專利名稱：抗腫瘤壞死因子α的人源化抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及至少一種抗腫瘤壞死因子-a (TNFa)或其片段的人源化抗體，包括其特定部分或變體，以及編碼所述抗TNF a人源化抗體的核酸、其互補(bǔ)核酸、載體、宿主細(xì)胞及其制備方法和包含所述抗TNF a人源化抗體的組合物、試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人腫瘤壞死因子- a (TNFa)是由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種促炎性細(xì)胞因子，最初生成的是26kDa的前體蛋白，N端在胞內(nèi)，C端在胞外，稱為跨膜型TNF a，Pennica等1984年首先克隆了 TNF-α基因cDNA，并推導(dǎo)出人TNF-α分子由157個(gè)氨基酸組成，其分子量約為 17KD (Pennica D, et al，Nature 1984 ;312 :724)。A TNFa 有兩種分子形式， 即TNFa和TNFLTNFa是由激活的巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞產(chǎn)生，可引起腫瘤組織出血壞死，也稱惡病質(zhì)素JNF-β主要由活化的T淋巴細(xì)胞分泌，兩者有相似致熱性。TNFa作用于瘤細(xì)胞表面的受體，通過對(duì)細(xì)胞的識(shí)別、結(jié)合、內(nèi)吞進(jìn)入溶酶體，致溶酶體和蛋白酶類高度活化導(dǎo)致細(xì)胞死亡，它在免疫反應(yīng)、炎癥和對(duì)損傷反應(yīng)中起重要作用，主要影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒性、細(xì)胞溶解、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制增殖等作用，還能夠促進(jìn)髓樣白血病細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力。適量的TNF α能激活免疫系統(tǒng)從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，能夠在宿主抵抗微生物入侵和抑制腫瘤產(chǎn)生的防御系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用。但過量的TNFa表達(dá)時(shí)，可以與其它炎性因子一起產(chǎn)生多種病理損傷，因此可在不同水平上抑制或中和TNFa的活性，使其不能達(dá)到受體，進(jìn)而避免信號(hào)傳導(dǎo)引發(fā)的后果。為試圖克服使用非人源抗體造成的相關(guān)問題，通過構(gòu)建的人-鼠嵌合抗體來降低HAMA引發(fā)的機(jī)體免疫原性，已成為較為有效的治療策略。此種嵌合抗體就是將非人源抗體可變區(qū)移植到人抗體恒定區(qū)，保留了非人源抗體原有的重鏈、輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(參見，Daddona, P. E等的PCT公開W092/16553號(hào)，Le, J.等人的美國專利5，919，452號(hào)，Kang7Heui H等PCT公開W02005/047329號(hào)，金伯泉等的中國專利公開CN1544466A號(hào))，金宜慧等中國專利公開CN101177453號(hào)提供了一種新的與人腫瘤壞死因子結(jié)合和嵌合抗體，此種嵌合抗體相對(duì)于非人源抗體，其免疫原性雖有所降低，但是，由于嵌合抗體中鼠源化程度依然較高，從而可能導(dǎo)致不同程度的HAMA應(yīng)答反應(yīng)，具體表現(xiàn)為皮膚黏膜反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)、心律失常和心絞痛、腎功能不全，嚴(yán)重時(shí)甚至可能造成昏迷，此類嵌合抗體的臨床應(yīng)用受到了很大的限制。通過臨床試驗(yàn)證明，此種嵌合抗體作為異種蛋白作用于人體后，可引起機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)該異種蛋白的免疫排斥反應(yīng)，即人抗鼠抗體(Human anti mouse antibody,HAMA)應(yīng)答反應(yīng)，該反應(yīng)會(huì)使鼠源單抗在人體內(nèi)往往被快速清除，其半衰期也較短，重復(fù)用藥甚至可能導(dǎo)致病人嚴(yán)重的過敏性休克。而且，這些外來抗體可能受到免疫抗體的攻擊，其結(jié)果使得他們?cè)诔尸F(xiàn)藥效之前被中和掉。發(fā)明人在上述專利技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行了開發(fā)，為了盡可能的降低在嵌合抗體中的鼠源部分，可利用基因工程技術(shù)制備人源化抗體，即，將鼠源抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(Complementarity determining reign, (DRs)分別移植到人抗體骨架區(qū)(Framework region, FR),由此獲得的人源化抗體在其結(jié)構(gòu)上盡可能接近人類序列的同時(shí)，也能維持其與親本非人源抗體相似的CDR構(gòu)象。相對(duì)于親本非人源抗體和嵌合抗體，改造后的人源化抗體來源于親本非人源氨基酸序列減少，一方面保持了抗體識(shí)別抗原的能力；另一方面，極大降低了鼠源性抗體的免疫原性，從而提高了抗體在臨床應(yīng)用的安全性。因此，本發(fā)明提供了一種比現(xiàn)有技術(shù)中的小鼠嵌合抗體更加安全可靠的，在人體內(nèi)半衰期更長(zhǎng)、功能更顯著的人源化抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一方面提供了如本文所描述的至少一種抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體及特定的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、重鏈或輕鏈可變區(qū)、重鏈或輕鏈恒定區(qū)、構(gòu)架區(qū)或其任意部分。本發(fā)明的抗體可以包括或來源于任何哺乳動(dòng)物，例如，但不限于人、小鼠、大鼠、嚙齒 類動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物或其任意組合等。本發(fā)明的抗體特異性地結(jié)合至少一種TNF蛋白、其亞基、片段、部分或其任意組合的特定表位。所述至少一種表位可以包含至少一種抗體結(jié)合區(qū)。所述至少一種抗體可以任選地包含至少一種互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)(如重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū))和/或至少一種恒定或可變構(gòu)架區(qū)(FR)或其任意部分。所述至少一種抗體的氨基酸序列可以進(jìn)一步任選包含至少一種氨基酸殘基的插入、缺失或保守性置換。本發(fā)明再一方面提供了至少一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼至少一種本文的抗腫瘤壞死因子人源化抗體的多核苷酸，或者與所述編碼至少一種本文的的抗腫瘤壞死因子人源化抗體的多核苷酸相互補(bǔ)或者相雜交，所述抗體包含至少一種其特定序列、結(jié)構(gòu)域、部分或變體。本發(fā)明的再一方面提供了包含所述抗腫瘤壞死因子人源化抗體核酸分子的重組載體，包含所述核酸和/或重組載體的宿主細(xì)胞，以及所述核酸、載體和/或宿主細(xì)胞的制備方法和/或應(yīng)用。本發(fā)明的至少一種抗體具有至少一種活性，例如但不限于中和rhTNF α對(duì)L929靶向細(xì)胞展現(xiàn)的毒性、抑制和/或競(jìng)爭(zhēng)TNF與受體和/或其他單抗例如但不限于阿達(dá)木單抗的結(jié)合。本發(fā)明的再一方面提供了本發(fā)明的抗體和/或組合物在抑制人hTNF α活性的應(yīng)用，其中hTNFa有關(guān)的疾病可以是例如膿毒癥、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、肺功能紊亂、移植排斥、細(xì)菌性腦膜炎、腦型瘧、AIDS和AIDS相關(guān)綜合癥(ARC)、移植繼發(fā)的巨細(xì)胞病毒感染。本發(fā)明的再一方面提供了本發(fā)明的抗體和/或組合物在制備用于hTNFa的診斷性分析的藥物中的應(yīng)用，其中所述抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體還可以被檢測(cè)分子進(jìn)行標(biāo)記和/或不進(jìn)行標(biāo)記，所述標(biāo)記包括放射性同位素；熒光標(biāo)記；各種酶底物標(biāo)記。本發(fā)明的再一方面提供了本發(fā)明的抗體和/或組合物在分析方法中的應(yīng)用，其中所述分析方法包括競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析、直接或間接夾心分析或免疫沉淀分析。本發(fā)明的再一方面提供了至少一種組合物，所述組合物包括本發(fā)明的抗腫瘤壞死因子人源化抗體和/或其編碼核酸，一種或多種可以選自但不限于可藥用載體、賦形劑、稀釋劑、添加劑等的輔劑。所述組合物可以任選地進(jìn)一步包括至少一種其他抗體、核酸、輔劑或其任意組合。本發(fā)明的再一方面提供了包括預(yù)定量試劑和說明書的試劑盒，所述試劑包括本發(fā)明的抗體、核酸和/或組合物。所述試劑盒還包括酶所需的底物和輔因子。所述試劑盒還可以進(jìn)一步包括但不限于穩(wěn)定劑、緩沖劑等其他添加劑。


本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解下述附圖僅是為了舉例說明。這些附圖不是要以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。圖I顯示了抗體中和TNFa殺傷U937細(xì)胞作用曲線 圖2顯示了 II型膠原誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度在體評(píng)分圖3A顯示了 Tgl97小鼠關(guān)節(jié)炎在體評(píng)分，圖3B顯示了治療組對(duì)Tgl97小鼠的的組織病理學(xué)評(píng)價(jià)，圖3C顯示了治療組對(duì)Tgl97小鼠的關(guān)節(jié)炎評(píng)分(AS)和組織病理(HS)評(píng)分的影響。
具體實(shí)施例方式抗腫瘤壞死因子抗體本發(fā)明的抗體包含由任意合適的多核苷酸編碼的本文的抗體氨基酸序列，或任意分離的或制備的抗體。人源化抗體或抗原結(jié)合片段優(yōu)選結(jié)合人腫瘤壞死因子，并因此部分地、基本上地或者全部地中和人腫瘤壞死因子的至少一種生物活性，從而抑制由TNF與TNF受體相結(jié)合所介導(dǎo)的信號(hào)傳遞過程以及生理過程。本發(fā)明的人源化抗體可以是任意類型(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等)或同種型，可以包含K或λ輕鏈以及a，μ，γ，ε或δ重鏈。本發(fā)明的至少一種抗體結(jié)合至少一種TNF蛋白、其亞基、片段、部分或其任意組合的至少一種特定表位。本發(fā)明的至少一種抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體具有以下氨基酸序列，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO :1，并且所述抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示SEQ ID NO 1 QVQLVQSGPELKKPGASVKISCKASGYTFTHYGMHWVKQTPGRGLKWVGWINTYTGEPTYDADFQGRFTFSLETSVSTAFLQINSLKDEDLATYFCARYDFDGFDYWGQGTTLTVSSSEQ ID NO 2 ENVLTQSPPILSASPGERVTMTCRASSSITFNYLHWYQQKS⑶SPKVWIYSTSNLVSGVPSRFSGSGSGTSYSLTISSLEAEDAATYYCQQYSDYPYTFGGGTKLEIK其中所述重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R-Hl為SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列；⑶R-H2為SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列KDR-H3為SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列；其中構(gòu)架區(qū)FR-Hl內(nèi)氨基酸16的A能被E替換，氨基酸17的S能被T替換，氨基酸20的I能被V替換(SEQ ID NO : 11) ；FR-H2內(nèi)氨基酸3的K能被R替換，氨基酸9的G能被S替換(SEQ ID NO 12) ；FR-H3內(nèi)氨基酸3的T能被V替換，氨基酸7的E能被D替換，氨基酸10的V能被T替換，氨基酸14的F能被Y替換，氨基酸19的S能被T替換，氨基酸27的T能被V替換(SEQ ID NO 13);以及該人源化抗體的輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R-Ll為SEQID NO 6所示氨基酸序列；CDR_L2為SEQ ID NO 7所示氨基酸序列；CDR_L3為SEQ ID NO 8所示氨基酸序列，其中構(gòu)架區(qū)FR-Ll內(nèi)氨基酸11的L能被M替換，氨基酸18的R能被E替換，氨基酸21的M能被I替換(SEQ ID NO 14) ；FR-L2內(nèi)氨基酸13的W能被L替換(SEQID NO 15) ；FR-L3內(nèi)氨基酸4的S能被A替換，氨基酸22的L能被V替換，以及氨基酸27的A能被F替換(SEQ ID NO 16)。SEQ ID NO. 3 HYGMHSEQ ID NO 4 WINTYTGEPTYDADFQGSEQ ID NO 5 YDFDGFDYSEQ ID NO 6 RASSSITFNYLHSEQ ID NO 7 STSNLVSSEQ ID NO 8 QQYSDYPYTSEQ ID NO 9 QVQLVQSGPELKKPG (E/A) (T/S) VK (I/V) SCKASGYTFTHYGMHffV (K/R) QTPGR (S/G)LKffVGffINTYTGEPTYDADFQGRF(T/V)FSL(E/D)TS(T/V)STA(F/Y)LQIN(T/S)LKDEDLA(T/V)YFCARYDFDGFDYffGQGTTLTVSSSEQ ID NO: 10:ENVLTQSPPI (M/L) SASPGE (E/R) VT (M/I) TCRASSSITFNYLHWYQQKSGDSPKV (W/L)IYSTSNLVSGVP(A/S)RFSGSGSGTSYSLTISS(V/L)EAED(A/F)ATYYCQQYSDYPYTFGGGTKLEIKSEQ ID NO: 11:QVQLVQSGPELKKPG(E/A)(T/S)VK(I/V)SCKASGYTFTSEQ ID NO 12 WV (K/R) QTPGR (S/G) LKffVGSEQ ID NO :13:RF(T/V)FSL(E/D) TS(T/V)STA(F/Y)LQIN(T/S)LKDEDLA(T/V)YFCARSEQ ID NO :14:ENVLTQSPPI(M/L)SASPGE(E/R)VT(M/1) TCSEQ ID NO :15:WYQQKS⑶SPKV(W/L)IYSEQ ID NO :16:GVP(S/A)RFSGSGSGTSYSLTISS(V/L)EAED(A/F)ATYYC
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體的重鏈恒定區(qū)序列是人IgGl的重鏈恒定區(qū)序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體的輕鏈恒定區(qū)序列是人抗體的輕鏈恒定區(qū)序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體的氨基酸序列可通過插入、缺失或保守性替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選為1-3個(gè)氨基酸殘基而被修飾。通過一個(gè)或多個(gè)以任何組合形式存在的插入、缺失或保守性替換進(jìn)行修飾的或變異的單克隆抗體在氨基酸序列上有所差異。優(yōu)選的變異體中修飾是通過氨基酸保守性替換從上述本發(fā)明單克隆抗體中變化而來。所述保守性替換是指用性質(zhì)相似的另一個(gè)氨基酸取代指定的氨基酸。下列以非限制性方式例舉的氨基酸被認(rèn)為是可進(jìn)行保守性替換(性質(zhì)相似的)a)丙氨酸，絲氨酸和蘇氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷胺酰胺；d)精 氨酸和賴氨酸；e)異亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸和纈氨酸和f)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。根據(jù)本發(fā)明功能相當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w是一種變異體，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選為1-3個(gè)氨基酸殘基被保守性替換。保守性替換是指在芳香族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之間一個(gè)替換另一個(gè)；羥基殘基Ser和Thr之間的相互替換；酸性殘基Asp和Glu之間的相互替換；酰胺殘基Asn和Gln之間的相互替換；堿性殘基Lys和Arg之間的相互替換；芳香族殘基Phe和Tyr之間的相互替換。另外，本發(fā)明公開了與本文公開的氨基酸序列具有至少50%同源性的氨基酸序列，或其片段和功能相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄?。在一個(gè)實(shí)施方式中，該氨基酸序列與本文提供的氨基酸序列SEQ ID NO :1和2具有至少75%的同源性，較優(yōu)選為至少85%的同源性，更優(yōu)選為至少90%同源性，更為優(yōu)選的是至少95 %同源性，更加優(yōu)選至少97 %同源性，最優(yōu)選至少99%的同源性。各種形式的抗體被包括在本發(fā)明之中。例如抗hTNFa抗體可以是全長(zhǎng)的抗體(例如具有完整的人Fe區(qū))，或者抗體片段(如Fv，SCFv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’和(Fab，) 2)等。此外，抗體可以用可檢測(cè)的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，固定在固相載體上，和/或偶聯(lián)于異源化合物(如細(xì)胞毒性物質(zhì))。Fab是通過用蛋白酶/木瓜蛋白酶處理IgG抗體分子獲得的。這是具有大約50, 000的分子量并具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，其中在通過木瓜蛋白酶(在H鏈的224位切開氨基酸殘基)獲得的片段中，H鏈的大約一半N-端側(cè)和整個(gè)L鏈通過二硫鍵結(jié)合在一起。本發(fā)明的Fab也可以通過將編碼抗體的Fab的DNA插入到原核生物表達(dá)載體或真核生物表達(dá)載體中以表達(dá)Fab來生產(chǎn)。Fab’是具有抗體結(jié)合活性的抗體片段，由(Fab’)2鉸鏈區(qū)的二硫鍵切開而產(chǎn)生，分子量大約50，000，本發(fā)明的Fab’也可以通過將編碼抗體的Fab’片段的DNA插入到原核生物表達(dá)載體或真核生物表達(dá)載體中，并將載體導(dǎo)入到原核生物或真核生物中以表達(dá)Fab’來生產(chǎn)。(Fab’)2是具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，分子量為大約100,000.其中在用蛋白酶/胃蛋白酶(在第234個(gè)氨基酸殘基處切開H鏈)處理IgG抗體而獲得的片段中，F(xiàn)ab通過鉸鏈區(qū)中的二硫鍵連接在一起的抗體片段略大。本發(fā)明的(Fab’)2可以通過用胃蛋白酶處理抗體來生產(chǎn)。此外，本發(fā)明的(Fab’)2也可以通過用硫醚鍵或二硫鍵連接Fab’來生產(chǎn)。scFv是具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，是使用適當(dāng)?shù)碾慕宇^將一條鏈V1^P—條鏈Vl連接在一起。本發(fā)明的scFv的生產(chǎn)可以通過獲得編碼抗體的Vh和\的cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA，將編碼抗體的scFv的DNA插入到原核生物表達(dá)載體或真核生物表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物中表達(dá)scFv。核酸本發(fā)明的核酸編碼如SEQ ID NO :1_16中的至少一種、其特定片段、變體或共有序列的至少70-100%的連續(xù)氨基酸的核苷酸序列，可以根據(jù)本文所描述的或本領(lǐng)域公知的方法獲得編碼至少一種抗TNF抗體的本發(fā)明的核酸分子。

本發(fā)明的核酸分子可以是RNA形式，例如mRNA、hnRNA、tRNA或任意其它形式，或可以是DNA形式，包括，但不限于通過克隆或合成產(chǎn)生，或其任意組合而產(chǎn)生的cDNA和基因組DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈。DNA或RNA的至少一條鏈的任意部分可以是編碼鏈，也稱作有義鏈，或可以是非編碼鏈，也稱作反義鏈。如本文中所指出的，包含編碼抗TNF抗體的核酸的本發(fā)明的核酸分子可以包括，但不限于自身編碼抗體片段的氨基酸序列的核酸；完整抗體或其部分的編碼序列；抗體、片段或部分的編碼序列，以及其它的序列，例如至少一種信號(hào)前導(dǎo)肽或融合肽的編碼序列，它具有或不具有前面提到的其它編碼序列，如至少一種內(nèi)含子，同時(shí)具有其它的非編碼序列，包括，但不限于非編碼5’和3’序列，如在轉(zhuǎn)錄、mRNA加工，包括剪接和聚腺昔酸化信號(hào)中起作用(例如mRNA的核糖體結(jié)合和穩(wěn)定性)的轉(zhuǎn)錄的、未翻譯的序列；編碼其它氨基酸，如提供其它功能的氨基酸的其它序列。因此，編碼抗體的序列可以與標(biāo)記序列融合，例如與促進(jìn)包含抗體片段或部分的融合抗體純化的肽的編碼序列融合。本發(fā)明的核酸還包括選擇性與此處描述的多核苷酸雜交的多核苷酸。本發(fā)明的核酸可以利用本領(lǐng)域公知的(a)重組方法，(b)合成技術(shù)，(C)純化技術(shù)或其組合進(jìn)行制備。本發(fā)明的核酸如DNA、RNA、cDNA、基因組DNA或其任意組合可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何克隆方法從生物來源中獲得。在一些實(shí)施方案中，在嚴(yán)格條件下選擇性與本發(fā)明的多核苷酸雜交的寡核苷酸探針被用于鑒定cDNA或基因組DNA文庫中的所需序列。RNA的分離和cDNA以及基因組文庫的構(gòu)建是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的。可以采用基于本發(fā)明的多核苷酸序列的探針篩選cDNA或基因組文庫?？梢杂锰结樑c基因組DNA或cDNA序列雜交，以分離相同或不同生物體中的同源基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在測(cè)定中可以使用不同嚴(yán)格性程度的雜交，雜交或洗滌介質(zhì)中的任意一個(gè)都可以是嚴(yán)格的。當(dāng)雜交條件更嚴(yán)格時(shí)，探針和靶序列之間的互補(bǔ)性必須更高，這樣才能形成雙鏈體。嚴(yán)格性程度可以由溫度、離子強(qiáng)度、PH和甲酞胺等部分變性溶劑的存在中的一個(gè)或多個(gè)條件進(jìn)行控制。例如，雜交的嚴(yán)格性可以通過改變反應(yīng)物溶液的極性而方便地改變，反應(yīng)物溶液的極性可以通過例如在0% -50%的范圍內(nèi)操作甲酞胺的濃度而改變?？蓹z測(cè)的結(jié)合所要求的互補(bǔ)性程度(序列等同性)將根據(jù)雜交介質(zhì)和/或洗滌介質(zhì)的嚴(yán)格性而改變?；パa(bǔ)性程度最佳為100%或70-100%，或其中的任意范圍或任意值。然而，應(yīng)該理解，探針和引物中的小量序列變異可以通過減少雜交和/或洗滌介質(zhì)的嚴(yán)格性而補(bǔ)償。
擴(kuò)增RNA或DNA的方法是本領(lǐng)域公知的。已知的擴(kuò)增RNA或DNA的方法包括，但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和相關(guān)的擴(kuò)增方法和RNA介導(dǎo)的擴(kuò)增。本發(fā)明的核酸也可以根據(jù)已知方法通過直接化學(xué)合成而制備?；瘜W(xué)合成一般產(chǎn)生單鏈核苷酸，該單鏈核苷酸可以通過與互補(bǔ)序列雜交或通過用單鏈作為模板，采用DNA聚合酶進(jìn)行聚合而轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA。人源化單克隆抗體表達(dá)載體的構(gòu)建將含有人源化抗體重鏈可變區(qū)序列￥11基因片段的質(zhì)粒(PHu-Vh)作為模板，使用 5 '引物 FVHX (5，-CGCGCAAG-CTTCCTCGAG-3，SEQ ID NO : 17)和 3 '引物RVCG(5’CGATGGGCCCTTGGTGGA3’SEQ ID NO :18)得到5'片段，含有人源化抗體的重鏈可變區(qū)(Vh)和人IgG1重鏈恒定區(qū)(CY1)5,端的7個(gè)氨基酸的基因。在此同時(shí)，用從人白細(xì)胞制備的 RNA 以合適的 5'引物 HuCGF (5，-ACCAAGGGCCCATCGGTCTTC-3 ’ ； SEQ ID NO 19)和 3'引物 HUCGE (5，-CGGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGA 3’，SEQ ID NO 20)通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和 PCR得到含人IgG1重鏈恒定區(qū)(Cy1)編碼序列的基因。最后，將含有人源化抗體的重鏈可變區(qū)(Vh)的片段與以上的人Cy1基因通過PCR，用5'引物(FVHX，SEQ ID NO :17)和3'引物(HUCGE,SEQ ID NO :20)，將人源化抗體的重鏈可變區(qū)(Vh)和人Cy1基因片段連接起來，得到含有重鏈編碼序列、長(zhǎng)度約為HOObp的基因片段。此基因片段以內(nèi)切酶Hind III和EcoRl處理后，插入載體如 PUC19 (ref Yanisch-Perron, C.，Vieira, J. and Messing, J. (1985)Gene,33,103-119.)中。將含有人源化抗體輕鏈可變區(qū)序列\(zhòng)基因片段的質(zhì)粒(pHu-Vj作為模板，使用5'引物 FVHX(SEQ ID NO :17)和 3'引物 VKCKO(5，-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG CTTGAT CTC CAG CTT GGT GCC-3’ SEQ ID NO 21)得到Y(jié)片段，含有人源化抗體的輕鏈可變區(qū)(')和人K輕鏈恒定區(qū)(Ck)5'端的7個(gè)氨基酸的基因。在此同時(shí)，用從人白細(xì)胞制備的 RNA 以合適的 5'引物 HuCKF (5，-GTG GCT GCA CCA TCT GTCTTC-3，SEQ ID NO 22)和 3'引物 HUCKB(5，-TGC GGA TCC CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA-3，，SEQ ID NO 23)通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR得到含人K輕鏈恒定區(qū)(Ck)編碼序列的基因。最后，將含有人源化抗體的輕鏈可變區(qū)(VL)的片段與以上的人Ck基因通過PCR，用5'引物(FVHX，SEQ ID NO:17)和3'引物(HUCKB，SEQ ID NO :23)，將人源化的輕鏈可變區(qū)(Vj和人Ck基因片段連接起來，得到含有輕鏈編碼序列、長(zhǎng)度約為700bp的基因片段。此基因片段以內(nèi)切酶HindIII 和 BamHl 處理后，插入載體如 PUC19 (ref Yanisch-Perron, C. ,Vieira, J. and Messing,J. (1985)Gene, 33,103-119.)中。用上述方法中獲得的重鏈或輕鏈的編碼cDNA、或編碼其修改產(chǎn)物的cDNA插入到pcDNA3 (購自 Invitrogen USA, Carlsbad, CA USA)載體中，構(gòu)建 pHu_anti_TNF α 人源化表達(dá)載體。該表達(dá)載體質(zhì)粒含有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)所需的巨細(xì)胞病毒早期基因啟動(dòng)因子-增強(qiáng)子。同時(shí)，載體質(zhì)粒中含有可選擇標(biāo)記基因，從而在細(xì)菌中賦予氨芐青霉素抗性，而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中賦予G418抗性。另外，載體質(zhì)粒中含有DHFR基因，在合適的宿主細(xì)胞中，能以氨甲喋呤(Methotrexate，MTX，Sigma)共擴(kuò)增嵌合抗體基因和DHFR基因(參見，例如 Axel, R.，等人的美國專利 5，179，017 號(hào)；Kaufman, R.和 Sharp, P.，J. Mol. Biol. 159 601-621，1982)。抗體宿主細(xì)胞
本發(fā)明也涉及用重組載體基因工程化的宿主細(xì)胞，以及通過本領(lǐng)域公知的重組技術(shù)產(chǎn)生至少一種抗TNF抗體。多核苷酸可以任選與含有可選擇標(biāo)記的載體連接，用于在宿主中增殖。一般地，將質(zhì)粒載體導(dǎo)入一種沉淀物，例如磷酸鈣沉淀，或?qū)刖哂袔щ娭|(zhì)的復(fù)合物。宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域公知的。適當(dāng)?shù)妮d體是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的。可以通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE 一右旋糖昔介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陰離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它已知方法將載體構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。本發(fā)明的抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體的宿主細(xì)胞由中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary)衍生而得,經(jīng)包含抗-TNF α基因內(nèi)碼的質(zhì)粒轉(zhuǎn)殖,及隨后一系列嚴(yán)謹(jǐn)、特定的篩選過程獲得，其間包括藥物篩選、基因放大和單細(xì)胞克隆以建立最終的細(xì)胞株。本發(fā)明的宿主細(xì)胞中國倉鼠卵巢細(xì)胞株CHO HUAT 132于2011年3月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO. :C201117。 本細(xì)胞株的細(xì)胞能在無血清培養(yǎng)液中懸浮繁殖；在2升發(fā)酵罐中培養(yǎng)時(shí)，于16-20天培養(yǎng)周期結(jié)束后其分泌于培養(yǎng)液中抗-TNFa的水平將不低于每升一克(lg/L)。本細(xì)胞株所生產(chǎn)的抗-TNF α為人源化單克隆抗體。與TNFa結(jié)合活性本發(fā)明的抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體僅與重組人源腫瘤壞死因子(rhTNF α，標(biāo)靶分子)有特定親和力，不與其他任何蛋白分子交叉結(jié)合。在對(duì)其標(biāo)靶分子親和力的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)試中，可測(cè)得與阿達(dá)木單抗(阿達(dá)木單抗)相近的親和力。本發(fā)明的抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體還具有活性可以中和rhTNFa對(duì)L929靶向細(xì)胞展現(xiàn)的毒性，其EC50值與阿達(dá)木單抗的EC50值相似，在20. 4ng/mL至50ng/mL濃度范圍內(nèi)。治療用途抗hTNFa抗體可用于治療和預(yù)防TNF α有關(guān)的疾病，其中hTNF α有關(guān)的疾病可以是例如膿毒癥、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、肺功能紊亂、移植排斥、細(xì)菌性腦膜炎、腦型瘧、AIDS和AIDS相關(guān)綜合癥(ARC)、移植繼發(fā)的巨細(xì)胞病毒感染，以下進(jìn)一步討論本發(fā)明的抗體和抗體部分在治療hTNF α有關(guān)疾病的用途I)膿毒癥腫瘤壞死因子在膿毒癥病理學(xué)中已有確定地位，其生物學(xué)效應(yīng)包括低血壓、心肌抑制、血管漏出綜合癥、器官壞死等(參見例如美國專利5，231，024號(hào))，因此本發(fā)明的人源化抗體和抗體部分可用于治療任何臨床背景中得膿毒癥，包括膿毒癥性休克、內(nèi)毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒癥和毒性休克綜合癥。2)自身免疫性疾病已發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子在各種自身免疫疾病的病理生理學(xué)中起作用，例如，已發(fā)現(xiàn)TNFa參與激活組織炎癥并引起類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)破壞(參見例如美國專利5，231，024 號(hào)；Moeller，A.等(1990) Cytokine 2 :162-169 ;)，也發(fā)現(xiàn) TNF α 在糖尿病中參與促進(jìn)胰島細(xì)胞死亡和介導(dǎo)對(duì)少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒和誘導(dǎo)炎癥斑。本發(fā)明的人源化抗體和抗體部分可以用于治療自身免疫疾病，特別是那些與炎癥有關(guān)的自身免疫疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊髓炎、骨關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、變態(tài)反應(yīng)、多發(fā)性硬化癥、自身免疫性糖尿病、自身免疫性眼色素層炎和腎病綜合癥。3)惡性腫瘤已發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子在惡性腫瘤中參與誘導(dǎo)惡病質(zhì)、刺激腫瘤生長(zhǎng)、增強(qiáng)轉(zhuǎn)移潛力和介導(dǎo)細(xì)胞毒性。因此，可以使用本發(fā)明的抗體和抗體部分治療惡性腫瘤，抑制腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移和/或減輕惡性腫瘤繼發(fā)的惡病質(zhì)?？梢詫⒃摽贵w或抗體部分系統(tǒng)性給藥或局部給予該腫瘤部位。4)肺功能紊亂已知腫瘤壞死因子參與成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)的病理生理學(xué)，包括刺激白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞激活、細(xì)胞毒性導(dǎo)向肺細(xì)胞和誘導(dǎo)血管漏出綜合癥。因此，可以用本發(fā)明的抗體和抗體部分治療肺功能紊亂，包括成人呼吸窘迫綜合癥、慢性肺炎、肺結(jié)節(jié)病、肺纖維化和硅肺。

5)腸功能紊亂可以使用本發(fā)明的人抗體和抗體部分治療腸功能紊亂，例如特發(fā)性炎癥性腸病，該病包括兩種綜合癥，即局限性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎。6)移植已發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子可能是同種移植排斥和移植植物抗宿主病(GVHD)的關(guān)鍵介質(zhì)并參與介導(dǎo)在用導(dǎo)向T細(xì)胞受體CD3復(fù)合物的大鼠抗體0KT3抑制腎移植排斥時(shí)觀察到的副反應(yīng)(參見例如 Suthanthiran, M.和 Strom, T. B. (1994)New Engl, J. Med. 331 365-375)因此，可以用本發(fā)明的抗體和抗體部分抑制移植排斥，包括同種移植和異種移植排斥和抑制GVHD.7)傳染病可以用本發(fā)明的抗體和抗體部分治療傳染病，包括細(xì)菌性腦膜炎、腦型瘧、AIDS和AIDS相關(guān)綜合癥(ARC)以及移植繼發(fā)得巨細(xì)胞病毒感染，也可以用于減輕與傳染病有關(guān)的癥狀，包括因感染(例如流感)引起的發(fā)燒和肌痛和感染繼發(fā)的惡病質(zhì)(例如AIDS或ARC繼發(fā)的)。分析及診斷用途本發(fā)明抗體可以用在任何一種已知的分析方法中，例如競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析，直接或間接夾心分析和免疫沉淀分析。Zola,《單克隆抗體技術(shù)手冊(cè)》(Monoclone Antibodies ；AManual of Techniques), pp.147-158(CRC Press, Inc.,1987)。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析依賴于標(biāo)記過的標(biāo)準(zhǔn)物與被測(cè)樣品中分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合有限量抗體的能力。被測(cè)樣品中hTNFa的量與抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量成反比。為了方便測(cè)定被結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)物的量，通常令抗體在競(jìng)爭(zhēng)前或競(jìng)爭(zhēng)后不溶解，這樣就可以方便地將與抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物和分析物與未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物和分析物分離。夾心分析法涉及使用兩種抗體，各自結(jié)合待測(cè)蛋白不同的免疫原性部位或表位。在夾心分析中，被測(cè)樣品分析物與固定在固相載體上的第一抗體結(jié)合，然后第二抗體與分析物結(jié)合，由此形成不溶性三部分復(fù)合物。參見美國專利4，376，110。第二抗體本身可以是用可檢測(cè)部分標(biāo)記過的(直接夾心分析法)，或者利用被可檢測(cè)部分標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體來測(cè)定(間接夾心分析法)。例如，夾心分析法之一是ELISA，其中的可檢測(cè)部分是酶?？筯TNF a抗體還可用于hTNF a的診斷性分析中，例如檢測(cè)其在特定細(xì)胞、組織或血清中的表達(dá)。這種診斷方法可用于診斷自身免疫疾病等的病因?？贵w通常用可檢測(cè)分子進(jìn)行標(biāo)記。有許多標(biāo)記可以使用，它們可以大致如下分類(a)放射性同位素，例如 lllIn、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P*35S?？梢岳美纭冬F(xiàn)代免疫學(xué)方法》(Current Protocols in Immunology)第I和第2卷,Coligen等編，ffiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)中所述的方法以放射性同位素來標(biāo)記抗體，放射性可以利用閃爍計(jì)數(shù)法來測(cè)定，以利用免疫閃爍照相術(shù)來定位患病部位。(b)熒光標(biāo)記，例如稀土螯合劑(銪螯合劑)或螢光素及其衍生物，羅丹明及其衍生物，丹酰，麗絲胺，藻紅素和德克薩斯紅(Texas red)。熒光標(biāo)記可以利用例如上文《現(xiàn)代免疫學(xué)方法》中所述的方法與抗體偶聯(lián)。熒光可以利用熒光計(jì)來定量。(C)有各種酶底物標(biāo)記可供使用，而美國專利4，275，149公開了其中部分。所述的 酶通常催化可以用各種技術(shù)測(cè)定的生色底物的化學(xué)改變。例如，酶催化底物的顏色變化，這種變化可以用分光光度計(jì)來測(cè)定，或者，酶改變底物的熒光性或化學(xué)發(fā)光性。前文已經(jīng)說明了定量測(cè)定熒光變化的技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光底物因化學(xué)反應(yīng)而被電激發(fā)，并由此發(fā)光，發(fā)出的光可以被測(cè)定(例如利用化學(xué)光度計(jì))或向熒光受體供能。酶標(biāo)記包括例如熒光素酶(例如螢火蟲螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶；美國專利4，737，456)，螢光素，2，3- 二氫二氮雜萘二酮(2, 3-dihydrophthalazinediones).蘋果酸脫氫酶,脲酶、過氧化物酶如辣根過氧化物酶(HRPO)，堿性磷酸酶、b-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)，雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)，乳過氧化物酶，微過氧化物酶等。O’ Sullivan等在“制備用于酶免疫分析的酶-抗體偶聯(lián)物的方法”，《酶學(xué)方法》(”Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugatesfor use in Enzyme Immunoassay，，(Methods in Enzym. ) (J. Langone 和 H. Van Vunakis編)，Academic press, New York, 73 :147-166 (1981)中描述了酶與抗體偶聯(lián)的技術(shù)。酶-底物的組合物包括，例如(i)辣根過氧化物酶(HRP)和作為底物的氫過氧化物酶，其中的氫過氧化物酶使染料前體(例如鄰苯二胺(OPD)或鹽酸3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB))氧化；(ii)堿性磷酸酶(AP)和作為生色底物的對(duì)硝基苯磷酸；(iii)b-D-半乳酸酐酶(b-D-Gal)和生色底物(例如對(duì)硝基苯_b_D_半乳糖苷酶)或熒光底物4-甲基傘形酮-b-D-半乳糖苷酶。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說還有許多其它酶-底物組合。對(duì)這些組合的綜述可參見美國專利4275149和4318980。有時(shí)，標(biāo)記物與抗體間接偶聯(lián)。技術(shù)人員也知道各種獲得所述組合物的方法。例如，抗體可以與生物素(biotin)偶聯(lián)，上述三大類標(biāo)記中的任何一種都可以與親和素偶聯(lián)，或者正相反。生物素選擇性地結(jié)合親和素，標(biāo)記可以間接方式與抗體偶聯(lián)?；蛘?，為了將標(biāo)記與抗體間接偶聯(lián)，抗體可以與小的半抗原(例如地高辛)偶聯(lián)，而上述不同類型的標(biāo)記之一與抗半抗原抗體(例如抗地高辛抗體)偶聯(lián)。這樣就獲得的標(biāo)記與抗體的間接偶聯(lián)。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，抗hTNFa抗體不必被標(biāo)記，其存在可以利用標(biāo)記過的結(jié)合該hTNFa抗體的抗體來檢測(cè)。親和純化試劑
本發(fā)明的抗體可以用作親和純化試劑。在這種方法中，抗體利用本領(lǐng)域公知的方法固定在例如S印hadex樹脂或?yàn)V紙的固相上。被固定的抗體與待純化的含hTNFa的樣品接觸，然后用合適的溶劑洗滌載體，所述的溶劑能夠基本上去除樣品中除了與固定化抗體結(jié)合的hTNFa之外所有其它物質(zhì)。藥用組合物和給藥方式可以將本發(fā)明的抗體和抗體部分加入適于給予受治療者的藥物組合物中，其中，該藥物組合物包括本發(fā)明抗體和可藥用賦形劑，藥用賦形劑包括任何所有的生理適用的溶劑、分散介質(zhì)、抗菌劑、抗真菌劑、等滲劑、包衣、吸收延遲劑等等。本發(fā)明的藥物組合物可以有各種形式，包括例如液半固體和固體劑量形式?？蓪⒃谒帉W(xué)上可接受的劑型中的本發(fā)明抗-hTNFa抗體，用已知方法施用于人。所述方法包括在靜脈內(nèi)(例如靜脈注射濃縮藥團(tuán)(bolus)或在一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)輸注)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓腔內(nèi)、皮下、動(dòng)脈內(nèi)、滑模腔內(nèi)、鞘內(nèi)注射、口服、局部或吸入途經(jīng)使用。抗 體還可合適地通過瘤內(nèi)、瘤周圍、損傷部位內(nèi)、損傷部位周圍的途經(jīng)給藥，以發(fā)揮局部和全身的治療效果。腹膜內(nèi)途經(jīng)預(yù)計(jì)特別有用，例如對(duì)于治療卵巢癌。為了預(yù)防或治療疾病來說，抗體的合適劑量將取決于上述定義的待治疾病的類型、疾病的嚴(yán)重程度和病程、抗體給予是用來預(yù)防還是用來治療、以前的治療情況、患者病史和對(duì)抗體的應(yīng)答性，以及主治醫(yī)師的獨(dú)立判斷。抗體適合一次性或系列地給患者使用。根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，不論是一次或多次分開給藥，還是連續(xù)輸注。I微克/公斤至50毫克/公斤(例如O. 1-20毫克/公斤)的抗體是給患者使用的最初候選劑量。典型的日劑量或周劑量可在約I毫克/公斤-20毫克/公斤或以上，這取決于上述提到的因素。對(duì)于幾天或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的重復(fù)給藥(這取決于病況)來說，治療需持續(xù)直至疾病癥狀發(fā)生所期望的抑制。但是，也可以使用其它給藥方案。所述治療的進(jìn)展可以方便地利用常規(guī)技術(shù)和分析方法來監(jiān)測(cè)。產(chǎn)品I)注射劑本發(fā)明另一實(shí)施方案提供了一種含有用于治療上述疾病的材料的產(chǎn)品。該產(chǎn)品包括容器和標(biāo)簽。合適的容器包括例如普通瓶、藥瓶、注射器和試管。容器可以用各種材料制成，例如玻璃或塑料。容器中含有治療疾病的有效組合物，并具有一個(gè)無菌的出入口(例如容器可以是一個(gè)有塞子的靜脈輸液袋或藥瓶，該塞子可用皮下注射針頭穿透)。該組合物中的有效成分是抗hTNFa抗體。容器上或與容器相聯(lián)的標(biāo)簽說明組合物所治療的特定病癥。產(chǎn)品還可以含有另一個(gè)容器，其中包含藥學(xué)上可接受的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液、林格式(Ringer)溶液和葡萄糖溶液。根據(jù)商業(yè)上的需要或使用者的需要，它還可以包括其他材料，例如其他緩沖液、稀釋齊U、濾器、針頭、注射器、以及附有使用說明的包裝說明書。2)緩釋制劑本發(fā)明的抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體可以用于制備緩釋制劑。合適的緩釋制劑包括例如包含所述抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質(zhì)體，所述的基質(zhì)體是有形的物體，例如膜或微膠囊。合適的緩釋基質(zhì)體包括例如聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美國專利3，773，919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、非降解性乙烯乙酸乙烯酯、諸如Lupron DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和Ieuprolideacetate組成的可注射微球)之類可降解乳酸_乙醇酸共聚物和聚_D-(-)_3-羥基丁酸。諸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之類聚合物能夠使分子釋放持續(xù)100天以上，有些水凝膠可在較短的時(shí)間內(nèi)釋放蛋白質(zhì)。當(dāng)膠囊化的抗體在體內(nèi)保留較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，它們可能會(huì)因?yàn)樵?7°C接觸水分而變性或凝聚，結(jié)果造成生物活性降低并可能造成免疫原性改變。根據(jù)有關(guān)的機(jī)制可以設(shè)計(jì)出合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)凝聚機(jī)制是通過硫-二硫鍵互換反應(yīng)而形成了分子間的S-S鍵，穩(wěn)定化可以是通過修飾巰基殘基、凍干酸性溶液、控制含水量、使用合適的添加劑和設(shè)計(jì)特殊的聚合基質(zhì)組合物而達(dá)到。試劑盒為了方便，本發(fā)明抗體可以試劑盒的形式提供，即將預(yù)定量的試劑與進(jìn)行診斷分析的說明書的包裝組合在一起。如果抗體是用酶標(biāo)記的，試劑盒將包含酶所需的底物和輔因子(例如提供可測(cè)定的生色團(tuán)和熒光團(tuán)的底物前體)。此外，還可能包括其他添加劑，例如穩(wěn)定劑、緩沖劑(例如封閉緩沖劑或裂解緩沖劑)等。為了使所提供的試劑濃度能使得分析的靈敏度最高，各種試劑的相對(duì)量變化很大。具體地說，試劑可以是干粉，通常是凍干 粉末形式的，可包括賦形劑在內(nèi)，它們一經(jīng)溶解將形成具有合適濃度的試劑溶液。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York ；Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例實(shí)施例I :抗hTNFa鼠單克隆抗體的生產(chǎn)I)免疫將重組hTNFa (rhTNF a，購自P印ro Tech Inc.)對(duì)一些7至11周齡的雌性Balb/c小鼠進(jìn)行IP或ID免疫，這些重組人TNFa采用等體積的TITERMAX或弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，其最終體積為100-400 μ L0每只小鼠在1-7，5-12，10-18，17-25和/或21-34天后用等體積TITERMAX或弗氏不完全佐劑乳化的TNF進(jìn)行IP (1-400 μ g)和SC(1400y gX2)免疫。12-25和25-40天之后可以通過不抗凝條件下的框后穿刺而從小鼠取血。然后使血液在RT下凝固I小時(shí)，收集血清，根據(jù)已知的方法采用TNFaELA測(cè)定滴度。當(dāng)重復(fù)注射不導(dǎo)致滴度增加時(shí)進(jìn)行融合。此時(shí)，可以用稀釋于100 μ L生理鹽水的1-400 μ g TNFa給予小鼠最后一次加強(qiáng)注射。3天后，通過斷頸椎處死小鼠，在無菌條件下取出脾，浸入含有1000U/mL青霉素、100 μ g/mL鏈霉素、和0. 25 μ g/mL兩性霉素B (PSA)的IOmL冰冷鹽酸緩沖鹽水(PBS)。通過用PSA-PBS無菌灌注脾而收獲脾細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色排除法計(jì)數(shù)，并且重懸于含 25mM!fepes 的 RPMI 1640 培養(yǎng)基。2)小鼠血清測(cè)試用PBS 中的 2 μ g/mL TNFa 包被平板過夜。在含有 O. 02% (v/v) Tween20 的(λ 15M鹽水中洗滌后，用PBS中的I % (w/v)BSA，以200 μ L/孔在RT下封閉各個(gè)孔I小時(shí)。立即使用平板或在_20°C下冷凍，以便將來使用。在TNF a包被的板上以50 μ L/孔在RT下孵育小鼠血清稀釋液I小時(shí)。洗滌平板，然后用1% BSA-PBS中I : 30000特異性稀釋的50 μ L/孔HRP標(biāo)記的IgG Fe在RT下探測(cè)I小時(shí)，再次洗滌平板，在RT下加入100 μ L/孔檸檬酸鹽-磷酸鹽底物溶液(O. IM檸檬酸和O. 2Μ硫酸鈉，0. 01% H2O2和lmg/mL 0PD) 15分鐘，然后加入25 μ L/孔終止溶液(4N硫酸)，在490nm下通過自動(dòng)平板分光光度計(jì)讀出OD值。3)細(xì)胞融合將血清測(cè)試鑒定出的，具有高水平抗hTNFa抗體血清的小鼠存活脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，兩者比例為I : I至10 : I。作為非限制性的實(shí)例，將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞一起沉淀，然后在37°c下，在lmL50% (w/v) PEG/PBS溶液(PEG分子量1450，sigma)中重懸沉淀30秒以上。然后通過緩慢加入10. 5mL含有25mM Hepes (37°C )的RPMI 1640培養(yǎng)基I分鐘以上，以便終止融合。以500-1500rpm將融合細(xì)胞離心5分鐘。然后將細(xì)胞重懸于 HAT 培養(yǎng)基(RPMI 1640 培養(yǎng)基，含有 25mMH印es，10% Fetal Clone I 血清(Hyclone)，ImM丙酮酸鈉，4mM L-谷氨酰胺，10 μ g/mL慶大霉素，2. 5% Origen培養(yǎng)補(bǔ)充物(Fisher)，10% 653調(diào)節(jié)的RPMI 1640/Hepes培養(yǎng)基，50 μ M 2-巰基乙醇，100 μ M次黃嘌呤和16 μ M胸苷)，并且以200 μ L/孔平鋪于15個(gè)96孔平底組織培養(yǎng)板。然后將板置于含有5% CO2和95%空氣的潮濕的37°C孵育器中7-10天。 實(shí)施例2 :抗hTNFa鼠源抗體的定性抗hTNFa抗體的定性有兩種測(cè)定法。一種方法是測(cè)定抗體對(duì)阿達(dá)木單抗與hTNFa的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，另一種方法是測(cè)定抗體在L929細(xì)胞毒性測(cè)定中中和hTNFa的能力。下文中分別對(duì)這兩種方法及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了描述。I)與阿達(dá)木單抗的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗hTNFa人抗體阿達(dá)木單抗作為試劑。將rhTNF(50y 1,0. 05g/mL)包被酶標(biāo)板，室溫過夜。棄去包被溶液，用溶解在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的1%脫脂奶封閉各孔O. 5小時(shí)，用含有O. 05%吐溫(Tween) 20的PBS洗孔。然后每孔加入50 μ I生長(zhǎng)培養(yǎng)基與50 μ I HRP標(biāo)記的阿達(dá)木單抗的混合液。以未標(biāo)記的阿達(dá)木單抗和不含抗體的培養(yǎng)基分別作為陽性與陰性對(duì)照。以此方法可篩選出含有高能力抑制HRP標(biāo)記阿達(dá)木單抗與rhTNF a結(jié)合的鼠單克隆抗體。將含有抑制HRP標(biāo)記阿達(dá)木單抗與rhTNF a結(jié)合的孔放大并亞克隆，繼續(xù)進(jìn)一步分析數(shù)個(gè)表現(xiàn)出此抑制作用的鼠單克隆抗體，最后篩選出二雜交瘤細(xì)胞。將此二雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，取澄清液提純，得鼠單克隆抗體TM2-11-12與TM2-6-3。以純化的鼠單克隆抗體TM2-11-12與TM2-6-3進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定，鼠抗體TM2-6-3在高達(dá)I μ g/mL濃度時(shí)，只能競(jìng)爭(zhēng)掉約50%阿達(dá)木單抗與hTNF a的結(jié)合。另一個(gè)鼠抗體TM2-11-12則顯示與未標(biāo)記的阿達(dá)木單抗具有同等優(yōu)良的競(jìng)爭(zhēng)能力，在大約O. 05 μ g/mL濃度時(shí)(相當(dāng)于3 X ΙΟ,Μ)，即可競(jìng)爭(zhēng)掉約50%阿達(dá)木單抗與hTNF a的結(jié)合2)抗hTNF a鼠源抗體的定性體外中和hTNF a的活性測(cè)定抗hTNF a鼠源抗體與嵌合抗體中和hTNF a的生物活性皆可用L929細(xì)胞毒性測(cè)定，方法如下所述。將96孔培養(yǎng)板的每孔注入共7. 5X103L929細(xì)胞(ATCC) (105/mL，75 μ I)，置于37°C 5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)24小時(shí)。L929細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基為含有5%胎牛血清的RPMI-1640 (GIBCO)。用另一塊96孔培養(yǎng)板將含有抗hTNF a抗體的溶液用RPMI生長(zhǎng)培養(yǎng)基雙份進(jìn)行1/2連續(xù)稀釋，并加入rhTNF a使每個(gè)樣品孔rhTNF a的最終濃度為5ng/mL，將有混合液的培養(yǎng)板放在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2小時(shí)后，再將含有抗體與rhTNF a的混合液加入L929細(xì)胞孔內(nèi)，每行各孔抗體濃度依次為O. 001至2 μ g/mL。將此培養(yǎng)板置入37°C，5%C02。3天后測(cè)存活細(xì)胞時(shí)，加入20 μ I PBS中有2. 5mg/mL溴化3 (4，4-二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基-四唑翁(MTT ;購自Sigma Biochemicals)在37°C培育4小時(shí)，再加入100 μ I O. OlN HCl中有10%十二烷基硫酸鈉(SDS)過夜。其后測(cè)定每孔于540/690nm光密度。將光密度度數(shù)與抗體濃度繪制曲線。分析結(jié)合曲線得IC5tl，即在此抗體濃度時(shí)，50%的rhTNF α對(duì)L929細(xì)胞的毒性可被中和。因此可用IC5tl值來比較個(gè)抗體抑制hTNF α細(xì)胞毒性的能力。數(shù)個(gè)抗hTNFa鼠源抗體(ΤΜ2-11-12，ΤΜ2-10-20，ΤΜ2-2-2)的IC5tl值與阿達(dá)木單抗的IC5tl值皆在O. 01至O. 04 μ g/mL濃度范圍內(nèi)，即皆具有相似的能力中和rhTNF a引起的L929細(xì)胞毒性?？筯TNFa鼠源抗體TM2-11-12被選作進(jìn)一步制備嵌合抗體。實(shí)施例3 :克隆TM2-11-12鼠源抗體的重鏈和輕鏈1)TM2-11-12鼠源抗體的重鏈可變區(qū)的克隆為設(shè)計(jì)鼠源抗體的人源化，首先須獲得含鼠源抗體TM2-11-12重鏈和輕鏈可變區(qū)編碼序列的DNA片段。用RNA純化試劑盒(Invitrogen Corp.)從TM2-11-12小鼠雜交瘤細(xì)胞分離出RNA,以此制備cDNA(GeneRacer試劑盒，Invitrogen Corp.)。通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)使用 5，引物(5，-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3，，SEQ ID NO 24)和 3’ 引物 (5’-TCCAGGGGCCAGTGGATAGAGAGA-3’，SEQ ID NO :25)從 cDNA 中分離重鏈可變區(qū) DNA 片段，3’引物與小鼠IgGl重鏈恒定區(qū)同源反義。將這些得到的DNA片段克隆進(jìn)TOPO TA載體(Invitrogen)并測(cè)序。重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO :34),互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸殘基為 CDR-Hl (SEQ ID NO 3), CDR-H2 (SEQ ID NO 4)和 CDR-H3 (SEQ ID NO :5)?；パa(bǔ)決定區(qū)的定義參見 Kabat E.等人的 Sequences of Proteins of Immunological Interest 第5 版 U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242。2)TM2-11-12鼠源抗體的輕鏈可變區(qū)的克隆以類似重鏈可變區(qū)克隆的PCR方法，使用SEQ ID NO :29作為5’引物和另一個(gè)與小鼠免疫球蛋白K輕鏈恒定區(qū)同源反義的3’引物(5’-CACTGGATGGTGGGAAGATGGATA-3’，SEQID NO :26)，從cDNA中分離輕鏈可變區(qū)DNA片段。將這些得到的DNA片段克隆進(jìn)Τ0Ρ0ΤΑ載體并測(cè)序，發(fā)現(xiàn)有兩類克隆。約3/4的克隆顯示部分核苷酸序列不能翻譯成能夠通讀的氨基酸序列(未顯示其序列)。此類克隆為畸變輕鏈信使RNA，不能編碼有功能的抗體輕鏈蛋白。另外約1/4的克隆顯示的核苷酸序列則可完全翻譯為能夠通讀的氨基酸序列，此類克隆衍生于有功能的輕鏈信使RNA。將這些得到的DNA片段克隆進(jìn)Τ0Ρ0 TA載體(Invitrogen)并測(cè)序。輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO :35)，互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸殘基為CDR-Ll (SEQID NO 6), CDR-L2 (SEQ ID NO 7)和 CDR-L3 (SEQ ID NO :8)。此氨基酸序列用于輕鏈的人源化設(shè)計(jì)。實(shí)施例4 :重鏈與輕鏈可變區(qū)的人源化設(shè)計(jì)為了保留抗原結(jié)合的活性，在人源化過程中所有輕鏈和重鏈高變區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基仍然沿用TM2-11-12鼠源抗體的序列。人源化設(shè)計(jì)則是依照人抗體的序列改變構(gòu)架區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基，設(shè)計(jì)了具有各種不同修飾的人源化抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，將抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的寡核苷酸位點(diǎn)進(jìn)行定向誘變。以增加抗體結(jié)合親和力或減小抗體免疫原性。對(duì)于人源化抗體重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 1)而言，其中構(gòu)架區(qū)FR-Hl內(nèi)氨基酸16的A能被E替換，氨基酸17的S能被T替換，氨基酸20的I能被V替換；FR_H2內(nèi)氨基酸3的K能被R替換，氨基酸9的G能被S替換；FR-H3內(nèi)氨基酸3的T能被V替換，氨基酸7的E能被D替換，氨基酸10的V能被T替換，氨基酸14的F能被Y替換，氨基酸19的S能被T替換，氨基酸27的T能被V替換。對(duì)于抗體人源化輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 2)而言，構(gòu)架區(qū)FR-Ll內(nèi)氨基酸11的L能被M替換，氨基酸18的R能被E替換，氨基酸21的M能被I替換；FR_L2內(nèi)氨基酸13的W能被L替換；FR-L3內(nèi)氨基酸4的S能被A替換，氨基酸22的L能被V替換，以及氨基酸27的A能被F替換。通過導(dǎo)入上述氨基酸修飾中至少一個(gè)修飾，設(shè)計(jì)多種人源化抗體重輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，部分人源化抗體重鏈可變區(qū)Vh、輕鏈可變區(qū)\氨基酸序列如表I所示表I :人源化抗體重鏈可變區(qū)Vh、輕鏈可變區(qū)\氨基酸序列
權(quán)利要求
1.ー種抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈具有SEQ ID NO: I所示或與其具有至少75%的同源性的氨基酸序列，且所述輕鏈具有SEQID NO :2所示或與其具有至少75%的同源性的氨基酸序列。
2.ー種抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈具有SEQ ID NO: I所示或與其具有至少75%的同源性的氨基酸序列，且所述輕鏈具有SEQID NO 2所示或與其具有至少75%的同源性的氨基酸序列，其中所述重鏈和/或輕鏈通過插入、缺失或保守性置換其中的I 5個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行修飾。
3.如權(quán)利要求I或2所述的抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體，其中所述重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R-Hl為SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列fDR-H2為SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列ADR-H3為SEQID NO 5所示的氨基酸序列；其中構(gòu)架區(qū)FR-Hl內(nèi)氨基酸16的A能被E替換，氨基酸17的S能被T替換，氨基酸20的I能被V替換(SEQ ID NO : 11) ；FR-H2內(nèi)氨基酸3的K能被R替換，氨基酸9的G能被S替換(SEQ ID NO : 12) ；FR-H3內(nèi)氨基酸3的T能被V替換，氨基酸7的E能被D替換，氨基酸10的V能被T替換，氨基酸14的F能被Y替換，氨基酸19的S能被T替換，氨基酸27的T能被V替換(SEQ ID NO : 13)；以及該人源化抗體的輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R-Ll為SEQ ID NO 6所示氨基酸序列ADR-L2為SEQ ID NO :7所示氨基酸序列；CDR-L3為SEQ ID NO :8所示氨基酸序列，其中構(gòu)架區(qū)FR-Ll內(nèi)氨基酸11的L能被M替換，氨基酸18的R能被E替換，氨基酸21的M能被I替換(SEQID NO 14) ；FR-L2內(nèi)氨基酸13的W能被L替換(SEQ ID NO 15) ；FR-L3內(nèi)氨基酸4的S能被A替換，氨基酸22的L能被V替換，以及氨基酸27的A能被F替換(SEQ ID NO 16)。
4.編碼如權(quán)利要求1-3中任ー項(xiàng)所述的抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體的核酸序列。
5.包括如權(quán)利要求4所述的核酸序列的載體。
6.如權(quán)利要求5所述的載體，其中所述載體也包括與所述核酸可操作性連接以有利于其表達(dá)的啟動(dòng)子。
7.包含如權(quán)利要求5或6所述的載體的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求1-3中任ー項(xiàng)所述的抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體在制備用于hTNFa的診斷性分析的藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求1-3中任ー項(xiàng)所述的抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體在制備用于治療hTNFa有關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中所述的hTNFa有關(guān)的疾病是膿毒癥、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、肺功能紊亂、移植排斥、細(xì)菌性腦膜炎、腦型瘧、AIDS和AIDS相關(guān)綜合癥(ARC)、移植繼發(fā)的巨細(xì)胞病毒感染。
11.包括如權(quán)利要求1-3中任ー項(xiàng)所述的抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體的藥物組合物，其中所述藥物組合物包括抗hTNF a人源化抗體和可藥用賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體及其應(yīng)用，所述抗腫瘤壞死因子人源化單克隆抗體相比現(xiàn)有的小鼠嵌合抗體，在保持了抗體識(shí)別抗原的能力的同時(shí)，極大降低了鼠源性抗體的免疫原性，從而提高了抗體在臨床應(yīng)用的安全性。
文檔編號(hào)A61P11/00GK102675460SQ201210026698
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月28日
發(fā)明者劉瑞賢, 周若蕓, 孫乃超, 張經(jīng)緯, 彭育才, 朱保國, 李強(qiáng), 胡振湘, 金宜慧, 陶德勝 申請(qǐng)人:珠海市麗珠單抗生物技術(shù)有限公司