專利名稱：具有抑制成纖維細胞生長因子受體3活性的多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術領域，涉及ー種活性多肽及其在制藥領域的應用。
背景技術：
成纖維細胞生長因子受體(fibroblastgrowth factor receptor, FGFR)是 ー類具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受體，與其相應配體成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)結合,在組織器官發(fā)育及損傷修復過程中發(fā)揮重要作用。目前已發(fā)現4種FGFR，即FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4。其中，FGFR3是介導軟骨內骨化的負性調節(jié)分子，在骨骼發(fā)育中具有重要作用。既往研究顯示，FGFR3功能獲得型基因突變會導致骨骺生長板中軟骨細胞的増殖和分化受到抑制，引起多種骨骼發(fā)育缺陷性遺傳疾病，如軟骨發(fā)育不全(ACH)、季肋發(fā)育不全(HCH)和致死性骨發(fā)育不全(TD)等；而FGFR3功能缺失型基因突變會導致骨骺生長板閉合延遲、肥大軟骨區(qū)增寬和長骨過度生長等。目前雖已發(fā)現23種FGF，但至今未見僅與FGFR3特異性結合的FGF。因多肽具有分子量小、空間結構簡單、免疫原性低等優(yōu)點，故開發(fā)能與FGFR3特異性結合并抑制其活性的多肽有著良好的應用前景，有望開發(fā)成為抗FGFR3功能增強型疾病的藥物。

發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之ー在于提供一種能夠與FGFR3特異性結合并抑制其活性的多肽；目的之ニ在于提供該多肽在制藥領域中的應用。為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案
I、具有抑制FGFR3活性的多肽，由Thr-Leu-Gly-Gln-Leu-Leu (TLGQLL)所示的氨基酸序列組成。2、具有抑制FGFR3活性的多肽在制備預防和/或治療FGFR3功能增強型疾病的藥物中的應用。進ー步，所述FGFR3功能增強型疾病為ACH和TD。本發(fā)明的有益效果在干本發(fā)明多肽可以與FGFR3胞外段特異性結合，并對其活性有明顯的抑制作用，且具有分子量小、制備簡單、質量易控、免疫原性低等優(yōu)點，可以制成預防和治療FGFR3功能增強型疾病的藥物，在致死性骨發(fā)育不全、軟骨發(fā)育不全等FGFR3功能增強型疾病的預防和治療方面具有潛在良好的應用前景。


圖I顯示ELISA法檢測不同濃度的多肽Corel與FGFR3胞外段的結合情況，其中林*表示與空白對照組相比ρ〈0· 001。圖2顯示Western blot法檢測多肽Corel處理ATDC5細胞5、10、30、45、60分鐘后ERK磷酸化水平的變化。
圖3顯示Western blot法檢測多肽Corel處理ATDC5細胞5、10、30、45、60分鐘后p38磷酸化水平的變化。圖4顯示Western blot法檢測多肽Corel處理ATDC5細胞5、10、30、45、60分鐘后Jnk磷酸化水平的變化。圖5顯示MTT法檢測不同濃度的多肽Corel處理ATDC5細胞24小時后的細胞增殖情況，其中*表示與空白對照組相比Pく 0. 05。 圖6顯示多肽Corel對體外培養(yǎng)的ACH模型小鼠骨骼生長的作用，其中A為體外培養(yǎng)7天的跖骨照片，B為體外培養(yǎng)7天的跖骨的長度增加百分率，Blank為正常小鼠C57BL/6對照組，ACH為ACH模型小鼠對照組，ACH+Corel為ACH模型小鼠Corel處理組；*表示與正常小鼠C57BL/6對照組相比p〈0. 05，**表示與正常小鼠C57BL/6對照組相比p〈0. 01,##表示與ACH模型小鼠對照組相比p〈0. 01。圖7顯示注射多肽Corel對TD模型小鼠存活的作用，其中TDII Corel(-)為TD模型小鼠對照組，TDII Corel (+)為TD模型小鼠Corel處理組，WT為EIIa-Cre小鼠對照組。圖8顯示注射多肽Corel對TD模型小鼠肺泡的作用，其中TDII Corel (-)為TD模型小鼠對照組，TDII Corel (+)為TD模型小鼠Corel處理組，WT為EIIa-Cre小鼠對照組。圖9顯示注射多肽Corel對TD模型小鼠脛骨的作用，其中TDII Corel(-)為TD模型小鼠對照組，TDII Corel (+)為TD模型小鼠Corel處理組，WT為EIIa-Cre小鼠對照組。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合附圖對本發(fā)明進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、多肽corel的合成
委托上海華大天源生物技術公司采用標準Fmoc方案固相合成氨基酸序列為Thr-Leu-Gly-Gln-Leu-Leu (TLGQLL, SEQ ID No. I)的多肽，將該多肽命名為Corel。合成多肽純度高于95%，置溫度-70°C保存。ニ、ELISA法檢測多肽Corel與FGFR3胞外段的結合
采用間接ELISA法，在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入濃度分別為1、10、100、1000 μ M的多肽Corel溶液100 μ L，同時設置空白對照組(以制備多肽Corel溶液的溶劑替代多肽Corel溶液)，溫度4°C包被過夜，棄去包被液，滿孔加入濃度為50g/L的小牛血清溶液(以pH7. 4的PBS為溶劑)，溫度37°C封閉40分鐘，棄去封閉液，用PBST(含有濃度為0. 5mL/L的吐溫-20的PBS，pH7. 4)洗滌3次，加入濃度為100 μ g/mL的FGFR3胞外段溶液30 μ L和ρΗ7· 4的PBS 70yL，溫度37°C孵育I小時，用PBST洗滌3次，加入按I : 500稀釋的鼠抗FGFR3胞外段抗體(美國Sigma公司，以質量分數為1%的牛血清白蛋白溶液為稀釋溶剤)100μ L，溫度37°C孵育I小時，棄去ー抗溶液，用PBST洗滌5次，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG (中杉金橋生物試劑公司)100μ L，溫度37°C孵育30分鐘，棄去ニ抗溶液，用PBST洗滌5次，加入四甲基聯苯ニ胺-過氧化氫尿素溶液100 μ L，溫度37°C避光顯色10分鐘，加入濃度為2M的硫酸溶液終止反應，在波長450nm處測定0D450值，各組結果以3個復孔的均值表示。結果見圖I，不同濃度的多肽Corel與FGFR3胞外段均有較高的結合率，與空白對照組相比具有極顯著性差異。三、Western blot法檢測多肽Corel對FGFR3主要下游信號通路MAPK中信號分子的激活
目前研究已經明確，促分裂原活化蛋白激酶信號通路MAPK是FGFR3下游最主要的信號通路之一，MAPK的激活情況直接或間接影響細胞的増殖、分化、轉化及凋亡等。在哺乳動物細胞中，目前已發(fā)現存在三條并行的MAPK信號通路，分別為ERK信號通路、p38MAPK信號通路和JNK/SAPK信號通路。同一刺激因素可同時激活多條MAPK信號通路，如應激刺激可同時激活ERK、p38MAPK和JNK/SAPK三條信號通路，而EGF可同時激活ERK及JNK/SAPK ニ條信號通路。并行的MAPK信號通路之間通過復雜的機制既可相互區(qū)別、又能相互調節(jié)。在12孔培養(yǎng)板中，每孔接種1父105個前軟骨細胞4了005 (由美國紐約大學贈送，表達FGFR3)，用含有濃度為50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在溫度為37°C、CO2氣體濃度為50mL/L的條件下培養(yǎng)24小時，待細胞貼壁后，吸除培養(yǎng)基，用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗細胞2次，加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)基lmL，培養(yǎng)24小吋，吸除培養(yǎng)基，再加入含有濃度為50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基和終濃度為10 μ M的多肽Corel，同時設置空白對照組(不加入多肽Core I )，分別處理5、10、30、45、60分鐘，收集細胞，用細胞裂解液吹打裂解細胞，于冰上收集細胞勻漿液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。已測濃度的蛋白樣品加入等體積2X上樣緩沖液，煮沸5分鐘，室溫冷卻后進行SDS-PAGE(采用濃度為50g/L的濃縮膠、濃度為90g/L的分離膠，電泳參數為80V 20分鐘、120V 80分鐘)，電泳結束后，將蛋白電轉印(恒流300mA 60分鐘)至聚偏ニ氟こ烯膜上，用濃度為50g/L的脫脂奶粉溶液(以TBST為溶劑)于室溫下封閉I小時，再加入β -Actin的ー抗(β -actin為內參照)以及P-ERK1/2 (磷酸化ERKl/2)、p-p38 (磷酸化P38)或p-Jnk (磷酸化Jnk)的ー抗，溫度4°C孵育過夜，用TBST洗膜5次，加入辣根過氧化物酶標記ニ抗，溫度37°C孵育I小時，用TBST洗膜5次，顯色，曝光，定影，檢測ERK、P38、Jnk磷酸化水平的變化。結果見圖2 4，多肽Corel對MAPK信號通路中信號分子ERK、p38及Jnk的磷酸化水平均有明顯的抑制作用，提示多肽Corel可能是通過調節(jié)FGFR3下游主要信號通路MAPK來調節(jié)細胞的生理過程。四、MTT法檢測不同濃度的多肽Corel對FGFR3表達細胞增殖的影響
在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種8000個ATDC5細胞，用含有濃度為50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在溫度為37°C、CO2氣體濃度為50mL/L的條件下培養(yǎng)24小時，待細胞貼壁后，吸除培養(yǎng)基，用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗細胞2次，加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)基ImL,培養(yǎng)24小吋，吸除培養(yǎng)基，再加入含有濃度為50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基和終濃度分別為I、5、IO、20、50、100、200 μ M的多肽Cor e I溶液，同時設置空白對照組(不加入多肽Corel)，處理24小時，加入細胞增殖檢測試劑20 μ L，在溫度為37°C、CO2氣體濃度為50mL/L的條件下避光孵育2飛小時，待孔中液體由紫色變?yōu)榉凵螅诓ㄩL490nm處測定0D490值，各組結果以3個復孔的均值表示。結果見圖5，多肽Corel在20 μ Μ、50 μ M濃度下對ATDC5細胞的增殖有顯著的促進作用。五、體外跖骨培養(yǎng)檢測多肽Corel對ACH模型小鼠軟骨生長的作用
采用相對活體小鼠而言簡單可控，相對細胞而言更能模擬體內情況的體外組織培養(yǎng)技術。設置正常小鼠C57BL/6對照組、ACH模型小鼠對照組和ACH模型小鼠Corel處理組，每組樣本數4 6，ACH模型小鼠由第一發(fā)明人在美國NIH建立；在無菌條件下取新生小鼠跖骨，同時剪取胎鼠鼠尾2mm用于胎鼠基因型鑒定，在解剖顯微鏡下機械去除絕大部分軟骨外膜和骨外膜，分離好的跖骨先在解剖顯微鏡下采圖(X 20)，再用無菌PBS漂洗后，浸入含O. 2%牛血清白蛋白、2mM谷氨酸、5(^g/ml維生素C、10mM β -甘油磷酸鈉和抗生素的BGJb培養(yǎng)基中，ACH模型小鼠Corel處理組在BGJb培養(yǎng)基中還加入終濃度為20 μ M的多肽Corel，正常小鼠C57BL/6對照組和ACH模型小鼠對照組均不加入多肽Corel，在溫度為37°C、CO2氣體濃度為50mL/L的條件下孵育，每2天換液，經過7天體外培養(yǎng)，在解剖顯微鏡下采圖(X20),測量骨總長度(TL)，計算長度増加百分率長度增加百分率=(體外培養(yǎng)7天的長度-體外培養(yǎng)O天的長度)/體外培養(yǎng)O天的長度X 100%。結果見圖6，ACH新生鼠跖骨在給予20μΜ多肽Corel處理后，其生長率與 相同培養(yǎng)條件下未給予多肽Corel處理的ACH新生鼠跖骨相比顯著提高。六、體內檢測多肽Corel對FGFR3功能增強所致疾病TD的作用
設置EIIa-Cre小鼠對照組、TD模型小鼠對照組和TD模型小鼠Corel處理組，每組樣本數4 6，EIIa-Cre小鼠和TD模型小鼠均由美國NIH贈送；將Fgfr3+/K644Eneo小鼠與EIIa-Cre小鼠交配，查陰栓當日記為E0. 5，之后第16. 5天(E16. 5)，TD模型小鼠Corel處理組的孕鼠按照100 μ g/kg/day的劑量腹腔注射多肽Corel，TD模型小鼠對照組的孕鼠腹腔注射等量注射用水，觀察小鼠出生后的存活情況，新生小鼠為基因重組的+/K644E小鼠即TDII模型小鼠；存活小鼠取相應時相點的脛骨及內臟，用4%多聚甲醛固定12 16小時后行HE染色。結果見圖疒9，從小鼠存活情況及表型來看，TD模型小鼠對照組新生TDII小鼠出生當日(PO)即出現皮膚青紫，最終缺氧死亡，而TD模型小鼠CoreI處理組新生TDII小鼠出生當日存活，皮膚及皮膚黏膜紅潤，與EIIa-Cre新生小鼠相同，TD模型小鼠Core I處理組I月齡(P30)的TDII小鼠體型較I月齡的EIIa-Cre小鼠明顯偏小，頭顱圓鈍，存活的TDII小鼠從幼年至成年大體均表現出類似ACH小鼠的表型，頭顱圓鈍、四肢短、個體明顯偏小；從肺泡形成數量及形態(tài)來看，TD模型小鼠對照組TDII小鼠的肺泡形成數量較TD模型小鼠Corel處理組和EIIa-Cre小鼠對照組少且肺泡壁變，而TD模型小鼠Corel處理組TDII小鼠的肺泡大小形態(tài)接近正常；從脛骨結構來看，TD模型小鼠對照組TDII小鼠的脛骨生長板結構紊舌し而TD模型小鼠Corel處理組TDII小鼠的脛骨生長板軟骨細胞排列接近正常?；谏鲜鰧嶒灲Y果，可以得出如下結論本發(fā)明的多肽Corel可以與FGFR3胞外段特異性結合，并對其活性有明顯的抑制作用，可以作為活性成分，単獨使用或與其它具有藥理活性的化合物和/或提取物組成復方使用，再與藥學上可接受的載體按照藥學領域的常規(guī)制劑方法制成各種劑型的藥物，用于預防和治療FGFR3功能增強型疾病如致死性骨發(fā)育不全、軟骨發(fā)育不全等。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經對本發(fā)明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權利要求
1.具有抑制成纖維細胞生長因子受體3活性的多肽，由Thr-Leu-Gly-Gln-Leu-Leu所示的氨基酸序列組成。
2.權利要求I所述的具有抑制成纖維細胞生長因子受體3活性的多肽在制備預防和/或治療FGFR3功能增強型疾病的藥物中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述FGFR3功能增強型疾病為軟骨發(fā)育不全和致死性骨發(fā)育不全。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有抑制成纖維細胞生長因子受體3活性的多肽，由Thr-Leu-Gly-Gln-Leu-Leu所示的氨基酸序列組成，該多肽可以與FGFR3胞外段特異性結合，并對其活性有明顯的抑制作用，且具有分子量小、制備簡單、質量易控、免疫原性低等優(yōu)點，可以制成預防和治療FGFR3功能增強型疾病的藥物，在致死性骨發(fā)育不全、軟骨發(fā)育不全等FGFR3功能增強型疾病的預防和治療方面具有潛在良好的應用前景。
文檔編號A61P19/08GK102627686SQ201210117618
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月20日 優(yōu)先權日2012年4月20日
發(fā)明者戚華兵, 杜曉蘭, 楊京, 羅鳳濤, 蘇楠, 謝楊麗, 譚喬燕, 金旻, 陳林 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院