專利名稱：視黃酸在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
視黃酸在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及視黃酸促進(jìn)細(xì)胞RXRa蛋白表達(dá)的新應(yīng)用。
背景技術(shù)：
視黃酸，又稱維生素甲酸、維甲酸、異維A酸等，是動物體內(nèi)維生素A的代謝中間產(chǎn)物。分子式=C20H28O2,分子量300. 44，CAS號302-79-4，熔點180°C。人體攝入β _胡蘿卜素后，會在需要時被人體轉(zhuǎn)換成維生素Α。維生素A的功能是通過不同的分子形式實現(xiàn)的 對于視覺起作用的是視黃醛，對生殖過程起作用的是視黃醇，而視黃酸及其代謝產(chǎn)物則對其它功能具有重要作用。自然界大約有100種化學(xué)結(jié)構(gòu)與β胡蘿卜素相似的類胡蘿卜素 (carotenojds).主要存在于黃色或紅色的植物中。β _胡蘿卜素在腸道被腸粘膜β _胡蘿卜素加氧酶氧化生成2個分子的視黃醇，即維生素A (簡稱VA)。后者被吸收入體內(nèi)被氧化成視黃醛，再進(jìn)一步被氧化成視黃酸(又稱維甲酸retinoic acid簡稱RA)，視黃酸是一種脂溶性的小分子物質(zhì)，屬于維生素A的衍生物，是細(xì)胞生長、分化增殖、凋亡的調(diào)節(jié)因子，參與胚胎發(fā)育、組織分化、腫瘤生長等過程。視黃酸必需與其受體，即視黃酸受體結(jié)合后，形成蛋白質(zhì)-核酸的結(jié)合形式才能發(fā)揮生物學(xué)作用。
視黃酸的受體包括兩類視黃酸受體(RAR)和視黃醇類X受體(RXR)，RAR和R)(R作為細(xì)胞內(nèi)獨立而又相互關(guān)聯(lián)的兩大受體信號系統(tǒng)，它們又分別包括α，β和Y三種亞型， 每種亞型在各種組織和細(xì)胞中的表達(dá)不同，導(dǎo)致其多重、復(fù)雜的生理功能。
RXR是留體激素受體超家族中研究較為深入的成員。由于它能與其他核受體形成異源二聚體，調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而產(chǎn)生不同的生物效應(yīng)，其選擇性配體可作為治療淋巴瘤、皮膚癌和糖尿病等疾病潛在的藥物。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種視黃酸的新應(yīng)用，即視黃酸在制備促進(jìn)細(xì)胞RXRa 蛋白表達(dá)藥物中的應(yīng)用，視黃酸在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明同時要求保護(hù)視黃酸作為調(diào)控乳腺癌增殖的生物標(biāo)記物的應(yīng)用。
為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是以人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231為研究對象，觀察視黃酸(ATRA)對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響及ATRA對細(xì)胞RXRa蛋白表達(dá)水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(1)在100 1000 nM/L范圍內(nèi)，ATRA可抑制細(xì)胞的增殖，并且存在 ATRA的濃度依賴性，即ATRA濃度越高，對MDA-MB-231細(xì)胞的生長抑制效果越明顯；O) 100 nM/L的ATRA作用乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-23148h后，可抑制細(xì)胞的增殖；(3) 100 1000 nM/ L的ATRA作用乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞72小時后，可誘導(dǎo)RXR α的表達(dá)增加，并且存在 ATRA的濃度依賴性，即ATRA濃度越高，誘導(dǎo)RXR α的表達(dá)越明顯。
因此，本發(fā)明要求保護(hù)視黃酸在制備促進(jìn)細(xì)胞RXRci蛋白表達(dá)藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選的技術(shù)方案中，視黃酸的濃度為lOOnm/L以上，并且作用時間為48小時以上。
本發(fā)明要求保護(hù)視黃酸在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選的技術(shù)方案中，視黃酸的濃度為lOOnm/L以上，并且作用時間為48小時以上。
本發(fā)明要求保護(hù)視黃酸作為調(diào)控乳腺癌增殖的生物標(biāo)記物的應(yīng)用。
由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點1.本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)濃度為lOOnm/L以上的視磺酸作用人乳腺癌細(xì)胞48小時以上后可以促進(jìn)細(xì)胞RXRa蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖。


圖1為實施例一中不同濃度的ATRA作用72小時后，對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響；圖2為實施例一中100 nM/L的ATRA作用不同的時間，對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響；圖3為實施例一中不同濃度的ATRA作用72小時后，對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞 RXRa蛋白表達(dá)的影響；圖4為實施例一中100 nM/L的ATRA作用不同的時間，對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞 RXRa蛋白表達(dá)的影響。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述 實施例一材料細(xì)胞株人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞。RA購買于美國Sigma公司，用乙醇溶解成貯存液，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到最后使用工作濃度。DMEM、PBS、胰酶、MTT、DMS0購自美國Gibco 公司。特級胎牛血清(澳洲源)，購自維森特公司。RXRA抗體購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司，化學(xué)發(fā)光試劑購自Amersham公司。
儀器ELx800型酶聯(lián)免疫檢測儀，Western blot儀器(SDS-PAGE電泳儀，電泳槽， 轉(zhuǎn)膜儀，搖床，離心機，暗室)。
(1)細(xì)胞培養(yǎng):MDA-MB-231細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37°C，5% 的(X)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。
(2)細(xì)胞增殖實驗細(xì)胞以5X103/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μ1，每組設(shè) 20個復(fù)孔，同時設(shè)立空白對照，待細(xì)胞貼壁后給予不同的處理。處理后的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)一定的時間，每孔加MTT溶液(5mg/ml，用PBS配制)20 μ 1，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)的上清培養(yǎng)液，每孔加150 μ 1 DMS0，振蕩15min，使結(jié)晶物充分融解。選擇570 nm波長，空白對照調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測定各孔的光吸收值，記錄結(jié)果，做圖分析。
細(xì)胞給予以下兩種處理①ATRA與細(xì)胞增殖的劑量反應(yīng)關(guān)系細(xì)胞給予10，50，100，200，1000 nM/L的ATRA處理，作用7 后分別用MTT進(jìn)行比色檢測。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的ATRA作用7 后，對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖影響與ATRA 的濃度存在關(guān)系，在0-10 nM/L時，ATRA可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而在100-1000 nM/L范圍內(nèi)，ATRA 可抑制細(xì)胞的增殖，并且存在ATRA的濃度依賴性，即ATRA濃度越高，對MDA-MB-231細(xì)胞的生長抑制效果越明顯，結(jié)果見圖1。
②ATRA與細(xì)胞增殖的時間依賴關(guān)系細(xì)胞給予100 nM/L的ATRA處理，作用Mh， 48h，72h后，分別用MTT進(jìn)行比色檢測。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，100 nM/L的ATRA對細(xì)胞的增殖作用，與其作用時間有關(guān)。ATRA作用Mh內(nèi)，并未對細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制效應(yīng)，反而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而作用4 后，可抑制細(xì)胞的增殖，結(jié)果見圖2。
(3) RXRa蛋白表達(dá)水平的測定細(xì)胞給予不同的處理后，采用flfestern blot，測定RXR α蛋白的表達(dá)，具體實驗步驟如下50μ g總蛋白，采用10% SDS-PAGE分離，采用電轉(zhuǎn)移方法，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，PBS沖洗后，加入抗RXRA抗體， 4°C卵育1小時，含0. 1% Tween的PBS沖洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，4°C卵育1 小時，含0. 1 % Tween的PBS沖洗后，加入化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行曝光。測定actin蛋白的表達(dá)水平作為樣品內(nèi)參對照。
細(xì)胞給予如下處理①細(xì)胞給予不同濃度(10，50，100，200，1000 nM/L)的ATRA處理7 后，收蛋白樣，測定RXRa蛋白的表達(dá)水平，以觀察ATRA的濃度與RXRa表達(dá)水平的關(guān)系；結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞給予0，10，50，100，200，1000 nM/L的ATRA處理72h后，收蛋白樣， Western blot測定RXRa蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果如圖3。從圖中可以看出，與對照組相比， 100 nM/L的ATRA處理即可誘導(dǎo)RXR α的表達(dá)增加，并且存在ATRA的濃度依賴性，即ATRA 濃度越高，誘導(dǎo)RXRa的表達(dá)越明顯，而10，50 nM/L的ATRA，并不能明顯誘導(dǎo)RXRα的表達(dá)。
②細(xì)胞給予100 nM/L的ATRA處理后，分別作用Mh，48h后，測定RXRα蛋白的表達(dá)水平，以觀察ATRA的作用時間與RXRa表達(dá)的關(guān)系；結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞給予100 nM/L的ATRA處理Mh，48h，7 后，收蛋白樣，Western blot 測定RXR α蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果如圖4。從圖中我們可以看出，100 nM/L的ATRA處理Mh 后即可誘導(dǎo)RXRa的表達(dá)增加，且存在時間依賴性。
注本實施例中以未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為對照；統(tǒng)計學(xué)處理采用t檢驗進(jìn)行差異比較，檢驗水準(zhǔn)a =0.05。
權(quán)利要求
1.視黃酸在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。
2.視黃酸在制備促進(jìn)細(xì)胞RXRa蛋白表達(dá)藥物中的應(yīng)用。
3.視黃酸作為調(diào)控乳腺癌增殖的生物標(biāo)記物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種視黃酸的新應(yīng)用，即視黃酸在制備促進(jìn)細(xì)胞RXRα蛋白表達(dá)藥物和治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用，以及視黃酸作為調(diào)控乳腺癌增殖的生物標(biāo)記物的應(yīng)用。本發(fā)明以人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231為研究對象，觀察視黃酸對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響及ATRA對細(xì)胞RXRα蛋白表達(dá)水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)視黃酸的濃度為100nm/L以上，并且作用時間為48小時以上，ATRA可抑制人乳腺癌細(xì)胞的增殖，可誘導(dǎo)RXRα的表達(dá)增加。
文檔編號A61K31/203GK102526011SQ201210017680
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者徐久宏, 李新莉 申請人:蘇州大學(xué)