調(diào)節(jié)PD1的方法和組合物對聯(lián)邦政府資助研究下所獲發(fā)明的權(quán)利聲明不適用。技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于基因組工程和核酸酶識別領(lǐng)域。發(fā)明背景已經(jīng)證實(shí)，核酸酶，包括工程化為與靶位點(diǎn)特異性結(jié)合的鋅指核酸酶和歸巢內(nèi)切核酸酶(例如SceI)，在基因組工程中有用。例如，鋅指核酸酶(ZFN)是包含與核酸酶結(jié)構(gòu)域融合的定點(diǎn)工程化鋅指的蛋白質(zhì)。這種ZFN已經(jīng)成功用于多個(gè)不同物種的基因組修飾。見，例如，美國專利公布20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20060188987、20060063231；和國際公布WO07/014275，其公開內(nèi)容通過引用整體并入用于所有目的。這些ZFN可用于在靶核苷酸序列中產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)，這使靶基因座處同源重組的頻率增加1000倍以上。另外，通過非同源末端連接(NHEJ)不精確修復(fù)定點(diǎn)DSB也可導(dǎo)致基因破壞。產(chǎn)生兩個(gè)這種DSB導(dǎo)致任意大區(qū)域缺失。已經(jīng)證實(shí)程序性死亡受體(PD1，也稱為PDCD1)與響應(yīng)于慢性抗原調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化和T細(xì)胞耐受之間的平衡有牽連。HIV1感染期間，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在CD4+T細(xì)胞中PD1的表達(dá)增加。據(jù)認(rèn)為，與HIV感染情況一樣，當(dāng)在慢性抗原暴露存在下觀察到T細(xì)胞功能障礙時(shí)，PD1上調(diào)從某種程度上與T細(xì)胞耗竭(定義為關(guān)鍵效應(yīng)子功能逐漸喪失)相關(guān)聯(lián)。PD1上調(diào)可能還與慢性病毒感染期間這些同類細(xì)胞中凋亡增加相關(guān)(見Petrovas等，(2009)JImmunol.183(2):1120-32)。PD1也可能在腫瘤特異性逃離免疫監(jiān)視中起作用。已經(jīng)證明，在慢性骨髓性白血病(CML)和急性骨髓性白血病(AML)中PD1在腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)中高度表達(dá)。在黑素瘤浸潤T淋巴細(xì)胞(TIL)中PD1也上調(diào)(見Dotti(2009)Blood114(8):1457-58)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤表達(dá)PD1配體(PDL)，當(dāng)結(jié)合CTL中PD1的上調(diào)時(shí)，PD1配體可為T細(xì)胞功能性喪失和CTL不能介導(dǎo)有效抗腫瘤反應(yīng)的促成因子。研究人員已經(jīng)證實(shí)，在慢性感染了淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)的小鼠中，施用抗PD1抗體阻滯PD1-PDL相互作用并且能夠恢復(fù)一些T細(xì)胞功能性(增殖和細(xì)胞因子分泌)，并導(dǎo)致病毒載量降低(Barber等(2006)Nature439(9):682-687)。PD1失調(diào)也可能在自身免疫性疾病中起作用。PD1(尤其是PD1.3)的SNP也與全身性紅斑狼瘡(SLE)風(fēng)險(xiǎn)升高相關(guān)。已經(jīng)證實(shí)，SLE患者具有更高頻率的PD1.3PD1等位基因，并且這些患者顯示在其活化CD4+T細(xì)胞上PD1表達(dá)減少(見Bertsias等，(2009)ArthritisRheum.60(1):207-18)。因此，仍需要另外的PD1靶向調(diào)節(jié)劑，例如可用于研究和治療應(yīng)用的PD1靶向核酸酶或轉(zhuǎn)錄因子。發(fā)明概述本發(fā)明涉及研發(fā)PD1靶向核酸酶，例如工程化大范圍核酸酶和鋅指核酸酶(ZFN)。本發(fā)明證明對人和嚙齒動物PD1有特異性的活性鋅指蛋白和包括含這些PD1特異性鋅指蛋白的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子(ZFP-TF)或鋅指核酸酶(ZFN)的融合蛋白。包含本發(fā)明的PD1特異性鋅指蛋白的蛋白質(zhì)可用于研究和治療目的，包括用于治療其中PD1表達(dá)異常，或其中由于PD1配體過表達(dá)而異常利用PD1途徑的任何疾病或病癥。例如，在慢性傳染性疾病和惡性腫瘤中，鋅指核酸酶靶向T細(xì)胞中的PD1基因座可用于阻滯PD1依賴性免疫抑制?？蛇x地，可使用ZFN依賴性靶向插入野生型序列修補(bǔ)缺陷型PD1基因座，或可使用鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子(ZFPTF)調(diào)節(jié)(例如，上調(diào)或下調(diào))缺陷型PD1表達(dá)。進(jìn)一步地，可使用靶向PD1基因座的ZFPTF調(diào)節(jié)野生型PD1基因。在本發(fā)明的另一方面，融合蛋白包含對人PD1基因有特異性的鋅指核酸酶(ZFN)。在某些實(shí)施方案中，核酸酶融合蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)域包含表1所示的非自然生成的識別螺旋和/或與表2所示的靶位點(diǎn)結(jié)合。又一方面，本文提供了能夠調(diào)節(jié)PD1基因表達(dá)的ZFP-TF。在某些實(shí)施方案中，ZFP-TF的鋅指結(jié)構(gòu)域包含表1或5所示的非自然生成的識別螺旋和/或與表2或6所示的靶位點(diǎn)結(jié)合。另一方面，本文提供了調(diào)控PD1基因的方法和組合物。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括將包含工程化為與PD1基因中的靶位點(diǎn)結(jié)合的鋅指蛋白的融合蛋白(或編碼融合蛋白的多核苷酸)引入來自有特征在于由PD1配體過表達(dá)引起PD1表達(dá)異常和/或PD1途徑不良使用的疾病或病癥的患者的細(xì)胞中。所述方法用于治療和/或預(yù)防慢性感染，例如HIV和HCV。類似地，所述方法和組合物可用于治療和/或預(yù)防癌癥和惡性疾病。可治療和/或預(yù)防的癌癥的非限制性實(shí)例包括肺癌、胰腺癌、肝癌、骨癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、白血病、卵巢癌、淋巴瘤、腦癌等。本文所述的方法和組合物可用作獨(dú)立治療，或可與其它抗病毒或抗癌療法聯(lián)合使用。這些方法和組合物可與抗病毒或抗癌療法一起以連續(xù)方式提供，或可同時(shí)施用。提供的方法和組合物可用于調(diào)節(jié)患有自身免疫性疾病的患者體內(nèi)的PD1表達(dá)，或者如果該患者攜帶缺陷型或有害等位基因，可用于通過整合野生型PD1等位基因或特征改變的PD1等位基因治療此類患者?？蓸?gòu)建細(xì)胞系以特異性改變所述PD1基因序列以產(chǎn)生可改變PD1基因的調(diào)控或功能性的治療性化合物的篩選系統(tǒng)。附圖簡述圖1是示出了通過測量將所指ZFN引入這些細(xì)胞中時(shí)誘導(dǎo)通過非同源末端連接(NHEJ)插入的突變百分比的基于Cel-1SURVEYORTM核酸酶測定法測定，使用PD1特異性鋅指核酸酶對人PBMC中PD1基因的破壞的圖。用各自使ZFN12942與DNA相反鏈上結(jié)合的不同ZFN變體組合并且在與具有12942的靶基因座結(jié)合后將形成功能核酸酶的ZFN對處理細(xì)胞。以下各圖中指出了這一對中第二ZFN的SBS數(shù)量。每一對最左邊一欄示出了在37℃下孵育的細(xì)胞核轉(zhuǎn)染后3天的NHEJ百分比。在所示每一對從左邊數(shù)第二欄示出了在37℃下孵育的細(xì)胞核轉(zhuǎn)染后10天的NHEJ百分比。在所示每一對從右邊數(shù)第二欄示出了在30℃下孵育的細(xì)胞核轉(zhuǎn)染后3天的NHEJ百分比并且在所示每一對最右邊一欄示出了在30℃下孵育的細(xì)胞核轉(zhuǎn)染后10天的NHEJ百分比。圖2描繪了用靶向外顯子1的PD1特異性ZFN對12942和12947處理后，測定CD8+T細(xì)胞中PD1基因座的序列的分析結(jié)果。用黑體大寫字母描繪了插入。用(-)表示缺失。如圖可見，由于經(jīng)NHEJ修復(fù)DSB，在ZFN切割位點(diǎn)附近觀察到若干插入和缺失。圖3描繪了從具有鼠PD1特異性ZFN的PmelTCR轉(zhuǎn)基因/Rag1-/-小鼠得到的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的結(jié)果。用抗CD3抗體刺激細(xì)胞，然后為PD1染色。圖中示出了每一組中的PD1陽性CD3+CD8+細(xì)胞百分比和每一組的中值PD1熒光性，并且下面以表格形式表示數(shù)據(jù)。如圖中可見，在接受了PD1特異性ZFN的細(xì)胞中，即使在CD3刺激存在下，PD1表達(dá)降低。圖4證明在稍后的時(shí)間點(diǎn)，PD1表達(dá)減少明顯。在CD3刺激72h后收獲細(xì)胞，并且為PD1染色。上部直方圖示出了每一組中PD1陽性CD3+CD8+細(xì)胞百分比和每一組的中值PD1熒光性。下圖示出了PD1/CFSE細(xì)胞的頻率。該圖證明，即使在CD3刺激72h后經(jīng)PD1特異性ZFN處理的細(xì)胞中PD1表達(dá)仍減少。圖5描繪了于CD4+T細(xì)胞中測試并且使用Cel-I測定法分析的PD1特異性ZFN對的基因組編輯活性的結(jié)果。在這些細(xì)胞中，對幾對觀察到高達(dá)44%的編輯。圖6描繪了用PD1特異性ZFN對處理成CD4+T細(xì)胞后對PD1(-)細(xì)胞的純化。通過如上所述的Cel-I測定法測量編輯或NHEJ百分比，并且對一些PD1特異性ZFN對觀察到高達(dá)44%的編輯。處理后，經(jīng)首次暴露于抗CD3/CD8珠刺激細(xì)胞以誘導(dǎo)ZFN轉(zhuǎn)基因，然后通過FAC或親和色譜法再次刺激并進(jìn)行純化過程。(i)在首次刺激后，(ii)在第二次刺激之后，但是在任何純化之前，(iii)CD25+(活化標(biāo)志)，PD1(-)細(xì)胞分選之后，或(iv)在親和色譜法之后，收集細(xì)胞并通過Cel-I測定法(上述)分析PD1編輯。如同所示，使用細(xì)胞分選技術(shù)，發(fā)現(xiàn)多達(dá)56%的回收細(xì)胞已被修飾。通過Cel-1分析測定，通過親和色譜法純化的PD1(-)細(xì)胞展示出高達(dá)42%的總體PD1修飾。圖7是描繪了在CD8+T細(xì)胞中測試的PD1特異性ZFN的結(jié)果的圖。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將編碼PD1特異性ZFN的mRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)至CD8+T中并通過CelI測定法分析PD1修飾百分比。觀察到的修飾量與所用mRNA量有關(guān)，輸入mRNA的量越少，產(chǎn)生的靶標(biāo)修飾百分比越少。這些結(jié)果證明，本文描述的PD1特異性ZFN能夠修飾細(xì)胞系和原代T細(xì)胞中的PD1基因座。發(fā)明詳述本文描述了用于鑒定功能性核酸酶的高通量體內(nèi)篩選系統(tǒng)的組合物和方法。具體而言，所述測定法使用報(bào)告系統(tǒng)監(jiān)測核酸酶在其靶位點(diǎn)處誘導(dǎo)雙鏈斷裂的能力。另外，所述測定法可用于測定核酸酶對細(xì)胞生長的影響(毒性)。工程化核酸酶技術(shù)基于對自然生成的DNA結(jié)合蛋白的工程化。例如，已經(jīng)描述了對具有定制DNA結(jié)合特異性的歸巢內(nèi)切核酸酶的工程化。Chames等(2005)NucleicAcidsRes33(20):e178；Arnould等(2006)J.Mol.Biol.355:443-458。另外，還描述了對ZFP的工程化。見，例如，美國專利No.6,534,261、6,607,882、6,824,978、6,979,539、6,933,113、7,163,824和7,013,219。另外，ZFP已經(jīng)與核酸酶結(jié)構(gòu)域連接以產(chǎn)生ZFN(一種能夠通過其工程化(ZFP)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識別其預(yù)期基因靶標(biāo)的功能實(shí)體)并且核酸酶引起基因在ZFP結(jié)合位點(diǎn)附近被切割。見，例如，Kim等(1996)ProcNat′lAcadSciUSA93(3):1156-1160。最近，ZFN已用于多種生物的基因組修飾。見，例如，美國專利公布20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20060188987、20060063231；和國際公布WO07/014275。雖然清楚表征了使ZFP工程化以與特異性DNA序列結(jié)合的作用并且精確鑒定了特異性ZFP，但是當(dāng)并入ZFN時(shí)這些相同ZFP可能不以相等親和力和/或特異性結(jié)合。例如，很可能染色體基質(zhì)可影響活細(xì)胞中核酸酶結(jié)構(gòu)域的精確二聚化，從而減少裂解可能，并且指定基因座上精確的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)將差異性影響ZFN結(jié)合并裂解其預(yù)期靶序列的能力。另外，如有可能，對于體外測定法而言難以模擬用染色質(zhì)化形式的細(xì)胞基因組呈遞時(shí)設(shè)計(jì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的搜索參數(shù)。因此，必須試驗(yàn)有關(guān)生物或細(xì)胞系中的許多變體，以鑒定表現(xiàn)出基因修飾最佳特征的ZFN。此外，因?yàn)槊總€(gè)體內(nèi)系統(tǒng)有其自身的特性，所以必須研發(fā)特異性檢測測定法以測定ZFN作用。因此，與先前描述的篩選具有不同于自然生成的歸巢內(nèi)切核酸酶的結(jié)合特異性的歸巢內(nèi)切核酸酶的體內(nèi)篩選方法不同，本文描述的方法提供了通過預(yù)測核酸酶的體內(nèi)功能性以及對宿主細(xì)胞的毒性把已知與特殊靶位點(diǎn)結(jié)合的核酸酶分等級的快速有效途徑。因此，本文描述的方法和組合物提供了鑒定在體內(nèi)具有生物活性的核酸酶的高效快速方法。除精確預(yù)測體內(nèi)核酸酶功能性外，本文描述的測定法也可用于測定核酸酶毒性，從而允許鑒定最安全且最具功能活性的蛋白質(zhì)?？倓t除非另外指出，否則本文公開的方法的實(shí)踐以及組合物的制備和使用采用分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、計(jì)算化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA和相關(guān)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)，如同在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)一樣。在文獻(xiàn)中充分解釋了這些技術(shù)。見，例如，Sambrook等MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL，第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989和第3版，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sons,NewYork,1987和定期更新；METHODSINENZYMOLOGY系列，AcademicPress,SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，第3版，AcademicPress,SanDiego,1998；METHODSINENZYMOLOGY，第304卷，“Chromatin”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe編輯)，AcademicPress,SanDiego,1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，第119卷，“ChromatinProtocols”(P.B.Becker編輯)HumanaPress,Totowa,1999。定義術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可交換使用并且指呈線性或環(huán)狀構(gòu)象和呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。為了本發(fā)明的目的，不得將這些術(shù)語視為對聚合物長度的限制。術(shù)語可涵蓋天然核苷酸的已知類似物，以及在堿基、糖和/或磷酸鹽部分(例如，磷硫酰骨架)中經(jīng)修飾的核苷酸。一般而言，特殊核苷酸的類似物具有相同堿基配對特異性，即A的類似物將與T堿基配對。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可交換使用并且指氨基酸殘基的聚合物。術(shù)語也適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸為相應(yīng)自然生成的氨基酸的化學(xué)類似物或經(jīng)修飾衍生物的氨基酸聚合物?！敖Y(jié)合”指大分子之間(例如，蛋白質(zhì)和核酸之間)的序列特異、非共價(jià)相互作用。只要總的來說相互作用具序列特異性，并非結(jié)合相互作用的所有組分需要具序列特異性(例如，與DNA骨架中的磷酸鹽殘基接觸)。這種相互作用的特征通常在于解離常數(shù)(Kd)為10-6M-1或更低?！坝H和力”指結(jié)合強(qiáng)度：結(jié)合親和力增強(qiáng)與Kd較低相關(guān)。“結(jié)合蛋白”是一種能夠與另一分子非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)。結(jié)合蛋白可與(例如)DNA分子(DNA結(jié)合蛋白)、RNA分子(RNA結(jié)合蛋白)和/或蛋白質(zhì)分子(蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白)結(jié)合。在蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白的情況下，其可與自身結(jié)合(形成同型二聚體、同型三聚體等)和/或可與一個(gè)或多個(gè)不同蛋白質(zhì)分子結(jié)合。結(jié)合蛋白可具有一種以上的結(jié)合活性。例如，鋅指蛋白具有DNA結(jié)合、RNA結(jié)合和蛋白質(zhì)結(jié)合活性?！颁\指DNA結(jié)合蛋白”(或結(jié)合結(jié)構(gòu)域)是以序列特異性方式通過一種或多種鋅指結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)或較大蛋白質(zhì)內(nèi)的結(jié)構(gòu)域，鋅指是通過鋅離子配位穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的氨基酸序列區(qū)域。常常將術(shù)語鋅指DNA結(jié)合蛋白縮寫為鋅指蛋白或ZFP。可將鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域“工程化”為與預(yù)定核苷酸序列結(jié)合。工程化鋅指蛋白的方法的非限制性實(shí)例為設(shè)計(jì)和選擇。設(shè)計(jì)的鋅指蛋白是在自然界中不存在的蛋白質(zhì)，其設(shè)計(jì)/組成主要由合理標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生。設(shè)計(jì)的合理標(biāo)準(zhǔn)包括應(yīng)用取代規(guī)則和計(jì)算機(jī)算法處理存儲現(xiàn)有ZFP設(shè)計(jì)和結(jié)合數(shù)據(jù)的信息的數(shù)據(jù)庫中的信息。見，例如，美國專利6,140,081、6,453,242和6,534,261；同樣見WO98/53058、WO98/53059、WO98/53060、WO02/016536和WO03/016496?！八x”鋅指蛋白是在自然界中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，其生成主要由經(jīng)驗(yàn)工藝引起，例如噬菌體展示、相互作用陷阱或雜種選擇。見例如，US5,789,538、US5,925,523、US6,007,988、US6,013,453、US6,200,759、WO95/19431、WO96/06166、WO98/53057、WO98/54311、WO00/27878、WO01/60970WO01/88197和WO02/099084?！傲呀狻敝钙茐腄NA分子的共價(jià)骨架?？赏ㄟ^多種方法引起裂解，包括但不限于磷酸二酯鍵的酶或化學(xué)水解。單鏈裂解和雙鏈裂解均可能，并且由于兩個(gè)不同單鏈裂解事件可發(fā)生雙鏈裂解。DNA裂解可導(dǎo)致生成平端或交錯末端。在某些實(shí)施方案中，融合多肽用于靶向雙鏈DNA裂解?！傲呀獍虢Y(jié)構(gòu)域”是連同第二多肽(相同或不同)形成具有裂解活性(優(yōu)選為雙鏈裂解活性)的復(fù)合物的多肽序列。術(shù)語“第一和第二裂解半結(jié)構(gòu)域”“+和-裂解半結(jié)構(gòu)域”和“右側(cè)和左側(cè)裂解半結(jié)構(gòu)域”可交換用于指二聚化的裂解半結(jié)構(gòu)域?qū)??！肮こ袒呀獍虢Y(jié)構(gòu)域”是已經(jīng)修飾以便與另一裂解半結(jié)構(gòu)域(例如，另一工程化裂解半結(jié)構(gòu)域)形成專性雜二聚體的裂解半結(jié)構(gòu)域。同樣，見，通過引用整體并入本文的美國專利申請No.10/912,932和11/304,981和美國臨時(shí)申請No.60/808,486(2006年5月25日提交)。術(shù)語“序列”指可為DNA或RNA；可為直鏈、環(huán)形或支鏈并且可為單鏈或雙鏈的任何長度的核苷酸序列。術(shù)語“供體序列”指插入基因組中的核苷酸序列。供體序列可具有任何長度，例如長度介于2和10,000個(gè)核苷酸(或之間或以上的任何整數(shù)值)，優(yōu)選長度介于約100和1,000個(gè)核苷酸(或之間的任何整數(shù))，更優(yōu)選長度介于約200和500個(gè)核苷酸?！叭旧|(zhì)”是包含細(xì)胞基因組的核蛋白結(jié)構(gòu)。細(xì)胞染色質(zhì)包含核酸(主要為DNA)和蛋白質(zhì)，包括組蛋白和非組蛋白染色體蛋白。大部分真核細(xì)胞染色質(zhì)以核小體的形式存在，其中核小體核心包含與八聚體締合的約150個(gè)堿基對的DNA，八聚體包含每種兩個(gè)的組蛋白H2A、H2B、H3和H4；并且連接子DNA(長度根據(jù)生物體可變)在核小體核心之間延伸。組蛋白H1分子通常與連接子DNA締合。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“染色質(zhì)”意在涵蓋所有類型的原核和真核細(xì)胞核蛋白。細(xì)胞染色質(zhì)包括染色體和附加體染色質(zhì)?！叭旧w”是包含細(xì)胞的整個(gè)或部分基因組的染色質(zhì)復(fù)合物。常用其核型表征細(xì)胞的基因組，核型是包含細(xì)胞基因組的所有染色體的總和。細(xì)胞的基因組可包含一條或多條染色體。“附加體”是復(fù)制核酸、核蛋白復(fù)合物或包含并非細(xì)胞染色體核型的一部分的核酸的其它結(jié)構(gòu)。附加體的實(shí)例包括質(zhì)粒和某些病毒基因組?！鞍形稽c(diǎn)”或“靶序列”是，倘若存在供結(jié)合的足夠條件，限定結(jié)合分子將與之結(jié)合的核酸部分的核酸序列。例如，序列5’-GAATTC-3’是EcoRI限制內(nèi)切核酸酶的靶位點(diǎn)?！奥詡魅拘约膊　笔怯蓚魅緞┮鸬募膊?，其中傳染持續(xù)。這種疾病可包括肝炎(A、B或C)、皰疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HSV-6、HSV-II、CMV和EBV)和HIV/AIDS。非病毒實(shí)例可包括慢性真菌疾病，如曲霉病(Aspergillosis)、念珠菌病(Candidiasis)、球孢子菌病(Coccidioidomycosis)，和與隱球菌屬(Cryptococcus)相關(guān)的疾病和組織胞漿菌病(Histoplasmosis)。慢性細(xì)菌傳染劑的非限制性實(shí)例可為肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae)、單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)和結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)。術(shù)語“癌癥”指在器官或體組織中存在細(xì)胞無限增殖的任何疾病。因此，術(shù)語包括任何類型的癌癥或惡性腫瘤，包括但不限于卵巢癌、白血病、肺癌、結(jié)直腸癌/結(jié)腸癌、CNS癌、黑素瘤、腎細(xì)胞癌、漿細(xì)胞瘤/骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌等。如本文所使用，除非另外特別指出，術(shù)語“腫瘤”指惡性類細(xì)胞或組織生長異常并且不包括良性類組織。如本文所使用，術(shù)語“抑制(inhibits)或抑制(inhibiting)”指減少生長/復(fù)制。術(shù)語“自身免疫性疾病”指受試者對其自身組織產(chǎn)生破壞性免疫反應(yīng)的任何疾病或病癥。自身免疫性病癥可影響受試者(例如，人)體內(nèi)的幾乎每個(gè)器官系統(tǒng)，包括但不限于神經(jīng)、胃腸和內(nèi)分泌系統(tǒng)，以及皮膚和其它結(jié)締組織、眼睛、血液和血管的疾病。自身免疫性疾病的實(shí)例包括但不限于橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto′sthyroiditis)、全身性紅斑狼瘡、干燥綜合征(Sjogren′ssyndrome)、格雷夫斯病(Graves′disease)、硬皮病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、重癥肌無力和糖尿病。“外源”分子是通常在細(xì)胞中不存在，但是通過一種或多種基因、生物化學(xué)或其它方法引入細(xì)胞中的分子。關(guān)于細(xì)胞的特殊發(fā)育階段和環(huán)境條件確定“在細(xì)胞中正常存在”。因此，例如，僅在肌肉胚胎發(fā)育期間存在的分子就成人細(xì)胞而言是外源分子。類似地，通過熱休克誘導(dǎo)的分子就非熱休克細(xì)胞而言是外源分子。外源分子可包括(例如)功能障礙內(nèi)源分子的功能形式或正常功能內(nèi)源分子的功能障礙形式。除了其它方面，外源分子可為小分子，例如通過組合化學(xué)工藝生成的小分子，或大分子例如蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、多糖、以上分子的任何修飾衍生物或包含一種或多種以上分子的任何復(fù)合物。核酸包括DNA和RNA，可為單鏈或雙鏈；可為直鏈、支鏈或環(huán)形；并且可具有任何長度。核酸包括能夠形成雙鏈體的核酸以及形成三鏈體的核酸。見，例如，美國專利No.5,176,996和5,422,251。蛋白質(zhì)包括但不限于DNA結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重塑因子、甲基化DNA結(jié)合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙?；浮⑷ヒ阴；?、激酶、磷酸酶、整合酶、重組酶、連接酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、促旋酶和解旋酶。外源分子可為與內(nèi)源分子相同類別的分子，例如外源蛋白質(zhì)或核酸。例如，外源核酸可包含引入細(xì)胞中的感染病毒基因組、質(zhì)?；蚋郊芋w，或通常在細(xì)胞中不存在的染色體。將外源分子引入細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且包括但不限于脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(例如，脂質(zhì)體，包括中性和陽離子脂質(zhì))、電穿孔、直接注射、細(xì)胞融合、粒子轟擊、磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。相反，“內(nèi)源”分子是通常在特殊環(huán)境條件下在特殊發(fā)育階段存在于特殊細(xì)胞中的分子。例如，內(nèi)源核酸可包含染色體、線粒體、葉綠體或其它細(xì)胞器的基因組或自然生成的附加體核酸。另外的內(nèi)源分子可包括蛋白質(zhì)，例如轉(zhuǎn)錄因子和酶?！叭诤稀狈肿邮瞧渲袃蓚€(gè)或更多個(gè)亞基分子優(yōu)選共價(jià)連接的分子。亞基分子可為相同化學(xué)類型的分子，或可為不同化學(xué)類型的分子。第一類融合分子的實(shí)例包括但不限于融合蛋白(例如，ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和裂解結(jié)構(gòu)域之間的融合)和融合核酸(例如，編碼上文描述的融合蛋白的核酸)。第二類融合分子的實(shí)例包括但不限于形成三鏈體的核酸與多肽之間的融合，和小溝結(jié)合分子與核酸之間的融合。細(xì)胞中融合蛋白的表達(dá)可由向細(xì)胞遞送融合蛋白或通過向細(xì)胞遞送編碼融合蛋白的多核苷酸產(chǎn)生，其中轉(zhuǎn)錄多核苷酸，并翻譯轉(zhuǎn)錄物，以生成融合蛋白。反式剪接、多肽裂解和多肽連接也可與蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)有牽連。在本發(fā)明其它地方提出了多核苷酸和多肽遞送至細(xì)胞的方法。為了本發(fā)明的目的，“基因”包括編碼基因產(chǎn)物(見下文)的DNA區(qū)域以及調(diào)控基因產(chǎn)物生成的所有DNA區(qū)域，無論此類調(diào)控序列是否與編碼和/或轉(zhuǎn)錄序列相鄰。相應(yīng)地，基因包括但不一定限于啟動子序列、終止子、翻譯調(diào)控序列(例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))、增強(qiáng)子、沉默子、絕緣子、邊界元件、復(fù)制起點(diǎn)、基質(zhì)附著位點(diǎn)和基因座控制區(qū)?！盎虮磉_(dá)”指將基因中所含信息轉(zhuǎn)化為基因產(chǎn)物?；虍a(chǎn)物可為基因的直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反義RNA、核酶、結(jié)構(gòu)RNA或其它類型的RNA)或通過mRNA翻譯生成的蛋白質(zhì)?；虍a(chǎn)物還包括通過例如帽化、聚腺苷酸化、甲基化和編輯等過程修飾的RNA和通過(例如)甲基化、乙?；⒘姿峄?、泛素化、ADP-核糖基化、肉豆蔻基化和糖基化修飾的蛋白質(zhì)?；虮磉_(dá)的“調(diào)節(jié)”指基因表達(dá)水平的改變。表達(dá)的調(diào)節(jié)包括但不限于基因活化和基因抑制。也可為全面調(diào)節(jié)，即其中基因表達(dá)完全滅活或活化至野生型水平或超過野生型水平；或可為部分調(diào)節(jié)，其中基因表達(dá)部分減少，或部分活化至野生型水平的某一分?jǐn)?shù)?！罢婧恕奔?xì)胞包括但不限于真菌細(xì)胞(例如酵母屬)、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞和人類細(xì)胞(例如，T細(xì)胞)。關(guān)于兩個(gè)或更多個(gè)組分(例如序列元件)的并置，術(shù)語“操作性連接(operativelinkage)”和“操作性連接(operativelylinked)”(或“可操作連接”)可交換使用，其中排列所述組分以便兩個(gè)組分正常作用并且容許至少一種組分可介導(dǎo)對至少一種其它組分發(fā)揮作用的可能性。舉例而言，如果轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列響應(yīng)于一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的存在或缺乏控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄水平，可使轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，例如啟動子與編碼序列操作性連接。轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列通常與編碼序列順式操作性連接，但是不需要與之直接相鄰。例如，即使它們不連續(xù)，但是增強(qiáng)子是與編碼序列操作性連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。至于融合多肽，術(shù)語“操作性連接(operativelylinked)”可指每個(gè)組分在與另一組分的連接中進(jìn)行與如果它不這樣連接時(shí)將進(jìn)行的相同作用的事實(shí)。例如，至于其中ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與裂解結(jié)構(gòu)域融合的融合多肽，如果在融合多肽中，ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分能夠結(jié)合其靶位點(diǎn)和/或其結(jié)合位點(diǎn)，而裂解結(jié)構(gòu)域能夠裂解鄰近靶位點(diǎn)的DNA，則ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和裂解結(jié)構(gòu)域操作性連接。類似地，至于其中ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與活化或抑制結(jié)構(gòu)域融合的融合多肽，如果在融合多肽中，ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分能夠結(jié)合其靶位點(diǎn)和/或其結(jié)合位點(diǎn)，而活化結(jié)構(gòu)域能夠上調(diào)基因表達(dá)或抑制結(jié)構(gòu)域能夠下調(diào)基因表達(dá)，則ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和活化或抑制結(jié)構(gòu)域操作性連接。蛋白質(zhì)、多肽或核酸的“功能片段”是其序列與全長蛋白質(zhì)、多肽或核酸不同，然而保持與全長蛋白質(zhì)、多肽或核酸相同的功能的蛋白質(zhì)、多肽或核酸。功能片段可具有比相應(yīng)天然分子更多、更少或與之相同數(shù)量的殘基，和/或可含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸取代。測定核酸功能(例如，編碼功能、與另一種核酸雜交的能力)的方法在本領(lǐng)域中眾所周知。類似地，測定蛋白質(zhì)功能的方法眾所周知。例如，可通過(例如)濾膜結(jié)合、電泳遷移率改變或免疫沉淀測定法測定多肽的DNA結(jié)合功能?？赏ㄟ^凝膠電泳測定DNA裂解。見Ausubel等，上文?？?例如)通過免疫共沉淀、雙雜交測定法或基因和生物化學(xué)互補(bǔ)測定蛋白質(zhì)與另一種蛋白質(zhì)相互作用的能力。見，例如，F(xiàn)ields等(1989)Nature340:245-246；美國專利No.5,585,245和PCTWO98/44350?！拜d體”能夠?qū)⒒蛐蛄修D(zhuǎn)移至靶細(xì)胞。通常，“載體構(gòu)建體”、“表達(dá)載體”和“基因轉(zhuǎn)移載體”指能夠指導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)并且可將基因序列轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的任何核酸構(gòu)建體。因此，所述術(shù)語包括克隆和表達(dá)媒介物以及整合載體?！皥?bào)告基因”或“報(bào)告序列”指生成易于測量，優(yōu)選盡管在常規(guī)測定法中沒有必要測量的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的任何序列。適合的報(bào)告基因包括但不限于編碼介導(dǎo)抗生素抗性(例如，氨芐青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白質(zhì)的序列，編碼有色或熒光或發(fā)光蛋白(例如，綠色熒光蛋白、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、熒光素酶)和介導(dǎo)增強(qiáng)細(xì)胞生長和/或基因擴(kuò)增的蛋白質(zhì)(例如，二氫葉酸還原酶)的序列。表位標(biāo)簽包括(例如)一個(gè)或多個(gè)拷貝的FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可檢測的氨基酸序列。“表達(dá)標(biāo)簽”包括編碼與所需基因序列可操作連接以便監(jiān)測目標(biāo)基因的表達(dá)的報(bào)告子的序列。概述本文描述了靶向PD1基因的鋅指蛋白-轉(zhuǎn)錄因子(ZFP-TF)和/或核酸酶(例如，ZFN)以及包含這些ZFP-TF和/或核酸酶的組合物和使用這些ZFP-TF和/或核酸酶治療其中PD1異?；虿缓闲枰乇磉_(dá)，或其中由于PD1配體過表達(dá)而異常或不合需要地利用PD1途徑的疾病或病癥，包括例如治療慢性傳染性疾病、癌癥和/或自身免疫性疾病的方法。為了治療患有經(jīng)調(diào)節(jié)PD1表達(dá)得到改善的疾病或病癥的受試者，可在體內(nèi)或離體將本文所述的ZFP-TF和/或核酸酶引入細(xì)胞(例如，從患有此類疾病的患者分離的原代細(xì)胞)。ZFP-TF和/或ZFN治療后，可再將細(xì)胞引入患者體內(nèi)以作為藥劑用于慢性傳染性疾病或癌癥的治療。類似地，可使用已經(jīng)用PD1特異性ZFN和/或ZFP-TF處理的干細(xì)胞?？墒惯@些細(xì)胞融合至患病患者體內(nèi)以治療此類醫(yī)療狀況。因此本文所述的組合物和方法允許調(diào)節(jié)PD1基因。可根據(jù)需要，使用PD1特異性ZFPTF或ZFN敲除、敲下、上調(diào)或下調(diào)PD1表達(dá)。可用ZFP-TF或一種或多種PD1特異性ZFN下調(diào)(例如)患有慢性傳染性疾病或癌癥的患者體內(nèi)的PD1表達(dá)，并且可上調(diào)患者，例如有自身免疫性疾病的患者體內(nèi)的PD1表達(dá)。本發(fā)明的方法和組合物還提供了包含編碼PD1特異性ZFPTF和/或核酸酶的多核苷酸的治療劑，其中直接向患者施用多核苷酸。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了方法和組合物，其中可將編碼ZFPTF和/或核酸酶的多核苷酸并入載體，例如病毒遞送媒介物中，以作為治療劑向患病患者全身施用。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域本文描述了包含與PD1基因中的靶位點(diǎn)特異性結(jié)合的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的組合物。任何DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可用于本文公開的組合物和方法中，包括但不限于鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或來自大范圍核酸酶的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含鋅指蛋白。優(yōu)選地，鋅指蛋白并非自然生成，因?yàn)閷⑵涔こ袒癁榕c所選靶位點(diǎn)結(jié)合。見，例如，Beerli等(2002)NatureBiotechnol.20:135-141；Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等(2001)NatureBiotechnol.19:656-660；Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；美國專利No.6,453,242、6,534,261、6,599,692、6,503,717、6,689,558、7,030,215、6,794,136、7,067,317、7,262,054、7,070,934、7,361,635、7,253,273；和美國專利公布No.2005/0064474、2007/0218528、2005/0267061，全部通過引用整體并入本文。與自然生成的鋅指蛋白相比，工程化鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可具有新型結(jié)合特異性。工程化方法包括但不限于合理的設(shè)計(jì)和各類選擇。合理的設(shè)計(jì)包括(例如)使用包含三聯(lián)(或四聯(lián))核苷酸序列和單獨(dú)鋅指氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫，其中每個(gè)三聯(lián)或四聯(lián)核苷酸序列與結(jié)合特殊三聯(lián)或四聯(lián)序列的鋅指的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列相關(guān)聯(lián)。見，例如，通過引用整體并入本文的共有美國專利6,453,242和6,534,261。在美國專利5,789,538、5,925,523、6,007,988、6,013,453、6,410,248、6,140,466、6,200,759和6,242,568以及WO98/37186、WO98/53057、WO00/27878、WO01/88197和GB2,338,237中公開了示例性選擇方法，包括噬菌體展示和雙雜交系統(tǒng)。另外，例如在共有WO02/077227中已經(jīng)描述了鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特異性的增強(qiáng)。另外，正如這些和其它參考中所公開的，可使用任何適合連接子序列，包括(例如)長度為5個(gè)或更多個(gè)氨基酸的連接子，將鋅指結(jié)構(gòu)域和/或多指鋅指蛋白連接在一起。同樣，見，美國專利No.6,479,626、6,903,185和7,153,949，例如長度為6個(gè)或更多個(gè)氨基酸的連接子序列。本文所述的蛋白質(zhì)可包括蛋白質(zhì)的單獨(dú)鋅指之間適合連接子的任何組合。另外，例如在共有WO02/077227中已經(jīng)描述了鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特異性的增強(qiáng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知靶位點(diǎn)的選擇；ZFP和設(shè)計(jì)并構(gòu)建融合蛋白(和編碼融合蛋白的多核苷酸)的方法并且在美國專利No.6,140,0815、789,538、6,453,242、6,534,261、5,925,523、6,007,988、6,013,453、6,200,759、WO95/19431、WO96/06166、WO98/53057、WO98/54311、WO00/27878、WO01/60970、WO01/88197、WO02/099084、WO98/53058、WO98/53059、WO98/53060、WO02/016536和WO03/016496中有詳細(xì)描述。另外，正如這些和其它參考中所公開的，可使用任何適合連接子序列，包括(例如)長度為5個(gè)或更多個(gè)氨基酸的連接子，將鋅指結(jié)構(gòu)域和/或多指鋅指蛋白連接在一起。同樣，見，美國專利No.6,479,626、6,903,185和7,153,949，例如長度為6個(gè)或更多個(gè)氨基酸的連接子序列。本文所述的蛋白質(zhì)可包括蛋白質(zhì)的單獨(dú)鋅指之間適合連接子的任何組合?？蛇x地，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可源自核酸酶。例如，已知?dú)w巢內(nèi)切核酸酶和大范圍核酸酶的識別序列，例如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。同樣見美國專利No.5,420,032；美國專利6,833,252；Belfort等(1997)NucleicAcidsRes.25:3379-3388；Dujon等(1989)Gene82:115-118；Perler等(1994)NucleicAcidsRes.22,1125-1127；Jasin(1996)TrendsGenet.12:224-228；Gimble等(1996)J.Mol.Biol.263:163-180；Argast等(1998)J.Mol.Biol.280:345-353和新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室目錄。另外，可工程化歸巢內(nèi)切核酸酶和大范圍核酸酶的DNA結(jié)合特異性以結(jié)合非天然靶位點(diǎn)。見，例如，Chevalier等(2002)Molec.Cell10:895-905；Epinat等(2003)NucleicAcidsRes.31:2952-2962；Ashworth等(2006)Nature441:656-659；Paques等(2007)CurrentGeneTherapy7:49-66；美國專利公布No.20070117128。在某些實(shí)施方案中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是與PD1基因中的靶位點(diǎn)結(jié)合(以序列特異性方式)并調(diào)節(jié)PD1表達(dá)的工程化鋅指蛋白。ZFP可選擇性與突變體PD1等位基因或野生型PD1序列結(jié)合。PD1靶位點(diǎn)通常包括至少一個(gè)鋅指，但是可包括幾個(gè)鋅指(例如，2、3、4、5、6個(gè)或更多個(gè)指)。通常，ZFP包括至少3指。某些ZFP包括4、5或6指。包括3指的ZFP通常識別包括9或10個(gè)核苷酸的靶位點(diǎn)；包括4指的ZFP通常識別包括12-14個(gè)核苷酸的靶位點(diǎn)；而具有6指的ZFP可識別包括18-21個(gè)核苷酸的靶位點(diǎn)。ZFP也可為包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)控結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其中這些調(diào)控結(jié)構(gòu)域可為轉(zhuǎn)錄活化或抑制結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是來自源自植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)的TAL效應(yīng)子的工程化結(jié)構(gòu)域(見Boch等，(2009)Science2009年10月29日(10.1126/science.117881)和Moscou和Bogdanove，(2009)Science2009年10月29日(10.1126/science.1178817)。同樣，見，美國專利申請13/068,735。融合蛋白還提供了包含如本文所述的DNA結(jié)合蛋白(例如，ZFP)和異源調(diào)控(功能)結(jié)構(gòu)域(或其功能片段)的融合蛋白。常見結(jié)構(gòu)域包括(例如)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域(活化子、抑制子、輔助活化子、輔助抑制子)、沉默子、致癌基因(例如，myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mos家族成員等)；DNA修復(fù)酶及其相關(guān)因子和修飾因子；DNA重排酶及其相關(guān)因子和修飾因子；染色質(zhì)相關(guān)蛋白及其修飾因子(例如激酶、乙酰化酶和去乙?；?；和DNA修飾酶(例如，甲基轉(zhuǎn)移酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、解旋酶、連接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、內(nèi)切核酸酶)及其相關(guān)因子和修飾因子。關(guān)于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸酶裂解結(jié)構(gòu)域融合的詳情，見通過引用整體并入本文的美國專利申請公布No.20050064474、20060188987和2007/0218528。實(shí)現(xiàn)活化的適合結(jié)構(gòu)域包括HSVVP16活化結(jié)構(gòu)域(見，例如，Hagmann等，J.Virol.71,5952-5962(1997))核激素受體(見，例如，Torchia等，Curr.Opin.Cell.Biol.10:373-383(1998))；核因子κB的p65亞基(Bitko&Barik，J.Virol.72:5610-5618(1998)和Doyle&Hunt，Neuroreport8:2937-2942(1997))；Liu等，CancerGeneTher.5:3-28(1998))，或人工嵌合功能結(jié)構(gòu)域例如VP64(Beerli等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:14623-33)和降解決定子(Molinari等，(1999)EMBOJ.18,6439-6447)。另外的示例性活化結(jié)構(gòu)域包括Oct1、Oct-2A、Sp1、AP-2和CTF1(Seipel等，EMBOJ.11、4961-4968(1992)以及p300、CBP、PCAF、SRC1PvALF、AtHD2A和ERF-2。見，例如，Robyr等(2000)Mol.Endocrinol.14:329-347；Collingwood等(1999)J.Mol.Endocrinol.23:255-275；Leo等(2000)Gene245:1-11；Manteuffel-Cymborowska(1999)ActaBiochim.Pol.46:77-89；McKenna等(1999)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.69:3-12；Malik等(2000)TrendsBiochem.Sci.25:277-283；和Lemon等(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:499-504。另外的示例性活化結(jié)構(gòu)域包括但不限于OsGAI、HALF-1、C1、AP1、ARF-5、-6、-7和-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP和TRAB1。見，例如，Ogawa等(2000)Gene245:21-29；Okanami等(1996)GenesCells1:87-99；Goff等(1991)GenesDev.5:298-309；Cho等(1999)PlantMol.Biol.40:419-429；Ulmason等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:5844-5849；Sprenger-Haussels等(2000)PlantJ.22:1-8；Gong等(1999)PlantMol.Biol.41:33-44；和Hobo等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:15,348-15,353。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言明顯的是，在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域之間的融合蛋白(或編碼融合蛋白的核酸)的形成中，活化結(jié)構(gòu)域或與活化結(jié)構(gòu)域相互作用的分子適合作為功能結(jié)構(gòu)域?；旧夏軌?yàn)榘谢蚧謴?fù)活化復(fù)合物和/或活化活性(例如，組蛋白乙?；?的任何分子用作融合蛋白的活化結(jié)構(gòu)域。例如，在共有美國專利申請2002/0115215和2003/0082552和共有WO02/44376中描述了適合在融合分子中用作功能結(jié)構(gòu)域的絕緣子結(jié)構(gòu)域、定位結(jié)構(gòu)域和染色質(zhì)重塑蛋白，例如含ISWI的結(jié)構(gòu)域和/或甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白。示例性抑制結(jié)構(gòu)域包括但不限于KRABA/B、KOX、TGF-β-誘導(dǎo)早期基因(TIEG)、v-erbA、SID、MBD2、MBD3、DNMT家族成員(例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、Rb和MeCP2。見，例如，Bird等(1999)Cell99:451-454；Tyler等(1999)Cell99:443-446；Knoepfler等(1999)Cell99:447-450；和Robertson等(2000)NatureGenet.25:338-342。另外的示例性抑制結(jié)構(gòu)域包括但不限于ROM2和AtHD2A。見，例如，Chem等(1996)PlantCell8:305-321；和Wu等(2000)PlantJ.22:19-27。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的克隆和生物化學(xué)綴合方法構(gòu)建融合分子。融合分子包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域(例如，轉(zhuǎn)錄活化或抑制結(jié)構(gòu)域)。融合分子還任選包含核定位信號(例如，來自SV40基質(zhì)T抗原的核定位信號)和表位標(biāo)簽(例如，F(xiàn)LAG和血凝素)。設(shè)計(jì)融合蛋白(和編碼融合蛋白的核酸)以便將翻譯閱讀框保存在融合的組分之中。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的生物化學(xué)綴合方法構(gòu)建，一方面的功能結(jié)構(gòu)域(或其功能片段)的多肽組分和另一方面的非蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，抗生素、嵌入劑、小溝結(jié)合分子、核酸)之間的融合。見，例如，PierceChemicalCompany(Rockford,IL)目錄。已經(jīng)描述了用于在小溝結(jié)合劑和多肽之間產(chǎn)生融合的方法和組合物。Mapp等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:3930-3935。在某些實(shí)施方案中，鋅指蛋白結(jié)合的靶位點(diǎn)存在于細(xì)胞染色質(zhì)的可達(dá)區(qū)域中?？扇?例如)共有國際公布WO01/83732中所述，確定可達(dá)區(qū)域。如果靶位點(diǎn)不存在于細(xì)胞染色質(zhì)的可達(dá)區(qū)域中，可如共有WO01/83793中所述，產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)可達(dá)區(qū)域。在另外的實(shí)施方案中，不管其靶位點(diǎn)是否在可達(dá)區(qū)域內(nèi)，融合分子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域均能夠與細(xì)胞染色質(zhì)結(jié)合。例如，此類DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠與連接子DNA和/或核小體DNA結(jié)合。在某些類固醇受體和肝細(xì)胞核因子3(HNF3)中發(fā)現(xiàn)這類“先鋒”DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Cordingley等(1987)Cell48:261-270；Pina等(1990)Cell60:719-731；和Cirillo等(1998)EMBOJ.17:244-254。正如本領(lǐng)域技術(shù)已知，融合分子可與藥學(xué)上可接受的載體一起配制。見，例如，Remington′sPharmaceuticalSciences，第17版，1985；和共有WO00/42219。融合分子的功能組分/結(jié)構(gòu)域可選自一旦融合分子經(jīng)由其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶序列結(jié)合，就能夠影響基因轉(zhuǎn)錄的多種不同組分。因此，功能組分可包括但不限于各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域，例如活化子、抑制子、輔助活化子、輔助抑制子和沉默子。例如，在共有美國專利No.6,534,261和美國專利申請公布No.2002/0160940中公開了另外的示例性功能結(jié)構(gòu)域。也可選擇受外源小分子或配體調(diào)控的功能結(jié)構(gòu)域。例如，可采用RheoSwitch技術(shù)，其中功能結(jié)構(gòu)域僅在外部RheoChemTM配體的存在下呈現(xiàn)其活性構(gòu)象(見例如US20090136465)。因此，ZFP可與可調(diào)控功能結(jié)構(gòu)域可操作連接，其中所產(chǎn)生的ZFP-TF活性受外部配體控制。在某些實(shí)施方案中，融合蛋白包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和裂解(核酸酶)結(jié)構(gòu)域。同樣地，可使用核酸酶，例如工程化核酸酶實(shí)現(xiàn)基因修飾。工程化核酸酶技術(shù)基于對自然生成的DNA結(jié)合蛋白的工程化。本文所述的方法和組合物廣泛適用并且可牽涉任何目標(biāo)核酸酶。核酸酶的非限制性實(shí)例包括大范圍核酸酶和鋅指核酸酶。核酸酶可包含異源DNA結(jié)合和裂解結(jié)構(gòu)域(例如，鋅指核酸酶；大范圍核酸酶DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和異源裂解結(jié)構(gòu)域)或，可選地，可改變自然生成的核酸酶的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以與所選靶位點(diǎn)結(jié)合(例如，已經(jīng)工程化為與同源結(jié)合位點(diǎn)不同的位點(diǎn)結(jié)合的大范圍核酸酶)。例如，已經(jīng)描述了對具有定制DNA結(jié)合特異性的歸巢內(nèi)切核酸酶的工程化，見Chames等(2005)NucleicAcidsRes33(20):e178；Arnould等(2006)J.Mol.Biol.355:443-458和Grizot等2009)NucleicAcidsRes7月7日電子出版物。另外，還已描述了ZFP的工程化。見，例如，美國專利No.6,534,261、6,607,882、6,824,978、6,979,539、6,933,113、7,163,824和7,013,219。在某些實(shí)施方案中，核酸酶為大范圍核酸酶(歸巢內(nèi)切核酸酶)。自然生成的大范圍核酸酶識別15-40個(gè)堿基對的裂解位點(diǎn)并且常分為4個(gè)家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cyst盒家族和HNH家族。示例性歸巢內(nèi)切核酸酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。其識別序列是已知的。同樣見美國專利No.5,420,032；美國專利6,833,252；Belfort等(1997)NucleicAcidsRes.25:3379-3388；Dujon等(1989)Gene82:115-118；Perler等(1994)NucleicAcidsRes.22,1125-1127；Jasin(1996)TrendsGenet.12:224-228；Gimble等(1996)J.Mol.Biol.263:163-180；Argast等(1998)J.Mol.Biol.280:345-353和新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室目錄。來自于主要來自LAGLIDADG家族的自然生成的大范圍核酸酶的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域已經(jīng)用于促進(jìn)植物、酵母、果蠅屬(Drosophila)、哺乳動物細(xì)胞和小鼠中的定點(diǎn)基因組修飾，但是已將這個(gè)方法限于修飾保護(hù)大范圍核酸酶識別序列的同源基因(Monet等(1999),Biochem.Biophysics.Res.Common.255:88-93)或已經(jīng)引入了識別序列的預(yù)工程化基因組(Route等(1994)，Mol.Cell.Biol.14:8096-106；Chilton等(2003)，PlantPhysiology.133:956-65；Puchta等(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:5055-60；Rong等(2002)，GenesDev.16:1568-81；Gouble等(2006)，J.GeneMed.8(5):616-622)。相應(yīng)地，已經(jīng)嘗試工程化大范圍核酸酶以在醫(yī)學(xué)或生物技術(shù)相關(guān)位點(diǎn)表現(xiàn)出新型結(jié)合特異性(Porteus等(2005)，Nat.Biotechnol.23:967-73；Sussman等(2004)，J.Mol.Biol.342:31-41；Epinat等(2003)，NucleicAcidsRes.31:2952-62；Chevalier等(2002)Molec.Cell10:895-905；Epinat等(2003)NucleicAcidsRes.31:2952-2962；Ashworth等(2006)Nature441:656-659；Paques等(2007)CurrentGeneTherapy7:49-66；美國專利公布No.20070117128、20060206949、20060153826、20060078552和20040002092)。另外，還已經(jīng)使來自大范圍核酸酶的自然生成或工程化的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與來自異源核酸酶(例如，F(xiàn)okI)的裂解結(jié)構(gòu)域可操作連接。在其它實(shí)施方案中，核酸酶為鋅指核酸酶(ZFN)。ZFN包含已經(jīng)工程化為與所選基因中的靶位點(diǎn)結(jié)合的鋅指蛋白和裂解結(jié)構(gòu)域或裂解半結(jié)構(gòu)域。正如上面所提到的，可將鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域工程化為與所選序列結(jié)合。見，例如，Beerli等(2002)NatureBiotechnol.20:135-141；Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等(2001)NatureBiotechnol.19:656-660；Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416。與自然生成的鋅指蛋白相比，工程化鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可具有新型結(jié)合特異性。工程化方法包括但不限于合理的設(shè)計(jì)和各類選擇。合理的設(shè)計(jì)包括(例如)使用包含三聯(lián)(或四聯(lián))核苷酸序列和單獨(dú)鋅指氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫，其中每個(gè)三聯(lián)或四聯(lián)核苷酸序列與結(jié)合特殊三聯(lián)或四聯(lián)序列的鋅指的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列相關(guān)聯(lián)。見，例如，通過引用整體并入本文的共有美國專利6,453,242和6,534,261。在美國專利5,789,538、5,925,523、6,007,988、6,013,453、6,410,248、6,140,466、6,200,759和6,242,568以及WO98/37186、WO98/53057、WO00/27878、WO01/88197和GB2,338,237中公開了示例性選擇方法，包括噬菌體展示和雙雜交系統(tǒng)。另外，例如在共有WO02/077227中已經(jīng)描述了鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特異性的增強(qiáng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知靶位點(diǎn)的選擇；設(shè)計(jì)并構(gòu)建融合蛋白(和編碼融合蛋白的多核苷酸)的ZFN和方法并且在通過引用整體并入本文的美國專利申請公布No.20050064474和20060188987中有詳細(xì)描述。另外，正如這些和其它參考中所公開的，可使用任何適合連接子序列，包括(例如)長度為5個(gè)或更多個(gè)氨基酸的連接子，將鋅指結(jié)構(gòu)域和/或多指鋅指蛋白連接在一起。見，例如，美國專利No.6,479,626、6,903,185和7,153,949，例如長度為6個(gè)或更多個(gè)氨基酸的連接子序列。本文所述的蛋白質(zhì)可包括蛋白質(zhì)的單獨(dú)鋅指之間的適合連接子的任何組合。核酸酶，例如ZFN和/或大范圍核酸酶也包含核酸酶(裂解結(jié)構(gòu)域、裂解半結(jié)構(gòu)域)。正如上面所提到的，裂解結(jié)構(gòu)域可與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域異源，例如來自核酸酶的鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和裂解結(jié)構(gòu)域或來自不同核酸酶的大范圍核酸酶DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和裂解結(jié)構(gòu)域。可從任何內(nèi)切核酸酶或外切核酸酶獲得異源裂解結(jié)構(gòu)域。從中得到裂解結(jié)構(gòu)域的示例性內(nèi)切核酸酶包括但不限于限制性內(nèi)切核酸酶和歸巢內(nèi)切核酸酶。見，例如，2002-2003目錄，NewEnglandBiolabs,Beverly,MA；和Belfort等(1997)NucleicAcidsRes.25:3379-3388。已知另外的裂解DNA的酶(例如，S1核酸酶；綠豆核酸酶；胰腺DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO內(nèi)切核酸酶；同樣見Linn等(編輯)Nucleases,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1993)。這些酶中的一種或多種(或其功能片段)可用作裂解結(jié)構(gòu)域和裂解半結(jié)構(gòu)域的來源。類似地，裂解半結(jié)構(gòu)域可源自如以上提出的對于裂解活性而言需要二聚化的任何核酸酶或其一部分。一般而言，如果融合蛋白包含裂解半結(jié)構(gòu)域，裂解需要兩個(gè)融合蛋白?？蛇x地，可使用包含兩個(gè)裂解半結(jié)構(gòu)域的單個(gè)蛋白。兩個(gè)裂解半結(jié)構(gòu)域可源自相同內(nèi)切核酸酶(或其功能片段)，或每個(gè)裂解半結(jié)構(gòu)域可源自不同內(nèi)切核酸酶(或其功能片段)。另外，兩個(gè)融合蛋白的靶位點(diǎn)優(yōu)選相對彼此布置，以致兩個(gè)融合蛋白與它們各自的靶位點(diǎn)的結(jié)合使彼此的裂解半結(jié)構(gòu)域置于允許裂解半結(jié)構(gòu)域(例如)通過二聚形成功能裂解結(jié)構(gòu)域的空間方位。因此，在某些實(shí)施方案中，靶位點(diǎn)的近邊被5-8個(gè)核苷酸或15-18個(gè)核苷酸分開。然而任何整數(shù)的核苷酸或核苷酸對可插入兩個(gè)靶位點(diǎn)之間(例如，2-50個(gè)核苷酸對或更多)。一般而言，裂解位點(diǎn)位于靶位點(diǎn)之間。限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)存在于許多物種中并且能夠與DNA(在識別位點(diǎn)處)序列特異性結(jié)合，并在結(jié)合位點(diǎn)或附近裂解DNA。某些限制酶(例如，IIS類)在遠(yuǎn)離識別位點(diǎn)的位點(diǎn)處裂解DNA并且具有可分離的結(jié)合和裂解結(jié)構(gòu)域。例如，IIS類酶FokI催化在一條鏈上距其識別位點(diǎn)9個(gè)核苷酸而在另一條鏈上距其識別位點(diǎn)13個(gè)核苷酸處的DNA雙鏈裂解。見，例如，美國專利5,356,802、5,436,150和5,487,994；以及Li等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279；Li等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2764-2768；Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:883-887；Kim等(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白包含來自至少一種IIS類限制酶的裂解結(jié)構(gòu)域(或裂解半結(jié)構(gòu)域)和可能工程化或未工程化的一個(gè)或多個(gè)鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域。裂解結(jié)構(gòu)域可與結(jié)合結(jié)構(gòu)域分離的示例性IIS類限制酶為FokI。這種特殊的酶呈二聚體時(shí)有活性。Bitinaite等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570-10,575。相應(yīng)地，為了本發(fā)明的目的，將公開的融合蛋白中所用的FokI酶部分視為裂解半結(jié)構(gòu)域。因此，對于使用鋅指-FokI融合進(jìn)行細(xì)胞序列的靶向雙鏈裂解和/或靶向置換，可使用兩個(gè)各包含一個(gè)FokI裂解半結(jié)構(gòu)域的融合蛋白重組具催化活性的裂解結(jié)構(gòu)域。可選地，也可使用含有一個(gè)鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)FokI裂解半結(jié)構(gòu)域的單個(gè)多肽分子。本發(fā)明其它地方提供了使用鋅指-FokI融合進(jìn)行靶向裂解和靶向序列改變的參數(shù)。裂解結(jié)構(gòu)域或裂解半結(jié)構(gòu)域可為保持裂解活性，或保持多聚化(例如，二聚化)形成功能裂解結(jié)構(gòu)域的能力的任何蛋白質(zhì)部分。在整體并入本文的國際公布WO07/014275中描述了示例性IIS類限制酶。另外的限制酶也含有可分離的結(jié)合和裂解結(jié)構(gòu)域，并且這些涵蓋于本發(fā)明。見，例如，Roberts等(2003)NucleicAcidsRes.31:418-420。在某些實(shí)施方案中，裂解結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)或多個(gè)最大限度減少或防止同型二聚化的工程化裂解半結(jié)構(gòu)域(也稱為二聚結(jié)構(gòu)域突變體)，例如美國專利公布No.20050064474和20060188987以及美國申請No.11/805,850(2007年5月23日提交)中所述，其全部的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。在FokI的位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538的氨基酸殘基全部是影響FokI裂解半結(jié)構(gòu)域二聚化的靶標(biāo)。形成專性雜二聚體的FokI的示例性工程化裂解半結(jié)構(gòu)域包括一對半結(jié)構(gòu)域，其中第一裂解半結(jié)構(gòu)域包括在FokI的位置490和538的氨基酸殘基處的突變并且第二裂解半結(jié)構(gòu)域包括在氨基酸殘基486和499處的突變。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，490處的突變用Lys(K)置換Glu(E)；538處的突變用Lys(K)置換Iso(I)；486處的突變用Glu(E)置換Gln(Q)；并且位置499處的突變用Lys(K)置換Iso(I)。具體地說，通過使一個(gè)裂解半結(jié)構(gòu)域中的位置490(E→K)和538(I→K)突變以生成命名為“E490K:I538K”的工程化裂解半結(jié)構(gòu)域并且使另一裂解半結(jié)構(gòu)域中的位置486(Q→E)和499(I→L)突變以生成命名為“Q486E:I499L”的工程化裂解半結(jié)構(gòu)域制備本文所述的工程化裂解半結(jié)構(gòu)域。本文所述的工程化裂解半結(jié)構(gòu)域是專性雜二聚體突變體，其中最大限度減少或消除了異常裂解。見，例如，美國臨時(shí)申請No.60/808,486(2006年5月25日提交)的實(shí)施例1，其公開內(nèi)容通過引用整體并入用于所有目的?？墒褂萌魏芜m合方法，例如，通過定點(diǎn)誘變野生型裂解半結(jié)構(gòu)域(FokI)制備本文所述的工程化裂解半結(jié)構(gòu)域，如美國專利公布No.20050064474的實(shí)施例5和美國專利公布No.2007/0305346和2008/0131962的實(shí)施例38和2010年2月8日提交的美國專利臨時(shí)申請No.61/337,769和2010年9月23日提交的美國專利臨時(shí)申請No.61/403,916所述?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法容易地設(shè)計(jì)核酸酶表達(dá)構(gòu)建體。見，例如，美國專利公布20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20060188987、20060063231；和國際公布WO07/014275。在某些實(shí)施方案中，核酸酶的表達(dá)受誘導(dǎo)型啟動子的控制，例如在棉子糖和/或半乳糖的存在下活化(去抑制)而在葡萄糖的存在下抑制的半乳糖激酶啟動子。具體而言，誘導(dǎo)半乳糖激酶啟動子并且在碳源連續(xù)變化(例如，從葡萄糖變?yōu)槊拮犹牵僮優(yōu)榘肴樘?后表達(dá)核酸酶。誘導(dǎo)型啟動子的其它非限制性實(shí)例包括CUP1、MET15、PHO5和四環(huán)素響應(yīng)啟動子。遞送可通過任何適合方式將本文所述的蛋白質(zhì)(例如，ZFP)、編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸和包含蛋白質(zhì)和/或多核苷酸的組合物遞送至靶細(xì)胞。適合細(xì)胞包括但不限于真核和原核細(xì)胞和/或細(xì)胞系。此類細(xì)胞或由此類細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞系的非限制性實(shí)例包括COS、CHO(例如，CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6細(xì)胞以及昆蟲細(xì)胞(例如，草地貪夜蛾(Spodopterafugiperda)(Sf))或真菌細(xì)胞(例如酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces))。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞系為CHO-K1、MDCK或HEK293細(xì)胞系。適合的原代細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和其它血細(xì)胞亞類，例如但不限于CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞。適合的細(xì)胞還包括干細(xì)胞，舉例而言，例如胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)元干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。例如，在美國專利No.6,453,242、6,503,717、6,534,261、6,599,692、6,607,882、6,689,558、6,824,978、6,933,113、6,979,539、7,013,219和7,163,824中描述了遞送如本文所述的包含鋅指蛋白的蛋白質(zhì)的方法，其全部的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。也可使用含有編碼一種或多種鋅指蛋白的序列的載體遞送如本文所述的鋅指蛋白?？墒褂萌魏屋d體系統(tǒng)，包括但不限于質(zhì)粒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體、皰疹病毒載體和腺相關(guān)病毒載體等。同樣，見，美國專利No.6,534,261、6,607,882、6,824,978、6,933,113、6,979,539、7,013,219和7,163,824，通過引用整體并入本文。此外，顯而易見的是，這些載體的任一種可包含一個(gè)或多個(gè)鋅指蛋白編碼序列。因此，將一個(gè)或多個(gè)ZFP引入細(xì)胞中時(shí)，可在相同載體或不同載體上攜帶ZFP。當(dāng)使用多種載體時(shí)，每種載體可包含編碼一種或多種ZFP的序列?？墒褂贸Ｒ?guī)的基于病毒或不基于病毒的轉(zhuǎn)基因方法將編碼工程化ZFP的核酸引入細(xì)胞(例如，哺乳動物細(xì)胞)和靶組織中。此類方法也可用于向體外細(xì)胞施用編碼ZFP的核酸。在某些實(shí)施方案中，施用編碼ZFP的核酸作體內(nèi)或離體基因療法使用。非病毒載體遞送系統(tǒng)包括DNA質(zhì)粒、裸露核酸和與遞送媒介物，例如脂質(zhì)體或泊洛沙姆復(fù)合的核酸。病毒載體遞送系統(tǒng)包括DNA和RNA病毒，其在遞送至細(xì)胞后具有附加體或整合基因組。對于基因療法過程的評論，見Anderson，Science256:808-813(1992)；Nabel和Felgner，TIBTECH11:211-217(1993)；Mitani和Caskey，TIBTECH11:162-166(1993)；Dillon，TIBTECH11:167-175(1993)；Miller，Nature357:455-460(1992)；VanBrunt，Biotechnology6(10):1149-1154(1988)；Vigne，RestorativeNeurologyandNeuroscience8:35-36(1995)；Kremer和Perricaudet，BritishMedicalBulletin51(1):31-44(1995)；Haddada等，在CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology中Doerfler和(編輯)(1995)；和Yu等，GeneTherapy1:13-26(1994)。核酸的非病毒遞送方法包括電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、顯微注射、基因槍法、病毒顆粒、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、聚陽離子或脂質(zhì):核酸偶聯(lián)物、裸露DNA、人工病毒粒子和試劑增強(qiáng)的DNA攝取。使用(例如)Sonitron2000系統(tǒng)(Rich-Mar)的聲孔效應(yīng)也可用于遞送核酸。另外的示例性核酸遞送系統(tǒng)包括AmaxaBiosystems(Cologne,Germany)、Maxcyte,Inc.(Rockville,Maryland)、BTXMolecularDeliverySystems(Holliston,MA)和CopernicusTherapeuticsInc.提供的核酸遞送系統(tǒng)(見例如US6008336)。例如，在US5,049,386、US4,946,787和US4,897,355中描述了脂質(zhì)轉(zhuǎn)染并且脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑在市場上有售(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。適合多核苷酸的有效受體-識別脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的陽離子和中性脂質(zhì)包括Felgner，WO91/17424,WO91/16024?？上蚣?xì)胞(離體施用)或靶組織(體內(nèi)施用)遞送。脂質(zhì):核酸復(fù)合物，包括靶向脂質(zhì)體(例如免疫脂質(zhì)復(fù)合物)的制備為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知(見，例如，Crystal，Science270:404-410(1995)；Blaese等，CancerGeneTher.2:291-297(1995)；Behr等，BioconjugateChem.5:382-389(1994)；Remy等，BioconjugateChem.5:647-654(1994)；Gao等，GeneTherapy2:710-722(1995)；Ahmad等，CancerRes.52:4817-4820(1992)；美國專利No.4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。另外的遞送方法包括使用將待遞送的核酸包裝至EnGeneIC遞送媒介物(EDV)中。特別地，使用雙特異性抗體將這些EDV遞送至靶組織，其中所述抗體的一條臂對靶組織有特異性而另一條臂對EDV有特異性?？贵w將EDV帶到靶細(xì)胞表面，然后通過胞吞作用將EDV帶到細(xì)胞中。一旦進(jìn)入細(xì)胞，就釋放內(nèi)容物(見MacDiarmid等(2009)NatureBiotechnology第27卷(7)第643頁)。使用基于RNA或DNA病毒的系統(tǒng)遞送編碼工程化ZFP的核酸利用高度發(fā)展過程將病毒靶向體內(nèi)特異性細(xì)胞并且將病毒有效載荷運(yùn)輸至細(xì)胞核?？上蚧颊?體內(nèi))直接施用病毒載體或可使用病毒載體處理體外細(xì)胞并向患者(離體)施用經(jīng)修飾細(xì)胞。常規(guī)的基于病毒的ZFP遞送系統(tǒng)包括但不限于用于基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、牛痘和單純皰疹病毒。可能用逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)基因方法在宿主基因組中整合，往往導(dǎo)致插入的轉(zhuǎn)基因長期表達(dá)。另外，已經(jīng)在許多不同細(xì)胞類型和靶組織中觀察到高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。可通過并入外來包膜蛋白，擴(kuò)展?jié)撛谀繕?biāo)群體的靶細(xì)胞來改變逆轉(zhuǎn)錄病毒的向性。慢病毒載體是能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染非分裂細(xì)胞并且通常產(chǎn)生高病毒滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的選擇取決于靶組織。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由具有高達(dá)6-10kb外來序列的包裝能力的順式作用長末端重復(fù)序列構(gòu)成。最小順式作用LTR對復(fù)制和包裝載體有效，然后可將其用于將治療基因整合至靶細(xì)胞中以提供永久轉(zhuǎn)基因表達(dá)。廣泛使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括基于鼠白血病毒(MuLV)、長臂猿白血病毒(GaLV)、猿猴免疫缺損病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及其組合的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(見，例如，Buchscher等，J.Virol.66:2731-2739(1992)；Johann等，J.Virol.66:1635-1640(1992)；Sommerfelt等，Virol.176:58-59(1990)；Wilson等，J.Virol.63:2374-2378(1989)；Miller等，J.Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。在優(yōu)選瞬時(shí)表達(dá)的應(yīng)用中，可使用基于腺病毒的系統(tǒng)?；谙俨《镜妮d體能夠在許多細(xì)胞類型中非常高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)而不需要細(xì)胞分裂。用此類載體，已經(jīng)獲得高滴度和高表達(dá)水平。在相對簡單的系統(tǒng)中可大量生成這種載體。例如，在核酸和肽的體外生成和體內(nèi)和離體基因治療過程中，也使用腺相關(guān)病毒(“AAV”)載體用靶核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(見，例如，West等，Virology160:38-47(1987)；美國專利No.4,797,368；WO93/24641；Kotin，HumanGeneTherapy5:793-801(1994)；Muzyczka，J.Clin.Invest.94:1351(1994)。在許多出版物中描述了重組AAV載體的構(gòu)建體，包括美國專利No.5,173,414；Tratschin等，Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin等，Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat和Muzyczka，PNAS81:6466-6470(1984)；和Samulski等，J.Virol.63:03822-3828(1989)。至少6種病毒載體方法目前可用于臨床試驗(yàn)中的基因轉(zhuǎn)移，其利用牽涉由插入輔助細(xì)胞系的基因補(bǔ)充缺陷型載體的方法生成轉(zhuǎn)導(dǎo)劑。pLASN和MFG-S是已經(jīng)用于臨時(shí)試驗(yàn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的實(shí)例(Dunbar等，Blood85:3048-305(1995)；Kohn等，Nat.Med.1:1017-102(1995)；Malech等，PNAS94:2212133-12138(1997))。PA317/pLASN是用于基因療法試驗(yàn)的首例治療載體。(Blaese等，Science270:475-480(1995))。已經(jīng)對MFG-S包裝載體觀察到50%或更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。(Ellem等，ImmunolImmunother.44(1):10-20(1997)；Dranoff等，Hum.GeneTher.1:111-2(1997)。重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)是基于缺陷型和非病原性細(xì)小病毒2型腺相關(guān)病毒的有前景的替代基因遞送系統(tǒng)。所有載體源自僅保留了在轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒兩側(cè)的AAV145bp反向末端重復(fù)序列的質(zhì)粒。因整合至轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞基因組中而產(chǎn)生的有效基因轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因遞送是這種載體系統(tǒng)的主要特征。(Wagner等，Lancet351:91171702-3(1998)，Kearns等，GeneTher.9:748-55(1996))。根據(jù)本發(fā)明也可使用其它AAV血清型，包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6和AAV8。復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體(Ad)可在高滴度下生成并易于感染許多不同細(xì)胞類型。工程化大多數(shù)腺病毒載體，以致轉(zhuǎn)基因置換AdE1a、E1b和/或E3基因；隨后復(fù)制缺陷型載體在以反式作用提供缺失基因功能的人293細(xì)胞中增殖。Ad載體可轉(zhuǎn)導(dǎo)多種類型的體內(nèi)組織，包括非分裂、分化細(xì)胞，例如在肝臟、腎臟和肌肉中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞。常規(guī)的Ad載體具有大承載能力。Ad載體用于臨床試驗(yàn)的實(shí)例牽涉經(jīng)肌肉內(nèi)注射進(jìn)行抗腫瘤免疫接種的多核苷酸療法(Sterman等，Hum.GeneTher.7:1083-9(1998))。腺病毒載體用于臨床試驗(yàn)中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的另外的實(shí)例包括Rosenecker等，Infection24:15-10(1996)；Sterman等，Hum.GeneTher.9:71083-1089(1998)；Welsh等，Hum.GeneTher.2:205-18(1995)；Alvarez等，Hum.GeneTher.5:597-613(1997)；Topf等，GeneTher.5:507-513(1998)；Sterman等，Hum.GeneTher.7:1083-1089(1998)。包裝細(xì)胞用于形成能夠感染宿主細(xì)胞的病毒顆粒。此類細(xì)胞包括包裝腺病毒的293細(xì)胞和包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒的ψ2細(xì)胞或PA317細(xì)胞。通常由將核酸載體包裝至病毒顆粒中的生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生基因療法中所用的病毒載體。載體通常含有包裝和隨后整合至宿主中所需的最小病毒序列(若適用)，編碼待表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)盒置換的其它病毒序列。由包裝細(xì)胞系以反式作用提供缺少的病毒功能。例如，基因療法中所用的AAV載體通常僅具有來自AAV基因組，包裝并整合至宿主基因組中所需的反向末端重復(fù)(ITR)序列。病毒DNA包裝在含有編碼其它AAV基因(即，rep和cap)，但是缺乏ITR序列的輔助質(zhì)粒的細(xì)胞系中。也用作為輔助因子的腺病毒感染細(xì)胞系。輔助病毒促進(jìn)AAV載體的復(fù)制和來自復(fù)制質(zhì)粒的AAV基因的表達(dá)。由于缺乏ITR序列，未包裝足夠量的輔助質(zhì)粒。例如，可通過對比AAV更敏感的腺病毒進(jìn)行熱處理減少腺病毒污染。在許多基因治療應(yīng)用中，期望以高度特異性將基因治療載體遞送至特殊細(xì)胞類型中。相應(yīng)地，可通過在病毒外表面上使配體表達(dá)呈與病毒外殼蛋白的融合蛋白，將病毒載體修飾為對指定細(xì)胞類型有特異性。選擇對已知在目標(biāo)細(xì)胞類型上存在的受體有親和力的配體。例如，Han等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:9747-9751(1995)，報(bào)道了可修飾莫洛尼鼠白血病病毒以表達(dá)與gp70融合的人調(diào)蛋白(heregulin)，并且重組病毒感染表達(dá)人表皮生長因子受體的某些人乳腺癌細(xì)胞?？蓪⑦@種原理擴(kuò)展至其它病毒-靶細(xì)胞對，其中靶細(xì)胞表達(dá)受體而病毒表達(dá)包含細(xì)胞表面受體的配體的融合蛋白。例如，可工程化絲狀噬菌體以展示對實(shí)際上任何所選細(xì)胞受體有特異性結(jié)合親和力的抗體片段(例如，F(xiàn)AB或Fv)。雖然以上描述主要適用于病毒載體，但是相同原理可應(yīng)用于非病毒載體?？蓪⒋祟愝d體工程化為含有促進(jìn)特異性靶細(xì)胞攝取的特異性攝取序列?？赏ㄟ^向個(gè)別患者施用，通常通過如下所述的全身施用(例如，靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或顱內(nèi)輸注)或局部應(yīng)用在體內(nèi)遞送基因治療載體?？蛇x地，可將載體遞送至離體細(xì)胞，例如從個(gè)別患者外移植的細(xì)胞(例如，淋巴細(xì)胞、骨髓抽吸物、組織活檢)或萬能供體造血干細(xì)胞，接著再將細(xì)胞植入患者體內(nèi)，通常在選擇已經(jīng)并入載體的細(xì)胞后。用于診斷、研究或基因療法的離體細(xì)胞轉(zhuǎn)染(例如，通過將轉(zhuǎn)染細(xì)胞再輸注至宿主生物體內(nèi))為本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，從受試生物體分離細(xì)胞，用ZFP核酸(基因或cDNA)轉(zhuǎn)染，并再輸注回受試生物(例如，患者)體內(nèi)。適合離體轉(zhuǎn)染的各種細(xì)胞類型為本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知(見，例如，F(xiàn)reshney等，CultureofAnimalCells,AManualofBasicTechnique(1994年第3版))和本文引用的討論如何從患者體內(nèi)分離并培養(yǎng)細(xì)胞的參考)。適合的細(xì)胞包括但不限于真核和原核細(xì)胞和/或細(xì)胞系。此類細(xì)胞或由此類細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞系的非限制性實(shí)例包括COS、CHO(例如，CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6細(xì)胞以及昆蟲細(xì)胞(例如，草地貪夜蛾(Sf))或真菌細(xì)胞(例如酵母屬、畢赤酵母屬和裂殖酵母屬)。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞系為CHO-K1、MDCK或HEK293細(xì)胞系。另外，可分離原代細(xì)胞并且在離體用ZFN處理后用于再引入待治療的受試者體內(nèi)。適合的原代細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和其它血細(xì)胞亞類，例如但不限于CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞。適合的細(xì)胞還包括干細(xì)胞，舉例而言，例如胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)元干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，將干細(xì)胞用于離體手術(shù)中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和基因治療。使用干細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)在于，它們可在體外分化為其它細(xì)胞類型，或可引入哺乳動物(例如細(xì)胞供體)中，在那里它們將植入骨髓。已知使用細(xì)胞因子，例如GM-CSF、IFN-γ和TNF-α，使體外CD34+細(xì)胞分化為臨床上重要的免疫細(xì)胞類型的方法(見Inaba等，J.Exp.Med.176:1693-1702(1992))。使用已知方法分離細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)和分化。例如，通過淘選具有結(jié)合有害細(xì)胞的抗體的骨髓細(xì)胞，例如CD4+和CD8+(T細(xì)胞)、CD45+(panB細(xì)胞)、GR-1(粒細(xì)胞)和Iad(分化抗原呈遞細(xì)胞)，從骨髓中分離干細(xì)胞(見Inaba等，J.Exp.Med.176:1693-1702(1992))。在一些實(shí)施方案中也使用已經(jīng)修飾的干細(xì)胞。例如，可使用已經(jīng)使其對細(xì)胞凋亡有抗性的干細(xì)胞作為治療組合物，其中干細(xì)胞也含有本發(fā)明的ZFPTF。例如，可使用BAX-或BAK-特異性ZFN(見，美國專利申請no.12/456,043)敲除干細(xì)胞中的BAX和/或BAK，或(例如)再次使用半胱天冬酶-6特異性ZFN敲除半胱天冬酶中破壞的BAX和/或BAK產(chǎn)生對細(xì)胞凋亡的抗性?？捎靡阎{(diào)控突變或野生型PD1的ZFPTF轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。也可向生物體直接施用含有治療性ZFP核酸的載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、脂質(zhì)體等)以轉(zhuǎn)導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞?？蛇x地，可施用裸露DNA。可通過常用于將分子引入與血液或組織細(xì)胞的最終接觸的任何途徑施用，包括但不限于注射、輸注、局部應(yīng)用和電穿孔。施用此類核酸的適合方法可用并且為本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知，并且，雖然可使用一種以上的途徑施用特殊組合物，但是一種特殊途徑往往可提供比另一種途徑更直接且更有效的反應(yīng)。例如，在美國專利No.5,928,638中公開了將DNA引入造血干細(xì)胞中的方法。對于將轉(zhuǎn)基因引入造血干細(xì)胞(例如，CD34+細(xì)胞)中有用的載體包括35型腺病毒。適于將轉(zhuǎn)基因引入免疫細(xì)胞(例如，T細(xì)胞)中的載體包括非整合慢病毒載體。見，例如，Ory等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:11382-11388；Dull等(1998)J.Virol.72:8463-8471；Zuffery等(1998)J.Virol.72:9873-9880；Follenzi等(2000)NatureGenetics25:217-222。部分由施用的特殊組合物，以及用于施用所述組合物的特殊方法確定藥學(xué)上可接受的載體。相應(yīng)地，如下所述，存在多種多樣的可用藥物組合物的適合制劑(見，例如，Remington’sPharmaceuticalSciences，第17版，1989)。應(yīng)用公開的組合物和方法可用于需要調(diào)節(jié)一個(gè)或多個(gè)PD1基因的表達(dá)的任何應(yīng)用中。具體而言，需要調(diào)節(jié)PD1等位基因時(shí)可使用這些方法和組合物，包括但不限于治療和研究應(yīng)用。所述方法和組合物可用于治療慢性傳染性疾病，例如HIV/AIDS和HCV。另外，所述方法和組合物可用于治療癌癥，例如黑素瘤、卵巢癌、結(jié)直腸癌/結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、漿細(xì)胞瘤/骨髓瘤、乳腺癌和肺癌。抑制PD1的ZFPTF或ZFN可用作治療劑的疾病和病狀包括但不限于慢性傳染性疾病和癌癥?；罨疨D1基因作為治療處理有用的疾病和病狀包括自身免疫性疾病，例如全身性紅斑狼瘡(SLE)。編碼ZFPTF或ZFN的多核苷酸本身可用作治療劑，或可并入載體中遞送。包含抑制PD1等位基因的ZFP-TF和/或PD1特異性ZFN的方法和組合物也可連同設(shè)計(jì)用于治療慢性傳染性疾病或癌癥的其它治療劑一起使用。這些ZFP或ZFN(或編碼這些ZFP或ZFN的多核苷酸)可同時(shí)施用(例如，在相同藥物組合物中)或可按任何順序依次施用?？芍委熑魏晤愋偷陌┌Y，包括但不限于肺癌、胰腺癌、肝癌、骨癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、腦癌等。類似地，設(shè)計(jì)用于活化PD1等位基因的ZFPTF可與設(shè)計(jì)用于治療自身免疫性疾病的其它治療劑一起使用。用于治療的方法和組合物還包括細(xì)胞組合物，其中已經(jīng)使用PD1特異性ZFN將從患者分離的細(xì)胞內(nèi)突變拷貝的PD1等位基因修飾為野生型PD1等位基因。然后再將這些體外修飾細(xì)胞引入患者體內(nèi)。另外，還預(yù)想了包含經(jīng)修飾干細(xì)胞的方法和組合物。例如，其中已經(jīng)使用PD1特異性ZFN將干細(xì)胞內(nèi)突變拷貝的PD1等位基因修飾為野生型PD1等位基因的干細(xì)胞組合物。在其它實(shí)施方案中，提供了干細(xì)胞組合物，其中已經(jīng)使用PD1特異性ZFN修飾干細(xì)胞內(nèi)的野生型PD1等位基因。這些組合物可連同其它治療劑一起使用。這些組合物可同時(shí)施用(例如，在相同藥物組合物中)或可按任何順序依次施用。本發(fā)明的方法和組合物對體外和體內(nèi)模型，例如慢性感染、癌癥或自身免疫的動物模型的設(shè)計(jì)和實(shí)現(xiàn)也有用，從而允許對這些病癥的研究并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)有用的治療劑。下列實(shí)施例涉及其中核酸酶包含ZFN的本發(fā)明的示例性實(shí)施方案。應(yīng)了解，這僅僅是為了舉例說明并且可使用其它核酸酶，例如具有工程化DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或自然生成的工程化歸巢內(nèi)切核酸酶(大范圍核酸酶)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和異源裂解結(jié)構(gòu)域融合的歸巢內(nèi)切核酸酶(大范圍核酸酶)。實(shí)施例實(shí)施例1：鑒定具持久生物活性的PD1特異性ZFN使ZFN裝配在人PD1基因上并通過Miller等(2007)Nat.Biotechnol.25:778-785和美國專利公布No.20050064474和國際專利公布WO2005/014791中所述的ELISA和CEL1測定法測試。表1中公開了ZFP的特定實(shí)例。這個(gè)表中的第一欄為ZFP的內(nèi)部引用名稱(數(shù)字)。表2列出了PD1上的靶結(jié)合位點(diǎn)?！癋”指指并且“F”后面的數(shù)字指哪個(gè)鋅指(例如，“F1”指第1指)。表1：人PD1靶向鋅指蛋白表2：人PD1基因中的ZFN靶位點(diǎn)SBS#靶位點(diǎn)12942ccAGGGCGCCTGTGGGAtctgcatgcct(SEQIDNO:56)12946caGTCGTCTGGGCGGTGctacaactggg(SEQIDNO:57)12947caGTCGTCTGGGCGGTGctacaactggg(SEQIDNO:57)12934gaACACAGGCACGGctgaggggtcctcc(SEQIDNO:58)12971ctGTGGACTATGGGGAGCTGgatttcca(SEQIDNO:59)12972ctGTGGACTATGGGGAGCTGgatttcca(SEQIDNO:59)18759caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)22237ccAGGGCGCCTGTGGGAtctgcatgcct(SEQIDNO:56)25005caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25006caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25010caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25011caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25012caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25013caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25014caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25015caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25016caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25017caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25022caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25023caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25025caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25027caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25028caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25029caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25030caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25031caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25032caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25034caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25036caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25040caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)25041caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQIDNO:60)對如上所述經(jīng)核轉(zhuǎn)染的細(xì)胞樣品進(jìn)行初始體外活性測定。簡言之，通過使用生產(chǎn)商指定的AmaxaTM核轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將編碼ZFP-FokI融合蛋白的質(zhì)粒引入K562細(xì)胞中。為了轉(zhuǎn)染，使兩百萬個(gè)K562細(xì)胞與不同量的每種鋅指核酸酶表達(dá)質(zhì)粒和100μLAmaxaTM溶液V混合。于AmaxaNucleofectorIITM中，使用程序T-16轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后立即將細(xì)胞分到兩個(gè)不同的燒瓶中并且使其在30℃或37℃下，于5%CO2中，在補(bǔ)充了10%FBS的RPMI培養(yǎng)基(Invitrogen)中生長4天。對于這種初始體外篩選，鑒定兩個(gè)前導(dǎo)ZFN對并提交細(xì)化以便設(shè)法提高其效率。這些對分別靶向PD1基因的外顯子1和5。在基本上如上所述的時(shí)程實(shí)驗(yàn)中再次測試細(xì)化(改良)蛋白。以下表3中總結(jié)了結(jié)果。表3：PD1NHEJ如表3所示，用對外顯子5設(shè)計(jì)的ZFN處理細(xì)胞引起從群體中丟失更大比例的基因組編輯細(xì)胞，而用對外顯子1設(shè)計(jì)的ZFN處理的細(xì)胞中的基因組編輯信號更加穩(wěn)定。為測定PD1基因座處的ZFN活性，基本上按照生產(chǎn)商的說明(TrangenomicSURVEYORTM)進(jìn)行基于Cel-1的SURVEYORTM核酸酶測定。收獲細(xì)胞并且根據(jù)生產(chǎn)商的指示(Epicentre)使用QuickextractTM試劑盒制備染色體DNA。使用AccuprimeTM高保真DNA聚合酶(Invitrogen)PCR擴(kuò)增PD1基因座的適當(dāng)區(qū)域。加熱PCR反應(yīng)至94℃，并逐漸冷卻至室溫。約200ng的退火DNA與0.33μLCel-I酶混合并且在42℃下孵育20min。于1XTris-硼酸鹽-EDTA緩沖液中，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物。還測試了在30℃或37℃下保存了3或10天的原代PBMC樣品中的構(gòu)建體(見表4)。簡言之，由AllCells獲得PBMC并且于RPMI+10%FBS+1%L-谷氨酰胺(30mg/mL)+IL-2(1ng/mL，Sigma)中培養(yǎng)并且根據(jù)生產(chǎn)商的方法(Dynal)用抗CD3/CD28珠活化。按1mL體積中3E5個(gè)細(xì)胞/mL將細(xì)胞接種于24孔板中。構(gòu)建體含有所述目標(biāo)ZFN對的腺病毒載體(見美國專利公布20080159996)并于2天后按10、30或100的MOI添加(基于感染滴度計(jì)算MOI)。暴露于病毒后3或10天收獲細(xì)胞并且使用如國際專利公布WO07/014275中所述進(jìn)行的基于Cel-I的SURVEYORTM核酸酶測定法測定基因修飾效率。同樣，見，Oleykowski等(1998)NucleicAcidsRes.26:4597-4602；Qui等(2004)BioTechniques36:702-707；Yeung等(2005)BioTechniques38:749-758。對于表4中所示的ZFN對，每個(gè)ZFN與ZFN12942聯(lián)合測試。通過上述基于Cel-1的SURVEYORTM核酸酶測定法測量，按照NHEJ活性百分比測量活性。還測試了另外的PD1特異性ZFN對在如上所述的原代PBMC中的活性，并且將結(jié)果示于表4中。在表4所示的數(shù)據(jù)中，PD1特異性單體12942總是與表4中所列的第二ZFN配對以形成活性對(即ZFN12942與ZFN12947-25041的每一個(gè)配對)。同樣，見，圖1(樣品如表4所示)。表4：PD1ZFN的活性為在分子水平上測定ZFN驅(qū)動的NHEJ活性的局部作用，用外顯子1特異性ZFN對12942和12947處理CD8+細(xì)胞。簡言之，從AllCells購買CD8+細(xì)胞并且于RPMI+10%FBS+1%L-谷氨酰胺(30mg/mL)+IL-2(30μg/mL，Sigma)中培養(yǎng)并使其靜置4-24h。構(gòu)建含有如上所述的目標(biāo)ZFN對的質(zhì)粒并且1e6細(xì)胞/核轉(zhuǎn)染與生產(chǎn)商指定的AmaxaTM核轉(zhuǎn)染試劑盒一起使用。根據(jù)生產(chǎn)商的方法(Dynal)核轉(zhuǎn)染后12-24h，用抗CD3/CD28珠活化細(xì)胞。核轉(zhuǎn)染后3或10天收獲細(xì)胞并且使用如國際專利公布WO07/014275所述進(jìn)行的基于Cel-1的SURVEYORTM核酸酶測定法測定基因修飾效率。同樣，見，Oleykowski等(1998)NucleicAcidsres.26:4597-4602；Qui等(2004)BioTechniques36:702-707；Yeung等(2005)BioTechniques38:749-758?？寺CR產(chǎn)物并轉(zhuǎn)染至大腸桿菌(E.coli)中。使抗生素抗性亞克隆長大，分離質(zhì)粒，然后進(jìn)行序列分析以觀測由于NHEJ已經(jīng)發(fā)生的任何序列改變(見圖2)。如圖中可見，在ZFN裂解位點(diǎn)附近觀察到多個(gè)插入和缺失。還在如美國公布No.20090111119中所述的酵母系統(tǒng)中測試了這些ZFN。實(shí)施例2：小鼠內(nèi)PD1特異性ZFN的離體活性為測試體內(nèi)除去PD1的概念，如上所述制備小鼠PD1特異性ZFN，然后在離體測試。以下表5和6中示出了鋅指結(jié)構(gòu)域的序列特征，及其結(jié)合特異性。表5：鼠PD1特異性鋅指設(shè)計(jì)表6：鼠PD1特異性鋅指設(shè)計(jì)的結(jié)合特異性SBS#靶位點(diǎn)14534gtGCTGCAGTTGAGCTGgcaatcagggt(SEQIDNO:75)14534-FokIKKgtGCTGCAGTTGAGCTGgcaatcagggt(SEQIDNO:75)14536ccCAAGTGAATGACCAGGGTacctgccg(SEQIDNO:76)14536-FokIELccCAAGTGAATGACCAGGGTacctgccg(SEQIDNO:76)14545caGCTGCCCAACAGGCAtgacttccaca(SEQIDNO:77)14545-FokIKKcaGCTGCCCAACAGGCAtgacttccaca(SEQIDNO:77)14546atGATCTGGAAGCGGGCatcctggacgg(SEQIDNO:78)14546-FokIELatGATCTGGAAGCGGGCatcctggacgg(SEQIDNO:78)第1天，將從PmelTCR轉(zhuǎn)基因/Rag1-/-小鼠收獲的脾細(xì)胞加工為單細(xì)胞懸液并且再懸浮于完全培養(yǎng)基(RPMI-1640、10%胎牛血清、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉、2mML-谷氨酰胺、50μg/ml硫酸慶大霉素、50μM2-巰基乙醇)中，25μlInvitrogen小鼠T-活化劑CD3/CD28Dynabeads/106個(gè)細(xì)胞。按2×106個(gè)細(xì)胞/ml(2ml/孔)將細(xì)胞接種于24孔板中。第3天，收獲細(xì)胞，使用磁鐵從珠中分離細(xì)胞并計(jì)數(shù)。按照與AmaxaTM核轉(zhuǎn)染試劑盒一起提供的方法進(jìn)行脾細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。簡言之，將1×10e7個(gè)活細(xì)胞再懸浮于100μl的Amaxa核轉(zhuǎn)染劑溶液中并且用4μg含ZFN對14546和14545的質(zhì)粒，或4μg含ZFN對14546FokIEL和14545-FokIKK的突變型PD1Fok1質(zhì)粒，2.5μg的AmaxapmaxGFP載體或無DNA對照，使用Amaxa核轉(zhuǎn)染劑(程序X-01)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，在30℃下于2ml充分補(bǔ)充的Amaxa小鼠T細(xì)胞核轉(zhuǎn)染劑培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。第二天，去除1ml的Amaxa小鼠T細(xì)胞核轉(zhuǎn)染劑培養(yǎng)基并且替換為1ml補(bǔ)充了10U/mlIL-2的完整培養(yǎng)基。2天后，收獲細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將2百萬個(gè)來自每一組的細(xì)胞接種于24孔板上涂有抗CD3的孔中。第二天，收獲細(xì)胞并且用抗PD1PE、抗CD3PE-Cy7和抗CD8APC染色。在BDFACSCalibur上分析細(xì)胞。圖中顯示每一組中的PD1陽性CD3+CD8+細(xì)胞%和每一組的中值PD1熒光性(見圖3)。數(shù)據(jù)顯示，在接受了PD1特異性ZFN的細(xì)胞中，即使在CD3刺激存在下，PD1表達(dá)降低。為驗(yàn)證在稍后的時(shí)間點(diǎn)，PD1表達(dá)減少明顯，還在CD3刺激后72h，而非如上所述的CD3刺激后24h收獲細(xì)胞。收獲細(xì)胞并且用抗PD1PE、抗CD3PE-Cy7和抗CD8APC染色。在BDFACSCalibur上分析細(xì)胞。圖4中呈現(xiàn)了數(shù)據(jù)。上部直方圖示出了每一組中PD1陽性CD3+CD8+細(xì)胞%和每一組的中值PD1熒光性。下圖示出了PD1/CFSE表達(dá)細(xì)胞的頻率。重要的是，突變型PD1Fok1和野生型PD1Fok1顯示出比對照組更高的PD1陰性CFSE二聚(分裂細(xì)胞)頻率，并且證明，即使在抗CD3刺激后72h經(jīng)PD1特異性ZFN處理的細(xì)胞中PD1表達(dá)仍減少。實(shí)施例3：TIL中人PD1特異性ZFN的活性在腫瘤存在下，測試人腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)中的人PD1特異性ZFN并且基本上如上所述并使用本領(lǐng)域已知的方法測定(見例如Yoshino等，(1992)CancerResearch52:775-781)。使用如上所述的抗CD3抗體活化PD1特異性ZFN，然后用表達(dá)PD1特異性ZFN的Ad5/F35腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。用IL2使細(xì)胞展開，然后用抗CD3抗體或腫瘤再次刺激細(xì)胞并且在刺激24h后測定。結(jié)果示于以下表7中。表7：TIL中的PD1表達(dá)和活力表7中的數(shù)據(jù)證明，當(dāng)用抗CD3抗體刺激細(xì)胞時(shí)，通過PD1特異性ZFN的作用，降低PD1表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞活力增強(qiáng)。當(dāng)用腫瘤處理轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞時(shí)，觀察到相同的現(xiàn)象-ZFN介導(dǎo)的PD1減少導(dǎo)致TIL活力增強(qiáng)。同樣，數(shù)據(jù)顯示，轉(zhuǎn)導(dǎo)TIL中PD1表達(dá)降低導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞活力降低。實(shí)施例4：PD1編輯的原代人T細(xì)胞的純化如以上實(shí)施例1中所述，測試CD4+T細(xì)胞中已經(jīng)進(jìn)一步詳細(xì)闡述的PD1特異性ZFN對。如圖5中所見，對一些對觀察到高達(dá)44%的編輯。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，‘陽性對照’指先前在不同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行的在CD8+T細(xì)胞中使用25025/12942ZFN對切割。選擇一個(gè)前導(dǎo)對，25029/12942，進(jìn)一步用于分離PD1修飾細(xì)胞。簡言之，在這些實(shí)驗(yàn)中，用編碼PD1特異性ZFN的mRNA處理CD4+T細(xì)胞，在“30℃”條件下培養(yǎng)，然后如以上實(shí)施例1中所述，經(jīng)首次暴露于刺激ZFN轉(zhuǎn)基因強(qiáng)烈表達(dá)并促進(jìn)PD1基因座處裂解的抗CD3/CD8珠(Dynal)刺激(見美國專利公布No.20080311095)。在這首次刺激后，再次刺激細(xì)胞并通過FAC或親和色譜法進(jìn)行純化過程。簡言之，用CCR5特異性ZFN(見美國專利公布20080159996)或PD1特異性ZFN處理CD4+T細(xì)胞。(i)在首次刺激后，(ii)在第二次刺激之后，但是在任何純化之前，(iii)使用標(biāo)準(zhǔn)方法對CD25+(活化標(biāo)志)，PD1(-)進(jìn)行細(xì)胞分選之后，或(iv)在使用用抗PD1抗體或抗CD25抗體制備的基質(zhì)進(jìn)行親和色譜法之后，收集細(xì)胞并通過Cel-I測定法(上述)分析PD1編輯。如圖6所示，使用細(xì)胞分選技術(shù)(分離對CD25呈陽性，但是對PD1呈陰性的細(xì)胞)，通過Cel-I測定法測定，發(fā)現(xiàn)多達(dá)56%的回收細(xì)胞已被修飾。通過Cel-1分析測定，通過親和色譜技術(shù)(使細(xì)胞通過使用抗PD1抗體、抗CD25抗體或二者制備的親和基質(zhì))純化的PD1(-)細(xì)胞展示出高達(dá)42%的總體PC1修飾。還通過測序分析了已經(jīng)通過細(xì)胞分選純化的細(xì)胞的PD1基因座，并且在以下表8中呈現(xiàn)了結(jié)果。如從表中可見，通過Cel-I分析預(yù)測的靶標(biāo)修飾百分比(‘%NHEJ’)與通過測序分析發(fā)現(xiàn)的靶標(biāo)修飾百分比相似。在這個(gè)表中，‘樣品’標(biāo)記與圖6中所示的相對應(yīng)。表8：CD25+細(xì)胞中的PD1修飾百分比*：‘修飾數(shù)量’指測序組中觀察到的被修飾的序列數(shù)量。例如，在樣品4中，分析的87個(gè)序列中有54個(gè)被修飾。還測試了CD8+T細(xì)胞中的PD1特異性ZFN。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用Ribomax大規(guī)模RNA生成T7試劑盒(Promega)，接著使用RNeasy迷你試劑盒(Qiagen)，根據(jù)生產(chǎn)商的方法生成編碼PD1特異性ZFN的mRNA。使用如上所述的Amaxa核轉(zhuǎn)染遞送系統(tǒng)，使用不同量的mRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，并通過CelI測定法分析PD1修飾百分比。如圖7所示，描述為‘%NHEJ’的觀察到的修飾量與所用mRNA量相關(guān)，輸入mRNA的量越少，產(chǎn)生的靶標(biāo)修飾百分比越少。這些結(jié)果證明，本文描述的PD1特異性ZFN能夠修飾細(xì)胞系和原代T細(xì)胞中的PD1基因座。本文提到的所有專利、專利申請和出版物據(jù)此通過引用整體并入。雖然為了清楚的理解，已經(jīng)通過舉例說明和實(shí)施例的方式相當(dāng)詳細(xì)地提供了公開內(nèi)容，但是對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見的是，在不背離公開內(nèi)容的精神或范圍的前提下，可實(shí)踐各種變化和修改。相應(yīng)地，不得將前述說明和實(shí)施例解釋為限制。