本發(fā)明涉及一種植物萃取物；具體而言，本發(fā)明涉及一種富含抗關(guān)節(jié)炎活性的到手香精萃取物。

背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)炎為最常見(jiàn)的自體免疫疾病，主要病癥為滑膜組織的發(fā)炎，伴隨著逐步骨頭侵蝕，形成關(guān)節(jié)組織的聯(lián)合與殘缺導(dǎo)致排列不齊的結(jié)果。該免疫功能的過(guò)度活躍不僅局限于關(guān)節(jié)局部，而是一種全身性親炎癥主控反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)發(fā)炎細(xì)胞與物質(zhì)，如CD4+T細(xì)胞，B細(xì)胞與發(fā)炎性細(xì)胞激素過(guò)度產(chǎn)生，形成長(zhǎng)期對(duì)關(guān)節(jié)組織破壞的能力。一般認(rèn)為宿主受到不明外來(lái)病原性感染，導(dǎo)致T細(xì)胞的活化啟動(dòng)了關(guān)節(jié)炎的病程，進(jìn)而誘發(fā)多重反應(yīng)，包含活化如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等發(fā)炎細(xì)胞，并直接刺激滑膜和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)發(fā)炎性細(xì)胞激素、蛋白酶的分泌與自我抗體的生產(chǎn)；而發(fā)炎性細(xì)胞激素在關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)展扮演核心角色，其中腫瘤壞死因子(TNF-α)可透過(guò)刺激前列腺素E(prostaglandinE)，膠原酶(collagenase)生成，誘導(dǎo)其他親炎癥分子如白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)與細(xì)胞白介素-6(IL-6)的分泌，腫瘤壞死因子與IL-1可刺激matrixmetalloproteinase的分泌，以及對(duì)軟骨內(nèi)多種組織細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞，滑膜纖維細(xì)胞和破骨細(xì)胞進(jìn)行直接的活化，而IL-6可進(jìn)一步增加關(guān)節(jié)組織中的發(fā)炎細(xì)胞、刺激破骨細(xì)胞增生并加強(qiáng)IL-1的作用，由于各親炎癥分子，包含細(xì)胞白介素1(IL-1β)，腫瘤壞死因子，IL-6和IL-17彼此間的串?dāng)_可導(dǎo)致持續(xù)性大規(guī)模的關(guān)節(jié)破壞，并抑制軟骨細(xì)胞代償性合成途徑而阻礙退化組織復(fù)原的完整性，因此現(xiàn)行臨床上除了傳統(tǒng)上免疫抑制劑與非類固醇類抗發(fā)炎治療藥物外，針對(duì)此類發(fā)炎因子或細(xì)胞進(jìn)行專一性拮抗生物制劑的研發(fā)是目前的主流，如TNF-α拮抗劑與IL-6拮抗劑，可減緩或預(yù)防關(guān)節(jié)損傷及維持功能，但需以侵入性方式治療較為不便，且盡管在關(guān)節(jié)炎的治療已經(jīng)取得較多的進(jìn)展，然而更長(zhǎng)期的治療結(jié)果，以及針對(duì)占較大比重的緩解期關(guān)節(jié)炎患者，仍無(wú)可充分控制的藥物，且至少一半患者對(duì)以一個(gè)生物制劑合并傳統(tǒng)關(guān)節(jié)炎藥物的治療組合已失去療效，因此開(kāi)發(fā)方便、安全性高且有效的治療藥物是十分重要的。到手香(Plectranthusamboinicus(Lour.)Spreng)，別名：藿香、左手香、印度薄荷、過(guò)手香、到手香。屬唇形花科多年生草本，主要產(chǎn)于馬來(lái)西亞、巴西、中國(guó)和印度。其葉肥厚脆嫩，對(duì)生，廣卵形，先端純圓或銳，齒狀緣有點(diǎn)上卷。到手香株高約15～30公分，全株密被細(xì)毛，具強(qiáng)烈特殊辛香味，是一種好的中藥材，根據(jù)古籍記載，到手香有預(yù)防感冒的功效、增強(qiáng)身體抵抗力功能。也能降低耳朵紅腫、發(fā)炎、發(fā)熱現(xiàn)象。作為中藥稱可消炎、祛風(fēng)、解毒，舒緩感冒發(fā)燒、扁桃腺炎、喉嚨發(fā)炎、肺炎、寒熱、頭痛、胸腹?jié)M悶、嘔吐瀉泄、胃弱、脾虛寒等現(xiàn)象。對(duì)新鮮到手香汁液對(duì)于擦傷、刀傷、燒燙傷、蚊蟲(chóng)咬傷、無(wú)名腫痛、疔瘡、耳朵發(fā)炎、喉嚨痛、腫毒、跌打損傷等有效。對(duì)皮膚也有相當(dāng)大殺菌效果，像是脂漏性皮膚炎、濕疹、粉刺、過(guò)敏、皮膚干裂、頭皮的毛囊炎、美白皮膚、消除疲勞、去除各種皮膚癬。有關(guān)到手香萃取物，中國(guó)臺(tái)灣專利申請(qǐng)案第092135016號(hào)曾公開(kāi)到手香萃取物制備方法，該方法主要包含下列步驟：(a)壓榨到手香葉片取其汁液；(b)加入醇至步驟(a)的汁液中，使最后醇濃度為70至80％，并于低溫下靜置；(c)調(diào)整步驟(b)中含醇汁液的pH值為5.0至7.0，并于低溫下靜置；(d)過(guò)濾去除步驟(c)中含醇汁液的雜質(zhì)；(e)蒸餾濃縮步驟(d)中已去除雜質(zhì)的含醇汁液，收集蒸餾液，并調(diào)整蒸餾液的pH值為5.0至7.0；及(f)真空過(guò)濾步驟(e)中的蒸餾液，以獲得茶褐色澄清的到手香萃取液。而中國(guó)臺(tái)灣專利申請(qǐng)案第093134346號(hào)則公開(kāi)到手香葉汁經(jīng)水萃取后取分子量大于50kD的到手香葉汁組分，其具有治療癌癥及/或腫瘤的功效。中國(guó)臺(tái)灣專利申請(qǐng)案第086118191號(hào)公開(kāi)一種到手香或藿香的水性萃取物，是在90.5％乙醇，4.5％甲醇及5.0％異丙醇所組成的試劑乙醇下沖提所得的萃取物，具有預(yù)防及治療流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)的效果。此外，中國(guó)臺(tái)灣專利申請(qǐng)案第096145943號(hào)，即第I335225號(hào)發(fā)明專利，則公開(kāi)一種使用與特定處理組合的固液分離法制備到手香萃取物，該到手香萃取物具有治療皮膚病癥及促進(jìn)傷口愈合的效果，尤其可促進(jìn)糖尿病患者傷口愈合。此案發(fā)明特征在于使用固液分離(攪拌分離)與特定處理的組合，包含將吸附樹(shù)脂(如DIAION)于左手香萃取物中攪拌，且利用不同溶劑藉由分別分離步驟將左手香萃取物中的不同部分分離。又，中國(guó)臺(tái)灣專利申請(qǐng)案第095134243號(hào)，即第I320714號(hào)發(fā)明專利，則公開(kāi)一種到手香的水萃取物，其具有治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的用途。該萃取物以適量高極性溶劑浸泡，過(guò)濾后，再以減壓旋轉(zhuǎn)濃縮儀濃縮；以溶劑稀釋后視需要，可連續(xù)以四種溶劑極性由高至低，從高極性溶劑至低極性溶劑等分四段不同極性(分別稱為高極性溶劑、次高極性溶劑、中極性溶劑、低極性溶劑)的溶液以管柱進(jìn)行沖提分離。針對(duì)不同萃取方式而得到不同功效的到手香萃取物，仍有開(kāi)發(fā)的空間。附圖說(shuō)明圖1為ON-024的HPLC圖，在200nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間13、20、21、27、37、39分鐘有6個(gè)吸收峰。圖2為ON-024的HPLC圖，在320nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間13分鐘有咖啡酸(Caffeicacid)吸收峰；27分鐘有迷迭香酸(Rosmarinicacid)吸收峰；35分鐘有吸收峰。圖3為ON-025的HPLC圖，在200nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間45分鐘有吸收峰；55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰。圖4為ON-025的HPLC圖，在320nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間39-43分鐘有8個(gè)吸收峰；45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰。圖5為ON-066的HPLC圖，在200nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰。圖6為ON-066的HPLC圖，在320nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；62分鐘有三裂鼠尾草素(Salvigenin)吸收峰。圖7為ON-080的HPLC圖，在200nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰。圖8為ON-080的HPLC圖，在320nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間18-21分鐘有3個(gè)吸收峰；37-41分鐘有3個(gè)吸收峰；43-45分鐘有2個(gè)吸收峰；45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；50-54分鐘有4個(gè)吸收峰；62分鐘有三裂鼠尾草素(Salvigenin)吸收峰。具體實(shí)施方式不同于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明涉及一種富含抗關(guān)節(jié)炎活性的到手香精萃取物，該精萃取物的特征在于以50％～95％的醇類溶液沖提或以正相層析萃取粗萃取物而得，其與公知的到手香萃取物不同，富含抗關(guān)節(jié)炎活性，可用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎。因此，本發(fā)明一方面提供一種富含抗關(guān)節(jié)炎活性的到手香精萃取物，其特征在于320nm波長(zhǎng)檢測(cè)，于45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰。本發(fā)明的實(shí)施例，該富含抗關(guān)節(jié)炎活性的到手香精萃取物，其特征在以50％～95％醇類溶液沖提到手香粗萃取物而得，較佳為70％～95％醇類溶液沖提，尤佳為95％醇類溶液沖提。該醇類溶液為乙醇。本發(fā)明的另一實(shí)施例，該富含抗關(guān)節(jié)炎活性的到手香精萃取物，其特征在于以正相層析萃取粗萃取物而得，以己烷(Hexane)為溶劑沖提，再以己烷/乙酸乙酯為溶劑沖提。另一方面，本發(fā)明提供一種制備富含抗關(guān)節(jié)炎活性的到手香精萃取物的方法，其包含將到手香植株或干燥藥材，經(jīng)溶劑萃取粗萃取物，再將該粗萃取物進(jìn)行層析分離粗萃取物以50％～95％醇類溶液沖提分離出富含抗關(guān)節(jié)炎活性的精萃取物。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，其中較佳以70％～95％醇類溶液沖提分離出富含抗關(guān)節(jié)炎活性的精萃取物，尤以約95％醇類溶液為更佳。再一方面，本發(fā)明提供一種制備富含抗關(guān)節(jié)炎活性的到手香精萃取物的方法，其包含將到手香植株或干燥藥材，經(jīng)溶劑萃取粗萃取物，再將該粗萃取物進(jìn)行正相層析分離粗萃取物，以己烷為溶劑沖提，然后以己烷/乙酸乙酯為溶劑沖提分離出富含抗關(guān)節(jié)炎活性的精萃取物。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，其中再以乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇、及/或甲醇為溶劑，沖提分離出富含抗關(guān)節(jié)炎活性的精萃取物。又一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)防或治療關(guān)節(jié)炎的組合物或方法，其包含使用本發(fā)明富含抗關(guān)節(jié)炎活性的到手香精萃取物。再一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)防或治療關(guān)節(jié)炎的醫(yī)藥組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明富含抗關(guān)節(jié)炎活性的到手香精萃取物以及一種醫(yī)藥上可接受的載劑。又再一方面，本發(fā)明提供一種治療發(fā)炎的組合物或醫(yī)藥組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明到手香精萃取物。除非另有定義，此處所有使用的技術(shù)及科學(xué)名詞具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員所一般性了解者相同的含意。本說(shuō)明書(shū)所使用的冠詞“一”或“該”，除非內(nèi)文另有清楚指明，皆指該冠詞的一或一個(gè)以上(即，至少一個(gè))的受體。舉例而言，“一樣本”是包括多個(gè)此類本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員所知的樣本及其等效物。本說(shuō)明書(shū)中所使用的“受體”一詞是指接受處理的動(dòng)物或人類。本說(shuō)明書(shū)所使用的“預(yù)防”一詞指如受體發(fā)病前預(yù)先處理可避免產(chǎn)生該病癥。而“治療”一詞則是指受體經(jīng)處理后病癥有改善的效果。本說(shuō)明書(shū)所使用的“治療有效量”一詞是指用于治療的物質(zhì)可提供治療功效的量。本發(fā)明提供一種富含抗關(guān)節(jié)炎活性的到手香精萃取物，該精萃取物的特征在于320nm波長(zhǎng)檢測(cè)，于45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰?？梢?0％～95％的醇類溶液沖提或以正相層析萃取粗萃取物而得，其與公知的到手香萃取物不同，富含抗關(guān)節(jié)炎活性，可用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎。根據(jù)本發(fā)明，該富含抗關(guān)節(jié)炎活性的到手香精萃取物，如以50％～95％乙醇溶液如應(yīng)沖提分離制得，其HPLC圖于200nm波長(zhǎng)檢測(cè)，在滯留時(shí)間45分鐘有吸收峰；55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰，如圖3；于320nm波長(zhǎng)檢測(cè)，在滯留時(shí)間39-43分鐘有8個(gè)吸收峰；45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰，如圖4。根據(jù)本發(fā)明，該富含抗關(guān)節(jié)炎活性的到手香精萃取物，如以70％～95％乙醇溶液如應(yīng)沖提分離制得，其HPLC圖在200nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰，如圖5；在320nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；62分鐘有三裂鼠尾草素(Salvigenin)吸收峰，如圖6。根據(jù)本發(fā)明，該富含抗關(guān)節(jié)炎活性的到手香精萃取物，如以正相層析法制得，其HPLC圖在200nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰，如圖7；其在320nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間18-21分鐘有3個(gè)吸收峰；37-41分鐘有3個(gè)吸收峰；43-45分鐘有2個(gè)吸收峰；45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；50-54分鐘有4個(gè)吸收峰；62分鐘有三裂鼠尾草素(Salvigenin)吸收峰，如圖8。本發(fā)明中，利用進(jìn)一步層析分離得到富含抗關(guān)節(jié)炎活性的到手香精萃取物。主要包含下列步驟：將到手香植株或干燥藥材，經(jīng)溶劑萃取得粗萃取物，再將該粗萃取物以50％～95％醇類溶液層析沖提分離出富含抗關(guān)節(jié)炎活性的精萃取物。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，其中較佳以70％～95％醇類溶液沖提，尤以約95％醇類溶液為更佳。根據(jù)本發(fā)明，其中用以沖提的醇類溶液可為甲醇、乙醇。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，尤以乙醇溶液為佳。本發(fā)明也提供另一種制備富含抗關(guān)節(jié)炎活性的到手香精萃取物的方法，其包含將到手香植株或干燥藥材，經(jīng)溶劑萃取粗萃取物，再將該粗萃取物進(jìn)行正相層析，先以己烷沖提，然后以己烷/乙酸乙酯沖提分離出富含抗關(guān)節(jié)炎活性的精萃取物。根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施例中，己烷/乙酸乙酯溶液中己烷與乙酸乙酯的比例為1∶1。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，其中再以乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇、及/或甲醇為溶劑，沖提分離出富含抗關(guān)節(jié)炎活性的精萃取物。根據(jù)本發(fā)明，萃取前該到手香可為任何形式的材料，包括但不限于新鮮植株或干燥藥材。以粉末形式進(jìn)行萃取效果尤佳。粗萃方法可以任何公知的方法進(jìn)行，例如，以溶劑萃取，包括但不限于以醇類溶液粗萃。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，為使用約95％乙醇溶液粗萃。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，可包含先以約95％乙醇溶液粗萃，合并粗萃液再以管柱層析法于70％～95％乙醇溶液下沖提分離出富含抗關(guān)節(jié)炎活性的精萃取物。根據(jù)本發(fā)明的又一具體實(shí)施例，可包含先以約95％乙醇溶液粗萃，合并粗萃液再將該粗萃取物進(jìn)行正相層析，先以己烷沖提，再以己烷/乙酸乙酯沖提分離出富含抗關(guān)節(jié)炎活性的精萃取物。根據(jù)本發(fā)明，另可搭配其他適當(dāng)?shù)臐饪s、純化方法，例如干燥濃縮、減壓濃縮、冷凍干燥等進(jìn)行萃取及純化。根據(jù)本發(fā)明，以本發(fā)明到手香精萃取物進(jìn)行針對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明到手香精萃取物富含抗關(guān)節(jié)炎的活性。因此，本發(fā)明同時(shí)提供一種預(yù)防或治療關(guān)節(jié)炎的組合物。本發(fā)明也提供一種預(yù)防或治療關(guān)節(jié)炎的醫(yī)藥組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明富含抗關(guān)節(jié)炎活性的精萃取物，以及醫(yī)藥上可接受的載劑。根據(jù)本發(fā)明，在治療關(guān)節(jié)炎醫(yī)藥物組合物中本發(fā)明富含抗關(guān)節(jié)炎活性的精萃取物的治療有效量為0.5-10克/天。根據(jù)本發(fā)明，該醫(yī)藥組合物是包含治療有效量的本發(fā)明富含抗關(guān)節(jié)炎活性的精萃取物，取決于施用的模式及待治療的狀況，包括年齡、體重、癥狀、治療效果、投藥路徑及治療時(shí)間。本說(shuō)明書(shū)所使用的“載劑”或“醫(yī)藥上可接受的載劑”一詞是指用于醫(yī)藥的稀釋劑、賦形劑或類似物，包括制藥業(yè)技術(shù)人員所熟知者?？梢匀魏芜m合的路徑施用本發(fā)明的醫(yī)藥組合物，包括但不限于非經(jīng)腸道或口服投藥。非經(jīng)腸道投藥的醫(yī)藥組合物其形式包括溶液、懸浮液、乳液，及可在使用前刻溶解或懸浮于溶劑中的固體可注射組合物?？山逵扇芙狻腋』蛉榛换蚨嗷钚猿煞钟谙♂寗┲衼?lái)制備該注射液。前述稀釋劑的實(shí)例為用于注射的蒸餾水、生理鹽水、植物油、醇類及其組合。又，該注射液可含有安定劑、助溶劑、懸浮劑、乳化劑、平滑劑、緩沖液、保存劑等。這些注射液在最終制劑步驟中滅菌或以無(wú)菌程序制備。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物也可被制劑成無(wú)菌固體配制品，例如，藉由冷凍干燥，并可在使用前刻滅菌或溶解于無(wú)菌可注射水或其他無(wú)菌稀釋劑。根據(jù)本發(fā)明，該醫(yī)藥組合物也可經(jīng)口投藥，其中該組合物可為固體或液體形式。固體組合物包括錠劑、丸劑、膠囊、分散性粉劑、顆粒及其類似物?？诜M合物也包括漱口藥及舌下片劑。膠囊包括硬膠囊及軟膠囊。在此類口服固體組合物中，一或多活性化合物可自行混合，或與稀釋劑、結(jié)合劑、散解劑、潤(rùn)滑劑、安定劑、助溶劑混合，接著以公知的方法制劑成配制品。當(dāng)需要時(shí)，此等配制品可以涂布劑涂布，或可以兩種或多種涂布層涂布。另一方面，口服液體組合物包括醫(yī)藥上可接受的液態(tài)溶液、懸浮液、乳液、糖漿、藥酒，及類似物。在此類組合物中，一或多活性化合物可被溶解、懸浮或乳化在通用稀釋劑中(如純化水、乙醇或其等的混合物等等)。除了此類稀釋劑，前述組合物也可含有潤(rùn)濕劑、懸浮劑、乳化劑、甜味劑、調(diào)味劑、香料、保存劑及緩沖液及其類似物。在下列具體實(shí)施例中，本發(fā)明將被更具體地描述。值得注意的是，下列所述本發(fā)明的具體實(shí)施例僅用于說(shuō)明，并非為詳列或限定本發(fā)明范圍至所公開(kāi)的特定形式。制備實(shí)施例制備實(shí)施例1(50％～95％乙醇溶液沖提精萃取物)初步萃?。喝⌒枰康牡绞窒愀稍锼幉姆勰?，加入95％乙醇溶液萃??；將過(guò)濾所得藥渣再以95％乙醇溶液進(jìn)行第二次萃取，經(jīng)過(guò)濾將兩次過(guò)濾液合并，進(jìn)行減壓濃縮至剩下原濾液體積的約1/20，得萃取濃縮液準(zhǔn)備進(jìn)行管柱層析分離。管柱層析：將所得萃取濃縮液進(jìn)行管柱層析，層析樹(shù)脂為HP-20。將所得萃取濃縮液加入逆滲透(RO)水，混和均勻后導(dǎo)入管柱中進(jìn)行層析，再以逆滲透水導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液。然后以4倍管柱體積逆滲透水與95％乙醇(體積比1∶1)的溶液導(dǎo)入管柱中沖提，收集沖出液，再進(jìn)行減壓濃縮至少量，冷凍干燥得一到手香精萃取物，編號(hào)為ON-024，作為0％～50％乙醇溶液沖提對(duì)照組。然后以4倍管柱體積95％乙醇溶液導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液，再進(jìn)行減壓濃縮至干燥得到手香進(jìn)一步的精萃取物，編號(hào)為ON-025，即50％～95％乙醇溶液沖提精萃取物。再以乙酸乙酯(EthylAcetate，EA)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液進(jìn)行減壓濃縮至干燥得到手香乙酸乙酯沖提萃取物。制備實(shí)施例2(50％～95％乙醇溶液沖提精萃取物)依制備實(shí)施例1的初步萃取步驟進(jìn)行萃取得萃取濃縮液，準(zhǔn)備進(jìn)行管柱層析。管柱層析：將所得萃取濃縮液進(jìn)行管柱層析，層析樹(shù)脂為HP-20。將所得萃取濃縮液加入其逆滲透(RO)水，混和均勻后導(dǎo)入管柱中進(jìn)行層析，然后以逆滲透水導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液，為到手香水沖提萃取物。然后以2倍管柱體積逆滲透水與95％乙醇(體積比1∶1)的溶液導(dǎo)入管柱中沖提，收集沖出液減壓濃縮至少量，冷凍干燥得到手香精萃取物，編號(hào)為ON-022。然后以2倍管柱體積95％乙醇溶液導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至干燥得到手香進(jìn)一步的精萃取物，編號(hào)為ON-023，即50％～95％乙醇溶液沖提精萃取物。再以乙酸乙酯(EthylAcetate，EA)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至干燥得到手香乙酸乙酯沖提萃取物。制備實(shí)施例3(70％～95％乙醇溶液沖提精萃取物)依制備實(shí)施例1的初步萃取步驟進(jìn)行萃取得萃取濃縮液，準(zhǔn)備進(jìn)行管柱層析。管柱層析：將所得萃取濃縮液進(jìn)行管柱層析，層析樹(shù)脂為HP-20。將所得萃取濃縮液加入逆滲透(RO)水，混和均勻后導(dǎo)入管柱中進(jìn)行層析，然后以逆滲透水導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液。再以逆滲透水與95％乙醇(體積比3∶7)的溶液導(dǎo)入管柱中沖提，收集沖出液再進(jìn)行減壓濃縮至少量，冷凍干燥得一到手香精萃取物，編號(hào)為ON-065。之后以95％乙醇溶液導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液，再進(jìn)行減壓濃縮至干燥得一到手香進(jìn)一步精萃取物，編號(hào)為ON-066，即70％～95％乙醇溶液沖提精萃取物。再以乙酸乙酯(EthylAcetate，EA)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液進(jìn)行減壓濃縮至干燥為到手香乙酸乙酯沖提萃取物。制備實(shí)施例4(正相層析精萃取物)初步萃?。喝⌒枰康牡绞窒愀稍锼幉姆勰?，加入95％乙醇溶液萃??；將過(guò)濾所得藥渣再以95％乙醇溶液進(jìn)行第二次萃取，經(jīng)過(guò)濾將兩次過(guò)濾液合并，進(jìn)行減壓濃縮至少量，得萃取濃縮液，加入硅膠(SilicaGel)，經(jīng)減壓濃縮至干燥得粗萃取物，使該粗萃取物均勻吸附在膠體上。管柱層析：取與原取用藥材重量相同的硅膠，以己烷(Hexane)充填于管柱內(nèi)，將所得吸附該粗萃取物的膠體覆蓋在充填好的管柱內(nèi)膠體上，己烷導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液進(jìn)行減壓濃縮至干燥得到手香精萃取物，編號(hào)為ON-078。然后以己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比1∶1)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至干燥得到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號(hào)為ON-079。然后以乙酸乙酯(EA)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至干燥得到手香進(jìn)一步的精萃取物，編號(hào)為ON-083。然后以乙酸乙酯(EA)/甲醇(Methanol，MeOH)溶液(體積比1∶1)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液再減壓濃縮至干燥得手香乙酸乙酯/甲醇沖提萃取物，編號(hào)為ON-084。然后以甲醇(MeOH)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液再以減壓濃縮至干燥得手香進(jìn)一步甲醇沖提萃取物，編號(hào)為ON-085。制備實(shí)施例5(正相層析精萃取物)根據(jù)制備實(shí)施例4的萃取步驟進(jìn)行萃取得粗萃取物，并使該粗萃取物均勻吸附在膠體上，準(zhǔn)備進(jìn)行管柱層析。管柱層析：取與原取用藥材重量相同的硅膠，以己烷(Hexane)充填于管柱內(nèi)，將所得吸附該粗萃取物的膠體覆蓋在充填好的管柱內(nèi)膠體上，己烷導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至干燥得到手香萃取物，編號(hào)為ON-078。然后以2倍管柱體積己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比1∶1)導(dǎo)入管柱沖提2倍的管柱體積，收集沖出液以減壓濃縮至干燥得到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號(hào)為ON-080。然后以4倍管柱體積己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比1∶1)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至干燥得到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號(hào)為ON-092。然后以乙酸乙酯(EA)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至干燥得到手香進(jìn)一步的精萃取物，編號(hào)為ON-083。制備實(shí)施例6(正相層析精萃取物)依制備實(shí)施例4的萃取步驟進(jìn)行萃取得粗萃取物，并使該粗萃取物均勻吸附在膠體上，準(zhǔn)備進(jìn)行管柱層析。管柱層析：取與原取用藥材重量相同的硅膠，以己烷(Hexane)充填于管柱內(nèi)，將所得吸附該粗萃取物的膠體覆蓋在充填好的管柱內(nèi)膠體上，己烷導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液進(jìn)行減壓濃縮至干燥得到手香精萃取物，編號(hào)為ON-078。然后以2倍管柱體積己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比1∶1)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液再減壓濃縮至干得到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號(hào)為ON-080。然后以2倍管柱體積己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比1∶1)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至干燥得一到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號(hào)為ON-081。然后以2倍管柱體積己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比1∶1)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至干得到手香進(jìn)一步的精萃取物，編號(hào)為ON-082。然后以乙酸乙酯(EA)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至干燥得到手香進(jìn)一步的精萃取物，編號(hào)為ON-083。然后以乙酸乙酯(EA)/甲醇(Methanol，MeOH)溶液(體積比1∶1)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至干燥得到手香乙酸乙酯/甲醇沖提萃取物，編號(hào)為ON-084。然后以甲醇(MeOH)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至干燥得一到手香精萃取物，編號(hào)為ON-085。制備實(shí)施例7(正相層析精萃取物)依制備實(shí)施例4的萃取步驟進(jìn)行萃取得粗萃取物，并使該粗萃取物均勻吸附在膠體上，準(zhǔn)備進(jìn)行管柱層析。管柱層析：取與原取用藥材重量相同的硅膠，以己烷(Hexane)充填于管柱內(nèi)，將所得吸附該粗萃取物的膠體覆蓋在充填好的管柱內(nèi)膠體上，己烷導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液進(jìn)行減壓濃縮至干燥得到手香精萃取物，編號(hào)為ON-078。然后以己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比9∶1)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液再減壓濃縮至干得到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號(hào)為ON-086。制備實(shí)施例8(正相層析精萃取物)根據(jù)制備實(shí)施例4的萃取步驟進(jìn)行萃取得粗萃取物，并使該粗萃取物均勻吸附在膠體上，準(zhǔn)備進(jìn)行管柱層析。管柱層析：取與原取用藥材重量相同的硅膠，以己烷(Hexane)充填于管柱內(nèi)，將所得吸附該粗萃取物的膠體覆蓋在充填好的管柱內(nèi)膠體上，己烷導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液進(jìn)行減壓濃縮至干燥得到手香精萃取物，編號(hào)為ON-078。然后以己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比8∶2)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液再減壓濃縮至干得到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號(hào)為ON-087。然后以己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比1∶1)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至干燥得到手香進(jìn)一步的精萃取物，編號(hào)為ON-088。制備實(shí)施例9(正相層析精萃取物)根據(jù)制備實(shí)施例4的萃取步驟進(jìn)行萃取得粗萃取物，并使該粗萃取物均勻吸附在膠體上，準(zhǔn)備進(jìn)行管柱層析。管柱層析：取與原取用藥材重量相同的硅膠，以己烷(Hexane)充填于管柱內(nèi)，將所得吸附該粗萃取物的膠體覆蓋在充填好的管柱內(nèi)膠體上，己烷導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液進(jìn)行減壓濃縮至干燥得到手香精萃取物，編號(hào)為ON-078。然后以己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比7∶3)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至干燥得到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號(hào)為ON-089。然后以己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比1∶1)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至干燥得到手香進(jìn)一步精萃取物，編號(hào)為ON-090。制備實(shí)施例10(正相層析精萃取物)依制備實(shí)施例4的萃取步驟進(jìn)行萃取得粗萃取物，并使該粗萃取物均勻吸附在膠體上，準(zhǔn)備進(jìn)行管柱層析。管柱層析：取與原取用藥材重量相同的硅膠，以己烷(Hexane)充填于管柱內(nèi)，將所得吸附該粗萃取物的膠體覆蓋在充填好的管柱內(nèi)膠體上，己烷導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液進(jìn)行減壓濃縮至干燥得到手香精萃取物，編號(hào)為ON-078。然后以己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比6∶4)導(dǎo)入管柱沖提，收集沖出液再減壓濃縮至干得到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號(hào)為ON-091。分別針對(duì)ON-024(0％～50％乙醇溶液沖提精萃取物)、ON-025(50％～95％乙醇溶液沖提精萃取物)、ON-066(70％～95％乙醇溶液沖提精萃取物)及ON-080(正相層析精萃取物)進(jìn)行HPLC分析，在200nm及320nm波長(zhǎng)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ON-024的HPLC圖與本發(fā)明精萃取物ON-025(50％～95％乙醇溶液沖提精萃取物)、ON-066(70％～95％乙醇溶液沖提精萃取物)及ON-080(正相層析精萃取物)不同：(1)ON-024的HPLC圖，在200nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間13、20、21、27、37、39分鐘有6個(gè)吸收峰(圖1)；ON-024的HPLC圖，在320nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間13分鐘有咖啡酸(Caffeicacid)吸收峰；27分鐘有迷迭香酸(Rosmarinicacid)吸收峰；35分鐘有吸收峰(圖2)。(2)ON-025的HPLC圖，在200nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間45分鐘有吸收峰；55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰(圖3)；ON-025的HPLC圖，在320nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間39-43分鐘有8個(gè)吸收峰；45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰(圖4)。(3)ON-066的HPLC圖，在200nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰(圖5)；ON-066HPLC圖，在320nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；62分鐘有三裂鼠尾草素(Salvigenin)吸收峰(圖6)。(4)ON-080的HPLC圖，在200nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰(圖7)；ON-080的HPLC圖，在320nm波長(zhǎng)檢測(cè)在滯留時(shí)間18-21分鐘有3個(gè)吸收峰；37-41分鐘有3個(gè)吸收峰；43-45分鐘有2個(gè)吸收峰；45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；50-54分鐘有4個(gè)吸收峰；62分鐘有三裂鼠尾草素(Salvigenin)吸收峰(圖8)。功效實(shí)施例功效實(shí)施例11.以完全弗氏佐劑(CFA)引發(fā)關(guān)節(jié)炎(arthritis)動(dòng)物模式實(shí)驗(yàn)將每組6只重量170±10克的雌性Lewis大鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。完全弗氏佐劑(CFA)，其為0.3mg的殺死結(jié)丁酸核分枝桿菌(Mycobacteriumbutyricum)溶于0.1mL植物油的均勻分散液，將CFA以單一劑量注射于大鼠右后腳掌副跖部位(定為第1天)，注射后1小時(shí)再分別以載劑(1％羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose)，10mL/kg)即對(duì)照組，或本發(fā)明萃取物以500mg/kg劑量灌食(PO)方式給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物服用，每天2次連續(xù)5天(bidx5)。在第0天(CFA處理前)及第14、18及21天以體積量測(cè)器(plethysmometer)量測(cè)每只動(dòng)物的左后腳掌體積，每一處理組動(dòng)物與載劑處理對(duì)照組相比計(jì)算腫脹程度(netswelling)，以抑制百分比(inhibition％)表示。如相對(duì)于載劑處理對(duì)照組，處理的萃取物抑制腳掌體積腫脹達(dá)30％或以上者，表示其具顯著的抗關(guān)節(jié)炎活性。將經(jīng)上述處理的實(shí)驗(yàn)老鼠，分別根據(jù)下表1所載劑量喂食本發(fā)明精萃取物500mg/kg，所得結(jié)果如下：表1相對(duì)于載劑對(duì)照組的抑制活性*顯示具有顯著的抗關(guān)節(jié)炎活性由表1結(jié)果可知，本發(fā)明精萃取物富含抗關(guān)節(jié)炎活性，尤其精萃取物樣品ON-023，ON-025，ON-066及ON-080具顯著的抗關(guān)節(jié)炎活性。2.抗發(fā)炎活性實(shí)驗(yàn)(A)細(xì)胞培養(yǎng)自健康成人捐贈(zèng)者的血液，以Ficoll-Paque(FP)梯度分離器分離得外圍血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMCs)。該血液加以稀釋置于Ficoll-Paque(FP)梯度分離器(AmershamBiosciences)頂部，室溫下以600g離心30分鐘。分離出含PBMC相并以磷酸緩沖食鹽水加以清洗細(xì)胞。隨之將這些細(xì)胞重新懸浮于含10％熱去活性的胎牛血清(FCS)并種植于96-孔組織培養(yǎng)盤(pán)，每孔細(xì)胞密度為2.0x105細(xì)胞，供評(píng)估其抗發(fā)炎功效。(B)本發(fā)明到手香精萃取物與公知的到手香萃取物對(duì)于PHA引發(fā)PBMC增生的抑制功效將人類PBMCs與最終濃度5μg/mLPHA以及各種形式的到手香萃取物(最終濃度0～90μg/mL)共同培養(yǎng)3天，PHA(5μg/mL)刺激前以Dexamethasone處理PBMCs，保留作為藥物正對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)物于37℃含5％CO2的濕潤(rùn)大氣中培養(yǎng)3天，使用噻唑藍(lán)(methylthiazolyltetrazolium，MTT)分析PBMC增生效果。未以PHA處理的PBMCs做為負(fù)對(duì)照組。使用光電比色計(jì)在540nm波長(zhǎng)下量測(cè)各孔內(nèi)容物的吸光值。顏色強(qiáng)度會(huì)隨細(xì)胞增生程度成正比，因而可計(jì)算抑制活性而以IC50濃度表示。本實(shí)驗(yàn)為三重復(fù)且數(shù)據(jù)以三重復(fù)的平均值±SEM表示。(C)細(xì)胞激素的產(chǎn)生及測(cè)量3天培養(yǎng)后的最后一天，收集細(xì)胞懸浮液并分裝儲(chǔ)存于-20℃直到分析。在細(xì)胞懸浮液中產(chǎn)生腫瘤壞死因子TNF-α，細(xì)胞白介素IL-6，IFN-γ及IL-5的量依使用說(shuō)明書(shū)指示以QuantikineELISAkits(R&DSystems，Minneapolis，MN)測(cè)量。結(jié)果(A)各種萃取物對(duì)于PHA引發(fā)PBMCs增生的抑制作用使用PHA引發(fā)PBMCs增生技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)各種萃取物的抗發(fā)炎功效。各種方法所得的到手香萃取物均可依劑量反應(yīng)抑制PHA引發(fā)淋巴白血球的增生。以含或不含到手香萃取物的MTT讀數(shù)(不含PHA)來(lái)評(píng)估待測(cè)物的細(xì)胞毒性。其中ON-023(40μg/mL)對(duì)PHA引發(fā)淋巴白血球的增生具完全的抑制活性，未見(jiàn)細(xì)胞毒性。相反的，ON-022(40μg/mL)對(duì)PHA引發(fā)淋巴白血球的增生僅具部分的抑制活性(～50％)。也就是，ON-023具有較ON-022高的抑制活性，且不具細(xì)胞毒性。(B)各種萃取物對(duì)于PHA引發(fā)細(xì)胞激素產(chǎn)生的抑制作用自發(fā)性及PHA刺激細(xì)胞激素自PBMCs培養(yǎng)物中釋出的結(jié)果顯示于表2。而各種到手香萃取物對(duì)自人類PBMCs培養(yǎng)物PHA引發(fā)細(xì)胞激素釋出的作用如表3～表6所示，以及對(duì)PHA引發(fā)人類PBMCs增生的作用及IC50則顯示于表7及表8。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知到手香的萃取物具有抗發(fā)炎的效果。表2PHA刺激人類PBMCs釋出TNF-α，IL-6，IFN-及IL-5等細(xì)胞激素的作用表3各種到手香萃取物抑制PHA刺激人類PBMCs釋出TNF-α(pg/mL)的作用表4各種到手香萃取物抑制PHA刺激人類PBMCs釋出IL-6(pg/mL)的作用表5各種到手香萃取物抑制PHA刺激人類PBMCs釋出IFN-γ(pg/mL)的作用表6各種到手香萃取物抑制PHA刺激人類PBMCs釋出IL-5(pg/mL)的作用表7各種到手香萃取物對(duì)PHA引發(fā)人類PBMCs增生的抑制作用(以MTT檢測(cè))表8各種到手香萃取物的抗發(fā)炎活性(數(shù)據(jù)以MTT檢測(cè)PHA引發(fā)PBMC增生計(jì)算的IC50濃度呈現(xiàn))樣本IC50(ug/ml)ON-02236.1ON-02311.6ON-02422.2ON-02521.5ON-06515.5ON-0666.1ON-078＞50ON-079＜5.6ON-08011.6ON-08140.7ON-0828.5ON-083＞55.5ON-084＞55.5ON-085＞55.5ON-08632ON-0877.1ON-08839.3ON-08914.2ON-09027.7ON-09112.3