一種低分子量肝素的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種低分子量肝素的制備方法，是用組氨酸標(biāo)簽肝素酶I在一定反應(yīng)溫度下降解肝素，反應(yīng)液經(jīng)純化即得到低分子量肝素，所述方法中，一定反應(yīng)溫度為15-40℃，所述的反應(yīng)過程是在反應(yīng)液的ΔA232達(dá)到15—50時(shí)終止。本發(fā)明采用適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溫度，保證了具有較高酶活性和較快反應(yīng)速度；同時(shí)能夠精確判斷反應(yīng)終點(diǎn)，控制低分子量肝素的數(shù)均分子量降解反應(yīng)的程度則通過檢測232nm處的吸光度來實(shí)現(xiàn)，從而使得到的低分子量肝素的分子量在目標(biāo)范圍內(nèi)，提高了降解肝素的效率。利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的組氨酸肝素酶I能夠以較低的成本制備質(zhì)量良好的低分子量肝素，具有巨大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種低分子量肝素的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種低分子量肝素的制備方法，屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素是有己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以1 — 4糖苷鍵交替形成的粘多糖，其分子量在3000-40000Da之間，平均分子量為15000Da，肝素作為抗凝試劑和抗栓試劑已有多年的歷史，此外肝素還具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌、調(diào)血脂等方面的生活功能。但是由于肝素具有抗凝血活性，所以大量的使用會引起出血和誘導(dǎo)性血小板減少、骨質(zhì)疏松等副作用，從而大大的限制了肝素在臨床上的應(yīng)用。
[0003]低分子量肝素(low-molecular-weightheparin, LMWH) (.Linhardt, R.J.Gunay, N.S.Production and chemical processing of low molecular weightheparins.Sem.Thromb.Hem.25 (3): 5-16)是未分級肝素中具有較低分子量的組分,或肝素降解后得到的小分子組分或片段，分子量在3000— SOOODa之間。與肝素相比，LMWH的抗凝作用弱于肝素，但其抗血栓作用明顯強(qiáng)于肝素，且還具有其他優(yōu)勢，如分子量小，生物利用率高，體內(nèi)半衰期長，按體重給藥，抗凝效果可以預(yù)測，較少與血小板結(jié)合，出血傾向小。所以LMWH是一種安全有效的抗血栓藥物，臨床上可取代肝素。分子量均一，分布范圍窄的LMWH在臨床上的藥效明顯較好，因而在對LMWH進(jìn)行質(zhì)量控制方面，各國藥典均規(guī)定了其平均分子量及分子量分布范圍。所以，制備分子量合適且窄分布的低分子量肝素具有重要的意義。
[0004]目前，LMWH的制備方法主要有化學(xué)裂解法和酶降解法。雖然化學(xué)裂解法工藝流程較簡單，但裂解過程中加入的強(qiáng)氧化劑會與肝素中的硫酸基團(tuán)作用而引起肝素抗凝活性的降低，此外這種方法還可能引入毒物而污染環(huán)境，而酶降解法由于其溫和的反應(yīng)條件且無毒性易實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù)化而越來越得到人們的關(guān)注。美國專利(US5106734，1992)通過檢測235nm處的吸光度可制備合適分子量的低分子量肝素產(chǎn)品。酶降解法中主要研究采用來自肝素黃桿菌(Flavobacterium heparinum)的肝素酶I來制備低分子肝素，因該酶產(chǎn)量低、純化困難，造成酶的成本非常昂貴，限制了酶法制備低分子肝素的發(fā)展。于廣利等(于廣利，王群，管華詩，徐家敏，Robert J.Linhardt,牛肺肝素寡糖的制備,青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，32(2):231— 235)利用肝素酶控制性降解牛肺肝素，得到了聚合度為2 — 20的寡糖純品°邪新會等(Ye FC, Kuang Y, Chen S，Zhang C，Chen Y, Xing XH.Characteristics of lowmolecular weight heparin production by an ultrafiltration membrane bioreactorusing maltose binding protein fused heparinase 1.BIOCHEM ENG J.2009，46:193-198)利用麥芽糖結(jié)合蛋白融合表達(dá)肝素酶I，并利用所生產(chǎn)的酶降解肝素，得到了一系列不同分子量的低分子量肝素。這些研究雖然對肝素酶I的產(chǎn)量、純化方式及制備體系都做了改進(jìn)，但酶解肝素中使用的肝素酶I仍然存在一定的穩(wěn)定性差的問題，造成酶的成本依然昂貴，限制了酶法制備低分子量肝素的發(fā)展。利用重組菌株生產(chǎn)肝素酶且在酶中添加穩(wěn)定劑是降低酶成本的有效途徑。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種采用適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溫度，具有較高酶活性、能夠精確判斷反應(yīng)終點(diǎn)，控制低分子量肝素的數(shù)均分子量的低分子量肝素的制備方法。
[0006]本發(fā)明所提供的低分子量肝素的制備方法，是用組氨酸標(biāo)簽肝素酶I在一定反應(yīng)溫度下降解肝素，反應(yīng)液經(jīng)純化即得到低分子量肝素，其特征在于:所述方法中，一定反應(yīng)溫度為15-40°C,所述的反應(yīng)過程是在反應(yīng)液的ΔΑ232達(dá)到15—50時(shí)終止,所述ΔΑ232是組氨酸標(biāo)簽肝素酶I降解肝素反應(yīng)結(jié)束時(shí)反應(yīng)液相比于起始時(shí)反應(yīng)液的232nm吸光度的增加值。
[0007]所述方法中，所述組氨酸標(biāo)簽肝素酶I是利用大腸桿菌表達(dá)的帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的重組肝素酶I，使用形式是含有二硫蘇糖醇和吐溫80的組氨酸標(biāo)簽肝素酶I凍干粉在水中重懸的溶液。
[0008]所述肝素是用如下方法配制:在IOOmL含5mM CaCl2和IOOmM NaCl的水中加入一定量的肝素，使肝素在肝素溶液中的濃度為I一100mg/mL,優(yōu)選為40mg/mL, pH用HCl調(diào)節(jié)至6.0-8.0，優(yōu)選為7.0。所述方法中，組氨酸標(biāo)簽肝素酶I與肝素的配比(組氨酸肝素酶I的酶活mIU:肝素溶液mg/mL)是1:1一4:1，優(yōu)選是2:1。
[0009]所述方法中，反應(yīng)溫度為15_40°C，優(yōu)選為20_35°C。對組氨酸標(biāo)簽肝素酶I的反應(yīng)溫度 進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在15-40°C之間，都有一定活性表現(xiàn)，而在20-35°C區(qū)間內(nèi)，酶活表現(xiàn)良好，最適反應(yīng)溫度約為30°C或32°C。從酶的穩(wěn)定性來看，溫度越高，酶失活速度越快，半衰期越短。從反應(yīng)效率來看，溫度高則所需的反應(yīng)時(shí)間短。綜合考慮酶的穩(wěn)定性及反應(yīng)效率，選擇反應(yīng)溫度的范圍為20-35°C較為合適，使其既能有效地降解肝素又能保證足夠的反應(yīng)效率。
[0010]所述方法中，反應(yīng)過程在反應(yīng)液的ΔΑ232達(dá)到15—50時(shí)終止,終止通過調(diào)節(jié)pH至
2.0實(shí)現(xiàn)。產(chǎn)品的分子量決定了產(chǎn)品的質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)分子量的精確控制則須對終點(diǎn)準(zhǔn)確判斷。反應(yīng)終點(diǎn)的控制可通過實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)程度實(shí)現(xiàn)，反應(yīng)程度與ΛΑ232呈正相關(guān)，可直接監(jiān)測ΔΑ232的值來控制反應(yīng)程度，以確保反應(yīng)終點(diǎn)的準(zhǔn)確。
[0011 ] 所述方法中，包括等式2所示的數(shù)均分子量的低分子量肝素與Λ A232的關(guān)系式，通過控制組氨酸標(biāo)簽肝素酶I降解肝素的反應(yīng)過程結(jié)束時(shí)反應(yīng)液的AA232，獲得目標(biāo)數(shù)均分子量的低分子量肝素；
[0012]1/Μη=1/13000+ Δ A232/ (7200*c) —等式 2
[0013]所述等式2中Mn為反應(yīng)液的數(shù)均分子量，AA232是組氨酸標(biāo)簽肝素酶I降解肝素反應(yīng)結(jié)束時(shí)反應(yīng)液相比與起始時(shí)反應(yīng)液的232nm吸光度的增加值。
[0014]所述方法中，按照以下方法純化低分子量肝素:終止反應(yīng)后，將反應(yīng)液用0.22微米的纖維膜過濾除去蛋白，收集初濾液用截留分子量為3000— 1000ODa的超濾膜過濾，在濾液中加入濾液體積3— 4倍的乙醇混勻后離心，收集沉淀加入丙酮洗滌，將沉淀減壓蒸干即可得到低分子量肝素產(chǎn)品。
[0015]本發(fā)明的方法采用組氨酸標(biāo)簽肝素酶I制備低分子量肝素，由于組氨酸標(biāo)簽由6個(gè)組氨酸組成，分子量僅為0.84kDa，位阻效應(yīng)較弱，對肝素酶I的空間構(gòu)象及酶學(xué)性質(zhì)的影響基本可以忽略，較大程度保留了肝素酶I對肝素的酶切作用，且組氨酸肝素酶I為可溶性表達(dá)，通過一步純化就可得到90%以上的蛋白酶，從而保證了低分子量肝素的質(zhì)量又降低了酶的生產(chǎn)成本。此外采用適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溫度，保證了具有較高酶活性和較快反應(yīng)速度；同時(shí)能夠精確判斷反應(yīng)終點(diǎn)，控制低分子量肝素的數(shù)均分子量降解反應(yīng)的程度則通過檢測232nm處的吸光度來實(shí)現(xiàn)，從而使得到的低分子量肝素的分子量在目標(biāo)范圍內(nèi)，提高了降解肝素的效率。利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的組氨酸肝素酶I能夠以較低的成本制備質(zhì)量良好的低分子量肝素，具有巨大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】[0016]圖1為反應(yīng)過程中反應(yīng)液的232nm的吸光度隨時(shí)間的變化圖
[0017]圖2為反應(yīng)液數(shù)均分子量Mn與A232值的關(guān)系圖
[0018]圖3為反應(yīng)液數(shù)均分子量Mn與重均分子量Mw關(guān)系圖
【具體實(shí)施方式】
[0019]下述實(shí)施例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對本發(fā)明的限定。
[0020]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0021]下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0022](實(shí)施例1)組氨酸標(biāo)簽肝素酶I降解肝素制備低分子量肝素過程中反應(yīng)液AA232的變化、數(shù)均分子量Mn與Δ A232值的關(guān)系以及液數(shù)均分子量Mn與重均分子量Mw的關(guān)系
[0023](I).組氨酸標(biāo)簽肝素酶I降解肝素制備低分子量肝素過程中反應(yīng)液AA232的變化
[0024]以未分級肝素(購自生工生物工程(上海)股份有限公司)為原料，將2000mg未分級肝素加入到IOOmL含5mM CaCl2和IOOmM NaCl的水中，pH用HCl調(diào)節(jié)至7.0,即得肝素溶液。
[0025]將上訴IOOmL肝素溶液置于30°C恒溫，加入4000mIU的組氨酸標(biāo)簽肝素酶I進(jìn)行反應(yīng)，每隔一定時(shí)間取出部分反應(yīng)液，測定其232nm的吸光度并按照歐洲藥典5.0所示測定方法測定其數(shù)均分子量Mn和重均分子量Mw。
[0026]上訴實(shí)驗(yàn)得到的不同反應(yīng)時(shí)間的反應(yīng)液的A232值變化情況如圖1所示。圖1表明，反應(yīng)液的A232值隨著時(shí)間的增加而增加,二者的關(guān)系大致符合一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。
[0027](2).組氨酸標(biāo)簽肝素酶I降解肝素制備低分子量肝素過程中反應(yīng)液數(shù)均分子量Mn與Δ A232值的關(guān)系
[0028]反應(yīng)液的數(shù)均分子量Mn與AA232的關(guān)系見美國專利US005106734:
[0029]I/Mn=I/Mn, u+AA232/ ( ε *c)等式 I
[0030]所述等式I中Mn為反應(yīng)液的數(shù)均分子量，Mn，u為未分級肝素的數(shù)均分子量，AA232為反應(yīng)液自反應(yīng)起始時(shí)232nm吸光度的增加值,c為初始未分級肝素的濃度(mg/mL), ε為摩爾吸光系數(shù)。
[0031]利用實(shí)例I得到的不同反應(yīng)時(shí)間的反應(yīng)液的數(shù)均分子量和反應(yīng)液的AA232值，符合等式I所示的關(guān)系，為l/Mn=l/13000+AA232/(7200*c)等式2
[0032]貝UI/Mn與Δ A232的關(guān)系如圖2所不。根據(jù)數(shù)均分子量可求出ΔΑ232,從而反應(yīng)的程度可通過檢測AA232的值實(shí)現(xiàn)。[0033](3).組氨酸標(biāo)簽肝素酶I降解肝素制備低分子量肝素過程中反應(yīng)液數(shù)均分子量Mn與重均分子量Mw的關(guān)系
[0034]利用實(shí)例I得到的不同反應(yīng)時(shí)間的反應(yīng)液的數(shù)均分子量和重均分子量，以重均分子量為橫坐標(biāo)，數(shù)均分子量為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖3所示，則反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液的重均分子量可根據(jù)圖3求得。
[0035](實(shí)施例2)組氨酸標(biāo)簽肝素酶I控制性降解肝素制備低分子量肝素之I
[0036]配制20mg/mL肝素、5mM CaCl2UOOmM NaCl、pH為7.0的反應(yīng)溶液，將其置于15°C恒溫水浴鍋預(yù)熱12min后，加入2000mIU的組氨酸標(biāo)簽肝素酶I進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)一段時(shí)間后，測得其AA232值為34.8，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0終止反應(yīng)，將反應(yīng)液用0.22微米的纖維膜過濾除去蛋白，收集初濾液用截留分子量為3000Da的超濾膜過濾，在濾液中加入濾液體積3— 4倍的乙醇混勻后離心，收集沉淀加入丙酮洗滌，將沉淀減壓蒸干后測定其數(shù)均分子量Mn和重均分子量Mw。Mn值為4322Da，Mw值為6433Da，分布系數(shù)為1.48，分子量符合藥典對低分子量肝素產(chǎn)品的要求。
[0037](實(shí)施例3)組氨酸標(biāo)簽肝素酶I控制性降解肝素制備低分子量肝素之2
[0038]配制20mg/mL肝素、5mM CaCl2UOOmM NaCUpH為7.0的反應(yīng)溶液，將其置于20°C恒溫水浴鍋預(yù)熱IOmin后，加入2000mIU的組氨酸標(biāo)簽肝素酶I進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)一段時(shí)間后，測得其AA232值為34.8，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0終止反應(yīng)，將反應(yīng)液用0.22微米的纖維膜過濾除去蛋白，收集初濾液用截留分子量為3000Da的超濾膜過濾，在濾液中加入濾液體積3— 4倍的乙醇混勻后離心，收集沉淀加入丙酮洗滌，將沉淀減壓蒸干后測定其數(shù)均分子量Mn和重均分子量Mw。Mn值為4322Da，Mw值為6433Da，分布系數(shù)為1.48，分子量符合藥典對低分子量肝素產(chǎn)品的要求。
[0039](實(shí)施例4)組氨酸標(biāo)簽肝素酶I控制性降解肝素制備低分子量肝素之3
[0040]配制20mg/mL肝素、5mM CaCl2UOOmM NaCUpH為7.0的反應(yīng)溶液，將其置于30°C恒溫水浴鍋預(yù)熱IOmin后,加入酶濃度為4000mIU的組氨酸標(biāo)簽肝素酶I溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)一段時(shí)間后，當(dāng)其AA232值為42.7時(shí)，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0終止反應(yīng)，同樣將反應(yīng)液用0.22微米的纖維膜過濾除去蛋白，收集初濾液用截留分子量為3000Da的超濾膜過濾，在濾液中加入濾液體積3— 4倍的乙醇混勻后離心，收集沉淀加入丙酮洗滌，將沉淀減壓蒸干后測定其數(shù)均分子量Mn和重均分子量Mw。Mn值為3590Da，Mw值為5488Da，分布系數(shù)為
1.52，分子量也符合藥典對低分子量肝素產(chǎn)品的要求。
[0041](實(shí)施例5)組氨酸標(biāo)簽肝素酶I控制性降解肝素制備低分子量肝素之4
[0042]配制10mg/mL肝素、5mM CaCl2UOOmM NaCUpH為7.0的反應(yīng)溶液，將其置于25°C恒溫水浴鍋預(yù)熱IOmin后,加入酶濃度為4000mIU的組氨酸標(biāo)簽肝素酶I溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)一段時(shí)間后，當(dāng)其AA232值為19.2時(shí)，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0終止反應(yīng)，同樣將反應(yīng)液用0.22微米的纖維膜過濾除去蛋白，收集初濾液用截留分子量為3000— 1000ODa的超濾膜過濾，在濾液中加入濾液體積3— 4倍的乙醇混勻后離心，收集沉淀加入丙酮洗滌，將沉淀減壓蒸干后測定其數(shù)均分子量Mn和重均分子量Mw。Mn值為4021Da，Mw值為6150Da，分布系數(shù)為1.52，分子量也符合藥典對低分子量肝素產(chǎn)品的要求。
[0043](實(shí)施例6)組氨酸標(biāo)簽肝素酶I控制性降解肝素制備低分子量肝素之5
[0044]配制30mg/mL肝素、5mM CaCl2UOOmM NaCUpH為7.0的反應(yīng)溶液，將其置于28°C恒溫水浴鍋預(yù)熱IOmin后,加入酶濃度為3000mIU的組氨酸標(biāo)簽肝素酶I溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)一段時(shí)間后，當(dāng)其AA232值為23.1時(shí)，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0終止反應(yīng)，同樣將反應(yīng)液用0.22微米的纖維膜過濾除去蛋白，收集初濾液用截留分子量為3000— 1000ODa的超濾膜過濾，在濾液中加入濾液體積3— 4倍的乙醇混勻后離心，收集沉淀加入丙酮洗滌，將沉淀減壓蒸干后測定其數(shù)均分子量Mn和重均分子量Mw。Mn值為3991Da，Mw值為5720Da，分布系數(shù)為1.43，分子量也符合藥典對低分子量肝素產(chǎn)品的要求。說明本發(fā)明能夠有效地制備分子量合適的低分子量肝素產(chǎn)品。
[0045](實(shí)施例7)組氨酸標(biāo)簽肝素酶I控制性降解肝素制備低分子量肝素之6
[0046]配制30mg/mL肝素、5mM CaCl2UOOmM NaCUpH為7.0的反應(yīng)溶液，將其置于32°C恒溫水浴鍋預(yù)熱IOmin后,加入酶濃度為3000mIU的組氨酸標(biāo)簽肝素酶I溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)一段時(shí)間后，當(dāng)其AA232值為23.1時(shí)，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0終止反應(yīng)，同樣將反應(yīng)液用0.22微米的纖維膜過濾除去蛋白，收集初濾液用截留分子量為3000— 1000ODa的超濾膜過濾，在濾液中加入濾液體積3— 4倍的乙醇混勻后離心，收集沉淀加入丙酮洗滌，將沉淀減壓蒸干后測定其數(shù)均分子量Mn和重均分子量Mw。Mn值為3991Da，Mw值為5720Da，分布系數(shù)為1.43，分子量也符合藥典對低分子量肝素產(chǎn)品的要求。說明本發(fā)明能夠有效地制備分子量合適的低分子量肝素產(chǎn)品。
[0047](實(shí)施例8)組氨酸標(biāo)簽肝素酶I控制性降解肝素制備低分子量肝素之7
[0048]配制10mg/mL肝素、5mM CaCl2UOOmM NaCUpH為7.0的反應(yīng)溶液，將其置于25°C恒溫水浴鍋預(yù)熱IOmin后,加入酶濃度為4000mIU的組氨酸標(biāo)簽肝素酶I溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)一段時(shí)間后，當(dāng)其AA232值為19.2時(shí)，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0終止反應(yīng)，同樣將反應(yīng)液用0.22微米的纖維膜過濾除去蛋白，收集初濾液用截留分子量為3000— 1000ODa的超濾膜過濾，在濾液中加入濾液體積3— 4倍的乙醇混勻后離心，收集沉淀加入丙酮洗滌，將沉淀減壓蒸干后測定其數(shù)均分子量Mn和重均分子量Mw。Mn值為4021Da，Mw值為6150Da，分布系數(shù)為1.52，分子量也符合藥典對低分子量肝素產(chǎn)品的要求。
【權(quán)利要求】
1.一種低分子量肝素的制備方法，是用組氨酸標(biāo)簽肝素酶I在一定反應(yīng)溫度下降解肝素，反應(yīng)液經(jīng)純化即得到低分子量肝素，其特征在于:所述方法中，一定反應(yīng)溫度為15-40°C,所述的反應(yīng)過程是在反應(yīng)液的AA232達(dá)到15—50時(shí)終止,所述ΔΑ232是組氨酸標(biāo)簽肝素酶I降解肝素反應(yīng)結(jié)束時(shí)反應(yīng)液相比于起始時(shí)反應(yīng)液的232nm吸光度的增加值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子量肝素的制備方法，其特征在于:所述方法中，一定反應(yīng)溫度為20-35°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子量肝素的制備方法，其特征在于:所述方法中，一定反應(yīng)溫度為30°C或32°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子量肝素的制備方法，其特征在于:通過控制組氨酸標(biāo)簽肝素酶I降解肝素的反應(yīng)過程結(jié)束時(shí)反應(yīng)液的AA232，獲得目標(biāo)數(shù)均分子量的低分子量肝素；所述低分子量肝素的數(shù)均分子量的與AA232的關(guān)系式為等式2，即:1/Μη=1/13000+ Δ A232/ (7200*c) 等式 2 所述等式2中Mn為數(shù)均分子量，AA232是組氨酸標(biāo)簽肝素酶I降解肝素反應(yīng)結(jié)束時(shí)反應(yīng)液相比于起始時(shí)反應(yīng)液的232nm吸光度的增加值，c為初始未分級肝素的濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備低分子量肝素的的方法，其特征在于:所述方法中，組氨酸標(biāo)簽肝素酶I與肝素的配比即組氨酸肝素酶I的酶活miu:肝素溶液mg/mL是1:1 一4:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備低分子量肝素的的方法，其特征在于:所述方法中，組氨酸標(biāo)簽肝素酶I與肝素的配比即組氨酸肝素酶I的酶活miu:肝素溶液mg/mL是2:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6任一所述低分子量肝素的制備方法，其特征在于:反應(yīng)終止通過調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至2.0實(shí)現(xiàn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~6任一所述低分子量肝素的制備方法，其特征在于:所述組氨酸標(biāo)簽肝素酶I是利用大腸桿菌表達(dá)的帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的重組肝素酶I，使用形式是含有二硫蘇糖醇和吐溫80的組氨酸標(biāo)簽肝素酶I凍干粉在水中重懸的溶液；所述二硫蘇糖醇和吐溫80在組氨酸標(biāo)簽肝素酶I溶液凍干前的濃度分別為ImM和0.001%。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述低分子量肝素的制備方法，其特征在于:所述組氨酸標(biāo)簽肝素酶I溶液中只含有IOmM Tris-HCl和組氨酸標(biāo)簽肝素酶I。
10.根據(jù)權(quán)利要求1~6任一所述低分子量肝素的制備方法，其特征在于:所述肝素是用如下方法配制:在IOOmL含5mM CaCl2和IOOmM NaCl的水中加入一定量的肝素，使肝素在肝素溶液中的濃度為I一 100mg/mL，優(yōu)選為40mg/mL，pH用HCl調(diào)節(jié)至6.0-8.0，優(yōu)選為7.0。
【文檔編號】C12P19/26GK103540630SQ201310498598
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】丁建文, 陳敬華, 程詠梅, 鄧超, 宋志新, 管惠娟, 張華
申請人:常山生化藥業(yè)（江蘇）有限公司