專利名稱：用于增強放射治療功效的met抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本說明書涉及MET抑制劑在增強腫瘤患者放射治療功效中的用途。
背景技術(shù)：
雖然放射治療已成功用于治療癌癥患者，但是其可能無法根除腫瘤，后者會以更加具有侵略性的表型復(fù)發(fā)。與此一致，動物模型的經(jīng)典研究掲示了電離輻射(IR)的矛盾的促轉(zhuǎn)移作用。放射治療后的腫瘤進展可能是由干“癌癥干細胞”亞群體的正向選擇，其在本質(zhì)上是耐輻射的。然而，顯著的證據(jù)表明，除了選擇之外，IR促進了ー種針對組織再生的適配表型，其可能表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移行為。該表型被定義為對于DNA損傷的“應(yīng)激并恢復(fù)型(stress-and-recovery) ”響應(yīng),其在單細胞和組織水平上都有發(fā)生。在單細胞中，對于DNA損傷的檢測得出了特定的分子機制，其主要由阻礙了復(fù)制和活性DNA的修復(fù)的ATM-p53途徑(axis)調(diào)節(jié)。如果損傷是不可逆的，正常細胞即程序性地進行凋亡，或通過衰老來休眠 其増殖能力。然而，在突變細胞死亡后，組織必須恢復(fù)足夠的細胞數(shù)目和模式，以恢復(fù)原始的結(jié)構(gòu)和功能。從而，再生(或“創(chuàng)傷愈合”)被存活下來的正常細胞或腫瘤細胞所啟動。如體外觀察到的，該過程包括例如從傷ロ邊緣脫離、獲得成纖維細胞表型、遷移至受損區(qū)域、以及可能存在的増殖等步驟。整個過程被稱為“上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化”(EMT)，一個強調(diào)形態(tài)學(xué)特征的術(shù)語。最近，該過程也被定義為“侵襲性生長(IG) ”一個強調(diào)與癌癥相關(guān)的功能性方面的用語。目前普遍承認EMT/IG是組織發(fā)育和再生的生理性程序，其被癌細胞篡奪以表現(xiàn)出入侵性和轉(zhuǎn)移性。EMT/IG在癌細胞中的活化(a)有時候是由于支持克隆選擇的遺傳損傷；(b)更多時候是由于針對不利環(huán)境條件的適應(yīng)性響應(yīng)。因此，EMT/IG是ー種由幾個特定轉(zhuǎn)錄因子最終控制的遺傳程序，并由ー些胞外信號調(diào)節(jié)。后者包括分散因子(scatter factor)，例如肝細胞生長因子(HGF)和巨噬細胞刺激蛋白(MSP)，它們結(jié)合屬于Met家族的酪氨酸激酶受體。

發(fā)明內(nèi)容
因此需要用于增強腫瘤患者放射治療的功效的改善的解決方案。本說明書的目標是提供該改善的解決方案。根據(jù)本發(fā)明，上述目標已經(jīng)由在之后的權(quán)利要求中特別重復(fù)提到的主題所完成，其應(yīng)被理解為本說明書的ー個完整的組成部分。本發(fā)明的一個實施方式提供了 Met抑制劑在治療腫瘤(優(yōu)選表現(xiàn)出失控的Met途徑的腫瘤)患者中的用途，其中該Met抑制劑選自i)抗-Met單克隆抗體，ii)含有該抗-Met單克隆抗體的互補決定區(qū)(OTR)的遺傳工程化的抗體，和iii)含有該抗-Met單克隆抗體的互補決定區(qū)(CDR)的⑴或(ii)的片段，或其組合，其中該Met抑制劑能夠誘導(dǎo)對MET基因所編碼的受體的下調(diào)和降低和/或去除患者對放射治療的抗性。
在優(yōu)選的實施方式中，該抗-Met單克隆抗體是由雜交瘤細胞系ICLC PD 05006產(chǎn)生的DN30抗-Met單克隆抗體。在進ー步優(yōu)選的實施方式中,包含于a)遺傳工程化的抗體或b)抗-Met單克隆抗體或遺傳工程化的抗體的片段中的互補決定區(qū)(CDR)是DN30抗-Met單克隆抗體的CDR，該CDR的氨基酸序列如SEQ ID No. : 12-14和20-22所示。本說明書的另ー實施方式涉及用于(例如，通過基因療法)治療腫瘤(優(yōu)選表現(xiàn)出失控的Met途徑的腫瘤)患者的編碼Met抑制劑的核苷酸序列，所述Met抑制劑選自i)抗-Met單克隆抗體，ii)含有該抗-Met單克隆抗體的互補決定區(qū)(OTR)的遺傳工程化的抗體，和iii)含有該抗-Met單克隆抗體的互補決定區(qū)(CDR)的⑴或(ii)的片段，或其 組合，其中所述Met抑制劑能夠誘導(dǎo)對MET基因所編碼的受體的下調(diào)和降低和/或去除患者對放射治療的抗性。在優(yōu)選的實施方式中，該抗-Met單克隆抗體是由雜交瘤細胞系ICLC PD 05006產(chǎn)生的DN30抗-Met單克隆抗體。在優(yōu)選的實施方式中，包含于編碼a)遺傳工程化的抗體或b)抗-Met單克隆抗體或遺傳工程化的抗體的片段的核苷酸序列中的互補決定區(qū)(CDR)是DN30抗-Met單克隆抗體的CDR,該CDR的氨基酸序列如SEQ ID No. :12-14和20-22所示。根據(jù)ー個優(yōu)選的實施方式，該Met抑制劑i)以可溶性蛋白的形式通過注射或輸液來進行給藥，或ii)通過載體的方式進行全身性或腫瘤內(nèi)給藥。根據(jù)進ー步優(yōu)選的實施方式，該Met抑制劑以Fab片段的形式存在，且可選的偶聯(lián)有至少ー種穩(wěn)定分子，其中該穩(wěn)定分子選自聚こニ醇、白蛋白結(jié)合區(qū)域、白蛋白。本說明書公開了輻射會上調(diào)MET (已知為驅(qū)動癌癥“侵襲性生長”的致癌基因)的表達，其反過來會促進細胞入侵并保護細胞免受輻射誘導(dǎo)的凋亡。因此，通過特定化合物(即特定的Met抑制劑)來終止MET的表達或抑制其激酶的活性，能促進凋亡并消除輻射誘導(dǎo)的侵入，從而增強放射治療的功效。


以下僅對本發(fā)明參考附圖通過實施例的方式進行描述，其中圖I. IR誘導(dǎo)MET轉(zhuǎn)錄。a，在輻射(IOGy)后給定的時間點的MDA-MB-435S中的Met蛋白。對照，在O時間點的Met。b，在輻射(I-IOGy)后12h的MDA-MB-435S中的Met蛋白。C，在輻射(IOGy)后給定的時間點的MDA-MB-435S的MET轉(zhuǎn)錄。d，在輻射(IOGy ;對照，未輻射的細胞)后給定的時間點的MDA-MB-231中由MET啟動子(基礎(chǔ)，不含啟動子的構(gòu)建體)驅(qū)動的熒光素酶活性。柱兩個獨立實驗的三個平行分析的均值土s. e. m. Op < O. 05, η = 6,成對t檢驗)。a. u.,任意單位。圖2. IR誘導(dǎo)的MET轉(zhuǎn)錄需要NF-K B。a,在輻射(IOGy)后給定的時間點或低氧培養(yǎng)24h (I % O2)后分析的MDA_MB_435S中的蛋白核聚積。對照，O時間點未輻射的細胞。b，在輻射的MDA-MB-231(10Gy ;對照，未輻射細胞)中的染色質(zhì)免疫沉淀。柱表示在MET啟動子中每個NF-K B結(jié)合序列(κΒ1_κΒ2)的抗_p65/RelA和非特異性IgG免疫沉淀之間的比例(三個平行分析的均值土 s. e. m.)。使用NFKBIAd κΒα)啟動子作為陽性對照。C，其p65/RelA表達被沉默(siRELA ；si對照，對照)的MDA-MB-231中的MET啟動子活性，并接受輻射(IOGy ;對照，未輻射的細胞)。柱表示MET啟動子驅(qū)動的和無啟動子(基礎(chǔ))的熒光素酶表達之間的比例(三個獨立實驗的三個平行分析的均值土s. e. m)。插圖siRNA轉(zhuǎn)染后的p65/RelA蛋白。d,福射后給定的時間點(對照，O時間點的未輻射的細胞)的其p65/RelA表達被沉默(siRELA ;si對照，對照)的MDA-MB-435S中的Met蛋白積累。圖3. IR誘導(dǎo)的MET表達需要ATM激酶活化。用ATM激酶抑制劑CGK733處理并在輻射后給定的時間點提取的MDA-MB-435S中的Met蛋白表達、Chk2磷酸化(p-Chk2)和p65/RelA核易位。對照，O時間點的未輻射的細 胞。圖4. IR誘導(dǎo)的侵襲性生長需要Met。a,由輻射的MDA-MB-231或U_251 (IOGy ;對照，對照)進行的基底膜侵襲。小室(transwell)過濾器(IOX)的顯微圖。b，在輻射的MDA-MB_435S(10Gy ;對照，對照)中的Met誘導(dǎo)的異常分枝化形態(tài)發(fā)生，培養(yǎng)中添加或不添加(_)給定的HGF濃度。比例尺ΙΟΟμπι。圖5. Met抑制使得細胞對IR誘導(dǎo)的凋亡和增殖捕獲敏感。用IOGy輻射的和/或在DN30抗-Met抗體的Fab片段的存在下培養(yǎng)的U-251存活率，各48h (載體未輻射的細胞)。柱三個獨立實驗的三個平行分析的均值土 s. e. m. (*p< O. 05，相對于單獨的Fab-DN30或IOGy而言存活率明顯下降，η = 9，成對t檢驗)。柱產(chǎn)生克隆的細胞的百分比(兩個獨立實驗的三個平行分析的均值土s. e. m.，*p < O. 05, η=6,成對t檢驗)。圖6. IR誘導(dǎo)Met磷酸化。在給定時間點對用HGF(50nM)和/或IR(IOGy)細胞處理的MDA-MB-231中的Met磷酸化用抗-Met抗體進行免疫沉淀,并用抗-磷酸-Tyr抗體(ρ-Tyr)進行蛋白質(zhì)印跡分析。Met作為蛋白免疫沉淀的對照。對照，用HGF處理的陰性對照細胞(參見方法)圖7.鼠和人MET啟動子的比對。使用TRANSFAC 7. O 軟件(Biobase Biological Database Gmbh, WolfenbutteI,Germany)對人MET啟動子(GenBank登錄號AF046925)進行分析來鑒定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。發(fā)現(xiàn)了兩處推測的NF- K B結(jié)合位點(K BI和K B2)。人和鼠(Gene ID :17295)MET啟動子的比對顯示κΒ2位點(人序列中的-1149/-1136，矩形框)在二者之間高度保守。圖8. DN30單克隆抗體重鏈的核酸(a)和氨基酸(b)序列。⑶R區(qū)域在核苷酸和氨基酸序列中均以下劃線標明。圖9. DN30單克隆抗體輕鏈的核酸(a)和氨基酸(b)序列。CDR區(qū)域在核苷酸和氨基酸序列中均以下劃線標明。
具體實施例方式在此對于本發(fā)明以非限制性實施例的方式對ー些優(yōu)選的實施方式進行詳細描述。在以下描述中給出了多個特定的細節(jié)用于提供對于實施方式的徹底理解。實施方式可以采用或不采用這些特定的細節(jié)來進行，或者采用其它方法、組分、材料等等。在其它例子中，沒有給出或細述公知的結(jié)構(gòu)、材料或操作以避免使得實施方式的內(nèi)容模糊不清。在此給出的標題僅僅出于方便考慮，而不是用于解釋實施方式的范圍或含義。除了損傷細胞內(nèi)靶點外，電離輻射(大多數(shù)情況下通過產(chǎn)生活性氧分子)還對調(diào)節(jié)分子的活性進行調(diào)整，該調(diào)節(jié)分子控制應(yīng)激并恢復(fù)型生物響應(yīng)。在該響應(yīng)中，MET致癌基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)表現(xiàn)為ー個關(guān)鍵的事件，其導(dǎo)致消除輻射誘導(dǎo)損傷的促存活(pro-survival)和復(fù)蘇程序的進行。本說明書顯示IR誘導(dǎo)的MET上調(diào)受到由蛋白激酶ATM在檢測到DNA損傷后引發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的控制。該途徑涉及ATM激酶的出核轉(zhuǎn)運和轉(zhuǎn)錄因子NF-K B從抑制中的解除。顯著的是，已知由DNA損傷導(dǎo)致的NF-K B活化在對于輻射的防御響應(yīng)中具有重要作用，因為NF-κ B是ー種顯著的杭-凋亡基因的調(diào)節(jié)子。有人提出由NF-κ B促進的細胞存活非常有效，以至于能夠誘導(dǎo)癌細胞對于放射治療的“適應(yīng)性抵抗”。本發(fā)明人在此表明，NF- K B維持的針對輻射的適應(yīng)性響應(yīng)關(guān)鍵涉及MET 原癌塞因(proto-oncogene)。IR的MET誘導(dǎo)是一種雙向的轉(zhuǎn)錄事件，其由NF-κ B結(jié)合至位于MET啟動子的兩個K B特異性響應(yīng)元件所介導(dǎo)。發(fā)生于輻射后l_2h的早期轉(zhuǎn)錄響應(yīng)很可能依賴于通過DNA損傷感應(yīng)器-ATM驅(qū)動的內(nèi)源性途徑的NF- K B的活化?？梢韵胂蟮氖牵琁R誘導(dǎo)的Met過表達自身足以誘發(fā)在普遍存在的HGF配體的生理濃度下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，如低氧誘導(dǎo)的Met過表達中所示的那樣。后期持續(xù)的MET上調(diào)(持續(xù)超過24h)也可能受到影響NF-K B的多重外源信號途徑的支持。事實上，輻射促進細胞因子(該細胞因子包括TNF-a、IL_l和IL-10)的表達，其在一方面是NF-K B的標靶，在另一方面刺激NF-K B轉(zhuǎn)錄活性。本發(fā)明人認為，在活體組織中，輻射誘導(dǎo)自分泌/旁分泌循環(huán)，該循環(huán)反彈作用在NF- K B上，而NF- K B在損傷組織各處傳播生存信號的波。顯著的是，已知對NF-K B的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)的除了促存活基因外還包括負責(zé)EMT/IG的分子。促存活和EMT/IG遺傳程序的共同執(zhí)行是一把雙刃劍在正常組織中，這些程序?qū)е麓婊詈蛽p傷后的再生；在癌細胞中，其促進惡性腫瘤的進展。MET原癌基因滿足成為NF-κ B關(guān)鍵靶標的條件，其是調(diào)節(jié)同時具有正面和負面影響的應(yīng)激并恢復(fù)型響應(yīng)所需要的。如在此說明書中所顯示的，一方面，IR誘導(dǎo)的Met過表達使得細胞能夠愈合創(chuàng)傷單層。另ー方面，IR刺激細胞穿過基底膜，該膜是惡性腫瘤的一個典型特征。更加顯著的是，有報道稱IR將Met誘導(dǎo)的分枝化形態(tài)發(fā)生的生理過程轉(zhuǎn)變?yōu)樵谌S基質(zhì)中混亂的細胞分散。在所有的情況下，雖然在受輻射細胞中表達了ー些NF-K B標靶基因，但是本發(fā)明人指出通過MET敲除或功能抑制，Met對于生理侵襲性生長(創(chuàng)傷愈合)和惡性侵襲性生長(侵入)而言都是需要的。從而，報道稱的輻射后腫瘤復(fù)發(fā)侵襲可能涉及在MET致癌基因嚴格控制下的EMT/IG程序的活化。Met參與抗-凋亡、再生和對IR的侵入響應(yīng)的這ー觀察具有重要的治療意義 放射治療與Met抑制的組合能夠放射增敏(radiosensitize)癌細胞,并防止促侵入的附屬效應(yīng)。事實上本說明書顯示在接觸治療量的IR后對Met的抑制顯著損害細胞的生存和克隆形成能力。最重要的是，既然MET表達于ー些正常組織的干細胞/祖細胞，可以想象其同樣表達于癌干細胞，后者通常源于正常干細胞或増殖性祖細胞的直接轉(zhuǎn)化。IR誘導(dǎo)的Met表達和活化支持了癌(干)細胞的抗輻射和侵入能力，從而增加了其陽性選擇和分散的幾率。
因此，Met的抑制(通過可溶性蛋白的形式給藥該Met抑制劑或通過基因療法，即，給藥如下定義的編碼該Met抑制劑的載體)與常規(guī)療法(即，放射治療)的組合是消除癌癥的進ー步策略。在本說明書中，表述“Met抑制劑”表示抗-Met單克隆抗體、其衍生物和/或片段，其能夠誘導(dǎo)對MET基因所編碼的受體的下調(diào)。在優(yōu)選的實施方式中，該“Met抑制劑”是DN30抗-Met單克隆抗體、其衍生物和/或片段，其能夠誘導(dǎo)對MET基因所編碼的受體的下調(diào)。表述“抗體衍生物”表示含有抗體的互補決定區(qū)(CDR)的分子，例如含有抗體的CDR的遺傳工程化的或人源化的抗體或含有抗體的CDR的多肽。表述“抗體片段”表示選自i)抗-Met單克隆抗體,和ii)含有抗-Met單克隆抗體的互補決定區(qū)(CDR)的遺傳エ程化的或人源化的抗體的ド18げ1 &13、？&13’、？(&13’)2片段的片段。
從藥理學(xué)觀點考慮，使用Fab片段既具有優(yōu)點也具有缺點。Fab分子可以很容易地使用簡單表達系統(tǒng)(包括低等真核和原核細胞)產(chǎn)生(Chambers RS. Curr Opin Chem Biol20059 :46-50)。另外Fab分子相對于全抗體而言免疫原性較低，且其較低的分子量改善了組織滲透。臨床上使用Fab片段的問題涉及Fab片段的低血漿半衰期，其是由于較高的腎臟清除導(dǎo)致的。這可以通過將Fab分子局部給藥至腫瘤位點來避免。對于需要全身遞送和延長治療的治療應(yīng)用，_在増加Fab半衰期的行為是必需的。為了得到増加的Fab半衰期，已經(jīng)實現(xiàn)了通過與穩(wěn)定分子(其沒有改變Fab片段的抗原結(jié)合性質(zhì))偶聯(lián)而得到的Fab的穩(wěn)定形式。雖然PEG 化(pegylation)是最成熟的技術(shù)(Chapman AP. Adv Drug Deliv Rev200254 :531-545.)，但是PEG化并非唯一可行的實現(xiàn)治療性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的方法?？梢源婊瘜W(xué)修飾的是，重組Fab分子可以在初級核苷酸序列水平上進行修飾以引入編碼能夠以高親和性結(jié)合血清白蛋白的肽或結(jié)構(gòu)域的序列(Dennis MS等人，J BiolChem 2002277 :35035-35043 ；Stork R等人，Protein Eng Des Sel 200720 :569-576)，或可以作為嵌合分子獲得，其中編碼Fab的一條鏈在框架中與編碼無生物活性的蛋白的序列進行融合(例如，血清白蛋白(Subramanian GM等人,Nat Biotechnol 200725:1411-1419))。聚こニ醇、白蛋白結(jié)合區(qū)域、白蛋白，或任何其它不改變Fab片段的抗原結(jié)合性質(zhì)的序列可被用作能夠增加Fab片段的體內(nèi)血清半衰期的穩(wěn)定分子。DN30抗-cMet單克隆抗體由保藏在高等生物技術(shù)中心(Advanced BiotechnologyCenter) (ABC), Interlab Cell Line Collection(ICLC), S. S. Banca Cellule e Colturein GMP, Largo Rosanna Benzi 10, Genova,意大利、保藏號為 ICLC PD 05006 的雜交瘤細胞
系產(chǎn)生。適合根據(jù)本說明書來給藥Met抑制劑以降低和/或去除放射治療抗性的腫瘤包括i)癌，優(yōu)選地選自膀胱癌、乳腺癌、膽管癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、卵巣癌、胰腺/膽嚢癌、前列腺癌、甲狀腺癌；ii)軟組織肉瘤，優(yōu)選地選自卡波濟氏肉瘤、平滑肌肉瘤、MFH/纖維肉瘤；iii)肌肉骨骼肉瘤，優(yōu)選地選自骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤；iv)血液系統(tǒng)惡性腫瘤，優(yōu)選地選自急性骨髄性白血病、成人T細胞白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤；v)其它腫瘤，優(yōu)選地選自腦腫瘤、黑色素瘤、間皮瘤、腎母細胞瘤(Wilms瘤)。所有這些腫瘤都事實上呈現(xiàn)出“失調(diào)的Met途徑”，其中該表述意味著這些腫瘤的特征是由于至少以下ー種i)Met突變、ii)Met蛋白過表達、iii)Met基因擴增、iv)升高的循環(huán)HGF水平而導(dǎo)致的異常Met信號傳導(dǎo)。Met抑制劑給藥至人類患者抗-Met抗體通過類似于靶向涉及人類惡性腫瘤的其它受體酪氨酸激酶的抗體的療程進行給藥(例如，曲妥珠單抗(Trastuzumab), 一種針對HER-2的抗體)。典型地,抗體或其衍生物或片段通過靜脈輸液進行給藥，周劑量為5-10mg/kg,優(yōu)選4-8mg/kg。為了與放射治療聯(lián)合，抗-Met抗體的給藥將在輻射前一周、更加優(yōu)選前一天開始，并持續(xù)至 放射治療結(jié)束后一周、優(yōu)選6-48小吋。編碼抗-Met抗體、或其衍生物或片段的cDNA序列也可通過“基因治療”過程對人類患者給藥。cDNA序列被克隆在病毒來源(慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒，等等)的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體中并組裝成病毒顆粒，該病毒顆粒能夠通過特異性表面結(jié)合蛋白的方式來特異性靶向腫瘤或腫瘤相關(guān)的細胞。然后在GMP等級的設(shè)備中生產(chǎn)病毒顆粒制劑。該制劑可以通過一次單獨的注射或多次注射被遞送至全身或腫瘤內(nèi)。由病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤組織會表達由抗-Met抗體或其衍生物或片段序列所編碼的蛋白，從而提供自抑制性循環(huán)。在下文中提供了實驗數(shù)據(jù)；使用DN30單克隆抗體和/或其衍生物和/或片段進行試驗，以對一些優(yōu)選的實施方式提供細節(jié)化的描述，但其并非用于對本發(fā)明的限制。材料和方法細胞系和siRNA。細胞系(A549、MDA-MB-231、LoVo、MDAMB-435S、U-87MG、U-251、PC3、SF295、DLDI、SK-N-SH)來自于ATCC。對于ATM激酶抑制，細胞在輻射前預(yù)處理4h并隨后保存于 CGK733 (10 μ M 于 DMS0)。對靶向 RELA 的 siRNA (ON-TARGET plus SMART poolL-003533-00 人 RELA， NM_021975, Dharmacon，IOOnM)、或?qū)φ?siRNA(ON-TARGET plusSMART pool, si CONTROL 非靶向性 siRNA，Dharmacon)進行瞬時轉(zhuǎn)染。siRNA序列如下所述?！癝MART pool L-003533-00 人 RELA NM_021975” 為 I :1:1: I 的下述雙鏈體序列的混合物(I)正義GGAUUGAGGAGAAACGUAAUU(SEQ ID No. :1)，反義5’-NUUUCCUACAAGCUCGUGGGUU(SEQ ID No. 2),(2)正義CCCACGAGCUUGUAGGAAAUU(SEQ ID No. :3)，反義5’-NUUUCCUACAAGCUCGUGGGUU(SEQ ID No. :4)，(3)正義GGCUAUAACUCGCCUAGUGUU(SEQ ID No. :5)，反義5’-NCACUAGGCGAGUUAUAGCCUU(SEQ ID No. :6)，(4)正義CCACACAACUGAGCCCAUGUU(SEQ ID No. :7)，反義5’-NCAUGGGCUCAGUUGUGUGGUU(SEQ ID No. :8)。SMART pool, si CONTROL非靶向性siRNA (—個單個的雙鏈體序列):正義AUGUAUUGGCCUGUAUUAG(SEQ ID No. :9)。DN30抗體和DN30Fab片段的制備DN30單克隆抗體按照Prat M.等人，1998，J. Cell Sci 111 :237-247的描述進行制備，并由高等生物技術(shù)中心進行保藏，保藏號ICLC PD05006o通過木瓜蛋白酶消化DN30和親和純化獲得DN30Fab片段(免疫純Fab制備試劑盒，Pierce)。DN30重鏈的氨基酸序列示于圖8b，如SEQ ID No 10所示，DN30重鏈核苷酸序列示于圖8a，如SEQ ID No. :11所示。對應(yīng)于DN30重鏈⑶R區(qū)域的氨基酸序列如下所述XDR-Hl GYTFTSYff (SEQ IDNO. 12) ;CDR-H2 :INPSSGRT(SEQ ID NO. :13) ;CDR_H3 :ASRGY(SEQ ID NO. :14)。對應(yīng)于DN30 重鏈 CDR 區(qū)域的核苷酸序列如下所述CDR-H I GGCTACACCTTCACCAGTTACTGGA (SEQ IDNO. 15) ;CDR-H2 :ATTAATCCTAGCAGCGGTCGTACT(SEQ ID NO. :16) ;CDR_H3 :GCAAGTAGG(SEQID NO. 17)。DN30輕鏈的氨基酸序列示于圖9b，如SEQ ID No :18所示，DN30輕鏈核苷酸序列示于圖9a，如SEQ ID No. :19所示。
對應(yīng)于DN30輕鏈CDR區(qū)域的氨基酸序列如下所述CDR-LI QSVDYDGGSY(SEQID NO. 20) ；CDR-L2 AAS (SEQ ID NO. :21) ；CDR-L3 QQSYEDPLT (SEQ ID NO. :22)。對應(yīng)于DN30輕鏈CDR區(qū)域的核苷酸序列如下所述CDR_L1 AAAGTGTTGATTATGATGGTGGTAGTTATAT(SEQ ID NO. :23) ；CDR-L2 GCTGCATCC (SEQ ID NO. :24) ；CDR-L3 CAGCAAAGTTATGAGGATCCGCTCACG(SEQ ID NO. :25)。體外輻射通過線性粒子加速器(Clinac 600C/D, Varian)發(fā)射X射線,在6MV下操作。Western 印跡在受輻射的血清饑餓的融匯細胞中研究蛋白表達。為了對細胞質(zhì)和細胞核部分進行分級，洗滌細胞并將其在冰上“緩沖液A”(IOmM HEPES pH 7. 9UOmM KCl、O. ImM EDTA,O. 5% NP-40、lmM ニ硫蘇糖醇、ImM苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制劑混合物)中培養(yǎng)lOmin。離心分離含有細胞質(zhì)提取物的上清液。將沉淀重懸于“緩沖液B”(20mM HEPES pH 7.9、400mM KCl、ImM EDTA、ImM ニ硫蘇糖醇、10%甘油、ImM苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制劑混合物)并在4°C下充分混合培養(yǎng)lh。高速離心澄清化得到的核溶解產(chǎn)物。通過SDS-PAGE將等量的蛋白進行分離，并使用以下初級抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析鼠杭-人Met (DL21，公開于 Prat 等人，Int. J. Cancer 49，323-328 (1991))、鼠抗-p65/RelA 和鼠抗-HIF-1 a (BDBiosciences)、兔抗-磷酸_Ser276和兔抗半胱天冬酶_3 (Cell Signaling),兔抗-磷酸-Chk2 (T68, R&D Systems)。分別使用山羊杭-肌動蛋白(C-ll ;Santa CruzBiotechnology)和鼠杭-核纖層蛋白B(Calbiochem)來控制等量的細胞質(zhì)或細胞核蛋白的上載量。印跡圖像使用分子成像儀(GelDoc XR ；Bio-Rad Laboratories)進行捕捉。使用Quantity One I-D(Bio-Rad Laboratories)進行光密度分析。蛋白質(zhì)印跡為至少三個獨立實驗獲得的代表性結(jié)果。Northern 印跡將融匯細胞血清饑餓48h并輻射。將全RNA用0. 8%瓊脂糖-甲醛凝膠分離，并按照標準流程轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Amersham)。通過pCEV-MET質(zhì)粒(參見Michieli等人,Oncogene18,5221-5231 (1999))獲得含有全編碼序列(GenBank登錄號J02958)的MET探針，并用[a-32P]dCTP(Megaprime,Amersham)進行標記。42°C下在 50% 甲酸胺中雜交 16h。在 42°C下將尼龍膜用2X SSC-0. 1% SDS洗滌兩次，用0. IX SSC-0. 1% SDS洗滌兩次，并進行自顯影。ROS 檢測根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用5_(和6)_羧基-2’ _7’ - ニ氯熒光素こ酰こ酸鹽(羧基-H2DCFDA, Molecular Probes)評價胞內(nèi)ROS的生成。簡而言之，處理前24h將細胞接種于黑色96孔板(3x IO4個細胞/孔)(IR:10Gy ;H202 :100 μΜ作為對照)。37°C下，細胞在不含酚紅的DMEM中、羧基-H2DCFDA(IOyM)存在下培養(yǎng)lh。洗滌細胞，在不含酚紅和羧基-H2DCFDA的DMEM中另外培養(yǎng)30分鐘，井隨后進行輻射。輻射后15min使用熒光分析儀檢測 ROS 的生成(λ ex = 485nm, λ em = 535nm) (DTX 880 Multimode Detector)。染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)使用4x IO7個細胞進行10次ChIP，其或者為受輻射的，或者為對照細胞。輻射后(IOGy)，室溫下將細胞用I %甲醛固定15min，用甘氨酸(O. 125M)終止反應(yīng)。洗滌固定的細胞，在冰凍的補充有蛋白酶抑制劑混合物的PBS中收集細胞并離心。按上述提取細胞質(zhì)級 分并棄除，沉淀胞核并重懸于Iml的SDS-溶解緩沖液(1% SDS, ImM EDTA, 50mM Tris-HClpH 8，和蛋白酶抑制劑混合物)。然后超聲破碎胞核，得到大小為400-1000bp的DNA片段。4°C下14，000rpm離心IOmin澄清化細胞碎片。用稀釋緩沖液10X(0. 01%SDS，1. I % TritonX-100,1. 2mM EDTA, 16. 7mM Tris-HCl pH 8,167mM NaCl)稀釋含有染色質(zhì)制劑的上清液。然后在4°C加入蛋白G-瓊脂糖(Amersham,補充有0. 2mg/ml的鮭精DNA的50%凝膠楽;，0. 1% BSA和0. 05% NaN3)預(yù)澄清化染色質(zhì)lh。4°C下4000rpm快速離心沉降珠粒，收集上清液。使用3%的染色質(zhì)制劑作為ChIP標準化的輸入。4°C下用4μ g抗體(抗-p65/RelA，Santa Cruz ;全鼠IgG, Chemicon)過夜進行ChIP,然后用50 μ I蛋白G-瓊脂糖珠培養(yǎng)3h。將珠粒在4°C下的旋轉(zhuǎn)臺上依次用以下溶液洗滌(lOmin/毎次)兩次低鹽緩沖液(0.1%SDS, I % Triton X-100,2mM EDTA, 20mM Tris-HCl pH 8,150mM NaCl)，兩次高鹽緩沖液(0. 1% SDS, 1% Triton X_100，2mM EDTA, 20mM Tris-HClpH 8,500mM NaCl)，一次 LiCl 緩沖液(0. 25M LiCl，I %脫氧膽酸，0. 5% NP-40，ImM EDTA, IOmM Tris-HCl pH 8)，以及兩次TEdOmMTris-HCl pH 8, ImM EDTA)。用 EB(1% SDS,0. IM NaHCO3)洗提 ChIP 兩次并在 65°C放置過夜來逆轉(zhuǎn)甲醛交聯(lián)。使用RNase(50y g/ml，37°C 30min)和蛋白酶_Κ(500 μ g/ml，45°C 2h)進行處理。對每個樣品進行酚/氯仿萃取的純化，并最終懸浮于40 μ I無菌水中。使用各樣品2μ I作為模板用于在ABI PRISM 7900ΗΤ序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)上使用 SYBR GREEN PCR Master Mix (Applied Biosystems)進行的 Real-Time PCR。使用以下引物-NFKBIA (正向GAACCCCAGCTCAGGGTTTAG-SEQ ID No. 26 ；反向GGGAATTTCCAAGCCAGTCA-SEQ ID No. 27)；- K BI (正向AGGCCCAGTGCCTTATTACCA-SEQ ID No. 28 ；反向GCGGCCTGACTGGAGATTT-SEQ ID No. 29)；-κΒ2(正向GGGACTCAGTTTCTTTACCTGCAA-SEQ ID No. 30 ；反向GGGACTCAGTTTCTTTACCTGCAA-SEQ ID No. 31)。創(chuàng)傷愈合分析在24孔板上將細胞生長至融匯狀態(tài)，饑餓24hr，并用塑料頭進行劃刻。使用含有I % FBS的新鮮培養(yǎng)基和僅載體(DMSO)來更換培養(yǎng)基，并立即輻射。24h后，細胞用11%戊ニ醒(Sigma)固定,并用結(jié)晶紫染色。用連接反向光學(xué)顯微鏡(DM IRB, Leica)的Leica照相機(Leica DFC320, Leica)獲得圖像。圖像為至少三個獨立實驗獲得的代表性結(jié)果。小室分析在Transwell 小室(BD Falcon)中檢測細胞侵襲。在包被有20 μ g/cm2重組 Matrigel 基底膜(Collaborative Research)的過濾器上部接種 MDA-MB-231 和MDA-MB-435S細胞(5xl05/小室)。在包被有50 μ g/cm2的過濾器上接種U-251 (104/小室)。在兩個小室中添加補充有1% FBS的培養(yǎng)基。接種后lh，輻射細胞(IOGy)，并在37°C培養(yǎng)24h。過濾器上部的細胞進行機械移除，遷移至較低部位的細胞按上述進行固定、染色和拍照。為了對細胞侵襲進行定量，對每個實驗條件隨機選擇10個區(qū)域，并用IOX的物鏡按上述進行顯微觀察。使用MetaM0rph7. I軟件進行形態(tài)分析。圖像為至少三個獨立實驗的代表性結(jié)果。分枝化形態(tài)發(fā)生分析 通過將單細胞重懸于240mg/ml甲基纖維素(Sigma)并在不粘連的96孔板(Greiner)上培養(yǎng)24h形成MDA-MB-435S球體。將球體轉(zhuǎn)移至含有I. 3mg/ml來自鼠尾的I型膠原蛋白(BD Biosciences)、10% FBS和240mg/ml甲基纖維素的基質(zhì)中。24h后,福射細胞和/或在HGF存在下培養(yǎng)7天。HGF獲得自SF9細胞中的桿狀病毒重組蛋白。使用來自未感染細胞的條件培養(yǎng)基作為陰性對照。圖像為三個獨立實驗獲得的代表性結(jié)果。用DN30Fab進行細胞存活分析 將IO3個細胞接種在96孔板上生長24h。用含有I % FBS和DN30Fab (28 μ g/ml)的培養(yǎng)基或僅含載體(PBS)來更換培養(yǎng)基。24h后，輻射細胞(IOGy)。細胞存活率按上述進行分析。IR誘導(dǎo)MET轉(zhuǎn)錄本發(fā)明人之前已經(jīng)顯示MET原癌基因被細胞外和細胞內(nèi)的特異性信號所轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這些信號包括生長因子和氧感知器(oxygen sensor)。在此研究了接觸治療劑量(高至IOGy)的IR下的Met表達的調(diào)控。在源于不同組織類型的腫瘤組織的十個細胞系中(乳腺癌、肺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌；黑色素瘤；成膠質(zhì)細胞瘤；成神經(jīng)細胞瘤)，發(fā)現(xiàn)Met蛋白水平在輻射后24h顯著增カロ。在代表性的細胞系中(例如MDA-MB-435S和MDA-MB-231)中，細化的時間進程實驗顯示了 Met蛋白聚積的雙向性。其特征為l_2h左右的Met誘導(dǎo)的早期峰( 5倍)，然后是相似的晩期峰或平臺，其發(fā)生在6h，并在輻射后24h下降(圖Ia)。劑量響應(yīng)實驗顯示Met誘導(dǎo)在IGy后開始，并在5Gy達到平臺(圖Ib)。在受輻射的細胞中還觀察到MET mRNA的聚積和全長MET啟動子的活化(圖lc-d)，表明IR誘導(dǎo)的MET過表達涉及轉(zhuǎn)錄機理。有趣的是，在MDA-MB-231中還檢測到短暫和不依賴配體的Met自磷酸化，其發(fā)生在接觸IR后IOmin內(nèi)(圖6)。IR誘導(dǎo)的Met磷酸化的強度與那些由非飽和濃度(50ng/ml)的HGF所誘導(dǎo)的相當(dāng)。然而，磷酸化的動力學(xué)不同，因為IR誘導(dǎo)的峰值在IOmin后達到，而HGF誘導(dǎo)的峰值在30min后達到。同時進行IR和HGF刺激沒有協(xié)同效應(yīng)(圖6)。IR誘導(dǎo)的MET轉(zhuǎn)錄需要NF-K B已知IR會調(diào)控ー些轉(zhuǎn)錄因子，包括NF-K B。因此，基因組表達譜顯示，在檢測的細胞系中，IR顯著誘導(dǎo)早期NF-κ B響應(yīng)。例如，在MDA-MB-231中，輻射后Ih所調(diào)控的33基因中的9個是NF-κ B的標靶，其表現(xiàn)出比預(yù)期高 20倍的頻率。另外，在MDA-MB-231、MDA-MB-435S或U-251細胞的時間進程實驗中，IR(IOGy)誘導(dǎo)了迅速(30min內(nèi))和持續(xù)(至24h)的NF- K B亞基p65/RelA的核聚積，這是NF- κ B活化的標志(圖2a)。另外，在輻射后的早期時間點，核p65/RelA的Ser276被短暫磷酸化(圖2a)。該磷酸化已知被活性氧物質(zhì)(ROS)經(jīng)過蛋白激酶A所誘導(dǎo)，并促進p65/RelA與轉(zhuǎn)錄共活化劑CBP/p300之間的相互作用，其是上調(diào)一系列的早期靶基因所必須的。這些數(shù)據(jù)表明IR通過p65/RelA亞基的核聚積和早期短暫磷酸化促進NF- κ B功能活化。在人MET啟動子中，對于兩處推測的NF- κ B結(jié)合位點κ BI，位于相對于序列(GenBank登錄號AF046925)的轉(zhuǎn)錄起始位點的-1349/_1340bp ；和κ Β2,位于-1149/-1136bp,通過計算機(in silico)分析進行了鑒定。有趣的是，κ B2位點在小鼠met啟動子中高度保守(圖7 ;小鼠met (小家鼠)啟動子序列，如SEQ ID No 32所 示，和人met (人類)啟動子序列，如SEQ ID No. :33所示)。染色質(zhì)免疫沉淀實驗顯示在接觸IOGy的細胞中p65/RelA與任一位點的結(jié)合都顯著增加(圖2b)，表明MET在受輻射細胞中受NF- κ B轉(zhuǎn)錄控制。這些發(fā)現(xiàn)提示本發(fā)明人去研究是否NF- κ B對于MET的IR誘導(dǎo)而言是必需的。由于p65/RelA參與幾個NF-κ B異ニ聚體每ー個的形成，從而對于整個NF- κ B-驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄活性都很重要，因此通過RNA干擾終止了 p65/RelA的表達。在用針對p65/RelA 的 siRNA (SMART pool L-003533-00 人 RELA，SEQ ID No. :1_8)處理的 MDA-MB-231或MDA-MB-435S中，IR不再能誘導(dǎo)全長MET啟動子活性(圖2c)或者Met蛋白的聚積?？偠灾?，這些數(shù)據(jù)提供了令人信服的證據(jù)顯示IR誘導(dǎo)的MET上調(diào)需要轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B的活化。還考慮了 IR誘導(dǎo)的MET轉(zhuǎn)錄中涉及的低氧可誘導(dǎo)因子-1 (HIF-I)，因為(a)HIF_l被證明是在受輻射細胞中由ROS的形成而受到激活，和(b)HIF-l是顯著的MET表達調(diào)控齊U。然而，HIF-I的相關(guān)性很低，如補充方法所顯示。首先，在MDA-MB-231和MDA-MB-435S中，IR沒有誘導(dǎo)HIF-Ia亞基的核易位(其是HIF-I活化的標志)，其在當(dāng)細胞培養(yǎng)于低氧濃度下可以觀察到(圖2a)。在受輻射細胞中缺少HIF-I活化并非因為ROS生產(chǎn)變?nèi)酰驗镽OS在接觸IOGy下15min后平均增加了 25±3. 5%。根據(jù)之前對接觸I-IOGy的細胞系的觀察，推測其與輻射后2-5min平均80%的ROS誘導(dǎo)有夫。此外，已發(fā)現(xiàn)IR不能激活包括兩個功能性低氧響應(yīng)元件(HRE)的所謂的“最小”MET啟動子，和負責(zé)低氧誘導(dǎo)的MET上調(diào)的Ap-I位點?？偠灾?，這些數(shù)據(jù)顯示HIF-I不參與IR導(dǎo)致的MET上調(diào)。然而，觀察到低氧誘導(dǎo)了 p65/RelA的核易位和絲氨酸的磷酸化(圖2a)。最后，也排除了主要的IR-標靶一轉(zhuǎn)錄因子p53的參與的可能性。事實上，MDA-MB-435S和MDA-MB-231 (表現(xiàn)出最高IR誘導(dǎo)MET的兩種細胞系)帶有p53失活突變(分別為G266E和R280K)。此外，與鼠啟動子不同，人MET啟動子不被p53的結(jié)構(gòu)性活化狀態(tài)所上調(diào)。IR誘導(dǎo)的MET表達由ATM激酶活化介導(dǎo)NF- κ B是ー些同時由胞外和胞內(nèi)信號啟動的途徑的交叉點。胞內(nèi)信號包括由蛋白激酶ATM在檢測到DNA損傷后誘發(fā)的那些(信號)。為了考察IR誘導(dǎo)的MET是否依賴ATM激酶的活化，對MDA-MB-435S或MDA-MB-231用10 μ M的特異性小分子抑制劑CGK733進行了處理。在時間進程實驗中，CGK733防止了 IR誘導(dǎo)的特異性ATM底物Chk2磷酸化，以及p65/RelA核易位，和Met蛋白過表達。這些數(shù)據(jù)顯示ATM激酶對IR誘導(dǎo)的MET上調(diào)是必需的(圖3)。IR誘導(dǎo)的侵襲性生長需要MetMet過表達并不意味著在不存在胞外配體HGF下的激酶活化。然而，其引起配體依賴的信號傳導(dǎo)活性的顯著增加(即，敏化作用)。這已經(jīng)在低氧上調(diào)Met表達至與輻射誘導(dǎo)相當(dāng)或較低水平的細胞中被觀察到。本發(fā)明人從而考察了 IR誘導(dǎo)的Met過表達是否能誘發(fā)或增強Met依賴的生物響應(yīng)。這包括侵襲性生長的生理和病理方面。在評價細胞再生受傷組織(即，生理侵襲性生
長)的傷ロ愈合分析中，受輻射的MDA-MB-231和MDA-MB-435S均自發(fā)性地通過從傷ロ邊緣解離并在受損區(qū)域遷移而表現(xiàn)出愈合程序。經(jīng)24h監(jiān)測，該響應(yīng)與由HGF刺激引起的響應(yīng)相重疊，HGF也被稱為“分散因子”，因其促進細胞解離和移動。然而，IR引發(fā)的愈合響應(yīng)并非因為HGF自分泌循環(huán)的誘導(dǎo)，因為經(jīng)定量PCR測定，受輻射細胞沒有表達HGF。本發(fā)明人推斷IR誘導(dǎo)的Met過表達使得細胞對于存在于補充有I %血清的培養(yǎng)基中的少量HGF敏感。該條件可能模擬了 HGF在體內(nèi)的生理存在，其在胞外基質(zhì)中到處存在。然后對受輻射細胞進行了小室分析，檢測其體外侵入人工基底膜的能力，其與體內(nèi)侵入(即惡性侵襲性生長)密切關(guān)聯(lián)。事實上，受輻射細胞(例如MDA-MB-231、MDA-MB-435S或U-251)在低血清濃度(1% )下自發(fā)性跨越了小室基底膜(圖4a)，再一次模擬了由HGF引發(fā)的行為。IR將Met誘導(dǎo)的形態(tài)發(fā)生變?yōu)榍秩脒^程分枝化形態(tài)發(fā)生是ー個復(fù)雜的生理過程，其由HGF誘導(dǎo)從而在發(fā)育過程中產(chǎn)生三維的器官。該多步驟程序需要包括細胞遷移、増殖和空間重組，最終產(chǎn)生由極化細胞填充的中空分支細管。ー些研究的細胞系(例如MDA-MB-435S)可完整進行體外分枝化形態(tài)發(fā)生程序。接觸IR使得這些細胞對于次優(yōu)濃度(5nM)的外源性HGF敏感，該濃度獨自無法誘導(dǎo)分枝化形態(tài)發(fā)生(圖4b)。重要的是，HGF刺激的受輻射細胞構(gòu)建了結(jié)構(gòu)顯著改變的細管，因為細胞從腔外表面解離并傳播至周圍基質(zhì)中(圖4b)。該表現(xiàn)令人聯(lián)想到被描述為響應(yīng)TNF α?xí)r發(fā)生的異常形態(tài)發(fā)生形式的“三維分散(tridimensional scatter)”。結(jié)論是治療劑量的IR可能將生理分枝化形態(tài)發(fā)生改變?yōu)楫惓５拇偾秩脒^程。對Met的抑制使得細胞對IR誘導(dǎo)的凋亡和增殖捕獲敏感作為EMT/IG程序的一部分，Met通過包括P13-激酶/AKT在內(nèi)的下游途徑的持續(xù)活化發(fā)出強烈的杭-凋亡信號。本發(fā)明人從而推論，MET上調(diào)能夠預(yù)防輻射誘導(dǎo)的細胞死亡，而相反的，對Met的抑制能夠增強放射治療的功效。在DN30抗-Met抗體Fab片段存在下保存的受輻射細胞中觀察到細胞存活率降低(高達75% )，所述抗體已知能夠誘導(dǎo)MET的下調(diào)，并從而抑制MET的信號傳導(dǎo)和生物活性(Petrelli 等人，PNAS 103 :5090-5,2006)(圖 5)。這些結(jié)果表明Met抑制活性通過在治療后增加細胞死亡和降低重新増殖的能力而使得細胞對放射治療敏感。自然，雖然本發(fā)明的原則保持不變，但是其構(gòu)建和實施方式的細節(jié)可以根據(jù)僅通過實施例的方式進行描述和闡明的內(nèi)容進行廣泛的變化，而不會偏離本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.用于治療腫瘤患者的Met抑制劑，所述Met抑制劑選自 i)抗-Met單克隆抗體， )含有該抗-Met單克隆抗體的互補決定區(qū)(CDR)的遺傳工程化的抗體，和iii)含有該抗-Met單克隆抗體的互補決定區(qū)(CDR)的(i)或(ii)的片段，或其組合，其中所述Met抑制劑能夠誘導(dǎo)對MET基因所編碼的受體的下調(diào)和降低和/或去除患者對放射治療的抗性。
2.用于治療腫瘤患者的編碼Met抑制劑的核苷酸序列，所述Met抑制劑選自 i)抗-Met單克隆抗體， )含有該抗-Met單克隆抗體的互補決定區(qū)(CDR)的遺傳工程化的抗體，和 iii)含有該抗-Met單克隆抗體的互補決定區(qū)(CDR)的(i)或(ii)的片段， 其中所述Met抑制劑能夠誘導(dǎo)對MET基因所編碼的受體的下調(diào)和降低和/或去除患者對放射治療的抗性。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2的Met抑制劑或編碼Met抑制劑的核苷酸序列，其中所述Met抑制劑選自 i)DN30抗-Met單克隆抗體， ii)含有DN30抗-Met單克隆抗體的互補決定區(qū)(CDR)的遺傳工程化的抗體，所述CDR具有如SEQ ID NO. :12-14和20-22所示的氨基酸序列，和 iii)含有DN30抗-Met單克隆抗體的互補決定區(qū)(CDR)的(i)或(ii)的片段，所述⑶R具有如SEQ ID NO. :12-14和20-22所示的氨基酸序列，或其組合， 其中所述DN30抗-Met單克隆抗體是由雜交瘤細胞系ICLC PD05006嚴生的。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求3的Met抑制劑，其中所述Met抑制劑用于以可溶性蛋白的形式通過注射或輸液來進行給藥。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的所述編碼Met抑制劑的核苷酸序列，其中所述編碼所述Met抑制劑的核苷酸序列用于通過載體的方式來進行給藥，其中所述載體顆粒的形式。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的所述編碼Met抑制劑的核苷酸序列，其中所述載體適于靶向腫瘤或腫瘤相關(guān)的細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的所述編碼Met抑制劑的核苷酸序列，其中所述載體用于進行全身性或腫瘤內(nèi)給藥，優(yōu)選經(jīng)注射給藥。
8.根據(jù)前述任ー權(quán)利要求的Met抑制劑或編碼Met抑制劑的核苷酸序列，其中所述片段是Fab片段，優(yōu)選是含有至少ー種穩(wěn)定分子的Fab片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的Met抑制劑或編碼Met抑制劑的核苷酸序列，其中所述至少ー種穩(wěn)定分子選自聚こニ醇、白蛋白結(jié)合域、白蛋白。
10.根據(jù)前述任ー權(quán)利要求的Met抑制劑或編碼Met抑制劑的核苷酸序列，其中所述Met抑制劑和/或所述編碼所述Met抑制劑的核苷酸序列用于在對所述患者進行放射治療前至少一周進行給藥。
11.根據(jù)前述任ー權(quán)利要求的Met抑制劑或編碼Met抑制劑的核苷酸序列，其中所述Met抑制劑和/或所述編碼所述Met抑制劑的核苷酸序列用于在對所述患者進行放射治療前至少一天進行給藥。
12.根據(jù)前述任ー權(quán)利要求的Met抑制劑或編碼Met抑制劑的核苷酸序列，其中所述Met抑制劑和/或所述編碼所述Met抑制劑的核苷酸序列進行給藥直到放射治療結(jié)束后至少一周、優(yōu)選6_48小時。
13.根據(jù)前述任ー權(quán)利要求的Met抑制劑或編碼Met抑制劑的核苷酸序列，其中所述腫瘤選自癌、骨骼肌肉肉瘤、軟組織肉瘤、造血系統(tǒng)惡性腫瘤、腦腫瘤、黑色素瘤、間皮瘤、腎母細胞瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于增強放射治療功效的MET抑制劑。本發(fā)明涉及用于在癌癥患者治療中減輕和/或去除患者對放射治療抗性的Met抑制劑和/或編碼Met抑制劑的核苷酸序列，其中該Met抑制劑選自i)抗-Met單克隆抗體，ii)含有該抗-Met單克隆抗體的互補決定區(qū)(CDR)的遺傳工程化的抗體，和iii)含有該抗-Met單克隆抗體的互補決定區(qū)(CDR)的(i)或(ii)的片段，或其組合。
文檔編號A61P35/00GK102688491SQ20121008036
公開日2012年9月26日 申請日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者C·伯卡希奧, F·佩特隆澤利, P·M·科蒙利奧, R·德桑蒂斯 申請人:梅思爾斯平移研究有限公司