專利名稱：使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體的輔助療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖在癌癥治療之后的輔助療法。
背景技術(shù)：
據(jù)報告，磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)家族是存在于細(xì)胞表面上的硫酸こ酰肝素蛋白多糖的新家族。迄今已報告有五種磷脂酰肌醇蛋白聚糖(磷脂酰肌醇蛋白聚糖1，磷脂酰肌醇蛋白聚糖2，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖4，和磷脂酰肌醇蛋 白聚糖5)是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成員。該家族的成員有大小均一(約60kDa)的核心蛋白，共有特異、高度保守的半胱氨酸序列，并通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定結(jié)合到細(xì)胞膜上。通過對中樞神經(jīng)發(fā)育中細(xì)胞分裂形態(tài)異常的黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)突變體進(jìn)行基因篩選，識別出 Dally (division abnormally delayed,分裂異常延遲)基因。已經(jīng)顯示出Daily的cDNA展示了開放閱讀框(0RF)，所述閱讀框所編碼的產(chǎn)物顯示出與脊椎動物膜整合蛋白聚糖(GRIPs)有序列同源性(24-26%同源)，所述GRIPs具有磷脂酰肌醇蛋白聚糖的全部特點。其后，這就提示了 dally在調(diào)節(jié)dpp(decapentaplegia)受體的機(jī)制中發(fā)揮作用，由此，提示了哺乳動物的磷脂酰肌醇蛋白聚糖有可能調(diào)節(jié)TGF和BMP的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。即，這提示了磷脂酰肌醇蛋白聚糖可以作為ー些肝素結(jié)合生長因子(如，EGF、PDGF, BMP2、FGFs等)的輔受體行使功能。磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3作為發(fā)育調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從大鼠小腸中被分離(Filmus, J.，Church, J. G.，和 Buick, R. N. (1988)Mol. Cell. Biol. 8，4243-4249)，并在之后被識別為0CI-5，磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的GPI-結(jié)合型硫酸こ酰肝素蛋白多糖，具有分子量 69kDa 的核心蛋白(Filmus, J. , Shi, ff. , Wong, Z. -M.,和 Wong, M. J. (1995) Biochem.J. 311，561-565)。在人類中，編碼磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基因也從人胃癌細(xì)胞株中被分離，稱為MRX-7 (Hermann Lage等，Gene 188(1997) 151-156)。已經(jīng)報告磷脂酰肌醇蛋白聚糖3與胰島素樣生長因子_2構(gòu)成蛋白-蛋白復(fù)合體，并調(diào)節(jié)該生長因子的功能(Pilia，G.等，(1996)Nat. Genet. 12,241-247)。該報告提示,磷脂酰肌醇蛋白聚糖3未必通過硫酸こ酰肝素鏈與生長因子相互作用。利用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作為肝細(xì)胞癌標(biāo)記物的可能性也已有報告(Hey-ChiHsu等，Cancer Research 57，5179-5184 (1997)),另外還有報告認(rèn)為抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體對肝癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，作為抗癌劑是有用的(國際公開WO 03/00883)。但是，對于應(yīng)用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體作為肝癌治療后的輔助療法尚沒有 艮告。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)反復(fù)專心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體對癌癥治療之后的輔助療法有用，遂完成了本發(fā)明。另外，因為在癌癥治療后觀察不到癌細(xì)胞的階段，給藥抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體能防止癌癥復(fù)發(fā)，因此抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體作為預(yù)防癌癥的藥物或作為預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)的藥物是有用的。


圖I是表示對肝內(nèi)移植小鼠模型給藥本發(fā)明的抗癌劑后的效果圖。圖2是表示早期對肝內(nèi)移植小鼠模型給藥本發(fā)明的抗癌劑后的效果圖。
具體實施方式

本發(fā)明提供了ー種含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑，其特征為在癌癥治療后給藥。癌癥治療后優(yōu)選是指在肝癌治療后，其中肝癌的治療特別是指肝癌細(xì)胞切除木。本發(fā)明的抗癌劑優(yōu)選應(yīng)用于在切除的肝癌細(xì)胞表達(dá)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的情況下。并且，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體優(yōu)選是單克隆抗體。本發(fā)明的抗癌劑在輔助療法中尤為有用。即使在癌癥治療、手術(shù)中認(rèn)為癌細(xì)胞已被摘除或死亡的情況下，仍可能殘留觀察不到的癌細(xì)胞。當(dāng)上述癌細(xì)胞仍殘留時，一定時間后，癌癥就可能復(fù)發(fā)，因此癌癥治療后必須進(jìn)行繼續(xù)治療以預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)。該治療稱作輔助治法或術(shù)后輔助治法。在本發(fā)明范圍內(nèi)，癌癥治療指以抑制癌細(xì)胞増殖或殺滅癌細(xì)胞或減少癌細(xì)胞為目的的任何一種治療，如癌切除術(shù)、用抗癌劑化療、放療、經(jīng)皮こ醇注射療法、經(jīng)皮射頻熱凝療法或經(jīng)導(dǎo)管動脈栓塞療法。本發(fā)明中優(yōu)選的癌癥治療是癌切除木?！鞍┌Y治療后”是指在已經(jīng)進(jìn)行上述治療后。需要說明的是，“癌癥治療后”在本發(fā)明中未必意味著癌癥已經(jīng)治愈。本發(fā)明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體可以在確認(rèn)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3是否表達(dá)后，給藥至癌癥治療后的患者?？梢杂萌魏畏椒ù_認(rèn)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3是否表達(dá)，例如，可以用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體等確認(rèn)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白的表達(dá)，也可用PCR等方法確認(rèn)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3基因的表達(dá)。癌癥治療后可以在任何時間給藥抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體，并且給藥可以在癌癥治療后立即進(jìn)行或間隔ー些時間后進(jìn)行。本發(fā)明中優(yōu)選的給藥時間是從癌癥治療后直至癌癥復(fù)發(fā)的期間。在術(shù)后輔助療法中，通常在治療后12周內(nèi)或6周內(nèi)開始給藥?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法判斷癌癥是否復(fù)發(fā)，例如，通過視覺所見或病理所見來確認(rèn)腫瘤是否發(fā)生進(jìn)行判斷。腫瘤可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法確認(rèn)，如成像法和以AFP等腫瘤標(biāo)記物作為指標(biāo)的方法。使用本發(fā)明的抗癌劑可以治療癌癥，可列舉如肝癌，肺癌，結(jié)腸癌，乳腺癌，前列腺癌，白血病，淋巴瘤，胰腺癌和膽管癌等，任何癌癥都可以。本發(fā)明的抗癌劑特別適合用于治療的癌癥是肝癌細(xì)胞。肝癌可以是原發(fā)或繼發(fā)性的，可舉例是肝細(xì)胞癌，肝內(nèi)膽管癌，膽管囊腺癌，混合型肝癌，肝母細(xì)胞瘤，未分化癌，血管肉瘤，肝平滑肌肉瘤和未分化肉瘤。應(yīng)用本發(fā)明抗癌劑的輔助療法的實施方式特別優(yōu)選是，在切除肝癌細(xì)胞后通過給藥抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體，防止肝癌復(fù)發(fā)。至于本發(fā)明所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的來源、類型(單克隆或多克隆)和形態(tài)，沒有要求。本發(fā)明所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體可以通過已知方法形成多克隆或單克隆抗體獲得。本發(fā)明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體特別優(yōu)選源自哺乳動物的單克隆抗體。源自哺乳動物的單克隆抗體包括經(jīng)雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，和用含有抗體基因的表達(dá)載體經(jīng)遺傳工程技術(shù)遺傳轉(zhuǎn)化后宿主所產(chǎn)生的抗體。產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞使用已知技術(shù)，可以如下述進(jìn)行制備。S卩，經(jīng)如下步驟制備以磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作為致敏抗原，將其依照通常的免疫方法進(jìn)行免疫化，利用通常的細(xì)胞融合技術(shù)使形成的免疫細(xì)胞與公知的伴侶細(xì)胞融合，然后通過通常的篩選方法篩選出單克隆的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。 具體而言，單克隆抗體如下述制備即可。首先，用作生產(chǎn)抗體致敏抗原的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3,可以通過誘導(dǎo)由Lage H.等，Genel88 (1997)，151-156公開的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(MXR7)基因/氨基酸序列的表達(dá)獲得。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基因序列和氨基酸序列分別顯示于序列編號I和2。即，編碼磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基因序列插入公知的表達(dá)載體系統(tǒng)，遺傳轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞后，將來自宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基上清液中的目標(biāo)人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白通過公知方法進(jìn)行純化。接著，將該純化后的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白用作敏化抗原?；蛘?，也可以用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的肽片段作為敏化抗原。這時，所述肽片段可以由人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸序列經(jīng)化學(xué)合成而獲得。抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體依靠細(xì)胞毒性如ADCC或CDC等體現(xiàn)抗癌活性，還在抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體與細(xì)胞毒性物質(zhì)如放射性同位素、化療藥或菌源毒素等結(jié)合時體顯示抗癌活性?？沽字＜〈嫉鞍拙厶?抗體識別的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上的表位不限于特定表位，只要抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體可以識別的存在于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上的任何表位都可。因此，為了制備本發(fā)明抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的抗原，任何存在于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上的含有表位的肽片段，都可以用作制備本發(fā)明抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的抗原。要用致敏抗原免疫的哺乳動物沒有具體限制，并優(yōu)選基于同在細(xì)胞融合中使用的伴侶細(xì)胞的兼容性的考慮來選擇。通常使用嚙齒類動物如小鼠、大鼠和倉鼠，或兔、猴等。可根據(jù)已知技術(shù)用致敏抗原對動物進(jìn)行免疫。例如，免疫可以通過一般方如向哺乳動物腹腔內(nèi)或皮下注射致敏抗原。具體而言，將致敏抗原用適量的PBS(磷酸鹽緩沖液)、生理鹽水等稀釋或懸浮，根據(jù)需要向其中混合通常的佐劑如弗氏完全佐劑，乳化后，每4-21天多次對哺乳動物進(jìn)行給藥。另外，以致敏抗原免疫期間，也能用適當(dāng)?shù)妮d體。哺乳動物的骨髓瘤細(xì)胞用作與前述免疫細(xì)胞融合的伴侶細(xì)胞。各種已知的細(xì)胞株適合用作該骨髓瘤細(xì)胞，例如 P3(P3x63Ag8. 653) (J. Immunol. (1979) 123，1548-1550)，P3x63Ag8U. I(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81, 1-7), NS-I(Kohler, G. and Milstein, C. Eur. J. Tmmunol · (1976)6，511-519), MPC-II(Margulies,D.H.等，Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M.等，Nature (1978) 276，269-270)，F(xiàn)O (deSt. Groth, S. F.等，J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp.Med. (1978) 148, 313-323),和 R210 (Galfre, G.等，Nature (1979) 277，131-133)等?！で笆雒庖呒?xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞之間的細(xì)胞融合基本上可根據(jù)已知的方法進(jìn)行，例如，Kohler 和 Milstein 等的方法(Kohler, G.和 Milstein, C. , Methods Enzymo I.(1981)73，3-46)。更具體而言，所述細(xì)胞融合在例如細(xì)胞融合促進(jìn)劑存在的條件下在通常的營養(yǎng)培養(yǎng)基中實施。例如，聚こニ醇(PEG)，仙臺病毒(HVJ)等可以用作細(xì)胞融合促進(jìn)劑，根據(jù)需要，還可加入助劑如ニ甲基亞砜等，以便提高融合效率。免疫細(xì)胞和骨髄瘤細(xì)胞使用比例可任意設(shè)定。舉例，優(yōu)選免疫細(xì)胞的數(shù)量是雜交瘤細(xì)胞的1-10倍。用于上述細(xì)胞融合的培養(yǎng)基可以是，例如，特別適于上述雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞株增殖的RPMI1640培養(yǎng)基或MEM培養(yǎng)基，或者其它用于培養(yǎng)該類型細(xì)胞的通常的培養(yǎng)基，此外，血清添加物如胎牛血清(FCS)等可以與之組合使用。 細(xì)胞融合通過在上述培養(yǎng)基中，充分混合規(guī)定量的上述免疫細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞，加入濃度通常為30-60% (w/v)、預(yù)加熱至大約37° C的PEG溶液(如，平均分子量約1000-約6000)，然后混合形成目標(biāo)融合細(xì)胞(雜交瘤細(xì)胞)。接著通過反復(fù)進(jìn)行每次加入合適的培養(yǎng)基然后離心除去上清的程序，清除不利于雜交瘤細(xì)胞増殖的細(xì)胞融合劑等。這樣得到的雜交瘤細(xì)胞，可以通過通常的選擇培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基(含有次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)選擇。為使除了目標(biāo)雜交瘤細(xì)胞以外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)死亡，就要使在所述HAT培養(yǎng)基上進(jìn)行的培養(yǎng)持續(xù)足夠的時間(通常為數(shù)天至數(shù)周)。然后進(jìn)行通常的限制稀釋法，之后篩選以及單克隆產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交瘤細(xì)胞。除了通過用抗原免疫非人類動物得到上述雜交瘤細(xì)胞之外，也可以通過人淋巴細(xì)胞在體外對磷脂酰肌醇蛋白聚糖3敏化，并把敏化的淋巴細(xì)胞與具有永久分裂能力的人源骨髄瘤細(xì)胞融合獲得(見日本特公平1-59878號)所需的具有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3結(jié)合活性的人類抗體。另外，將磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作為抗原給藥具有完整的人抗體基因庫的轉(zhuǎn)基因動物后能得到產(chǎn)生抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的細(xì)胞，也可以從將產(chǎn)生抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體細(xì)胞永生化的細(xì)胞中獲得(見國際專利申請公開編號WO 94/25585號公報，WO 93/12227號公報，W092/03918號公報，和WO 94/02602號公報。產(chǎn)生這樣制備得到的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞能連續(xù)培養(yǎng)在通常的培養(yǎng)基上，或者可以長時間保存在液氮中。為使單克隆抗體能從該雜交瘤細(xì)胞獲得，一般采用如下方法依照通常方法培養(yǎng)該雜交瘤細(xì)胞得到并在培養(yǎng)基上清液中回收單克隆抗體的方法，或者將雜交瘤細(xì)胞施用到與之相容的哺乳動物中并使之増殖，在腹水中得到單克隆抗體的方法等。前ー個方法適于得到高純度抗體，而后ー個方法適于抗體的大量產(chǎn)生。本發(fā)明所用的單克隆抗體可以是重組的單克隆抗體，其制備是通過從雜交瘤細(xì)胞克隆抗體基因，將基因整合在適當(dāng)?shù)妮d體中，將其轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主中，并使宿主通過基因重組技術(shù)產(chǎn)生(例如，參見 Vandamme, A. M.等，Eur. J. Biochem. (1990) 192，767-775，1990)。具體而言，編碼抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體可變(V)區(qū)的mRNA，從生成抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的雜交瘤細(xì)胞中分離。所述mRNA可以通過已知的方法分離，例如，通過氨基甲脈超離心法(Chirgwin, J. M.等，Biochemistry (1979) 18，5294-5299)或 AGPC 法(Chomczynski, P.等，Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159)等制備總 RNA,之后用 mRNA 提純試劑盒(由Pharmacia制造)等制備目標(biāo)mRNA。另タ卜，mRNA也能用QuickPrep mRNA提純試劑盒(由Pharmacia制造)直接制備。抗體V區(qū)的cDNA可以用逆轉(zhuǎn)錄酶由得到的mRNA合成。CDNA的合成可以用例如，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈 cDNA 合成試劑盒(Reverse Transcriptase First-StrandcDNA Synthesis Kit)(由生成化學(xué)工業(yè)公司制造)等。⑶NA的合成和擴(kuò)增還能用例如，5 ' -Ampli FINDER RACE 試劑盒(由 Clontech 制造)和使用了 PCR 的 5 ' -RACE 法(Frohman, Μ. A.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A.等，Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932)等。將目標(biāo)DNA片段從如此得到的PCR產(chǎn)物純化，然后連接到載體DNA上。另外，由此制備重組載體，然后將其導(dǎo)入大腸桿菌等，再選擇菌落制備所需的重組載體。接著目標(biāo)DNA核苷酸序列用已知的方法證實，如雙脫氧核糖核酸鏈終止法。 得到編碼目標(biāo)抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體V區(qū)的DNA后，該DNA被整合在含有編碼所期望的抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA的表達(dá)載體中。為了制備用于本發(fā)明中的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體，抗體基因整合在表達(dá)控制區(qū)例如，增強(qiáng)子和啟動子這樣的控制區(qū)，以表達(dá)的表達(dá)載體。接著用該表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并誘導(dǎo)抗體表達(dá)。抗體基因表達(dá)可以通過編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA分別整合到表達(dá)載體中，然后用這些載體同時轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，或者也可以通過編碼H鏈和L鏈的DNA整合在單個表達(dá)載體中，用該載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(參見WO 94/11523)。不僅是以上列舉的宿主細(xì)胞，還有轉(zhuǎn)基因動物也能用于產(chǎn)生重組抗體。例如，融合基因的制備能通過將抗體基因插入在乳汁中產(chǎn)生的編碼蛋白(如山羊β酪蛋白)的基因中。然后將含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片段，注射到山羊胚胎中，該胚胎導(dǎo)入母山羊。所需的抗體可以從接受胚胎的山羊所生的轉(zhuǎn)基因山羊或其后代所產(chǎn)生的乳汁中得至IJ。此外，可以給轉(zhuǎn)基因山羊施用適當(dāng)?shù)募に?，以便增加轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的含有所需抗體的乳汁量(Ebert, K. Μ.等，Bio/Technology (1994) 12，699-702)。除了上面列舉的抗體，本發(fā)明可以利用人工修飾的基因重組抗體，如嵌合抗體和人源化抗體，g在降低對人類的異種抗原性。這些修飾的抗體可以通過已知的方法制備。嵌合抗體的獲得是通過，編碼由上述方法得到的抗體V區(qū)的DNA與編碼人類抗體C區(qū)的DNA連接，將其整合在表達(dá)載體中，然后把載體導(dǎo)入宿主并誘導(dǎo)生產(chǎn)。對本發(fā)明有用的嵌合抗體能以該已知方法獲得。人源化抗體，也稱為改型人類抗體，其是通過將非人類哺乳動物如小鼠抗體互補決定區(qū)(complementarity determining region, Q)R),移植到人類抗體的互補決定區(qū)，對此的常規(guī)基因重組技術(shù)也是已知的(見歐洲專利申請公開No. EP 125023號公報和WO96/02576 號公報)。具體而言，以連接小鼠抗體⑶R與人類抗體骨架區(qū)(FR)設(shè)計的DNA序列以PCR法合成，其是用與CDR和FR 二者的末端區(qū)都具有重疊的區(qū)域而構(gòu)建的數(shù)個寡核苷酸作為引物(參見WO 98/13388號公報中記載的方法)。其中的互補決定區(qū)構(gòu)成了良好的抗原結(jié)合部位的骨架區(qū)被選作跨CDR連接的人抗體骨架區(qū)?？贵w可變區(qū)中骨架區(qū)的氨基酸必要時可被取代，以便改型的人類抗體的互補決定區(qū)能構(gòu)成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合部位(Sato, K.等，Cancer Res. (1993)53,851-856)。在嵌合抗體和人源化抗體的C區(qū)中可以使用人類抗體C區(qū)，例如，Cy1，Cy2，Cy3和Cy4可用作H鏈，Ck和CA可用作L鏈。另外，可以修飾人類抗體C區(qū)以便改善抗體或其生成的穩(wěn)定性。嵌合抗體包含源自非人類哺乳動物的抗體可變區(qū)和源自人類的抗體恒定區(qū)。另ー方面，人源化抗體包含源自非人類哺乳動物的抗體互補決定區(qū)和源自人類的抗體骨架區(qū)以及C區(qū)。由于人源化抗體在體內(nèi)的抗原性降低， 其可用作本發(fā)明的治療藥的有效成分。本發(fā)明所用的抗體只要能與磷脂酰肌醇蛋白聚糖3結(jié)合并且能抑制磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的活性，抗體片段或其修飾體即可，還可以含有ニ價抗體和單價抗體，并不限于整個抗體分子?？贵w片段的實例如Fab、F(ab' ) 2、Fv、具有ー個Fab和ー個完整Fe的Fab/c,或H鏈或L鏈Fv由適當(dāng)?shù)慕宇^連接的單鏈Fv(scFv)。具體而言，抗體片段可以通過用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體而產(chǎn)生，或者可以構(gòu)建編碼所述抗體片段的基因，并將其導(dǎo)入表達(dá)載體，由適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞表達(dá)(參見，例如Co，M. S.等，J. Immunol. (1994) 152,2968-2976，Better,M. &Horwitz, A. H. Methods in Enzymology(1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc. , Plueckthun, A. & Skerra,A. Methods in Enzymology(1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc. , Lamoyi, E. , Methods in Enzymology(1989) 121, 652-663，Rousseaux, J.等，Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669，andBird, R. E.等，TIBTECH(1991)9, 132-137)。ScFv通過連接抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)得到。H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)通過接頭并優(yōu)選肽接頭連接在scFv中(Huston, J. S.等，Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. (1988) 85，5879-5883)。ScFv的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)可以是源自本說明書所述的任何抗體。連接V區(qū)的肽接頭可使用例如，包含12-19個氨基酸殘基的任何單鏈肽。編碼scFv的DNA可以按下述方法得到編碼上述抗體H鏈或H鏈V區(qū)的DNA，以及編碼L鏈或L鏈V區(qū)的DNA，以編碼前面所述序列的全部或所需的氨基酸序列的DNA部分作為模板，使用指定了末端的引物對經(jīng)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，接著重組指定的引物對，并進(jìn)行擴(kuò)增以使編碼肽接頭區(qū)的DNA和其兩端分別結(jié)合于H鏈和L鏈。另外，一旦編碼scFv的DNA制備好，含有該DNA的表達(dá)載體和用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主可以依照常法獲得，并且通過應(yīng)用所述宿主，依照常法可以得到scFv。所述抗體片段可以通過和上述同樣方法，由宿主獲得和表達(dá)其基因并誘導(dǎo)生產(chǎn)。本發(fā)明的“抗體”也包括這些抗體的片段。修飾抗體還可以使用與聚こニ醇(PEG)等各種不同分子結(jié)合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗體。本發(fā)明的“抗體”也包括這些修飾抗體。所述修飾抗體可以通過實施化學(xué)修飾已得到的抗體而獲得。需要說明的是，修飾抗體的方法在本領(lǐng)域中已建立。本發(fā)明所用的抗體還可以是雙特異性抗體。雙特異性抗體可以是具有識別磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上不同表位的抗原結(jié)合位點的雙特異性抗體，或ー個可識別磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的抗原結(jié)合位點和另ー個可識別細(xì)胞毒性物質(zhì)如化療藥或細(xì)胞產(chǎn)生的毒素等的抗原結(jié)合位點。這時，使得細(xì)胞毒性物質(zhì)能直接作用在表達(dá)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的細(xì)胞上，從而特異性破壞腫瘤細(xì)胞和抑制腫瘤細(xì)胞増殖。雙特異性抗體可以通過結(jié)合兩種類型的抗體的H-L對來制備，也可以通過融合能產(chǎn)生不同的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，制成產(chǎn)生雙特異性抗體的融合細(xì)胞來獲取。雙特異性抗體也可以通過基因工程技術(shù)制備。按上述所構(gòu)建的抗體基因可通過公知的方法表達(dá)和獲得。為哺乳動物細(xì)胞時，基因可以通過常用的有效啟動子、要表達(dá)的抗體基因和在其3'下游側(cè)的poly A信號的功能性連接來表達(dá)。啟動子/增強(qiáng)子舉例說明是人巨細(xì)胞病毒的早期啟動子/增強(qiáng)子。可以用來表達(dá)本發(fā)明所用的抗體的其它啟動子/增強(qiáng)子的實例包括，來自例如源自逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒或猴病毒40 (SV40)的病毒啟動子/增強(qiáng)子，或人延伸因子I a (HEF1 α )等哺乳動物細(xì)胞的啟動子/增強(qiáng)子等。應(yīng)用SV40啟動子/増強(qiáng)子時，基因表達(dá)易于以Mulligan等方法進(jìn)行(Nature (1979) 277，108)，應(yīng)用HEFl α啟動子/增強(qiáng)子時，基因表達(dá)易于以Mizushima等方法進(jìn)行(Nucleic Acids Res. (1990) 18，5322)。 在使用大腸桿菌時，基因表達(dá)可以通過常用的有效啟動子、抗體分泌的信號序列和要表達(dá)的抗體基因的功能性連接來實現(xiàn)。舉例說明啟動子可以是Iacz啟動子、araB啟動子。用Iacz啟動子時，表達(dá)可以通過Ward等方法實現(xiàn)(Nature (1098) 341，544-546; FASEBJ. (1992)6，2422-2427)，而用araB啟動子時，表達(dá)可通過Better等方法實現(xiàn)(Science (1988)240，1041-1043)。至于抗體分泌的信號序列，當(dāng)抗體在大腸桿菌的外周胞質(zhì)中產(chǎn)生時，可以用pelB信號序列(Lei, S. P.等，J.Bacteriol. (1987) 169,4379)。當(dāng)外周胞質(zhì)中產(chǎn)生的抗體被分離后，抗體結(jié)構(gòu)被適當(dāng)再折疊并使用。作為復(fù)制起點適用的是，舉例，源自SV40、多瘤病毒、腺病毒或牛乳頭瘤病毒(BPV)的復(fù)制起點。此外，為了擴(kuò)增宿主細(xì)胞系統(tǒng)中的基因拷貝數(shù)，表達(dá)載體可以含有例如氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (Ecogpt)基因、或ニ氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標(biāo)記。任何表達(dá)系統(tǒng)，例如真核細(xì)胞系統(tǒng)或原核細(xì)胞系統(tǒng)，都可以用于制備本發(fā)明所用的抗體。真核細(xì)胞的實例包括例如已建立的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)或昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)，以及絲狀真菌細(xì)胞和酵母細(xì)胞等的動物細(xì)胞等。原核細(xì)胞的實例包括細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞。本發(fā)明所用的抗體優(yōu)選在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，如在CHO，COS,骨髓瘤，BHK，Vero，或HeLa細(xì)胞中。然后轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在體外或體內(nèi)培養(yǎng)，以誘導(dǎo)產(chǎn)生目標(biāo)抗體。宿主細(xì)胞可以根據(jù)已知方法培養(yǎng)。例如，可用DMEM，,MEM,RPMI1640或頂DM作為培養(yǎng)基，也可合用血清添加物如胎牛血清(FCS)等。使用已知的方法可測定本發(fā)明所用抗體的抗原結(jié)合活性(Antibodies ALaboratory Manual Ed Harlow David Lane Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)矛口^^配體-受體結(jié)合抑制活性(Harada, A.等，International Immunology (1993) 5，681-690)。測定本發(fā)明所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的抗原結(jié)合活性，可以用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)、EIA(酶免分析)、RIA(放免分析)或熒光抗體技術(shù)來測定。舉例，用酶免分析時，將含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的樣本，如抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體生成細(xì)胞的培養(yǎng)上清液或純化的抗體，加至涂有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的板上。加入以酶如堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，對板進(jìn)行培養(yǎng)，清洗后加入酶底物如對硝基苯磷酸鹽，通過測定吸光度來評價抗原結(jié)合活性。本發(fā)明所用抗體的細(xì)胞毒性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法測定。可以通過混合效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體測定，檢查ADCC的程度來測定ADCC的活性。例如，小鼠脾細(xì)胞或者從骨髓或人外周血分離的單核細(xì)胞等可以用作效應(yīng)細(xì)胞，可以用人類建立的細(xì)胞株如人肝細(xì)胞株HuH-7等作為靶細(xì)胞。預(yù)先用51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞，向該細(xì)胞中加入抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體，之后培養(yǎng)，然后加入與靶細(xì)胞成適當(dāng)比例的效應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。ADCC活性可以用通過收集培養(yǎng)后的上清，計算上清中的放射活性進(jìn)行測定。CDC活性可以通過混合上述標(biāo)記的靶細(xì)胞和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體，然后加入補足物進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)后計算上清中的放射活性來測定。由于Fe區(qū)通常對于抗體發(fā)揮細(xì)胞毒性是必需的，在本發(fā)明的細(xì)胞生長抑制劑利用了抗體細(xì)胞毒活性的那些情況下，本發(fā)明所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體優(yōu)選含有Fe區(qū)。
本發(fā)明的抗癌劑用于預(yù)防癌癥或預(yù)防癌癥治療后的癌癥復(fù)發(fā)。本發(fā)明的抗癌劑特別優(yōu)選用于預(yù)防肝癌細(xì)胞切除術(shù)后的肝癌復(fù)發(fā)。有效劑量選自姆次給藥O. 001mg-1000mg/kg體重的范圍。或者,劑量可以選自姆名患者O. Ol-IOOOOOmg/個體。但是，本發(fā)明的含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑不受所述劑量的限制。本發(fā)明的抗癌劑通常以非ロ服途徑給藥，例如，注射(如皮下，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi))或經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻或經(jīng)肺等途徑，但是，ロ服給藥也是可能的。至于本發(fā)明的抗癌劑的給藥時間，可以在疾病臨床癥狀出現(xiàn)之前或之后給藥。根據(jù)特別優(yōu)選的本發(fā)明的實施方案，本發(fā)明的抗癌劑可以在肝癌細(xì)胞切除術(shù)后作為輔助治療給藥。含有本發(fā)明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體作為活性成分的治療藥可以依照常法配制(ReminRton ' s Pharmaceutical Science, latest edition, Mark PublishingCompany, Easton, U. S. A.)并且還可以同時含有藥用載體和添加劑。所述載體和藥用添加劑的實例是，水、藥用有機(jī)溶劑、膠原、聚こ烯醇、聚こ烯吡咯烷酮、羧こ烯聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性右旋糖苷、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、こ基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、瓊脂、聚こニ醇、雙甘油、甘油、丙烯醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖和適合作為藥物添加劑的表面活性劑。根據(jù)本發(fā)明的治療藥劑型，實際的添加劑可以是上述中的一種或多種進(jìn)行適當(dāng)組合，當(dāng)然也不受其限制。例如，可注射制劑的制備如下在溶劑如生理鹽水、緩沖液或葡萄糖溶液中溶解純化的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體，然后在溶液中加入防吸附劑如Tween80、Tween20、明膠、或人血清白蛋白?；蛘?，在使用前通過溶解重構(gòu)的劑型，可以是凍干制齊U，用于凍干的賦形劑可以用如甘露醇和葡萄糖等的糖醇或糖類。本說明書特意引用的所有專利和參考文獻(xiàn)的內(nèi)容，整體合并作為本說明書的一部分。此外，日本專利申請2004-244273和2005-90945的說明書和附圖的內(nèi)容，是構(gòu)成本發(fā)明持有的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的申請，整體合并作為本說明書的一部分。實施例
本發(fā)明通過下面提供的實施例更具體地描述，但這些實施例不限制本發(fā)明的范圍。實施例I小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體GC33在肝內(nèi)移植的小鼠模型中的藥效試驗(I)甲胎蛋白(AFP)的測定使用人ELISA試劑盒(由Hope Laboratories公司制造)，測定血清中的AFP濃度，作為腫瘤標(biāo)記物。ELISA的檢測限約Ing/mL，低于檢測限的樣本作為Ing/mL。為了獲取血清，在S印arapit S(由セキス?；瘜W(xué)制造)中通過眼窩采血收集血液，室溫下靜置15分鐘后，以1200Xg離心分離20分鐘。(2)制備肝內(nèi)移植小鼠模型 肝內(nèi)移植小鼠模型的制備如下HepG2細(xì)胞(ATCC)用Hanks培養(yǎng)基(由Sigma制造)配制到I X IO8個/mL。在戊巴比妥鈉麻醉下，50yL的！fepG2細(xì)胞懸液(5X106個/小鼠)注射到裸鼠(Charles River)的肝囊內(nèi)。移植后第21天測定血清中AFP濃度，在10-100ng/mL范圍內(nèi)的個體被分成兩組(η = 4)。在該時間點，肝癌細(xì)胞(瘤塊)還沒有視覺可見，將其用作肝臟切除術(shù)后微肝內(nèi)移植存活模型。(3)抗體給藥給藥當(dāng)天通過用生理鹽水(由大塚製薬制造)配制小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體GC33 (參考下面的參考例)達(dá)0. 5mg/mL作為給藥樣本。給藥樣本在腫瘤移植后的第21天和28天，以10mL/kg通過尾靜脈給藥至前述的小鼠模型。陰性對照中將生理鹽水作為媒介同樣給藥。(4)抗腫瘤作用的評價抗腫瘤作用根據(jù)腫瘤移植后第35天的AFP濃度評價。其結(jié)果顯示在圖I中，GC33給藥組與媒介給藥組相比，腫瘤移植后第35天的AFP濃度較低，從而證實了本發(fā)明抗體的抗腫瘤作用。如前所顯示，GC33在肝內(nèi)移植模型中表現(xiàn)出具有抗腫瘤的作用，可見本發(fā)明抗體能用在輔助治療中。實施例2小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體GC33在肝內(nèi)移植的小鼠模型中的早期給藥試驗(I)甲胎蛋白(AFP)的測定使用人ELISA試劑盒(由Hope Laboratories公司制造)，測定血清中的AFP濃度，作為腫瘤標(biāo)記物。ELISA的檢測限約Ing/mL，低于檢測限的樣本作為Ing/mL。為了獲取血清，在S印arapit S(由セキス?；瘜W(xué)制造)中通過眼窩采血收集血液，室溫下靜置15分鐘后，以1200Xg離心分離20分鐘。(2)制備肝內(nèi)移植小鼠模型肝內(nèi)移植小鼠模型的制備如下HepG2細(xì)胞(ATCC)用Hanks培養(yǎng)基(由Sigma制造)配制到I X IO8個/mL。在戊巴比妥鈉麻醉下，50μ L的H印G2細(xì)胞懸液(5 X IO6個/小鼠)注射到裸鼠(Charles River)的肝囊內(nèi)。移植后的第2天，隨機(jī)分成兩組(n = 10)。雖然HepG2在移植后的第一天的時間點就存在于小鼠肝內(nèi)，但此時小鼠血清中測不到人AFP，這可用作在臨床上更接近于肝臟切除術(shù)后殘余的微肝內(nèi)移植的模型。(3)抗體給藥
給藥當(dāng)天通過用生理鹽水(由大塚製薬制造)配制小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體GC33 (參考下面的參考例)達(dá)O. 5mg/mL作為給藥樣本。給藥樣本在腫瘤移植后的第2天和第7天，以10mL/kg通過尾靜脈給藥至前述的小鼠模型。陰性對照中將生理鹽水作為媒介同樣給藥。(4)抗腫瘤作用的評價抗腫瘤作用根據(jù)腫瘤移植后第15天和第40天的AFP濃度評價。其結(jié)果顯示在圖2中，媒介組中觀察到AFP濃度升高，而GC33給藥組兩個測定時間都沒有看到AFP濃度升聞。如前所顯示，在肝癌細(xì)胞肝內(nèi)移植的模型中，通過在AFP尚檢測不到的早期給與小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體GC33，可以抑制腫瘤増殖，從而提示本發(fā)明抗體能用在輔助治療中。參考實施例制備小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體GC33用來自GST和來自磷脂酰肌醇蛋白聚糖3中524位丙氨酸至563位賴氨酸的肽形成的融合蛋白作為免疫原，免疫三只Balb/c小鼠(購自Charles River Japan)和三只MRL/lpr小鼠。在初次免疫中，皮下給與乳劑，所述乳劑用FCA制備并調(diào)節(jié)使之能提供每只(per head) 100 μ gGC-3。兩周后,皮下給藥乳劑,所述乳劑用FIA制備并調(diào)節(jié)使之能提供姆只50yg。第五次免疫后,姆只最后免疫(50yg)在所有小鼠的尾靜脈中進(jìn)行,并進(jìn)行細(xì)胞融合。用固定有已去除C端側(cè)的疏水區(qū)(564至580的氨基酸)的可溶性GPC3核心蛋白的免疫板，通過ELISA進(jìn)行篩選。對于陰性對照，用限制性稀釋法進(jìn)行單克隆化。結(jié)果是獲得了具有對GPC3的較強(qiáng)結(jié)合活性的GC33抗體。GC33H鏈可變區(qū)的氨基酸序列顯示在序列編號3中，而L鏈可變區(qū)的氨基酸序列顯示在序列編號4中。エ業(yè)實用件本發(fā)明的抗癌劑適用于預(yù)防癌癥和預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)。
權(quán)利要求
1.抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體在制備用于預(yù)防肝癌復(fù)發(fā)的抗癌劑中的應(yīng)用，其中所述抗癌劑給藥的患者已將肝癌細(xì)胞切除術(shù)作為肝癌治療，并且所述肝癌細(xì)胞表達(dá)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，并且其中所述抗體與磷脂酰肌醇蛋白聚糖3上被包含如SEQ ID N0:3所示的H鏈可變區(qū)和如SEQ ID N0:4所示的L鏈可變區(qū)的抗體所結(jié)合的表位相同的表位結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中所述抗體的給藥使得患者血清中的AFP濃度未見升高。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的應(yīng)用，其中所述抗體是單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述抗體是嵌合抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述抗體為人源化抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體的輔助療法，提供了一種含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑，其中所述抗癌劑在癌癥治療后給藥。癌癥治療后優(yōu)選是指在肝癌治療后，其中肝癌的治療特別是指肝癌細(xì)胞切除術(shù)。本發(fā)明的抗癌劑優(yōu)選在切除的肝癌細(xì)胞中表達(dá)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3時使用?？沽字＜〈嫉鞍拙厶?抗體優(yōu)選是單克隆抗體。本發(fā)明的抗癌劑適用于預(yù)防癌癥或預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)。
文檔編號A61K39/395GK102698267SQ20121015481
公開日2012年10月3日 申請日期2005年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月24日
發(fā)明者岡部尚文, 木下恭子, 杉本正道 申請人:中外制藥株式會社