專利名稱：蠐螬總生物堿的制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種蠐螬總生物堿有效部位的提取和制備，及其在制備抗癌藥物中的應用，屬于中藥現(xiàn)代化領域。
背景技術：
擠贈為金龜子科昆蟲朝鮮黑金龜子Holotrichia diomphalia Bates及同屬近緣昆蟲的干燥幼蟲。始載于漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》。歷代典籍中收載的其它別名有乳齊、地蠶、 土蠶、老母蟲、核桃蟲等。蠐螬味咸，微溫，有小毒，歸肝經(jīng)。在中醫(yī)學中則有著悠久的應用歷史，有破血，行瘀，散結(jié)，通乳的作用，可治療折損瘀痛，痛風，破傷風，喉痹，目翳，丹毒，癰疽，痔漏等。蠐螬生活于3 6cm深的土內(nèi)，喜食剛播種的種子、根、塊莖以及幼苗，是世界性的地下害蟲。據(jù)資源調(diào)查顯示，蠐螬在我國分布很廣，主產(chǎn)于江蘇、安徽、四川、河北、山東、 河南和東北等地。從黑龍江起至長江以南地區(qū)以及內(nèi)蒙古、陜西等地均有分布，資源豐富。近年來，隨著人們對天然藥物的研究越來越深入，蠐螬也受到了研究人員的關注。曹蔚等(曹蔚，劉丹，王四旺，等.不同產(chǎn)地蠐螬中蛋白質(zhì)、氨基酸和無機元素分析.中藥材，2010，10(10) =1538-1541)對全國不同產(chǎn)地蠐螬的蛋白質(zhì)、氨基酸和無機元素等含量進行測定。結(jié)果表明不同產(chǎn)地蠐螬中含有的成分有一定差異，蛋白質(zhì)含量為33. 4 44. 4%，江西產(chǎn)蛋白質(zhì)含量最高；各產(chǎn)地蠐螬中均含有17種氨基酸，其中7種為人體必需，含量較高的有谷氨酸(5. 21% 7.03% )、酪氨酸(4. 10% 5. 27% )、天門冬氨酸 (3. 21% 5. 35% )?！吨袊幱美ハx集成》中記載蠐螬含有脂肪、外細胞糖酶，蔗糖酶等多種酶。此外國外文獻報道擠贈含有兩種酹氧化酶原(Propo-Ι和Propo-II),三種酹氧化酶原活化因子(PPAF-I、PPAF-II和PPAF-III)及數(shù)種活性多肽，如脂多糖識別蛋白、抗菌肽 holotricinl III(Kim MS,Baek MH,Lee MH,et al.A new easter-type serine protease cleaves a masquerade-1 ike protein during prophenoloxidase activation in Holotirichia diomphalia larvae. Journal of Biological Chemistry，2002，277(42) 39999-40004)。韓國學者 Piao 等(Piao SF, Kim DK, Park JW, et al. Overexpression and preliminary X-ray crystallographic analysis of prophenoioxidase activating factor II，a clip domain family of serine proteases. Biochimica et Biophysica Acta, 2005,1752 (I) :103-106)還從蠐螬中分離得到了酚氧化酶原活化因子PPAF-II的高純度單晶。張慶鎬等(張慶鎬，樸奎善，李基俊，等.蠐螬礦物元素和維生素含量分析.微量元素與健康研究，2002，19 (I) 30-31)研究發(fā)現(xiàn)蠐螬中Cu、Mn含量非常豐富，Ca、Mg、CiNFe、 Zn含量其次，K/Na的比值也很高；B族維生素的含量較高，維生素A和維生素E的含量也較豐富。金莉莉等從蠐螬石油醚提取物中得到的五個單體化合物，分別鑒定為棕櫚酸，癸酸， 十八烷烯酸，P膽留醇，十六碳烯酸；乙酸乙酯提取物中得到了一個單體化合物鑒定為肉豆蘧酸。Dong 等(Dong Q F，Wang J L，Zhang S F，et al. The fat-soluble constituents of Holotrichia diomphalia larvae. Chemistry of Natural Compounds，2009，45 (4) 530-531)用GC-MS對蠐螬提取物的脂溶性成分分析發(fā)現(xiàn)其中含烯脂酸59. 94%，烷烴酸33. 46%，此外還含有反油酸、十六烷酸、十五酸和硬脂酸。藥理研究發(fā)現(xiàn)蠐螬水浸液I : 10000濃度對兔冠狀血管、離體兔耳血管、蟾蜍肺血管皆有收縮作用；I 1000濃度能興奮離體心臟，濃度更高則導致舒張期停止；I 1000 以上能興奮離體兔子宮，收縮蟾蜍內(nèi)臟血管；I 100能抑制離體兔腸管。大劑量有利尿作用，對血壓無影響。蠐螬提取物可以抑制實驗性家兔脈絡膜新生血管(CNV)中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的表達，從而可以抑制實驗性CNV的形成(陳梅，邱曉星，彭清華，等.蠐螬提取物對兔脈絡膜新生血管VEGF和bFGF表達的影響.國際眼科雜志，2008,8(12) :2443-2448)。近年研究表明，蠐螬提取液具有一定的抗腫瘤活性。崔春愛等(崔春愛，孫抒，楊萬山.蠐螬提取物對人肺癌A549細胞誘導凋亡作用的形態(tài)學觀察.山東醫(yī)藥，2008，48 (27) :7_8)發(fā)現(xiàn)蠐螬石油醚提取物使人肺癌A549細胞核中CyclinDl的表達明顯降低，進而抑制細胞的增殖和凋亡。宋蓮蓮等(宋蓮蓮，孫抒， 李香丹，等.蠐螬石油醚提取物對人宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響.中草藥，2006， 37(6) =488-492)發(fā)現(xiàn)蠐螬石油醚提取物對HeLa細胞具有抑制增殖及誘導凋亡作用。金哲等(金哲，孫抒，李基俊，等.蠐螬提取物體外對人MGC-803胃癌細胞株凋亡相關基因作用的研究.中國中醫(yī)藥科技，2004,11(2) :90-92)研究發(fā)現(xiàn)蠐螬乙酸乙酯提取物在體外對人胃癌MGC-803細胞株有抗增殖及誘導凋亡作用，其誘導腫瘤細胞凋亡的可能機制與調(diào)節(jié)凋亡相關基因bcl-2、bax的表達改變有關。蠐螬體內(nèi)含有多種抗菌肽(Lee SY, Moon HJ, Kurata S，et al. Purification and eDNA cloning of an antifungal protein from the hemolymph of Holotrichia diomphaiia larvae. Biological pharmaceutical bulletin， 1995,18(8) :1049-1052.) o其中holotricin I對革蘭氏陽性菌有很強的抗菌活性，但對革蘭氏陰性菌的抗菌活性不明顯；holotricin II能抑制革蘭陰性菌的生長。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)蠐螬的乙醇和石油醚提取物具有較強的抗真菌活性(Dong QF, Wang JL, Zhang SF, et al. Antifungal activity of crude extracts and fat-soluble constituents of Holotrichia diomphalia larvae. Bioresource Technology，2008，99 (17) :8521-8523)。 蠐螬單味藥作用于由氯仿和β-D-氨基半乳糖誘導的急性肝細胞損傷，可降低小鼠血漿中轉(zhuǎn)氨酶的含量。肝硬化模型小鼠經(jīng)4周蠐螬治療后，血漿中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶以及堿性磷酸酶的活性同時降低；肝臟中羥脯氨酸的含量降低，保肝作用強于水飛薊素(Oh WYiPyo S,Lee KR,et al. Effect of Holotrichia diomphalia larvae on liver fibrosis and hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology，2003，87(2-3) :175-180)。盡管如此，蠐螬化學成分方面的研究較少，更鮮有蠐螬生物堿的報道。我們對蠐螬生物堿的提取分離工藝進行了探索，對蠐螬生物堿的藥理作用進行了進一步研究。首次發(fā)現(xiàn)蠐螬生物堿具有抗腫瘤的藥理作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蠐螬總生物堿及其制備方法。本發(fā)明的另一個目的是提供該蠐螬總生物堿在制備具有抗癌活性藥物的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案一種蠐螬總生物堿的制備方法，包括以下步驟(I)乙醇提取將蠐螬粉碎成粗粉，用50 95%乙醇浸泡12 24h，加熱回流、浸潰或滲漉提??；(2)濃縮酸化把提取液濃縮至每毫升含原藥材量O. 5 5g，用O. 5 10%酸水調(diào)PH為I 2 ;(3)萃取除雜酸化液加入低極性有機溶劑萃取，靜置分層后，收集水層；(4)堿化萃取水層加堿液調(diào)PH為10 12,堿化液加低極性有機溶劑萃取,靜置分層后，收集有機層；(5)濃縮干燥減壓濃縮有機溶劑萃取液，干燥，即得蠐螬總生物堿。上述(I)步驟中采用50 95%乙醇浸泡12 24h，最好采用70-90 %乙醇；提取方法包括加熱回流、浸潰或滲漉提取等，最好為加熱回流或滲漉提取。提取液濃度小于50% 可使提取液中水溶性雜質(zhì)含量增高；浸潰法提取率較低。上述⑵步驟中調(diào)節(jié)PH的酸可以是無機酸如鹽酸、硫酸，也可以是有機酸如檸
檬酸等。上述(3)步驟中所述低極性有機溶劑可以是鹵代烷烴、苯、甲苯、二甲苯、乙醚、乙酸乙酯等低極性有機溶劑中的一種。上述(4)步驟中調(diào)節(jié)PH的堿可以是氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、氨水中的一種或兩種的混合溶液，優(yōu)選為NaOH或KOH ;萃取用低極性有機溶劑可以是鹵代烷烴、 苯、甲苯、二甲苯、乙醚、乙酸乙酯等低極性有機溶劑中的一種。優(yōu)選為氯仿或二氯甲烷。上述(5)步驟中減壓濃縮物的干燥方法為真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥等。一種蠐螬總生物堿，該生物堿采用上述方法制備得到。按上述方法制備的蠐螬總生物堿為黃色，無定型粉末，微溶于水，與碘化汞鉀試劑在酸性溶液中生成白色沉淀；與碘化鉍鉀試劑在酸性溶液中生成桔紅色沉淀。一種蠐螬總生物堿的應用，將上述的蠐螬總生物堿用于制備治療癌癥的藥物組合物，其中含有治療有效量的上述蠐螬總生物堿和藥學上可接受的載體。本發(fā)明得到的蠐螬總生物堿有很好的抗癌作用，可用于食管癌，肺癌，胃癌，肝癌， 結(jié)、直腸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，宮頸癌，白血病，黑色素瘤等的治療。
具體實施例方式下面列舉典型實施例，對本發(fā)明進一步說明，但不以任何形式構(gòu)成對本發(fā)明的限制。實施例I稱取蠐螬lkg，粉碎為粗粉；用2000ml 70 %乙醇潤濕；裝入滲漉桶中，浸潰放置 24h，使溶劑充分滲透擴散；用8000ml，70%乙醇進行滲漉，收集滲漉液；把滲漉液濃縮成 1000ml,(每毫升含原藥材量Ig)，向濃縮液中加入3% H2SO4，調(diào)節(jié)PH ^ 1，每次2倍體積乙酸乙酯萃取，共萃取3次，除脂溶性雜質(zhì)。取水層，加入5% NaOH調(diào)節(jié)PH ^ 12，靜置8h。每次3倍體積氯仿萃取，共萃取5次，得氯仿萃取物，濃縮氯仿萃取液，干燥后，得蠐螬總生物堿 2. 95g。實施例2稱取蠐螬5kg，粉碎為粗粉；用5000ml 80%乙醇潤濕；浸潰放置24h ;用20000ml， 80%乙醇進行滲漉，收集滲漉液；把滲漉液濃縮成1250ml (每毫升含原藥材量4g)，向濃縮液中加入2% HC1，調(diào)節(jié)PH 2，每次I倍體積乙酸乙酯萃取，共萃取2次，除脂溶性雜質(zhì)。 取水層，加入3% NaOH調(diào)節(jié)PH ^ 11，靜置12h。每次2倍體積氯仿萃取，共萃取6次，得氯仿萃取物，濃縮氯仿萃取液，干燥后，得蠐螬總生物堿8. 03g。實施例3稱取蠐螬500g，粉碎為粗粉；置于索氏提取器中用IOOOml 95%乙醇潤濕；浸潰 12h ;共用2000ml95%乙醇回流提取，收集提取液；把提取液濃縮成200ml (每毫升含原藥材量2. 5g)，向濃縮液中加入2% HCl，調(diào)節(jié)PH 2，每次3倍體積二氯乙烷萃取，共萃取2次， 除脂溶性雜質(zhì)。取水層，加入氨水調(diào)節(jié)PH 10，靜置8h。每次2倍體積二氯乙烷萃取，共萃取6次，得氯仿萃取物，濃縮氯仿萃取液，干燥后，得蠐螬總生物堿O. 50g。實施例4稱取蠐螬2kg，粉碎為粗粉；用2000ml 60%乙醇潤濕；浸潰放置24h ;用8000ml， 80%乙醇回流提取2小時，濾出乙醇提取液，把浸過的藥渣按上述方法再處理兩次，合并三次濾出的乙醇提取液，減壓濃縮成2500ml (每毫升含原藥材量O. 8g)，用4 % HCl酸化，調(diào)節(jié)PH 1，每次3倍體積乙醚萃取，共萃取2次，除脂溶性雜質(zhì)。取水層，加入4% KOH調(diào)節(jié) PH 11，靜置8h。每次3倍體積氯仿萃取，共萃取4次，得氯仿萃取物，濃縮氯仿萃取液，干燥后，得蠐螬總生物堿2. 67g。實施例5稱取蠐螬1kg，粉碎為粗粉；用8000ml 80%乙醇在室溫浸潰24小時，濾出乙醇提取液，把浸過的藥渣按上述方法再處理三次，合并四次濾出的乙醇提取液，減壓濃縮成 500ml (每毫升含原藥材量2g)，用2% H2SO4酸化，調(diào)節(jié)PH ^ 2，每次2倍體積乙酸乙酯萃取，共萃取3次。取水層，加入5% NaOH調(diào)節(jié)PH 12靜置8h。每次2倍體積氯仿萃取，共萃取8次，得氯仿萃取物，濃縮氯仿萃取液，干燥后，得蠐螬總生物堿3. 15g。以下通過試驗例來進一步闡明本發(fā)明所述蠐螬總生物堿對癌癥的治療效果。試驗例I :蠐螬總生物堿對體外培養(yǎng)的食管癌，肺癌，胃癌，肝癌，結(jié)腸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，宮頸癌，白血病，黑色素瘤的生長抑制作用實驗試劑環(huán)磷酰胺購于恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜 (DMSO)為Sigma產(chǎn)品；RPMI 1640、DMEM、胰蛋白酶及小牛血清為Gibco產(chǎn)品。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。細胞培養(yǎng)使用RPMI 1640或DMEM培養(yǎng)液(含10%滅活的小牛血清、100U -πιΓ1 青霉素和IOOmg · Γ1鏈霉素)，置于37°C、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞的抑制作用取對數(shù)生長期的細胞，以3 5X 107/1的密度接種于96孔板，每孔100μ 1，在37°C C,5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)12h。試驗設陰性對照組、DMSO溶劑對照組、不同濃度給藥組。每個培養(yǎng)孔加入O. 2 20 μ g/ml的蠐螬生物堿(用DMSO溶解，終濃度彡O. 5% ) 100 μ 1，使終濃度為O. I 10 μ g/ml，每個濃度設6個復孔，37°C>5% CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h，每孔加入MTT液(5g/l) 20 μ L，培養(yǎng)4h后，離心，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μ L 二甲基亞砜，輕度振蕩溶解結(jié)晶，置自動酶標儀570nm波長處測OD值，按下列公式計算細胞生長的抑制率細胞生長抑制率/% = (I-給藥組OD值 /對照組OD值)X 100 %，實驗重復3次。結(jié)果MTT法測定蠐螬總生物堿對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251、結(jié)腸癌SWl 116、肝癌!fepG2、 肺癌A549、宮頸癌HeLa、胃癌SGC7901、黑色素瘤A375、白血病HL-60、食管癌Eca-109細胞的生長抑制作用，結(jié)果表明蠐螬生物堿在O. I 10 μ g/ml濃度范圍內(nèi)能明顯抑制U251、 SW1116、!fepG2、A549、HeLa、SGC7901、A375、HL-60、Eca-109 細胞的增殖，抑制作用具有濃度依賴性，結(jié)果見表1、2。 表I蠐螬生物堿對腫瘤細胞增殖的抑制作用I (7±^ η= 6)
權(quán)利要求
1.蠐螬總生物堿的制備方法，其特征在于該生物堿是由下述制備方法制成的(1)乙醇提取將蠐螬粉碎成粗粉，用50 95%乙醇浸泡12 24h，加熱回流、浸潰或滲漉提??；(2)濃縮酸化把提取液濃縮至每毫升含原藥材量O.5 5g，用O. 5 10%酸水調(diào)PH 為I 2 ;(3)萃取除雜酸化液加入低極性有機溶劑萃取，靜置分層后，收集水層；(4)堿化萃取水層加堿液調(diào)PH為10 12,堿化液加低極性有機溶劑萃取,靜置分層后，收集有機層；(5)濃縮干燥減壓濃縮有機溶劑萃取液，干燥，即得蠐螬總生物堿。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蠐螬總生物堿的制備方法，其特征在于所述(I)步驟中采用 70 90%乙醇，用加熱回流或滲漉的方法提取。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蠐螬總生物堿的制備方法，其特征在于所述(2)步驟中調(diào)節(jié) PH的酸可以是無機酸如鹽酸、硫酸，也可以是有機酸如檸檬酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蠐螬總生物堿的制備方法，其特征在于，所述低極性有機溶劑可以是鹵代烷烴、苯、甲苯、二甲苯、乙醚、乙酸乙酯等低極性有機溶劑中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蠐螬總生物堿的制備方法，其特征在于總生物堿提取和精制提純過程調(diào)節(jié)PH的堿可以是氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、氨水中的一種或兩種的混合溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蠐螬總生物堿的制備方法，其特征在于，調(diào)PH的堿優(yōu)選為 NaOH 或 KOH。
7.—種蠐螬總生物堿，其特征是經(jīng)權(quán)利要求I至6之一的蠐螬總生物堿的制備方法所制備。
8.用于治療癌癥的藥物組合物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求7所述的蠐螬總生物堿和藥學上可接受的載體。
9.權(quán)利要求8的蠐螬總生物堿藥物組合物在制備抗癌藥物中的應用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述應用，所述癌癥包括食管癌,肺癌，胃癌,肝癌，結(jié)、直腸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，宮頸癌，白血病，黑色素瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蠐螬總生物堿的制備方法，和以該化合物為活性成分的藥物組合物，該藥物組合物在制備治療抗癌藥物中的應用。蠐螬總生物堿的制備方法包括乙醇提取、濃縮酸化、萃取除雜、堿化萃取和減壓濃縮等工藝步驟。蠐螬總生物堿及其組合物可用于癌癥，包括食管癌，胃癌，乳腺癌、肝癌，肺癌，結(jié)、直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病等的治療。
文檔編號A61P35/00GK102579506SQ20121010196
公開日2012年7月18日 申請日期2012年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月9日
發(fā)明者張雅, 曹蔚, 楊倩, 王四旺, 謝艷華 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學