅, 董教明 申請人:東華大學(xué)