專利名稱：一種高品質(zhì)超低分子量肝素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種制備高品質(zhì)超低分子量肝素的方法。
背景技術(shù)：
肝素(普通肝素即未分級(jí)肝素)是一種高度硫酸化的糖胺聚糖，在體內(nèi)和體外都有抗凝血作用。在臨床上主要用于血液透析、血栓栓塞性疾病、心血管手術(shù)、心臟導(dǎo)管檢查、體外循環(huán)等。其最大的副作用是引起出血，有時(shí)甚至?xí)?dǎo)致出血性死亡，據(jù)統(tǒng)計(jì)其出血的發(fā)生率高達(dá)35%。盡管如此，它仍是防止血栓形成、肺栓塞、彌漫性血管內(nèi)凝血以及某些血栓栓賽性并發(fā)癥的首選藥物。雖然人們采取各種方法，比如減小劑量、局部用藥等以降低出血危險(xiǎn)，但是都無法從根本上解決問題。肝素的抗凝血活性分為抗栓活性(FXa)和抗凝(FIIa)活性兩大類，在抗血栓形成的過程中，抗FXa活性與抗FIIa活性的作用都是必需的，抗血栓 作用的衡量標(biāo)準(zhǔn)用抗FXa / FIIa值表示，其值越大，表示抗血栓作用越強(qiáng)，出血傾向越小。低分子肝素是由未分級(jí)肝素經(jīng)化學(xué)降解或酶降解方法制備的鈉鹽或鈣鹽，是普通肝素的一種升級(jí)產(chǎn)品，其平均分子量約為5000 Da。當(dāng)皮下注射低分子肝素時(shí)，其在體內(nèi)的抗FXa的作用要比普通肝素強(qiáng)得多，而抗FIIa活性較弱，還具有體內(nèi)半衰期延長、生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)，是目前主流的抗血栓類的藥物。雖然低分子肝素的抗FIIa活性與未分級(jí)肝素相比相對(duì)較弱，但是它依然會(huì)有一定幾率引起出血以及血小板減少癥。超低分子量肝素是經(jīng)降解而成的肝素寡糖片段，其主要雙糖結(jié)構(gòu)與肝素基本相同，S卩 a-L-IdoA-2-S04-P (I — 4) - a-D-GIrNS03-6_S04，平均分子量約為 2200 Da，而且分子量的分布區(qū)間比低分子肝素更加集中。它與低分子肝素產(chǎn)品相比，有著更好的抗血栓活性，更小的出血危險(xiǎn)，以及更低的對(duì)血小板的影響。對(duì)超低分子肝素的研究與開發(fā)已受到越來越多的關(guān)注，已逐漸成為國內(nèi)外肝素研究的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)證實(shí)，在多種轉(zhuǎn)移性或局部進(jìn)展性實(shí)體瘤患者中預(yù)防性使用超低分子量肝素后，靜脈血栓栓塞事件的發(fā)生率大幅降低。我國現(xiàn)有公開號(hào)為CN101671711A的發(fā)明專利“一種制備超低分子量肝素的方法”和公開號(hào)為CN102040671A的發(fā)明專利“一種超低分子量肝素的制備及純化工藝”。其中“一種制備超低分子量肝素的方法”是用麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白降解底物中肝素，得到超低分子量肝素；“一種超低分子量肝素的制備及純化工藝”是以￠-消除降解法為基礎(chǔ)，肝素與有機(jī)季銨鹽作用生成的肝素季銨鹽親和取代后生成的肝素芐基酯，堿性條件下降解得到低分子量的肝素片段，通過無機(jī)陶瓷超濾與中空纖維超濾結(jié)合的方法進(jìn)行分離純化，獲得分子量分布范圍在200(T2500D、平均分子量為2200 Da的超低分子量肝素鈉(鈣)。其中，以酶降解從肝素鈉提取超低分子肝素的工藝存在著反應(yīng)條件苛刻、成本過高、雜質(zhì)過多、產(chǎn)品難以純化等缺點(diǎn)。而采用￠-消除降解法制備的超低分子肝素也有著抗FXa因子效價(jià)過低、抗FIIa效價(jià)過高、會(huì)有一定幾率導(dǎo)致出血等問題，主要是由于樣品純度不夠、雜質(zhì)含量過多、小分子肝素聚積等因素導(dǎo)致，這些都是目前的提取工藝所不能解決的問題
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高品質(zhì)超低分子量肝素的低成本制備方法。本發(fā)明應(yīng)用類似于化學(xué)合成肝素五糖的作用原理，針對(duì)豬腸黏膜來源的肝素，以改良的P -消除降解法為基礎(chǔ)，創(chuàng)新性地采用重鹽化、磷腈堿解聚、皂化等方法解決了料液中的大分子肝素過多、小分子肝素聚積等關(guān)鍵問題，從而制備得到超小分子片段。通過此種方法制備得到的超低分子肝素鈉平均分子量為2000 3000，分子量分布 < 1600的比例(40. 0% ；> 4500 的比例彡 11. 0%> 30，抗FXa 效價(jià):145-180 IU/mg，抗FIIa效價(jià)<5.0 IU/mg。與低分子肝素鈉和超低分子肝素鈉相比，本發(fā)明制備的高品質(zhì)超低分子量肝素鈉有著非常好的的抗血栓活性，更小的出血危險(xiǎn)，以及更低的對(duì)血小板的影響，有望成為新生代的肝素類抗血栓藥物。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的超低分子量肝素制備方法包括以下步驟
1、肝素-苯索氯銨鹽的合成按I:2 3的重量比稱取肝素鈉和苯索氯銨鹽，分別溶于蒸餾水中，將在肝素鈉溶液緩慢加入到苯索氯銨鹽溶液中，攪拌2小時(shí)以上，靜置分層，去上清，并將剩余懸浮物離心，收集沉淀物肝素-苯索氯銨鹽，然后洗滌并干燥；
2、肝素芐基酯的合成將(I)所得肝素-苯索氯銨鹽溶于二甲基甲酰胺，然后加入氯化芐，于55飛(TC下進(jìn)行酯化反應(yīng)25 30小時(shí)；
3、芐基肝素鈉鹽的合成配制飽和的醋酸鈉乙醇溶液，加入到(2)所得的料液中并攪拌，控制料液溫度15°C以下，靜置6小時(shí)以上；吸去上清液，將下層懸濁液離心，收集沉淀物芐基肝素鈉鹽，然后洗滌；
4、重鹽化稱取芐基肝素鈉2.5倍重量的苯索氯銨鹽和芐基肝素鈉，在水溶液中攪拌反應(yīng)2小時(shí)以上，而后再靜置分層，去上清，將剩余懸浮物離心，收集沉淀物肝素芐基酯苯索氯銨鹽，并用蒸餾水洗滌；
5、解聚反應(yīng)將芐基肝素芐索銨鹽溶于二氯甲烷中，并加入磷腈堿作為催化劑，在室溫下攪拌反應(yīng)24小時(shí)以上；然后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至飽和的醋酸鈉甲醇溶液中，出現(xiàn)沉淀后，離心分離，所得為解聚合的芐基肝素鈉鹽，甲醇洗滌并干燥；
6、皂化將解聚的芐基肝素鈉鹽溶于蒸餾水中，于10°C以下，加入氫氧化鈉反應(yīng)2小時(shí)以上，再加入氯化鈉并用稀鹽酸調(diào)整pH為6. 5^7. 5，然后向反應(yīng)液中加入2 3倍的甲醇沉淀，將沉淀洗滌并干燥；
7、堿氧純化將(6)中所得沉淀溶于蒸餾水中，調(diào)整pH值到9.0 11. 0，加入過氧化氫在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6 8小時(shí)；
8、物理純化將料液轉(zhuǎn)移至納濾循環(huán)罐進(jìn)行納濾；測(cè)定截留液相對(duì)平均分子量和分子量分布，若相對(duì)分子量和分子量分布不符合要求，則用1000 Da超濾膜進(jìn)行超濾操作；再調(diào)節(jié)濾液PH值到6. 5^7. 4之間，經(jīng)0. 22 微孔濾器過濾；
9、凍干濾液放入凍干機(jī)中干燥。按上述方法，肝素芐基酯的合成中，每公斤肝素-苯索氯銨鹽加入的氯化芐的體積為1L。按上述方法,解聚反應(yīng)中,磷腈堿加入量為節(jié)基肝素節(jié)索銨鹽質(zhì)量的1%。本發(fā)明是根據(jù)類似化學(xué)合成肝素五糖作用原理，以改良的￠-消除法為基礎(chǔ)，通 過創(chuàng)新性地采用重鹽化、磷腈堿催化解聚、皂化等步驟，解決了超低分子量肝素制備的傳統(tǒng)工藝中大分子肝素過多、小分子肝素聚積等關(guān)鍵性問題。本發(fā)明與其他產(chǎn)品的比較如下
權(quán)利要求
1.一種高品質(zhì)超低分子量肝素鈉的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)肝素-苯索氯銨鹽的合成按I:2 3的重量比稱取肝素鈉和苯索氯銨鹽，分別溶于蒸餾水中，將在肝素鈉溶液緩慢加入到苯索氯銨鹽溶液中，攪拌2小時(shí)以上，靜置分層，去上清，并將剩余懸浮物離心，收集沉淀物肝素-苯索氯銨鹽，然后洗滌并干燥； 2)肝素芐基酯的合成將(I)所得肝素-苯索氯銨鹽溶于二甲基甲酰胺，然后加入氯化芐，于55飛(TC下進(jìn)行酯化反應(yīng)25 30小時(shí)； 3)芐基肝素鈉鹽的合成配制飽和的醋酸鈉乙醇溶液，加入到(2)所得的料液中并攪拌，控制料液溫度15°C以下，靜置6小時(shí)以上，吸去上清液，將下層懸濁液離心，收集沉淀物芐基肝素鈉鹽，然后洗滌； 4)重鹽化稱取芐基肝素鈉2.5倍重量的苯索氯銨鹽，和芐基肝素鈉在水溶液中攪拌反應(yīng)2小時(shí)以上，而后再靜置分層，去上清，將剩余懸浮物離心，收集沉淀物肝素芐基酯苯索氯銨鹽，并用蒸餾水洗滌； 5 )解聚反應(yīng)將芐基肝素芐索銨鹽溶于二氯甲烷中，并加入磷腈堿作為催化劑，在室溫下攪拌反應(yīng)24小時(shí)以上，然后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至飽和的醋酸鈉甲醇溶液中，出現(xiàn)沉淀后，離心分離，所得為解聚合的芐基肝素鈉鹽，甲醇洗滌并干燥； 6)皂化將解聚的芐基肝素鈉鹽溶于蒸餾水中，于10°C以下，加入氫氧化鈉反應(yīng)2小時(shí)以上，再加入氯化鈉并用稀鹽酸調(diào)整pH為6. 5^7. 5，然后向反應(yīng)液中加入2 3倍的甲醇沉淀，將沉淀洗滌并干燥； 7)堿氧純化將(6)中所得沉淀溶于蒸餾水中，調(diào)整pH值到9.O 11. 0，加入過氧化氫在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6 8小時(shí)； 8)物理純化將料液轉(zhuǎn)移至納濾循環(huán)罐進(jìn)行納濾；測(cè)定截留液相對(duì)平均分子量和分子量分布，若相對(duì)分子量和分子量分布不符合要求，則用1000 Da超濾膜進(jìn)行超濾操作；再調(diào)節(jié)濾液PH值到6. 5^7. 4之間，經(jīng)O. 22 微孔濾器過濾； 9)凍干濾液放入凍干機(jī)中干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，肝素芐基酯的合成中，每公斤肝素-苯索氯銨鹽加入的氯化芐的體積為1L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，解聚反應(yīng)中，磷腈堿加入量為芐基肝素芐索銨鹽質(zhì)量的1%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高品質(zhì)超低分子量肝素的制備方法。以改良的β-消除降解法為基礎(chǔ)，創(chuàng)新性地加入了重鹽化、磷腈堿解聚、皂化等方法解決了料液中的大分子肝素過多、小分子肝素聚積等關(guān)鍵問題，從而制備得到超小分子片段。通過此種方法制備得到的超低分子肝素鈉平均分子量為2000～3000，其分子量分布為＜1600的比例≤40.0%；＞4500的比例≤11.0%；抗FXa/FIIa＞30，其中抗FXa效價(jià)145-180IU/mg，抗FIIa效價(jià)＜5.0IU/mg。與低分子肝素鈉和超低分子肝素鈉相比，這種高品質(zhì)超低分子量肝素鈉有著非常好的抗血栓活性，更小的出血危險(xiǎn)，以及更低的對(duì)血小板的影響，有望成為新生代的肝素類抗血栓藥物。
文檔編號(hào)A61P7/02GK102633908SQ201210131730
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月2日
發(fā)明者周霞, 郭維, 雷曉剛 申請(qǐng)人:雷曉剛