專利名稱：抗癌腺病毒的制作方法
抗癌腺病毒相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2010年8月16日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/374，215的權(quán)益，所述臨時(shí)申請(qǐng)為了所有目的全部并入本文。對(duì)聯(lián)邦政府資助研發(fā)做出的發(fā)明的權(quán)利的聲明本發(fā)明是在National Institutes of Health授予的政府支持CA137094下做出的。政府對(duì)本發(fā)明擁有某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
有52種人類腺病毒感染不同的人組織，還有上百種腺病毒能夠感染從魚到靈長動(dòng)物的其他物種。這些病毒是高效的納米級(jí)機(jī)器，能夠在感染I小時(shí)內(nèi)將它們的遺傳物質(zhì)有效負(fù)載至細(xì)胞核內(nèi)。這些DNA病毒不整合到宿主DNA中，利用成熟的GMP方案可以產(chǎn)生高滴度的病毒，而且它們?cè)跒榱吮磉_(dá)異位基因進(jìn)行的研究和人類基因治療應(yīng)用中表現(xiàn)很安全。但是，到目前為止，由于使用幾乎只限于一個(gè)變種Ad5或Ad2/5嵌合體以及不能快速和系統(tǒng)地構(gòu)建和組合多個(gè)基因修飾，它們的潛在應(yīng)用受到了局限。因此，需要將常用的腺病毒載體擴(kuò)展到Ad2/5以外，并且要建立一個(gè)技術(shù)平臺(tái)來協(xié)助由組成部分快速離體地組裝新的腺病毒基因組，以便能夠系統(tǒng)地引入多個(gè)修飾和異源元件。這樣的系統(tǒng)可以利用天然的病毒架構(gòu)在能夠高效運(yùn)送和表達(dá)36個(gè)基因(不包括剪接變體)方面的優(yōu)點(diǎn)。所述系統(tǒng)可以提供有力的診斷劑和治療劑，這些診斷劑和治療劑包含對(duì)不同腫瘤樣品中失去調(diào)控的途徑活性的多重和定量測(cè)量。腺病毒載體在多種應(yīng)用中的潛力受限于快速和系統(tǒng)地操縱36kb病毒基因組的能力。而且，基礎(chǔ)研究、動(dòng)物模型、基因治療和溶瘤治療中使用的腺病毒載體只限于腺病毒(Ad)血清型2和5。Ad2和Ad 5居于最早發(fā)現(xiàn)的腺病毒之列，因此傳統(tǒng)上有大量載體/工具來操縱它們的基因組，特別是El區(qū)域。Ad2/5纖維蛋白(Fiber proteins)通過結(jié)合受體CAR感染上皮細(xì)胞。不幸的是，不是所有類型的細(xì)胞都表達(dá)CAR，而且在許多轉(zhuǎn)移病例中被下調(diào)。再者，接近80%的人口具有預(yù)先存在的抗Ad2/5的中和抗體，這與脫靶肝攝取和炎癥一起限制了它的系統(tǒng)性應(yīng)用。因此，使用Ad2/5載體進(jìn)行基因遞送和癌癥治療不一定是最佳選擇，相反主要是歷史的偶然事件。我們的最終目的是建立強(qiáng)力的病毒癌癥療法，所述療法不僅能夠進(jìn)行腫瘤選擇性裂解復(fù)制，還可以在多輪治療中進(jìn)行系統(tǒng)地給藥、避免對(duì)肝臟的毒性、有效地靶向和穿越令人苦惱的腫瘤血管、經(jīng)由不同的受體感染細(xì)胞、在腫瘤內(nèi)通過前藥活化酶/毒素的局部表達(dá)產(chǎn)生腫瘤旁觀者效應(yīng)并且復(fù)蘇有益的宿主抗病毒免疫反應(yīng)。這些主要挑戰(zhàn)又因?yàn)槿祟愊俨《静荒茉谛∈笾袕?fù)制而更加嚴(yán)重。這排除了相比異種移植模型有許多優(yōu)勢(shì)的在免疫活性癌癥基因工程小鼠模型(GEMMs)中進(jìn)行人溶瘤病毒評(píng)價(jià)的可以。52種人類腺病毒的存在表明腺病毒高度專性適應(yīng)不同宿主組織環(huán)境中的感染和復(fù)制。這些病毒中有許多可以感染不同組織，并且具有與除CAR之外的細(xì)胞受體結(jié)合的纖維蛋白以及各不相同的“E3”免疫調(diào)節(jié)基因群。由于缺少修飾它們的基因組所需要的工具，對(duì)它們的這些獨(dú)特屬性還沒有廣泛的研究或利用。類似地，還存在感染其他物種的腺病毒，包括小鼠腺病毒(MAV-1)。本文提供了對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的這些和其他問題的解決方案。發(fā)明概述發(fā)明一方面提供了經(jīng)過改造的腺病毒。所述經(jīng)過改造的腺病毒可以是p53復(fù)制受損型腺病毒。P53復(fù)制受損型腺病毒處于p53表達(dá)細(xì)胞內(nèi)時(shí)是復(fù)制受損的，但在p53受損型細(xì)胞內(nèi)時(shí)不是復(fù)制受損的。發(fā)明另一方面提供了治療癌癥的方法。所述方法包括將有效量(例如治療有效劑量或者用量)的經(jīng)過改造的腺病毒(如上所述)或者一或多個(gè)編碼經(jīng)過改造的腺病毒的核酸給予有此需要的受試對(duì)象。附圖簡述

圖1.腺病毒感染的原代或腫瘤細(xì)胞中ElB_55k的丟失或p53的降解誘導(dǎo)了P53水平，但對(duì)轉(zhuǎn)錄活性沒有影響，這與ARF表達(dá)無關(guān)。a.用模擬物、野生型(wt)或AElB-55k(A55k)病毒感染人原代小氣道上皮細(xì)胞(SAECs)，并在感染后(hours postinfection, h.p.1.)24、36和48小時(shí)收集。對(duì)蛋白裂解物進(jìn)行歸一化，并分析p53、p21、MDM2和ARF的表達(dá)情況。分析肌動(dòng)蛋白的表達(dá)作為上樣對(duì)照。b.用模擬物、wt或A 55k病毒感染U20S細(xì)胞并在28h.p.1.固定。通過免疫熒光檢測(cè)p53，用Hoechst染料將DNA復(fù)染。c.用模擬物、被或八551^病毒感染似03細(xì)胞，在24、36和4811. .1.收集。多柔比星(Doxorubicin, dox)處理12小時(shí)作為p53激活的陽性對(duì)照。將蛋白裂解物歸一化，并分析p53、p21和MDM2的表達(dá)。分析肌動(dòng)蛋白的表達(dá)作為上樣對(duì)照。d.用模擬物、wt或A 55k病毒感染帶有異丙基P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)性ARF的U20S穩(wěn)定細(xì)胞系(NARF細(xì)胞)。細(xì)胞不做處理或者在8h.p.1.加入IPTG以誘導(dǎo)ARF的表達(dá)。利用實(shí)時(shí)PCR在36h.p.1.定量p21和MDM2的mRNA水平(下方小圖)，作圖表示為相對(duì)于(with respect to, wrt)模擬物感染的細(xì)胞(-ARF)的倍數(shù)改變；豎線代表三個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。還收集(48h.p.1.)了蛋白裂解物，歸一化并分析p53、p21、MDM2和ARF的表達(dá)(上方小圖)。肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照。圖2.ElB_55k的缺失在感染腺病毒的細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)了高水平磷酸化p53，而p53轉(zhuǎn)錄靶被明顯阻遏，不能被輻射、基因毒性藥物、ARF、MDM2拮抗劑或者組蛋白去乙?；敢种苿┘せ?。a.用模擬物、wt或八551^病毒感染似03細(xì)胞。樣品在24h.p.1.用介質(zhì)對(duì)照(-)或5-氟尿嘧啶(5-FU)處理。36h.p.1.收集蛋白裂解物，歸一化并分析p53和p21的表達(dá)。分析肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照。b.用模擬物、A 55k或wt病毒感染SAECs。細(xì)胞不做處理或者在31h.p.1.用IOGy進(jìn)行Y -照射(IR)。在36h.p.1.收集蛋白裂解物(下方小圖)，歸一化并分析P53、p21和MDM2的表達(dá)。利用磷酸化特異性抗體檢測(cè)p53在絲氨酸(ser) 15處的磷酸化。肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照。還在36h.p.1.收集了總RNA，并通過實(shí)時(shí)PCR定量p53的轉(zhuǎn)錄靶(上方小圖)。將PUMA、MDM2、p21、GADD45A和14_3_3 o的水平作圖為相對(duì)于(wrt)未感染細(xì)胞在0小時(shí)的倍數(shù)改變；豎線代表三個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。c.用模擬物或A 55k病毒感染SAECs，并在36h.p.1.收集。多柔比星(dox)處理12小時(shí)作為p53活化的陽性對(duì)照。將蛋白裂解物歸一化，并通過Western印跡分析總的p53和p21水平。利用p53磷酸化特異性抗體確定 P53 在 ser6 和 9 (酪蛋白激酶 I)、serl5 (ATM、ATR、DNA-PK)、ser20 (CHK1、CHK2、JNK、MAPKAP2)、ser33 (p38、PIN1)、ser46 (HIPK2 和 DYRK2)、蘇氨酸(thr)81 (JNK、PIN1)、ser315 (Aurora 激酶、PIN1、CDK2 和 GSK-3)和 ser392 (PKR、CDK9 和 p38FACT_CK2) 3的磷酸化。d.用模擬物、wt或A 55k病毒感染SAECs。樣品在24h.p.1.用介質(zhì)對(duì)照(-泳道)、多柔比星(dox)、MDM2拮抗劑、nut I in或曲古菌素(trichostatin A, TSA)處理。在36h.p.1.收集蛋白裂解物,歸一化并通過Western印跡分析p53、MDM2和p21。肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照。圖3.E1A-13S誘導(dǎo)E4-0RF3，后者在感染腺病毒的細(xì)胞中獨(dú)立于ElB_55k和p53降解而將p53滅活。a.用以下病毒感染SAECs:模擬物；野生型(wt);帶有E4-0RF3 ( A 0RF3), ElB-55k( A 55k)突變或者E4基因缺失(AE4)的病毒、帶有下述復(fù)合突變的病毒:ElB-55k 和 ElA ( A 55k/ElA A p300)、ElB_55k 和 E4-0RF6 ( A 55k/ A 0RF6)、ElB-55k 和 E4-0RF2 ( A 55k/ A 0RF2)、ElB_55k 和 E4-0RF3 ( A 55k/ A 0RF3)或者 ElB_55k 和ElA-13s(A55k/A13s)(參見補(bǔ)充的圖4)。在36h.p.1.收集蛋白裂解物，歸一化并通過Western印跡分析p53、MDM2、p21、ElB_55k和E4-0RF3的表達(dá)。肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照。b.用模擬物、A 55k、A 55k/A 0RF3或A 55k/A 13s病毒感染SAECs。細(xì)胞同時(shí)共感染對(duì)照病毒(Ad-GFP, +泳道)或異位表達(dá)E4-0RF3的病毒(Ad_0RF3，+泳道)。在36h.p.1.收集蛋白提取物，歸一化并分析p53、MDM2、p21、GFP和E4-0RF3的表達(dá)。分析肌動(dòng)蛋白的表達(dá)作為上樣對(duì)照。c.用模擬物、wt、A 0RF3、A 55k或A 55k/A 0RF3病毒感染SAECs。在0、24、36和48h.p.1.收集蛋白裂解物，歸一化并通過Western印跡分析p53、MDM2、p21、ElB_55k和E4-0RF3的表達(dá)。分析肌動(dòng)蛋白的表達(dá)作為上樣對(duì)照。d.用模擬物、wt、A 55k、A 0RF3或A 55k/A 0RF3病毒感染SAECs。在36h.p.1.收集RNA。利用實(shí)時(shí)PCR定量p53轉(zhuǎn)錄靶的mRNA水平，作圖表示為相對(duì)于(wrt)模擬物感染細(xì)胞的倍數(shù)改變；豎線代表標(biāo)準(zhǔn)差。e.缺少內(nèi)源p53但帶有坡那留酮(ponasterone) A誘導(dǎo)性p53cDNA的H1299-D1細(xì)胞用模擬物、wt、A 55k或A 55k/A 0RF3病毒感染,并在非誘導(dǎo)性(-ponA)或誘導(dǎo)性(+ponA)條件下分析。細(xì)胞還用多柔比星(dox)進(jìn)行了處理。在48h.p.1.收集蛋白提取物并分析p53、MDM2和p21的病毒。分析肌動(dòng)蛋白的病毒作為上樣對(duì)照。圖4.E4-0RF3誘導(dǎo)新的SUV39`H1和SUV39H2H3K9me3異染色質(zhì)形成，并特異性阻止P53結(jié)合和接近內(nèi)源啟動(dòng)子中的DNA靶位點(diǎn)。a.用p53_熒光素酶報(bào)告物(p53_luc)、p53結(jié)合位點(diǎn)已突變的P53-熒光素酶報(bào)告物(p53突變體)、或者對(duì)照pGL3-熒光素酶(pGL3_luc)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(一式三份)U20S細(xì)胞(補(bǔ)充圖10)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞用wt、A 55k或者A55k/A0RF3病毒感染，并在4h.p.1.加入D-熒光素。每小時(shí)讀取發(fā)光讀數(shù)，共48小時(shí)。將一式三份的平均發(fā)光對(duì)時(shí)間(h.p.1.).作圖。b和c.用模擬物、A 55k或A 55k/ A 0RF3病毒感染U20S細(xì)胞。在36h.p.1.收集RNA、蛋白裂解物和染色質(zhì)。多柔比星處理12小時(shí)作為p53活化的陽性對(duì)照。b.通過實(shí)時(shí)PCR確定p21和MDM2mRNA水平，作圖表示為相對(duì)于(wrt)模擬物感染的倍數(shù)改變(上圖)；豎線代表標(biāo)準(zhǔn)差。將蛋白裂解物歸一化并分析P53表達(dá)；分析肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照(下方小圖)。c.利用p53單克隆抗體進(jìn)行p53染色質(zhì)免疫沉淀(ChIPs)。相配的IgG同種型被作為針對(duì)特異性的對(duì)照。通過半定量PCR分析ChIP樣品中p21(5，p53結(jié)合位點(diǎn)位于-2.4kb，3，位點(diǎn)位于_1.3kb)和MDM2啟動(dòng)子中的p53DNA靶序列。p21啟動(dòng)子中的_5kb區(qū)域不含p53結(jié)合序列，被用作陰性對(duì)照。左側(cè)顯示了輸入DNA。d.用模擬物、A 55k或八551^/八01^3病毒感染似05細(xì)胞，并在3611. .1.固定。通過免疫熒光檢測(cè)p53(綠色)和組蛋白H3的賴氨酸9的三甲基(H3K9me3，紅色)，用Hoechst (白色)將DNA復(fù)染。e.用八551^病毒感染似03細(xì)胞，在3611. .1.固定。通過免疫熒光檢測(cè)SUV39H1、SUV39H2、SETDBl和G9a的H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶(綠色)以及H3K9me3 (紅色)。用Hoechst (白色)復(fù)染 DNA。圖5.E4-0RF3形成核骨架，其直接限定異染色質(zhì)組裝，并在p53靶啟動(dòng)子處重新(de novo)誘導(dǎo)H3K9甲基，阻止p53DNA結(jié)合。a.用模擬物、A 55k或A 55k/A 0RF3病毒感染U20S細(xì)胞。在36h.p.1.收集蛋白裂解物和染色質(zhì)。將蛋白裂解物歸一化，并分析p53、肌動(dòng)蛋白、組蛋白H3(H3)的水平和組蛋白H3在賴氨酸9的甲基(H3K9me3)。利用H3K9me3和P53的抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀。小鼠和兔IgGs作為針對(duì)特異性的對(duì)照。通過實(shí)時(shí)定量PCR分析ChIP樣品，并相對(duì)于輸入DNA進(jìn)行歸一化。將p21和MDM2啟動(dòng)子中p53靶序列上結(jié)合的p53和H3K9me3作圖，表示為相對(duì)于(wrt)模擬物的倍數(shù)改變。將IgG對(duì)照作圖，以便衡量背景并作為P53和H3K9me3ChIPs中靶DNA序列富集度的對(duì)照。b和c.共聚焦圖像顯示的是感染了八551^病毒并在3611. .1.固定的U20S和小氣道上皮細(xì)胞(SAECs)。左側(cè)小圖顯示了細(xì)胞用H3K9me3 (綠色)、E4_0RF3 (紅色)和Hoechst (DNA為白色)復(fù)染的單個(gè)共聚焦切片。右側(cè)小圖顯示Z堆(z-stack)的中央切片，其中的橫線和豎線代表貫穿整個(gè)堆(stack)的正交切割，然后在圖的底部和右手側(cè)顯示為平面投影。d.感染了 A55k的SAECs細(xì)胞，在36h.p.1.時(shí)，貫穿細(xì)胞核的0.3 ii m單個(gè)共聚焦切片的高分辨率和放大的圖(放大系數(shù)=3，像素尺寸=40nm) (H3K9me3的免疫熒光為綠色，E4-0RF3為紅色)。合并圖顯示對(duì)E4-0RF3核網(wǎng)和相關(guān)的異染色質(zhì)區(qū)的放大(套印的小圖)。

圖6.E4-0RF3在全面轉(zhuǎn)錄改變(驅(qū)動(dòng)致癌性細(xì)胞性和病毒性復(fù)制)的背景下選擇性地沉默P53靶。a.用AfTymetrix表達(dá)陣列分析被模擬物、A 55k或A 55k/A 0RF3病毒感染的SAECs在36h.p.1.時(shí)的全面基因表達(dá)改變。還對(duì)nutlin處理的SAECs進(jìn)行了表達(dá)分析作為P53活化的陽性對(duì)照。每個(gè)條件下各個(gè)重復(fù)進(jìn)行兩次獨(dú)立試驗(yàn)。文式圖(Venndiagram)顯示:在感染了 A 55k/A 0RF3的SAEC相對(duì)于感染了模擬物的SAEC(2711個(gè)基因)中，以及在感染了八551^的5八￡(:相對(duì)于感染了模擬物的54￡(:(2178個(gè)基因)中，顯著差異化表達(dá)的基因(log倍數(shù)改變(FC) >2或〈-2，假發(fā)現(xiàn)率(FDR)為0.05)有重疊(1730個(gè)基因)。被模擬物、A 55k和A 55k/ A 0RF3感染的SAEC中1730個(gè)重疊基因的每一個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度值的熱點(diǎn)圖顯示在右側(cè)。b.在A55k/A0RF3相對(duì)A 55k感染的SAECs中有265個(gè)被差別上調(diào)(log FC>2，F(xiàn)DR為0.05)的顯著轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在這265個(gè)差別上調(diào)基因中，72個(gè)基因預(yù)期在它們的啟動(dòng)子中含有P53轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS) ;55個(gè)基因在應(yīng)答nutlin時(shí)被上調(diào)log FOl.5，但無預(yù)期的p53TFBS;62個(gè)基因既含有預(yù)期的p53TFBS，又在應(yīng)答nutlin時(shí)被上調(diào)。還有76個(gè)其他被顯著上調(diào)的基因(灰色)不屬于以上任何類別。c.在A55k/A0RF3感染和nutlin處理中差別上調(diào)最明顯的轉(zhuǎn)錄物中的46個(gè)的無監(jiān)督系統(tǒng)聚類。d.在應(yīng)答癌變和基因毒性脅迫時(shí)P53水平和磷酸化的誘導(dǎo)被認(rèn)為決定了 p53的轉(zhuǎn)錄活化。ElB-55k結(jié)合并降解P53，這對(duì)于p53在腺病毒復(fù)制中的滅活非常關(guān)鍵。但是，我們揭示還有另外一個(gè)腺病毒蛋白E4-0RF3，它通過新的顯性表觀遺傳機(jī)制滅活p53，這與p53穩(wěn)定化和磷酸化無關(guān)。E4-0RF3形成新的核骨架，其引導(dǎo)p53靶啟動(dòng)子處的SUV39Hl/2H3K9me3抑制性異染色質(zhì)組裝。在不能接近其靶啟動(dòng)子的情況下，P53無法阻止病毒復(fù)制。補(bǔ)充圖1 (文中又稱為圖7)。在感染了 AElB_55k的人原代乳房上皮細(xì)胞或支氣管上皮細(xì)胞中，P53降解的丟失能夠誘導(dǎo)但不能活化p53。圖7a:用模擬物、野生型(wt)或A ElB-55k ( A 55k)病毒感染原代人乳房上皮細(xì)胞(HMEC)，并在感染后(h.p.1.) 24和36小時(shí)收集。通過Western印跡分析蛋白裂解物中p53、p21和MDM2的表達(dá)。分析肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照。圖7b:用模擬物、wt或A 55k病毒感染原代人支氣管上皮細(xì)胞(HBEC)，在24h.p.1.收集。通過Western印跡分析蛋白裂解物中p53和p21的表達(dá)。補(bǔ)充圖2(文中又稱為圖8)。在被感染的腫瘤細(xì)胞中，ElB_55k的丟失誘導(dǎo)了P53水平，但對(duì)轉(zhuǎn)錄靶沒有誘導(dǎo)。用模擬物、wt或△ 55k病毒感染p53野生型腫瘤細(xì)胞系(HCT-116p53+/+，A549)和 p53 突變體腫瘤細(xì)胞系(HCT_116p53-/-，MDA-MB-231 和 C33A)。多柔比星(dox)處理作為p53活化的陽性對(duì)照。在24和36h.p.1.收集蛋白裂解物并分析p53、p21和MDM2的表達(dá)。分析肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照。補(bǔ)充圖3 (文中又稱為圖9)。在AElB_55k感染細(xì)胞中，UV輻射未能激活p53的轉(zhuǎn)錄靶。用模擬物或者A 55k病毒感染小氣道上皮細(xì)胞，然后在24h.p.1.不處理或者用UV (13J)照射。在32h.p.1.分離總RNA。利用實(shí)時(shí)PCR定量p53的轉(zhuǎn)錄靶GADD45A、MDM2、p21和14-3-3.0的mRNA水平。將相對(duì)于(wt)未感染細(xì)胞的mRNA水平倍數(shù)改變作圖，豎線代表二個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。補(bǔ)充圖4(文中又稱為圖10)。腺病毒早期病毒基因的基因組圖譜，以及它們的已知細(xì)胞目標(biāo)和功能。補(bǔ)充圖5 (文中又稱為圖11)。Ad-GFP中的E4-0RF3表達(dá)能夠被A 55k/A 0RF3感染中的E1A-13S反式激活，但不能被八551^/八138感染中的￡認(rèn)-138反式激活(圖3b示意了病毒基因組相互作用和互補(bǔ)試驗(yàn))。Ad-GFP是復(fù)制缺陷型病毒，其中的CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)了代替所刪El區(qū)的GFP的表達(dá)(來自Invitrogen的Ad-CMV)。Ad-CMV基因組骨架包括E4轉(zhuǎn)錄單位。E4基因(以及其他病毒ORFs)正常情況下在Ad-CMV感染中不表達(dá)，因?yàn)樗鼈兊霓D(zhuǎn)錄活化需要E1A-13S。但是，當(dāng)用A 55k/ A 0RF3共感染Ad-GFP時(shí)(如圖3b所示)，A 55k/ A 0RF3感染中的ElA_13s表達(dá)能夠反式地部分地活化Ad-GFP E4基因的轉(zhuǎn)錄，包括E4-0RF3 (左側(cè)小圖)。相反，與A 55k/ A 13s共感染Ad-GFP在任一病毒中都未導(dǎo)致E4-0RF3表達(dá)的活化(右側(cè)小圖)。補(bǔ)充圖6(文中又稱為圖12)。AE1B-55K感染細(xì)胞中的非p53轉(zhuǎn)錄靶基因的mRNA水平都相似，與E4-0RF3的表達(dá)無關(guān)。用模擬物、A 55k或A 55k/ A 0RF3病毒感染SAECs。在36h.p.1.收集RNA。利用實(shí)時(shí)PCR來定量管家基因⑶SB，以及被病毒感染誘導(dǎo)的p53的mRNA水平。將mRNA水平相對(duì)于模擬物感染的倍數(shù)改變作圖；豎線代表三個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。補(bǔ)充圖7 (文中又稱為圖13)。帶有坡那甾酮誘導(dǎo)型p53cDNA的H1299(p53無效突變)穩(wěn)定細(xì)胞系(H1299-D1)。H1299-D1細(xì)胞是H1299(p53無效突變)穩(wěn)定細(xì)胞系，其中的p53cDNA表達(dá)受到坡那甾酮誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的調(diào)控。以0、1、2.5和511|1加入坡那甾酮4。16小時(shí)后收集蛋白裂解物，通過Western印跡分析p53和p21的表達(dá)。補(bǔ)充圖8(文中又稱為圖14)。E4-0RF3不與p53共定位。用模擬物、A 55k或八551^/八01^3病毒感染似03細(xì)胞并在2811. .1.固定。通過免疫熒光檢測(cè)p53和E4-0RF3，用 Hoechst 復(fù)染 DNA。補(bǔ)充圖9 (文 中又稱為圖15)。在有E4-0RF3的情況下，p53有野生型和活性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白構(gòu)象。用模擬物、《1八01^3、八551^或八551^/八01^3感染54￡08。多柔比星(dox)處理作為p53活化的陽性對(duì)照。用p53構(gòu)象特異性抗體PAbl620和PAb240從裂解物中免疫沉淀P53。裂解物和免疫沉淀物經(jīng)Western印跡檢測(cè)p53。補(bǔ)充圖10 (文中又稱為圖16)。與p53_luc (圖4a)相反，對(duì)照pGL3_熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒在野生型、A 55k和A 55k/A 0RF3感染中被活化到相似的水平。用p53_熒光素酶報(bào)告基因(p53-luc)、p53結(jié)合位點(diǎn)被突變的p53-熒光素酶報(bào)告基因(p53_突變體)或者對(duì)照PGL3-熒光素酶(pGL3-luc)質(zhì)粒(一式三份地)轉(zhuǎn)染U20S細(xì)胞。轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞用 七、八551^或八551^/八01^3病毒感染。感染后4小時(shí)的適合，添加D-熒光素。每小時(shí)讀取發(fā)光讀數(shù)，共48小時(shí)。將三個(gè)重復(fù)的平均發(fā)光對(duì)感染后小時(shí)數(shù)(h.p.1.)所代表的時(shí)間作圖。對(duì)照PGL3-熒光素酶轉(zhuǎn)染的發(fā)光讀數(shù)如上顯示(相同試驗(yàn)中p53-luc數(shù)據(jù)如圖4a所示)。補(bǔ)充圖11(文中又稱為圖17)。E4-0RF3能夠阻止p53結(jié)合細(xì)胞染色質(zhì)中的靶啟動(dòng)子。利用P53單克隆抗體，在36h.p.1.對(duì)用模擬物、A 55k或A 55k/A 0RF3病毒感染的U20S細(xì)胞進(jìn)行了 p53染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)。多柔比星作為陽性對(duì)照。使用相配的IgG同種型作為針對(duì)特異性的對(duì)照。通過實(shí)時(shí)定量PCR分析ChIP樣品的p21 (5’和3’p53結(jié)合位點(diǎn))和MDM2啟動(dòng)子序列，并相對(duì)于輸入DNA進(jìn)行歸一化。將p53的回收率％和IgGChIPs作圖到I軸。IgG對(duì)照中的回收率作為背景的衡量尺度。p21啟動(dòng)子的_5kb區(qū)域不含有p53結(jié)合序列，被作為陰性對(duì)照。補(bǔ)充圖12(文中又稱為圖18)。八551^感染中，在細(xì)胞核周圍誘導(dǎo)出1131(911163異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域，而在A55k/A0RF3中未誘導(dǎo)。(圖4d中的感染對(duì)照)U20S細(xì)胞用模擬物、A 55k或A 55k/ A 0RF3病毒感染，并在感染后36小時(shí)固定。通過免疫熒光檢測(cè)H3K9三甲基(H3K9me3)、E1A( A 55k和A 55k/ A 0RF3感染中均表達(dá)的腺病毒早期蛋白)和E4-0RF3 (白色)。用Hoechst將DNA復(fù)染。圖像用Zeiss Axioplan2顯微鏡獲取。補(bǔ)充圖13(文中又稱為圖1 9)。甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H2與凝聚的細(xì)胞DNA或H3K9三甲基在A 55k感染細(xì)胞中特異地共定位。(圖4e的對(duì)照)U20S細(xì)胞用模擬物、A 55k或 A55k/A0RF3 病毒感染并在 36h.p.1.固定。圖 19a.用抗 SUV39H2 (Abeam)和 H3K9三甲基(H3K9me3)的抗體進(jìn)行免疫熒光。用Hoechst (白色)將DNA染色。圖19b.用抗SUV39H2 (sc, Santa Cruz Biotechnology)的獨(dú)立二抗進(jìn)行免疫突光，與H3K9me3共染色以證明SUV39H2的重新定位。圖19c.SUV39H2和H3K9me3免疫熒光的IgG同種型和二抗對(duì)照。圖像用Leica共聚焦SP2顯微鏡獲取。補(bǔ)充圖14 (文中又稱為圖20)。甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39HI與凝聚的細(xì)胞DNA和H3K9三甲基在A 55k感染細(xì)胞中特異地共定位。(圖46的對(duì)照)似05細(xì)胞用模擬物、八551^或八551^/A0RF3病毒感染并在36h.p.1.固定。圖20a.用抗SUV39H1和H3K9三甲基(H3K9me3)的抗體進(jìn)行免疫熒光。用Hoechst (白色)將DNA染色。圖20b.1gG同種型和二抗對(duì)照。圖20c.為了用內(nèi)源SUV39H1抗體證實(shí)結(jié)果，U20S細(xì)胞用帶有myc標(biāo)簽的SUV39H1表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，用八551^病毒感染并在3611. .1.固定。通過免疫熒光檢測(cè)帶有Myc標(biāo)簽的SUV39H1和H3K9me3，用Hoechst (白色)復(fù)染DNA。圖像用Leica共聚焦SP2顯微鏡獲取。補(bǔ)充圖15(文中又稱為圖21)。甲基轉(zhuǎn)移酶G9a不與凝聚的細(xì)胞DNA或H3K9三甲基在A 55k感染細(xì)胞中特異地共定位。(圖46的對(duì)照)似05細(xì)胞用模擬物、八551^或八551^/A0RF3病毒感染并在36h.p.1.固定。用抗G9a和H3K9三甲基(H3K9me3)的抗體進(jìn)行免疫熒光。用Hoechst (白色)將DNA染色。圖像用Axioplan顯微鏡獲取。
補(bǔ)充圖16(文中又稱為圖22)。甲基轉(zhuǎn)移酶SETDBl不與凝聚的細(xì)胞DNA或H3K9三甲基在A 55k感染細(xì)胞中特異地共定位。(圖4e的對(duì)照)U20S細(xì)胞用模擬物、A 55k或八551^/八01^3病毒感染并在36114.1.固定。用抗SETDBl和H3K9三甲基(H3K9me3)的抗體進(jìn)行免疫熒光。用Hoechst (白色)將DNA染色。圖像用Nikon Al共聚焦顯微鏡獲取。補(bǔ)充圖17(文中又稱為圖23)。E4-0RF3在p53靶啟動(dòng)子處誘導(dǎo)H3K9三甲基化，阻止P53DNA結(jié)合(造成圖5a作圖顯示的回收率％)。U20S細(xì)胞用模擬物、A 55k或A 55k/A0RF3病毒感染，并在36h.p.1.收集。利用p53(圖23a)或H3K9三甲基(H3K9me3)(圖23b)抗體，進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀(ChIPs)。使用無免疫性的兔IgG做為陰性對(duì)照。對(duì)p21 (5’和3’ p53結(jié)合位點(diǎn))、MDM2、GADD45A和肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。將全部結(jié)果相對(duì)于輸入DNA進(jìn)行歸一化。p21啟動(dòng)子的_5kb區(qū)域是p53結(jié)合的陰性對(duì)照。補(bǔ)充圖18 (文中又稱為圖24)。E4-0RF3通過阻止p53DNA結(jié)合到多重p53靶啟動(dòng)子中的啟動(dòng)子上來滅活P53。感染了模擬物、八551^或八551^/八01^3病毒的似05細(xì)胞在36h.p.1.收集。為了擴(kuò)展圖5a中的p53靶啟動(dòng)子成員，利用p53抗體或者無免疫性小鼠IgG對(duì)照進(jìn)行p53染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)。ChIP樣品經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR分析。對(duì)p215’和3’ p53結(jié)合位點(diǎn)的分析證實(shí)ChIP結(jié)果如補(bǔ)充圖17所示，此外還分析了 FAS、PUMA、GADD45A和PIG3啟動(dòng)子，將它們的結(jié)果相對(duì)于輸入DNA進(jìn)行了歸一化。p53ChIP的回收％在y軸作圖。IgG對(duì)照的回收用于衡量背景。補(bǔ)充圖19 (文中又稱為圖25)。A55k感染中，E4-0RF3誘導(dǎo)了 p53靶啟動(dòng)子處H3K9三甲基。感染了模擬物、八551^或八551^/八01^3病毒的似05細(xì)胞在3611. .1.收集。為了擴(kuò)展圖5a中的p53靶啟動(dòng)子和對(duì)照的成員，利用H3K9三甲基(H3K9me3)抗體或者無免疫性小鼠IgG對(duì)照進(jìn)行H3K9me3染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)。ChIP樣品經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR分析。對(duì)P215’和3’ p53結(jié)合位點(diǎn)的分析 證實(shí)了補(bǔ)充圖17中的ChIP結(jié)果，此外還分析了 p53的靶FAS、PUMA和PIG3啟動(dòng)子。P0LR2 (不是p53靶位點(diǎn))被用作陰性對(duì)照。將它們的結(jié)果相對(duì)于輸入DNA進(jìn)行了歸一化。H3K9me3ChIP的回收％在y軸作圖。補(bǔ)充圖20(文中又稱為圖26)。E4-0RF3與U20S細(xì)胞核中H3K9三甲基異染色質(zhì)的形成直接相關(guān)。(圖5b的對(duì)照)U20S細(xì)胞用模擬物、△551^或八551^/^01^3病毒感染并在36h.p.1.固定。用抗E4-0RF3和H3K9三甲基(H3K9me3)抗體進(jìn)行免疫熒光。DNA用Hoechst染色(白色)。用Nikon Al共聚焦顯微鏡獲取圖像。補(bǔ)充圖21 (文中又稱為圖27)。E4-0RF3與SAECs細(xì)胞核中H3K9三甲基異染色質(zhì)的形成直接相關(guān)。(圖5c中獲取的高分辨率圖像的對(duì)照)小氣道上皮細(xì)胞(SAECs)用模擬物、八551^或八551^/八01^3病毒感染并在3611. .1.固定。用抗E4-0RF3和H3K9三甲基(H3K9me3)抗體進(jìn)行免疫熒光。DNA用Hoechst染色(白色)。用Leica共聚焦SP2顯微鏡獲取圖像。補(bǔ)充圖22(文中又稱為圖28)。來自在SAECs中進(jìn)行的兩個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的裂解物，從中收集RNA進(jìn)行全基因組表達(dá)分析。按照說明進(jìn)行不同批次細(xì)胞的兩個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)(I和II)。用模擬物、野生型(wt)、AElB-55k(A55k)或 A ElB-55k/ A E4-0RF3 ( A 55k/ A 0RF3)病毒感染小氣道上皮細(xì)胞，并在感染后36小時(shí)收集以獲得裂解物。Nutlin處理12小時(shí)作為P53活化的陽性對(duì)照。對(duì)模擬物、A 55k、A 55k/A 0RF3和nutlin樣品(每個(gè)試驗(yàn)一式兩份)收集RNA并純化，然后標(biāo)記并與Affymetrix外顯子陣列雜交以進(jìn)行全基因組表達(dá)分析。補(bǔ)充圖23 (文中又稱為圖29)。Affymetrix陣列的探針強(qiáng)度分布。與模擬物、A ElB-55k ( A 55k)、A ElB_55k/ A E4-0RF3 ( A 55k/ A 0RF3)和 nutlin 處理的 SAEC 樣品(每個(gè)條件有4個(gè)獨(dú)立的重復(fù))雜交后的Affymetrix外顯子陣列芯片的探針強(qiáng)度分布。補(bǔ)充圖24 (文中又稱為圖30)。A 55k和A 55k/A 0RF3Affymetrix陣列樣品的各個(gè)基因強(qiáng)度(表達(dá))值的箱線圖和須圖。將A 55k和A 55k/A 0RF3各自的基因轉(zhuǎn)錄物的log強(qiáng)度值在y-軸作圖。每個(gè)點(diǎn)代表獨(dú)立的重復(fù)。星號(hào)代表p53轉(zhuǎn)錄靶。補(bǔ)充圖25(文中又稱為圖31)。在原代SAECs中的AElB-55k/AE4_0RF3病毒復(fù)制相對(duì)于AElB-55k而言被抑制。用模擬物、AElB-55k/AE4-0RF3(A55k/A0RF3)、A ElB-55k ( A 55k)或wt病毒以感染復(fù)數(shù)10感染SAECs,并在感染后(h.p.1.) 48和72小時(shí)收集。按照方法章節(jié)中的描述，通過在293/E4細(xì)胞中進(jìn)行病毒復(fù)制分析來確定以噬菌斑形成單位(P.f.u.)表示的總病毒產(chǎn)量；豎線代表三份的標(biāo)準(zhǔn)差。圖32.E4-0RF3的高階寡聚化對(duì)于它在滅活p53、MRN和促進(jìn)病毒復(fù)制方面的功能非常重要。(A和D)原代SAEC用模擬物、野生型Ad5 (WT)、E4-0RF3、E1B-55K、E1B-55K/E4-0RF3或者E1B-55K/E4-0RF3N82A腺病毒感染。在36h.p.1.收集蛋白裂解物，歸一化并對(duì)p53、MDM2和p21進(jìn)行免疫印跡。分析P -肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照。(B)用指示的病毒感染SAECs，在36h.p.1.固定，并對(duì)E4-0RF3、NBS1和DNA免疫染色。(C)與(B) —樣，除了免疫染色的是E2A病毒復(fù)制結(jié)構(gòu)域。(D)與(A) —樣，除了裂解物是針對(duì)Ad5衣殼蛋白進(jìn)行了免疫印跡。發(fā)明詳述定義 “核酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和它們的聚合物，以及它們的互補(bǔ)鏈。該術(shù)語涵蓋這樣的核酸，所述核酸含有已知的核苷酸類似物或者骨架帶有修飾的殘基或連接；所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的；所述核酸與參照核酸有類似的結(jié)合性能并且與參照核苷酸的代謝方式類似。這種類似物的例子包括，但不限于硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNAs)。術(shù)語“Ad5”和“腺病毒基因組”用于本文是指SEQ ID NO:3中給出的核酸序列。除非另有說明，特定核酸序列還暗含其保守性修飾的變體(例如簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。具體來說，可以通過產(chǎn)生這樣的序列來實(shí)現(xiàn)簡并密碼子取代，所述序列中的一或多個(gè)選中(或全部)密碼子的第三個(gè)位點(diǎn)被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081(1991) ; Ohtsuka et al., J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes8:91-98 (1994))。術(shù)語核酸與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可以互換使用。特定核酸序列還暗含“剪接變體”。類似地，由核酸編碼的特定蛋白暗含由該核酸的剪接變體編碼的所有蛋白。“剪接變體”正如這個(gè)術(shù)語暗示的是基因替代剪接的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，開始的核酸轉(zhuǎn)錄物可以發(fā)生剪接，使得不同(替代)核酸剪接產(chǎn)物編碼不同的多肽。剪接變體的產(chǎn)生機(jī)制可以各不相同，但都包括外顯子的替代剪接。由同一核酸經(jīng)過通讀轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的替代的多肽也涵蓋在這個(gè)定義中。剪接反應(yīng)的任何產(chǎn)物，包括重組形式的剪接產(chǎn)物都包括在這個(gè)定義中。Leicher, et al.，J.Biol.Chem.273 (52): 35095-35101 (1998)中討論了一例鉀離子通道剪接變體。構(gòu)建含有所需治療基因編碼和調(diào)控序列的合適載體可以采用常規(guī)的連接和限制性酶切技術(shù)，這些技術(shù)在本領(lǐng)域已有很好的了解(參見Maniatis et al., in MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1982))?？梢詫⒎蛛x的質(zhì)粒、DNA序列或者合成寡核苷酸切割、修飾并按照需要的形式重新連接。核酸在與另一個(gè)核酸序列形成功能性關(guān)系時(shí)是“可操縱地連接”。例如，編碼前體序列或者分泌前導(dǎo)序列的DNA如果能夠表達(dá)為參與多肽分泌的前體蛋白，則所述DNA是可操縱地連接編碼多肽的DNA;啟動(dòng)子或增強(qiáng)子如果能夠影響序列的轉(zhuǎn)錄，則所述啟動(dòng)子或增強(qiáng)子是可操縱地連接編碼序列；或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)如果定位方式能夠協(xié)助翻譯的進(jìn)行，則所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)是可操縱地連接編碼序列。通常，“可操縱地連接”意味著被連接在一起的DNA序列距離很近，而且對(duì)于分泌前導(dǎo)序列的情況，是連續(xù)的和符合讀框的。但增強(qiáng)子不需要是連續(xù)的。連接是通過在方便的限制酶切位點(diǎn)進(jìn)行相連完成的。如果不存在這樣的位點(diǎn)，可以按照常規(guī)做法使用合成寡核苷酸適配子或接頭。在提及兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多肽序列的語境中，術(shù)語“相同的”或“同一性”百分比是指利用BLAST或BLAST2.0序列比較算法，使用以下描述的缺省參數(shù)，或者通過人工比對(duì)和目測(cè)進(jìn)行測(cè)量(參見例如NCBI網(wǎng)站等)，所述兩個(gè)或更多個(gè)序列或子序列是相同的，或者含有特定百分比的氨基酸殘基或核苷酸是相同的(即在比較窗口或者指定區(qū)域內(nèi)按照最大對(duì)應(yīng)性進(jìn)行比較和對(duì)位排列時(shí)，特定區(qū)域內(nèi)有大約60%的同一性，優(yōu)選65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的同一性)。這樣的序列即可被認(rèn)為是“基本相同的”。這個(gè)定義還可以指示或者可以應(yīng)用于測(cè)試序列的互補(bǔ)序列。定義還包括含有缺失和/或添加的序列，以及含有取代的序列。正如以下描述的，優(yōu)選的算法可以計(jì)數(shù)空位等。優(yōu)選地，至少大約25個(gè)氨基酸或核苷酸長的區(qū)域內(nèi)存在同一性，或者更優(yōu)選地在50-100個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域內(nèi)。對(duì)于序列比較，一 般將一個(gè)序列作為參照序列，將測(cè)試序列與它相比。使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參照序列輸入計(jì)算機(jī)，指定子序列坐標(biāo)，如果需要還可以指定序列算法的程序參數(shù)。優(yōu)選地，可以使用缺省程序參數(shù)，或者可以指定替代參數(shù)。然后序列比較算法基于程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)參照序列的序列同一性百分比?！氨容^窗口”用于本文包括兩個(gè)序列被最優(yōu)化對(duì)位排列后，選自多個(gè)由20-600，優(yōu)選大約50-大約200，更通常是大約100-大約150個(gè)位點(diǎn)組成的連續(xù)位點(diǎn)之一的區(qū)段，其中所述序列與具有相同數(shù)量連續(xù)位點(diǎn)的參照序列進(jìn)行比較。用于將序列對(duì)位排列進(jìn)行比較的方法是本領(lǐng)域已知的?？梢匀缦聦?shí)施序列比較的最佳對(duì)位排列，例如通過Smith &Waterman, Adv.Appl.Math.2:482 (1981)的局部同源性算法；通過 Needleman & ffunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970)的同源比對(duì)算法；通過 Pearson&Lipman, Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA85:2444(1988)的尋找相似性的方法；通過這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施(WisconsinGenetics Software Package 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA, Genetics ComputerGroup, 575Science Dr.，Madison, WI);或者通過人工比對(duì)和目測(cè)(參見例如CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.1995supplement))。適用于確定序列同一性百分比和序列相似性的算法的優(yōu)選例子是BLAST和BLAST2.0 算法，這兩個(gè)算法分別在Altschul et al.，Nuc.Acids Res.25:3389-3402 (1977)和 Altschul et al.，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中有描述。使用了參數(shù)如文中所述的BLAST和BLAST2.0來確定本發(fā)明的核酸和蛋白的序列百分比同一性。正如本領(lǐng)域已知的，進(jìn)行 BLAST 分析的軟件可以通過 National Center for Biotechnology Information公開獲得。該算法涉及首先通過鑒定查詢序列中長度為W的短字節(jié)來鑒定高評(píng)分序列對(duì)(HSPs)，所述HSPs當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字節(jié)比對(duì)時(shí)，或者匹配或者滿足某些正數(shù)的閾值打分 T。T 代表相鄰字得分閾值(neighborhood word score threshold) (Altschulet al.,同前)。這些初始的匹配相鄰字作為種子，啟動(dòng)搜索含有它們的更長的HSPs。將匹配字沿著每個(gè)序列，在累加比對(duì)得分能夠增加的情況下盡量遠(yuǎn)地向兩個(gè)方向延伸。對(duì)于核苷酸序列，利用參數(shù)M(—對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分；永遠(yuǎn)>0)和N(錯(cuò)配殘基的罰分；永遠(yuǎn)〈O)計(jì)算累加得分。對(duì)于氨基酸序列，利用打分矩陣來計(jì)算累加得分。當(dāng)累加比對(duì)得分從它達(dá)到的最大值下降數(shù)量X時(shí)；由于一或多個(gè)得負(fù)分的殘基比對(duì)的累積，累加得分達(dá)到零或以下時(shí)；或者到達(dá)序列的末端時(shí)，停止匹配字在每個(gè)方向的延伸。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定算法的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的缺省參數(shù)為字長(W)=ll、期望值(E)=10、M=5、N=-4，雙鏈比較。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用的缺省參數(shù)為字長=3、期望值(E)=10、BL0SUM62 打分矩陣(參見 Henikoff & Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915 (1989))比對(duì)(B) =50、預(yù)期值(E) =10、M=5、N=_4，雙鏈比較。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在文中可以互換使用來指代氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語適用這樣的氨基酸聚合物，所述氨基酸聚合物中的一或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在氨基酸的人工化學(xué)模擬物；也適用天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及能夠按照和天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸，以及后來發(fā)生修飾的氨基酸，例如羥脯氨酸、Y -羧基谷氨酸鹽和0-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指與天然存在的氨基酸有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即結(jié)合在氫原子上的a碳、羧基、氨基和R基團(tuán)，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這些類似 物帶有被修飾的R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或者被修飾的肽骨架，但保持了和天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指其結(jié)構(gòu)與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的化合物，但與天然存在的氨基酸發(fā)揮功能的方式類似。氨基酸在文中可以用它們的眾所周知的三字母符號(hào)或者IUPAC-1UB BiochemicalNomenclature Commission推薦的單字母符號(hào)來表示。類似地,可以用它們的公認(rèn)單字母代碼來指示核苷酸?！氨Ｊ匦孕揎椀淖凅w”適用于氨基酸和核酸序列兩者。就特定核酸序列而言，保守性修飾的變體是指那些編碼相同或基本相同氨基酸序列的核酸，或者對(duì)于不編碼氨基酸序列的核酸，是指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性，有大量功能上相同的核酸可以編碼任何給定蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在密碼子限定是丙氨酸的每個(gè)位點(diǎn)，可以將密碼子改變?yōu)樯鲜鱿鄳?yīng)密碼子中的任何一個(gè)而不會(huì)改變被編碼的多肽。這樣的核酸變異是“沉默變異”，是保守性修飾變體的一種。本文中每個(gè)編碼多肽的核酸序列還描述了所述核酸的每個(gè)可以的沉默變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到核酸中的每個(gè)密碼子(除了 AUG，它通常是唯一的甲硫氨酸的密碼子jPTGG，通常是唯一的色氨酸的密碼子)都可以被修飾而產(chǎn)生功能相同的分子。相應(yīng)地，就表達(dá)產(chǎn)物而言，每個(gè)被描述序列中暗含了多肽編碼核酸的每個(gè)沉默變體，但對(duì)實(shí)際的探針序列來說，沒有這種含義。對(duì)于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到那些改變、增加或者刪除編碼序列中的單個(gè)氨基酸或較小百分比氨基酸的對(duì)核酸、肽、多肽或蛋白序列進(jìn)行的個(gè)別取代、缺失或添加是“保守性修飾變體”，其中所述改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸所取代。給出功能相似氨基酸的保守性取代表格是本領(lǐng)域已知的。這樣的保守性修飾變體是本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間同源物和等位基因額外的，而不是排除它們。以下8個(gè)組各自含有相互是保守性取代的氨基酸:1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ;3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K); 5)異亮氨酸( I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V) ;6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y), Tryptophan (W) ; 7)絲氨酸(S),蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins (1984))。提到例如細(xì)胞、病毒、核酸、蛋白或載體時(shí)使用的術(shù)語“重組”表明這些細(xì)胞、病毒、核酸、蛋白或載體被引入了異源核酸或蛋白或者天然核酸或蛋白被改變而被修飾，或者細(xì)胞來源于被這樣修飾的細(xì)胞。因此，重組細(xì)胞例如表達(dá)天然(非重組的)細(xì)胞中沒有的基因；或者表達(dá)的是天然基因，但是表達(dá)異常、表達(dá)下降或者根本沒有表達(dá)。術(shù)語“嚴(yán)緊雜交條件”是指這樣的條件，在所述條件下探針與通常存在于復(fù)雜的核酸混合物中它的靶子序列雜交，但不和其他序列雜交。嚴(yán)緊條件是序列依賴性的，并且隨著環(huán)境的不同而不同。較長的序列在較高溫度下特異雜交。Tijssen, Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with NucleicProbes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid aSSayS”(1993)中可以找到關(guān)于核酸雜交的全面指南。通常對(duì)于限定的離子強(qiáng)度pH，選擇的嚴(yán)緊條件比具體序列的融解溫度CU低大約5-10° C。Tm是(一定離子強(qiáng)度、pH和核苷濃度下)與靶序列互補(bǔ)的探針有50%與靶序列平衡雜交的溫度(靶序列過量的情況下，在Tm，平衡時(shí)有50%的探針被占據(jù))。還可以通過加入去穩(wěn)定劑，比如甲酰胺來達(dá)到嚴(yán)緊條件。對(duì)于選擇性或特異性雜交，陽性信號(hào)是背景的至少兩倍，優(yōu)選是背景雜交的10倍。示范性的嚴(yán)緊雜交條件可以如下:50%甲酰胺、5x SSC和1%SDS，42° C溫育，或者5x SSC、1%SDS、于65。C溫育，并于65。C在0.2x SSC和0.1%SDS中洗滌。嚴(yán)緊條件下相互不雜交的核酸如果編碼的多肽基本相同，所述核酸仍然是基本相同的。例如核酸拷貝是利用遺傳密碼所能允許的最大密碼子簡并性形成的，會(huì)發(fā)生這種情況。在這種情況中，核酸一般在中等嚴(yán)緊的雜交條件下發(fā)生雜交。示范性的“中等嚴(yán)緊雜交條件”包括在37° C下在40%甲酰胺、IM NaCl、1%SDS的緩沖液中雜交和在45° C在IXSSC中洗滌。陽性雜交至少是背景的兩倍。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解可以使用替代的雜交和洗滌條件來提供嚴(yán)緊度相似的條件。確定雜交參數(shù)的其他指導(dǎo)方針在許多參考文獻(xiàn)和例如 Current Protocols in Molecular Biology, ed.Ausubel, et al., John Wiley & Sons中有提供。對(duì)于PCRJ^ 36° C的溫度對(duì)于低嚴(yán)緊擴(kuò)增是典型的，雖然根據(jù)引物長度，退火溫度可以在約32° C和48° C之間。對(duì)于高嚴(yán)緊PCR擴(kuò)增，約62° C的溫度是典型的，雖然根據(jù)引物長度和特異性，高嚴(yán)緊退火溫度可以處于約50° C到約65° C的范圍。對(duì)高和低嚴(yán)緊擴(kuò)增的典型循環(huán)條件包括90° C-95° C30秒-2分鐘的變性階段，持續(xù)30秒-2分鐘的退火階段，和大約72° Cl-2分鐘的延伸階段。Innis et al.(1990)PCR Protocols, AGuide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.N.Y.)中提供了低和高嚴(yán)緊擴(kuò)增反應(yīng)的試驗(yàn)方案和指南。用于本文，術(shù)語“癌癥”是指在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的所有類型的癌癥、腫瘤(neoplasm)或惡性腫瘤,包括白血病、癌(carcinomas)和肉瘤(sarcomas)。示范性的癌癥包括腦、乳房、宮頸、結(jié)腸、頭頸、肝、腎、肺、非小細(xì)胞肺、黑素瘤、間皮瘤、卵巢、肉瘤、胃、子宮和髓母細(xì)胞瘤的癌癥。額外的例子包括何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、原發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性巨球蛋白血癥、原發(fā)性腦瘤、癌癥、惡性胰島素瘤、惡性類癌、膀胱癌、惡性前皮膚病損、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、惡性高鈣血癥、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌、胰腺內(nèi)分泌和外分泌的腫瘤以及前列腺癌。術(shù)語“白血病”是泛指造血器官的進(jìn)展性、惡性疾病，通常特征在于血液和骨髓中白細(xì)胞和它們的前體細(xì)胞的異常增殖和發(fā)育。白血病的臨床分類通?；?I)疾病的持續(xù)期和特點(diǎn)-急性或慢性；(2)涉及的細(xì)胞類型-骨髓的(髓細(xì)胞性)、淋巴的(淋巴性)或者單核細(xì)胞型；和(3)血液中異常細(xì)胞的增加或未增加-白血病或非白血性(亞白血病性)。P388白血病模型是廣泛接受的預(yù)測(cè)體內(nèi)抗白血病活性的模型。據(jù)信，在P388檢測(cè)方法中測(cè)試顯示陽性的化合物一般在體內(nèi)會(huì)表現(xiàn)出一定水平的抗白血病活性，無論被治療的白血病類型如何。相應(yīng)地，本發(fā)明包括白血病的治療方法，優(yōu)選治療下述白血病的方法:急性骨髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞性白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、成人T-細(xì)胞白血病、非白血性白血病、白細(xì)胞不增多性白血病、嗜堿性白血病、母細(xì)胞性白血病、牛白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、皮膚白血病、胚胎性白血病、嗜酸粒細(xì)胞白血病、葛氏(Gross ’)白血病、毛細(xì)胞白血病、成血細(xì)胞性白血病、血胚細(xì)胞性白血病、組織細(xì)胞性白血病、干細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、白血病減少性白血病、淋巴性白血病、淋巴細(xì)胞性(lymphoblastic)白血病、淋巴細(xì)胞性(lymphocytic)白血病、淋巴球性(lymphogenous)白血病、淋巴樣白血病、淋巴肉瘤細(xì)胞性白血病、肥大細(xì)胞白血病、巨核細(xì)胞白血病、小原粒細(xì)胞性白血病、單核細(xì)胞白血病、髓性(myeloblastic)白血病、髓細(xì)胞性(myelocytic)白血病、骨髓粒細(xì)胞性白血病、髓單核細(xì)胞性白血病、內(nèi)格利型(Naegeli)白血病、漿細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞性白血病、早幼粒細(xì)胞性白血病、李德爾氏細(xì)胞性(Rieder cell)白血病、希林氏(Schilling’s)白血病、干細(xì)胞性白血病、亞白血性白血病和未分化細(xì)胞白血病。術(shù)語“肉瘤”通常所指的腫瘤是由胚胎結(jié)締組織這樣的物質(zhì)組成的，一般包含包埋在纖維或均相物質(zhì)中的緊密堆積的細(xì)胞。可以組合使用抗腫瘤的巰基結(jié)合線粒體氧化劑和抗癌劑來治療的肉瘤包括軟骨肉瘤、纖維肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、艾伯內(nèi)西氏(Abemethy’s)肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、軟組織腺泡狀肉瘤、成釉細(xì)胞肉瘤、葡萄狀肉瘤、綠色肉瘤、絨毛膜癌、胚胎性肉瘤、Wilms’瘤、子宮內(nèi)膜肉瘤、間質(zhì)肉瘤、尤文氏(Ewing's)肉瘤、筋膜肉瘤、纖維母細(xì)胞肉瘤、巨細(xì)胞肉瘤、粒細(xì)胞肉瘤、何杰金氏肉瘤、特發(fā)性多發(fā)性色素沉著出血性肉瘤(idiopathic multiple pigmented hemorrhagic sarcoma)、B細(xì)胞的免疫母細(xì)胞肉瘤、淋巴瘤、T細(xì)胞的免疫母細(xì)胞肉瘤、詹森(Jensen’s)肉瘤、卡波西(Kaposi’s)肉瘤、庫柏法細(xì)胞(Kupffer cell)肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、惡性間葉瘤、骨膜外肉瘤、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤、勞氏肉瘤(Rous sarcoma)、漿液囊性肉瘤、外陰滑膜肉瘤和毛細(xì)管擴(kuò)張性肉瘤。術(shù)語“黑素瘤”意味著從皮膚和其他器官的黑色素細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)生的腫瘤。可以組合使用抗腫瘤的巰基結(jié)合線粒體氧化劑和抗癌劑來治療的黑素瘤包括例如，肢端雀斑樣痣黑素瘤、無黑素性黑素瘤、良性幼年黑素瘤、克羅德曼(Cloudman’ s)黑素瘤、S91黑素瘤、哈帕二氏(Harding-Passey)黑素瘤、青少年性黑素瘤、雀斑樣痣惡性黑素瘤、惡性黑素瘤、結(jié)節(jié)性黑素瘤、甲床黑素瘤和淺表擴(kuò)散性黑素瘤。術(shù)語“癌(carcinoma)”是指由上皮細(xì)胞構(gòu)成的惡性新生長物，易于滲透到周圍組織，產(chǎn)生轉(zhuǎn)移物?？梢越M合使用抗腫瘤的巰基結(jié)合線粒體氧化劑和抗癌劑來治療的示范性癌包括例如腺泡癌、腺泡狀癌、腺囊性癌、腺樣囊性癌、腺癌、腎上腺皮質(zhì)癌、肺泡上皮癌、肺泡細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma)、基底細(xì)胞癌(carcinomabasocellulare)、類基底細(xì)胞癌、基底鱗狀細(xì)胞癌、細(xì)支氣管肺泡癌、細(xì)支氣管癌、支氣管癌、髓樣癌、膽管癌、絨膜上皮癌、膠樣癌(colloid carcinoma)、粉刺癌、子宮體癌、篩狀癌、銷甲狀癌、癌瘡、柱狀細(xì)胞癌(cylindrical carcinoma)、柱狀細(xì)胞癌(cylindrical cellcarcinoma)、導(dǎo)管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎癌、腦樣癌、表皮樣癌、腺樣上皮細(xì)胞癌、夕卜生性癌、潰瘍性癌、纖維癌、膠樣癌(gelatinifornicarcinoma)、膠狀癌(gelatinouscarcinoma) >巨大細(xì)胞癌、巨細(xì)胞癌、腺癌、粒層細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌(hair-matrixcarcinoma)、多血癌、肝細(xì)胞癌、許特耳氏細(xì)胞(Hurthle cell)癌、膠樣癌(hyalinecarcinoma) > hypemephroid carcinoma、幼稚型胚胎性癌、原位癌(carcinoma in situ)、表皮內(nèi)癌、上皮內(nèi)癌、克龍派切爾(Krompecher’s)癌、庫爾契茨基細(xì)胞(Kulchitzky-cell)癌、大細(xì)胞癌、豆?fàn)畎?lenticular carcinoma、carcinoma lenticulare)、脂瘤樣癌、淋巴上皮性癌、軟癌(carcinoma medullare)、髓樣癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、髓樣癌(carcinoma molle)、粘液癌(mucinous carcinoma、carcinoma muciparum)、粘液細(xì)胞癌、粘液表皮樣癌、粘液癌(carcinoma mucosum、mucous carcinoma)、粘液瘤樣癌、鼻咽癌、燕麥細(xì)胞癌、骨化性癌 (carcinoma ossificans、osteoid carcinoma)、乳頭狀癌、門脈周癌、原位癌(preinvasive carcinoma)、棘細(xì)胞癌、腦樣癌、腎臟的腎細(xì)胞癌、儲(chǔ)備細(xì)胞癌、肉瘤樣癌、施奈德氏(Schneiderian)癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、陰囊癌、印戒細(xì)胞癌、單純癌、小細(xì)胞癌、馬鈴薯狀癌、球狀細(xì)胞癌、梭細(xì)胞癌、髓樣癌(carcinomaspongiosum)、鱗狀癌、鱗狀細(xì)胞癌、繩捆癌(string carcinoma)、血管擴(kuò)張性癌(carcinomatelangiectaticum> carcinoma telangiectodes)、移行細(xì)胞癌、結(jié)節(jié)性皮癌(carcinomatuberosum、tuberous carcinoma)、撫狀癌和絨毛狀癌。“治療有效劑量或量”在本文意味著一個(gè)能夠產(chǎn)生它的給藥效應(yīng)的劑量。確切的劑量和劑型取決于治療目的，由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用已知技術(shù)確定(參見例如Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols.1-3, 1992) ；Lloyd, The Art, Scienceand Technology of Pharmaceutical Compounding (1999) ；Remington: The Scienceand Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor(2003)和 Pickar, DosageCalculations(1999))。
術(shù)語“可藥用鹽”或“可藥用載體”意味著包括活性化合物的鹽，根據(jù)本文描述的化合物帶有的取代基，所述鹽是用相對(duì)無毒的酸或堿制備的。本發(fā)明的化合物含有相對(duì)酸性的功能團(tuán)時(shí)，可以通過在無溶劑或合適的惰性溶劑中用足夠量的所需堿與所述化合物的中性形式進(jìn)行接觸獲得堿加成鹽?？伤幱脡A加成鹽的例子包括鈉、鉀、鈣、鋁、有機(jī)胺或鎂鹽或者類似的鹽。當(dāng)本發(fā)明的化合物含有相對(duì)堿性的功能團(tuán)時(shí)，可以通過在無溶劑或合適的惰性溶劑中用足夠量的所需酸與所述化合物的中性形式進(jìn)行接觸獲得酸加成鹽?？伤幱盟峒映甥}的例子包括那些由下述無機(jī)酸衍生的鹽:鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、重碳酸、磷酸、一氫磷酸、二氫磷酸、硫酸、一氫硫酸、氫碘酸或亞磷酸等等，以及由下述相對(duì)無毒的有機(jī)酸衍生的鹽:乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥m酸、辛二酸、延胡索酸、乳酸、扁桃酸(mandelic)、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對(duì)甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸、甲磺酸等等。還包括諸如精氨酸等的氨基酸的鹽，和諸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸的有機(jī)酸的鹽(參見例如Berge etal., Journal of Pharmaceutical Science66:1-19 (1977))。本發(fā)明的某些特定化合物既含有堿性功能團(tuán)也含有酸性功能團(tuán)，使得化合物能夠轉(zhuǎn)化為堿或者酸加成鹽。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他可藥用載體也適用于本發(fā)明。1.經(jīng)過改造的腺病毒發(fā)明一個(gè)方面提供了經(jīng)過改造的腺病毒。所述改造過的腺病毒可以是P53復(fù)制受損型腺病毒。P53復(fù)制受損型腺病毒在處于表達(dá)p53的細(xì)胞內(nèi)時(shí)是復(fù)制受損的，當(dāng)處于p53受損的細(xì)胞內(nèi)時(shí)不是復(fù)制受損的。術(shù)語“復(fù)制受損的”用于本文意味著與在P53受損細(xì)胞中的病毒復(fù)制相比，當(dāng)處于P53表達(dá)細(xì)胞時(shí)病毒復(fù)制是減弱的。p53表達(dá)細(xì)胞是表達(dá)正常水平具有正?；钚缘腜53的細(xì)胞。經(jīng)過改造的腺病毒還可以是p53復(fù)制受損腺病毒和/或E4-0RF3受損的。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)過改造的腺病毒是P53復(fù)制受損的和E4-0RF3受損的。經(jīng)過改造的腺病毒可以是分離的腺病毒。術(shù)語“經(jīng)過改造的腺病毒”是指含有自然界中沒有的基因序列的腺病毒(例如非野生型腺病毒)。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)過改造的腺病毒是重組腺病毒。
`
術(shù)語“p53復(fù)制受損型”用于本文意味著當(dāng)感染細(xì)胞時(shí)，在有正常水平的活性細(xì)胞性P53的情況下，腺病毒復(fù)制被部分或全部減弱。例如，如果被感染細(xì)胞是P53受損的(即被感染細(xì)胞不能表達(dá)正常水平的功能完全的P53)，p53復(fù)制受損型腺病毒的復(fù)制可以正常進(jìn)行。相反，如果細(xì)胞表達(dá)正常水平的有功能的P53 (例如具有正?；钚缘膒53，文中又稱為“P53表達(dá)細(xì)胞”)，p53復(fù)制受損型腺病毒的復(fù)制被弱化或者阻止。如果不能表達(dá)正常水平的p53(例如突變發(fā)生在p53基因的調(diào)控區(qū)(例如啟動(dòng)子))或者表達(dá)具有低于正常p53活性的突變P53，細(xì)胞可以是p53受損的。在相同類型的健康非疾病細(xì)胞中可以發(fā)現(xiàn)正常水平的p53和正常的p53活性水平。因此，在一些實(shí)施方案中，p53受損細(xì)胞包含突變的p53基因。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，P53受損的細(xì)胞包含的基因組中p53基因被完全或者部分缺失。P53受損細(xì)胞可以是癌癥(例如腫瘤)細(xì)胞。術(shù)語“E4-0RF3受損的”用于本文意味著腺病毒不能產(chǎn)生正常水平和/或功能完全的E4-0RF3基因產(chǎn)物。例如，如果不能表達(dá)正常水平的SEQ ID NO:1中給出的E4-0RF3基因產(chǎn)物(例如突變發(fā)生在E4-0RF3基因的調(diào)控區(qū)(例如啟動(dòng)子))或者表達(dá)具有低于正常E4-0RF3基因產(chǎn)物活性的突變E4-0RF3基因產(chǎn)物，病毒可以是E4-0RF3受損的。因此在一些實(shí)施方案中，E4-0RF3受損腺病毒包含突變的E4-0RF3基因。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，E4-0RF3受損腺病毒包含的基因組中E4-0RF3基因被完全或者部分缺失。沒有其他限制，一個(gè)受損E40RF3蛋白的例子是E40RF3蛋白，其中SEQ ID NO:1中給出的氨基酸殘基82被突變(圖32)。 在一些實(shí)施方案中，腺病毒還是ElB_55k受損的。術(shù)語“ElB_55k受損的”用于本文意味著腺病毒不能產(chǎn)生正常水平的和/或功能完全的SEQ ID N0:2中給出的ElB-55k基因產(chǎn)物。例如，如果不能表達(dá)正常水平的ElB-55k基因產(chǎn)物(例如突變發(fā)生在E4-0RF3基因的調(diào)控區(qū)(例如啟動(dòng)子))或者表達(dá)具有低于正常E4-0RF3基因產(chǎn)物活性的突變ElB-55k基因產(chǎn)物，病毒可以是ElB-55k受損的。ElB-55k基因產(chǎn)物和E4-0RF3基因產(chǎn)物的正常水平和活性是相同類型的野生型腺病毒(例如未突變腺病毒)能夠產(chǎn)生的水平和活性。因此，在一些實(shí)施方案中，ElB-55k受損的腺病毒包含突變的ElB-55k基因。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，ElB-55k受損腺病毒包含的基因組中ElB-55k基因被完全或者部分缺失。有各種確定蛋白(比如p53、ElB_55k基因產(chǎn)物、E4-0RF3基因產(chǎn)物)水平和活性的檢驗(yàn)方法可以使用，比如擴(kuò)增/表達(dá)方法、免疫組織化學(xué)方法、FISH和脫落抗原法、Southern印跡或者PCR技術(shù)。此外,可以利用體外診斷方法來評(píng)估蛋白表達(dá)和擴(kuò)增,例如通過給予能夠結(jié)合待檢測(cè)蛋白并且?guī)в锌蓹z測(cè)標(biāo)記(例如放射性同位素)的分子(比如抗體)，給患者外部掃描來定位標(biāo)記。因此，測(cè)量細(xì)胞內(nèi)蛋白水平的方法通常是已知的，可以用于評(píng)測(cè)與本文提供的方法和組合物有關(guān)的蛋白水平和/或活性。發(fā)明另一方面提供了細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已經(jīng)感染了如上所述的經(jīng)過改造的腺病毒。在一些實(shí)施方案中 ，細(xì)胞已經(jīng)被以上描述的經(jīng)過改造的腺病毒轉(zhuǎn)化。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞由于攝入、并入或者表達(dá)了以上描述的經(jīng)過改造的腺病毒的遺傳物質(zhì)而發(fā)生遺傳改變。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，比如人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，腺病毒是哺乳動(dòng)物腺病毒，比如人腺病毒。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是兩棲動(dòng)物細(xì)胞(例如青蛙細(xì)胞)或者爬行動(dòng)物細(xì)胞(例如蛇細(xì)胞)。不受任何具體機(jī)制論的限制，病毒ElB_55k和E4-0RF3基因產(chǎn)物被認(rèn)為能夠減輕細(xì)胞P53介導(dǎo)的效應(yīng)，包括應(yīng)答病毒感染時(shí)的細(xì)胞凋亡。因此，病毒ElB-55k和E4-0RF3基因產(chǎn)物可以是起到減少細(xì)胞中的P53水平、細(xì)胞中的p53活性或者參與p53介導(dǎo)事件的蛋白(例如 MDM2、FAS、PIG3、TP53INP1、BTG2、LRDD/PIDD、HRHl、RNASE7 和 JMJDlC 的蛋白基因產(chǎn)物)的活性水平的作用。因此，在一些實(shí)施方案中，本文提供的經(jīng)過改造的腺病毒在具有正常p53活性的細(xì)胞內(nèi)不能有效地復(fù)制，但能夠在具有減少的p53活性的細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)內(nèi)復(fù)制。本文還提供了編碼以上描述的經(jīng)過改造的腺病毒的核酸。在一些實(shí)施方案中，提供了一個(gè)編碼經(jīng)過改造的腺病毒的核酸(例如質(zhì)粒)。在其他實(shí)施方案中，提供了復(fù)數(shù)個(gè)編碼經(jīng)過改造的腺病毒的核酸(例如復(fù)數(shù)個(gè)質(zhì)粒)。I1.癌癥治療方法發(fā)明另一方面提供了治療癌癥的方法。方法包括將有效量(例如治療有效劑量或者用量)的經(jīng)過改造的腺病毒(如上所述)或者一或多個(gè)編碼經(jīng)過改造的腺病毒的核酸給予有需要的受試對(duì)象。在一些實(shí)施方案中，癌癥是p53相關(guān)癌癥。本文描述的“p53相關(guān)癌癥”是由p53受損癌細(xì)胞導(dǎo)致的癌癥。因此，在一些實(shí)施方案中，本文中需要治療的癌癥可以特征在于P53的表達(dá)或者活性降低(例如p53蛋白的表達(dá)低于正?；蛘叩退?或者在于所表達(dá)的P53具有低(或者沒有)活性或者低于正常的活性。確定癌癥是否是P53受損癌細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的，通常適合與本文提供的方法和組合物聯(lián)合使用。在一些實(shí)施方案中，癌癥是肺癌、皮膚癌或者乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，需要治療的癌癥是惡化前的乳腺癌。II1.給藥方法和制劑按照已知方法將經(jīng)過改造的病毒(或者一或多個(gè)編碼經(jīng)過改造的腺病毒的核酸)給予人患者，比如以例如大丸劑的靜脈內(nèi)給藥，或者通過一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)輸注，通過肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、動(dòng)脈內(nèi)、滑液內(nèi)、鞘內(nèi)、口、表面、瘤內(nèi)或者吸入途徑。給藥可以是局部或者系統(tǒng)性的。用于給藥的組合物通常包含本文描述的試劑(例如經(jīng)過改造的腺病毒或者一或多個(gè)編碼經(jīng)過改造的腺病毒的核酸)，所述試劑溶解在可藥用載體，優(yōu)選水性載體中。有多種水性載體可供使用，例如緩沖鹽等。這些溶液是無菌的，通常不含有不需要的物質(zhì)。這些組合物可以通過常規(guī)的眾所周知的滅菌技術(shù)來滅菌。組合物可以含有為了接近生理?xiàng)l件而需要的可藥用輔助性物質(zhì)，比如PH調(diào)節(jié)和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。這些制劑中活性成分的濃度可以變化很大，主要根據(jù)具體的給藥方式和患者的需求，在液體體積、粘度、體重等的基礎(chǔ)上選擇。因此，典型的用于靜脈內(nèi)給藥的藥物組合物會(huì)根據(jù)試劑而改變。制備可以通過腸胃外給藥的組合物的實(shí)際方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的或者顯而易見的，在諸如Remington’s Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.(1980)的出版物中有更詳細(xì)描述。根據(jù)給藥方法，藥物組合物可以按照各自單位劑量形式進(jìn)行給藥。例如，適合經(jīng)口給藥的單位劑量形式包括，但不限于粉末、片劑、藥丸、膠囊和錠劑。藥物制劑，特別是經(jīng)過改造的病毒的藥物制劑可以通過將具有所需純度的改造過的腺病毒(或者一或多個(gè)編碼經(jīng)過改造的腺病毒的核酸)與任選的可藥用載體、賦形劑或者穩(wěn)定劑進(jìn)行混合來制備。這類制劑可以是凍干的制劑或者水溶液。可接受的載體、賦形劑或者穩(wěn)定劑在所用的劑量和濃度對(duì)接受者是無毒的?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑可以是醋酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑(例如抗壞血酸)保存低分子量多肽；蛋白，比如血清白蛋白或者明膠，或者親水性多聚物，比如聚乙烯吡咯烷酮；和氨基酸，單糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑；和離子型和非離子型表面活性劑(例如聚山梨醇酯)；可成鹽的抗衡離子，比如鈉；金屬復(fù)合體(例如Zn蛋白復(fù)合體)；和/或非離子型表面活性劑。經(jīng)過改造的腺病毒(或者一或多個(gè)編碼經(jīng)過改造的腺病毒的核酸)可以按照任何合適的感染單位濃度來成劑。制劑還可以提供其他的活性化合物，包括化療劑、細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子、生長抑制劑和抗激素劑。組合物可以用于治療或預(yù)防處置的給藥。在治療性應(yīng)用中，將組合物以“治療有效量”給予患有疾病(例如癌癥)的患者。對(duì)這種用途有效的量取決于疾病的嚴(yán)重程度和患者的整體健康狀況。根據(jù)患者需要并且能夠忍受的劑量和頻率將組合物進(jìn)行單次或者多次給藥。本發(fā)明的“患者”或者“受試對(duì)象”包括人和其他動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物。因此，方法適用于人治療和獸醫(yī)應(yīng)用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，患者是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選靈長類，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，患者是人。其他已知的癌癥療法可以與本發(fā)明的方法聯(lián)用。例如，按照發(fā)明使用的組合物還可以用于尋靶或者使細(xì)胞對(duì)其他癌癥治療劑(比如5FU、長春堿、放線菌素D、順鉬、甲氨喋呤等)敏感。在其他實(shí)施方案中，發(fā)明的方法與其他癌癥療法、放療、激素療法或者化療一起聯(lián)用。聯(lián)合給藥考慮了使用分開的制劑或者單一藥物制劑進(jìn)行的同時(shí)給藥，和按照任意順序的連續(xù)給藥，其中優(yōu)選有一段時(shí)期兩種(或者全部)活性劑同時(shí)發(fā)揮它們的生物活性。適合口服給藥的制劑可以由下述構(gòu)成:(a)液體溶液，比如懸浮在稀釋劑(比如水、鹽水或者PEG400)中的有效量包裹的核酸；(b)膠囊、藥包或片劑，每個(gè)含有預(yù)先確定量的活性成分，比如液體、固體、顆?；蛎髂z；(c)在合適液體中的懸浮物；和(d)合適的乳化齊U。片劑形式可以包括乳糖、蔗糖、甘露糖、山梨醇、磷酸鈣、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、微晶纖維素、明膠、膠體二氧化硅、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸和其他賦形劑、著色劑、填充劑、粘合劑、稀釋劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑、調(diào)味劑、染料、崩解劑和藥學(xué)上相容的載體中的一或多個(gè)。錠劑形式可以包含某個(gè)風(fēng)味(例如蔗糖)的活性成分，以及包含處于惰性基質(zhì)(如明膠和甘油或者蔗糖和阿拉伯膠、膠等)中的活性成分的錠劑，除了活性成分，還含有本領(lǐng)域已知的載體。經(jīng)過改造的腺病毒(或者一或多個(gè)編碼經(jīng)過改造的腺病毒的核酸)可以單獨(dú)或者與其他合適的成分組合制成氣溶膠制劑(即它們可以被“噴霧化”)以便經(jīng)由吸入給藥。氣溶膠制劑可以被放入壓縮的可接受推進(jìn)劑中，比如二氯二氟甲烷、丙烷、氮?dú)獾?。用于直腸給藥的合適制劑包括例如栓劑，其由包裹的核酸和栓劑基質(zhì)構(gòu)成。合適的栓劑基質(zhì)包括天然或合成的三甘油酯或鏈烷烴。此外，還可以使用明膠直腸用膠囊，其由選中的化合物組合與基質(zhì)(包括例如液體三甘油酯、聚乙二醇和鏈烷烴)構(gòu)成。適合腸胃外(比如例如通過關(guān)節(jié)內(nèi))給藥的制劑包括水性和非水性、等滲壓無菌注射液，其可以包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使制劑與接受者血液等滲的溶質(zhì)，以及可以包含懸浮劑、助溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑的水性和非水性無菌懸浮液，其中所述腸胃外給藥是例如通過關(guān)節(jié)內(nèi)(在關(guān)節(jié)中)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、瘤內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑。在實(shí)施本發(fā)明時(shí),可以將組合物通過例如靜脈內(nèi)輸注、經(jīng)口、表面、腹腔內(nèi)、膀胱內(nèi)、瘤內(nèi)或者鞘內(nèi)給藥。腸胃外給藥、瘤內(nèi)給藥后靜脈內(nèi)給藥是優(yōu)選的給藥方法?；衔镏苿┛梢蕴幱趩挝粍┝炕蛘叨鄤┝棵芊獾娜萜鲀?nèi)，比如安瓿和小管。注射液和懸浮液可以由無菌粉末、顆粒和前面描述過的類型的片劑制備。用于離體療法的轉(zhuǎn)導(dǎo)或者感染了腺病毒或者轉(zhuǎn)染了核酸的細(xì)胞也可以如上所述通過靜脈內(nèi)或者腸胃外給藥。優(yōu)選藥學(xué)制品處于單位劑量形式。在這種形式中，制品被分為含有合適量活性成分的單位劑量。優(yōu)選的藥學(xué) 制品遞送一或多個(gè)活性的經(jīng)過改造的腺病毒(或者一或多個(gè)編碼經(jīng)過改造的腺病毒的核酸)，任選與一或多個(gè)化療劑或者免疫治療劑在緩釋制劑中組合。一般來說，經(jīng)過改造的腺病毒(或者一或多個(gè)編碼改造過的腺病毒的核酸)被作為敏化劑給予，所述敏化劑使腫瘤細(xì)胞對(duì)其他細(xì)胞毒癌癥療法(包括化療、放療、免疫療法和激素療法)的易感性提聞。在處置癌癥的治療用途中，本發(fā)明的藥學(xué)方法中使用的經(jīng)過改造的腺病毒(或者一或多個(gè)編碼改造過的腺病毒的核酸)可以按照每天大約0.0Olmg/kg到大約1000mg/kg的初始劑量給予?？梢允褂么蠹s0.0lmg/kg到大約500mg/kg,或者大約0.lmg/kg到大約200mg/kg,或者大約lmg/kg到大約100mg/kg,或者大約10mg/kg到大約50mg/kg的每日劑量范圍。但是劑量可以根據(jù)患者的需要、要處理的狀況的嚴(yán)重程度和應(yīng)用的化合物變化。例如，可以考慮特定患者中診斷的癌癥階段來根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定劑量。在本發(fā)明的語境中給予患者的劑量應(yīng)當(dāng)足夠在患者中隨時(shí)間產(chǎn)生有益的治療反應(yīng)。劑量的大小還可以通過特定患者中伴隨給予的特定載體或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞類型的任何副作用的存在、屬性和程度來確定。確定特定情形的合適劑量是醫(yī)務(wù)人員能力以內(nèi)的。通常，治療以比化合物最佳劑量少的較小劑量開始。然后，以小的增加提高劑量直至達(dá)到最佳效果。為了方便，如果需要可以將總的每日劑量分開，在一天內(nèi)分成幾份給予。按照發(fā)明使用的藥物制品一般是遞送給哺乳動(dòng)物，包括人和非人哺乳動(dòng)物。使用所述方法處置的非人哺 乳動(dòng)物包括馴養(yǎng)的動(dòng)物(即貓、犬、鼠、嚙齒目和兔形目)和農(nóng)業(yè)動(dòng)物(牛、馬、羊、豬)。
實(shí)施例以下實(shí)施例僅用于闡述，而不是限制發(fā)明。迫切需要鑒定新類型的能夠確實(shí)地除去癌細(xì)胞而不傷害正常細(xì)胞的藥物和治療方法。對(duì)病毒進(jìn)行改造，從而能夠駐扎到腫瘤細(xì)胞受體上并選擇性地在腫瘤塊內(nèi)復(fù)制(溶瘤病毒)有極大的潛力作為溶癌療法?！叭芰霾《尽钡慕⒖梢酝ㄟ^利用癌癥突變和腺病毒蛋白之間深厚的功能重疊來實(shí)現(xiàn)。在臨床試驗(yàn)中，這些藥劑的第一個(gè)原型已經(jīng)展現(xiàn)出有前景的效力。不希望受限于任何理論，相信現(xiàn)在可以利用對(duì)推動(dòng)腫瘤和病毒復(fù)制的分子機(jī)制的臨床經(jīng)驗(yàn)和新觀點(diǎn)來開發(fā)有強(qiáng)力和改善的治療性能的新病毒。不幸的是，以前構(gòu)建這類病毒的方法學(xué)未能實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的。相應(yīng)地，文中提供了能夠快速產(chǎn)生和尋靶治療用病毒的技術(shù)。本文提供的是新的基因編碼的可誘導(dǎo)性化學(xué)適配系統(tǒng)，其能夠?qū)⒏腥緦?dǎo)靶到多個(gè)細(xì)胞受體。溶瘤病毒療法有潛力破壞任何大小的腫瘤塊，但需要病毒能夠穿越脈管系統(tǒng)，感染從一個(gè)癌細(xì)胞擴(kuò)散到另一個(gè)。因此，以前的腺病毒載體的攝入對(duì)單一細(xì)胞受體的依賴限制了它們的治療潛力。改變病毒衣殼的化學(xué)性能和結(jié)合從而使感染可以特異地尋靶到任何細(xì)胞類型是個(gè)極大的突破。這一點(diǎn)通過利用癌癥藥物雷帕霉素的已知性能將帶有FKBP和FRB結(jié)構(gòu)域的異源蛋白二聚體化(例如，表達(dá)纖維蛋白-FRB衣殼蛋白的病毒與融合FKBP的重新尋靶配體)。這些病毒在經(jīng)過雷帕霉素處理時(shí)能夠經(jīng)由多個(gè)重新尋靶配體感染細(xì)胞，這是作為新的癌癥療法的化學(xué)和病毒武器的合理和有力組合。并且，這些技術(shù)使得能夠通過腺病毒感染在任何細(xì)胞類型中進(jìn)行多蛋白復(fù)合體和完整途徑的組裝、遞送和共表達(dá)。這些技術(shù)可以開發(fā)特異殺傷P53突變腫瘤和惡化前乳腺癌細(xì)胞的“新一代”溶瘤病毒，具有挽救眾多癌癥患者生命的潛力。A.在細(xì)胞染色質(zhì)沉默p53活性p53最初被發(fā)現(xiàn)是DNA病毒蛋白SV40Large T抗原的細(xì)胞祀分子。但是盡管對(duì)p53的研究有30年，還是沒有完全了解決定p53轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵因素。p53在正常細(xì)胞中是組成型表達(dá)，其活性受到高度調(diào)節(jié)的P53蛋白降解的限制。p53轉(zhuǎn)錄激活是在應(yīng)答癌基因和DNA損傷信號(hào)時(shí)被引發(fā)的，這兩者都能穩(wěn)定p53。這造成一般的觀點(diǎn)認(rèn)為p53水平的誘導(dǎo)和磷酸化與P53在細(xì)胞染色質(zhì)中靶啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄活性是同義的。正因如此，p53水平的誘導(dǎo)被解讀為P53的活化，并且是多種癌癥療法的原理，包括放射和基因毒性藥物、MDM2拮抗劑(比如nutlin)和ElB-55k缺失的溶瘤腺病毒療法0NYX-015。腺病毒ElB-55k結(jié)合p53的反式激活結(jié)構(gòu)域并將p53導(dǎo)靶到腺病毒感染細(xì)胞內(nèi)的降解。ElB-55k在細(xì)胞轉(zhuǎn)化分析中能夠有效地抑制p53，被認(rèn)為對(duì)于腺病毒復(fù)制中p53滅活很重要。AElB-55k突變病毒dll520/0NYX-015在感染細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)高p53水平。在此基礎(chǔ)上，在患者中測(cè)試了 0NYX-015作為p53腫瘤選擇性病毒癌癥療法，目前在多個(gè)國家已獲得批準(zhǔn)(現(xiàn)在的名稱為Oncorine)。然而，ElB-55k病毒在RNA輸出中，而不是p53滅活中的功能的丟失才是AElB-55k腫瘤選擇性的主要決定因素。與預(yù)期相反，我們發(fā)現(xiàn)雖然p53在感染了 AElB-55k的原代小氣道上皮細(xì)胞(SAECs)中積累到高水平，腺病毒感染的生理靶細(xì)胞群，p53 轉(zhuǎn)錄靶比如 p21、MDM2、Cyclin G、14_3_3o、PERP、PIG3 和 GADD45 不被誘導(dǎo)(圖1a)。不能活化p53轉(zhuǎn)錄靶不是p53調(diào)節(jié)的組織特異性效果，p53在感染AElB_55k的原代乳房上皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞中也更加穩(wěn)定，但不能誘導(dǎo)p21(補(bǔ)充圖1)。在AElB-55kU20S腫瘤細(xì)胞中得出了類似的結(jié)論，p53在所述細(xì)胞中被誘導(dǎo)在細(xì)胞核內(nèi)達(dá)到高水平(圖1b)，但與多柔比星處理(圖1c和補(bǔ)充圖2)相反，未能引發(fā)下游轉(zhuǎn)錄靶物，比如p21和MDM2的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)顯示P53降解的丟失導(dǎo)致感染腺病毒的細(xì)胞中的高p53水平，但盡管如此，P53轉(zhuǎn)錄靶的誘導(dǎo)被抑制到和帶有p53腫瘤突變(C33A、MDA-MB-231和HCT-116p53_/_)的細(xì)胞系相似的程度(補(bǔ)充圖2)。這揭示了我們對(duì)腺病毒生物學(xué)以及p53活化的理解還存在基本的分歧。細(xì)胞和病毒癌基因(比如Ras和腺病毒ElA)通過引發(fā)ARF的表達(dá)來活化p53。ARF抑制MDM2導(dǎo)致p53水平的誘導(dǎo)和p53 轉(zhuǎn)錄靶的活化。ARF在58%的人類癌癥，主要是那些保留了野生型P53的癌癥中發(fā)生丟失，這在以前已經(jīng)被認(rèn)為是阻止p53在感染AElB-55k的腫瘤細(xì)胞中的活化的關(guān)鍵因素。利用其中ARF通過IPTG得到調(diào)節(jié)的U20S穩(wěn)定細(xì)胞系(p53野生型、ARF陰性)，我們顯示了在模擬感染細(xì)胞中ARF表達(dá)穩(wěn)定了 p53并且激活p21的轉(zhuǎn)錄。然而，盡管ARF的誘導(dǎo)和基礎(chǔ)的p53活性，p21水平在野生型和感染A 55k的細(xì)胞中仍然被抑制到相似的水平(圖1d)。而且，在感染AElB-55k的原代SAECs中，內(nèi)源ARF表達(dá)也未能激活P53轉(zhuǎn)錄靶(圖1a)。因此，即使在腺病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)ElB-55k和ARF，p53被滅活。DNA損傷信號(hào)在激活p53、引發(fā)p53磷酸化和蛋白穩(wěn)定中也起到關(guān)鍵的作用。我們推測(cè)單獨(dú)P53水平的誘導(dǎo)不足以激活A(yù)ElB-55k感染的細(xì)胞中的p53，還需要DNA損傷信號(hào)。在臨床試驗(yàn)中，AElB-55k突變病毒0NYX-015與基因毒性化療劑比如5-氟尿嘧啶(5-FU)組合使用。因此，我們測(cè)試了 DNA損傷信號(hào)是否是激活A(yù)ElB-55k感染細(xì)胞中的P53靶所必需的。我們顯示了用5-FU進(jìn)行的處理未能活化AElB-55k感染的U20S細(xì)胞中的p53 (圖2a)?？紤]到許多腫瘤細(xì)胞中DNA損傷檢查點(diǎn)被突變破壞，我們還分析了原代細(xì)胞，結(jié)果顯示P53轉(zhuǎn)錄靶在A ElB-55k感染的SAECs中占優(yōu)勢(shì)地被抑制，不能被Y照射(圖2b)、UV照射(補(bǔ)充圖3)或多柔比星(圖2d)活化。
應(yīng)答DNA損傷時(shí)的p53活化是由激酶，比如ATM、ATR、DNA-PKcs、CHKl和CHK2介導(dǎo)的，這些酶在關(guān)鍵殘基將P53磷酸化。例如，p53在絲氨酸15和20的磷酸化可以移走M(jìn)DM2，阻止了 p53的降解，而其他位點(diǎn)的磷酸化增強(qiáng)了 p53在靶啟動(dòng)子結(jié)合DNA。因此，DNA損傷未能激活A(yù)ElB-55k感染細(xì)胞中高水平的p53的可以解釋是p53磷酸化在病毒感染時(shí)被抑制。然而，即使沒有內(nèi)源基因毒性脅迫的誘導(dǎo)，在AElB-55k感染的原代細(xì)胞中，p53已經(jīng)在多個(gè)DNA損傷活化的激酶的靶位點(diǎn)被高度磷酸化(圖2c)。因此，在沒有ElB-55k的情況下，癌基因和DNA損傷信號(hào)引發(fā)了 p53的穩(wěn)定化和磷酸化，但盡管如此，p53從生物學(xué)上說是惰性的，不能活化下游效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄。我們接下來檢驗(yàn)了在沒有ElB-55k的情況下，在腺病毒感染細(xì)胞中MDM2是否能夠結(jié)合并滅活p53。Nutlin是MDM2的小分子拮抗劑，能夠抑制MDM2_p53結(jié)合和p53降解的誘導(dǎo)。與模擬感染細(xì)胞相反，nutlin對(duì)MDM2-p53結(jié)合的抑制未能進(jìn)一步穩(wěn)定p53或者誘導(dǎo)AElB-55k感染的SAECs中的p21水平(圖2d)。這些結(jié)果與A ElB_55k感染的U20S細(xì)胞中ARF的過表達(dá)不能活化p53(圖1d)是一致的。綜合起來，我們的數(shù)據(jù)顯示p53靶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活化在腺病毒感染細(xì)胞中被抑制，即使P53被誘導(dǎo)。組蛋白脫乙酰基酶(HDAC)抑制劑曲古菌素A(TSA)是一種通用轉(zhuǎn)錄活化分子，能夠誘導(dǎo)p21(以及多個(gè)其他細(xì)胞基因)的表達(dá)。在模擬物感染的原代細(xì)胞中，TSA不依賴p53穩(wěn)定或磷酸化地誘導(dǎo)p21表達(dá)(圖2d)。相反，在AElB-55k感染的細(xì)胞中，TSA不能誘導(dǎo)p21的轉(zhuǎn)錄。我們得出結(jié)論，在腺病毒感染的細(xì)胞中，無論ElB-55k，p53轉(zhuǎn)錄靶主要被抑制而且不能在應(yīng)答輻射、基因毒性藥物、ARF、MDM2拮抗劑或者HDAC抑制劑時(shí)被激活。準(zhǔn)確地解釋這個(gè)機(jī)制對(duì)于理解p53的活化，以及如果操縱它來進(jìn)行癌癥治療都是重要的。我們的數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明有一個(gè)以前沒有發(fā)現(xiàn)的腺病毒蛋白在獨(dú)立于ElB_55k和p53降解的情況下滅活P53。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們使用了遺傳學(xué)方法，將帶有ElB-55k和其他早期病毒基因復(fù)合突變的原代細(xì)胞感染腺病毒后篩選P53活化(補(bǔ)充圖4)。我們發(fā)現(xiàn)除了缺失ElB-55k，腺病毒感染 細(xì)胞中p53的活化需要丟失E1A(E1A-13s)或E4-0RF3的13s剪接形式(圖3a)。我們發(fā)現(xiàn)在ElB-55k之外，腺病毒編碼兩個(gè)能夠滅活p53的病毒蛋白令人驚訝，特別是因?yàn)镋lA是細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究中引發(fā)p53活化的強(qiáng)力癌基因。在腺病毒感染中，ElA的替代13s剪接形式是反式激活其他早期病毒基因，包括E4-0RF3所必需的(圖3a)。因此，我們?cè)O(shè)想E1A-13S通過誘導(dǎo)E4-0RF3在病毒感染中的表達(dá)來滅活p53。與這個(gè)假想相符，我們顯示與Ad-GFP相反，E4-0RF3的異位表達(dá)足夠挽救AElB_55k/AE4-0RF3和AElB_55k/A ElA-13s感染細(xì)胞中的p53滅活(圖3b)。A ElB_55k/ A E4-0RF3共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Ad-GFP對(duì)p21的輕微減少是由于ElA-13s對(duì)E4-0RF3 (反式)的部分活化，這在A ElB_55k/ A ElA_13s共感染中不發(fā)生(補(bǔ)充圖5)。因此，E1A-13S對(duì)E4-0RF3表達(dá)的誘導(dǎo)經(jīng)由獨(dú)立于ElB_55k的機(jī)制滅活了腺病毒感染細(xì)胞中的P53。提議的AElB-55k溶瘤腺病毒療法(0NYX-015 (Oncorine))對(duì)p53腫瘤的選擇性是基于ElB-55k是腺病毒感染細(xì)胞中滅活p53所借助的關(guān)鍵和唯一機(jī)制。雖然與野生型病毒相比，AElB-55k感染細(xì)胞中可以有某些基礎(chǔ)p53活性，這里我們顯示了額外缺失E4-0RF3是病毒感染原代細(xì)胞時(shí)程中誘導(dǎo)p53水平從而激活下游靶的轉(zhuǎn)化所必需的(圖3c)。p53水平的誘導(dǎo)是激活p53轉(zhuǎn)錄靶所必需的，在AE4-0RF3感染中(即p53是ElB_55k降解的靶)沒有這種情況。而且，我們顯示了 E4-0RF3阻止了多個(gè)p53轉(zhuǎn)錄靶的活化，包括細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)和凋亡基因(圖3d)。相對(duì)模擬物感染，E4-0RF3抑制某些p53靶(比如p21)的轉(zhuǎn)錄，并且阻止其他靶(比如PUMA和MDM2)的誘導(dǎo)。與p53轉(zhuǎn)錄靶相反，p53mRNA水平的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)和管家基因GUSB的穩(wěn)定態(tài)mRNA水平不被E4-0RF3影響(補(bǔ)充圖6)。利用含有坡那留酮誘導(dǎo)性p53的p53無效突變穩(wěn)定細(xì)胞系(H1299-D1)(圖3e和補(bǔ)充圖7)，我們顯示了 p21和MDM2在八￡18-551^/八￡4-01^3感染細(xì)胞中的誘導(dǎo)在沒有￡4-01^3的情況下是P53依賴性的，不是全面轉(zhuǎn)錄活化的結(jié)果。由于H1299-D1細(xì)胞表達(dá)p53cDNA，這些試驗(yàn)還證明E4-0RF3不能通過誘導(dǎo)替代的p53剪接形式來滅活p53。我們得出結(jié)論，E4-0RF3在滅活p53中具有關(guān)鍵和新的作用，該作用獨(dú)立于ElB_55k和p53降解。諸如ElB-55k、SV40LT和HPV E6的DNA腫瘤病毒蛋白通常是經(jīng)由高親和力蛋白-蛋白相互作用而滅活P53的。但是，與這個(gè)成熟的模式相反，E4-0RF3不與p53共定位(補(bǔ)充圖8)。而且，與ElB-55k相反，在來自病毒感染細(xì)胞或者以帶有表位標(biāo)簽的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的裂解物中，E4-0RF3不與p53共同免疫沉淀。這表明E4-0RF3是經(jīng)由非標(biāo)準(zhǔn)的機(jī)制滅活p53。p53水平的誘導(dǎo)和磷酸化正常情況下推動(dòng)p53的四聚體化和構(gòu)象改變，促進(jìn)在被它調(diào)控的基因的啟動(dòng)子發(fā)生序列特異性DNA結(jié)合，p53在此召集輔助因子從而激活它們的表達(dá)。活性相對(duì)失活P53DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)可以通過分別與單克隆抗體PAbl620相對(duì)PAb240的免疫沉淀來區(qū)分。在AElB-55k和AElB_55k/AE4-0RF3感染細(xì)胞中，p53被PAb 1620選擇性地免疫沉淀(補(bǔ)充圖9)，顯示p53具有活性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白構(gòu)象，能夠結(jié)合細(xì)胞啟動(dòng)子中的DNA靶位點(diǎn)。為了從功能上確定E4-0RF3能否阻止p53DNA結(jié)合，我們用P53熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(p53-luc)轉(zhuǎn)染了 U20S細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)p53與共有DNA序列的結(jié)合活化了熒光素酶轉(zhuǎn)錄。這些試驗(yàn)的進(jìn)行是通過在病毒感染的48小時(shí)過程中實(shí)時(shí)測(cè)量熒光素酶活性。對(duì)照PGL3-熒光素酶報(bào)告子(非p53靶啟動(dòng)子)在所有病毒感染中被激活到相似水平(補(bǔ)充圖10)。在野生型病毒感染細(xì)胞中，p53激活的熒光素酶轉(zhuǎn)錄在24小時(shí)后被抑制(圖4a)，預(yù)計(jì)是因?yàn)閜53的降解(圖lc)。相反，p53-熒光素酶在AElB_55k和AElB-55k/AE4-0RF3感染中均被激活(圖4a)。熒光素酶活性的誘導(dǎo)需要p53與DNA的結(jié)合，因?yàn)楹型蛔僷53應(yīng)答元件的啟動(dòng)子使熒光素酶活性消失。這些試驗(yàn)表明E4-0RF3不與P53競(jìng)爭結(jié)合共有DNA靶序列或者阻止異位報(bào)告質(zhì)粒中啟動(dòng)子的p53轉(zhuǎn)錄活化。E4-0RF3能夠阻止p53對(duì)內(nèi)源靶的轉(zhuǎn)錄激活，而不能阻止它對(duì)相同細(xì)胞中異位熒光素酶的轉(zhuǎn)錄激活很難統(tǒng)一(圖4b)。質(zhì)粒DNA與細(xì)胞染色質(zhì)中的DNA受到的架構(gòu)和包裝的限制不同。因此，我們進(jìn)行了 P53染色質(zhì)免疫沉淀(ChIPs)來確定E4-0RF3是否在細(xì)胞染色質(zhì)的環(huán)境中特異性地阻止P53DNA結(jié)合。在多柔比星處理和AElB-55k/AE4-0RF3感染時(shí)，p53與p21 (5’和3’位點(diǎn))和MDM2啟動(dòng)子中的靶位點(diǎn)發(fā)生DNA結(jié)合，p53以此激活p21和MDM2RNAs的轉(zhuǎn)錄(圖4b_c)。相反，雖然在AElB_55k感染細(xì)胞中p53被誘導(dǎo)到相似的水平，我們顯示了 E4-0RF3阻止了 p53與p21和MDM2啟動(dòng)子中靶位點(diǎn)的DNA結(jié)合(圖4b-c和補(bǔ)充圖11)。結(jié)果，p53的誘導(dǎo)未能引發(fā)AElB-55k感染細(xì)胞中下游效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄。因此，E4-0RF3在細(xì)胞染色質(zhì)的環(huán)境下，通過阻止p53與DNA靶位點(diǎn)的特異結(jié)合來滅活p53。我們推理P53DNA結(jié)合不 僅取決于p53的蛋白構(gòu)象，還依賴靶啟動(dòng)子在細(xì)胞基因組中的可得性。發(fā)育調(diào)控的基因通過壓緊成異染色質(zhì)而在胚胎發(fā)生中被表觀遺傳地沉默，從而阻止體細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靠近。異染色質(zhì)具有組蛋白乙?；瘉G失和抑制性組蛋白甲基化標(biāo)記誘導(dǎo)的特性。我們?cè)O(shè)想E4-0RF3能夠通過在內(nèi)源靶啟動(dòng)子誘導(dǎo)異染色質(zhì)，阻止接近P53從而滅活p53。與此一致，組蛋白脫乙酰酶抑制劑TSA不能在AElB-55k感染的原代細(xì)胞中誘導(dǎo)p21(圖2d)。由此，我們推斷E4-0RF3滅活p53調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子是經(jīng)由對(duì)組蛋白脫乙酰抑制顯性的一個(gè)機(jī)制，比如組蛋白甲基化。在癌癥中，腫瘤抑制基因(比如pl6INK4a)的異常表觀遺傳沉默被組蛋白H3在賴氨酸9 (H3K9)的甲基化所抑制。SUV39H1和SUV39H2 (它們之間有59%的氨基酸同一性，具有冗余的功能)對(duì)H3K9三甲基化(H3K9me3)的誘導(dǎo)還有的一個(gè)重要作用是誘導(dǎo)著絲粒異染色質(zhì)中DNA的壓緊和轉(zhuǎn)錄抑制特點(diǎn)。無法區(qū)別P53在AElB-55k相對(duì)A ElB_55k/A E4-0RF3感染細(xì)胞中的定位(圖4d)。然而，在AElB-55k感染細(xì)胞中p53被滅活，H3K9me3抑制性異染色質(zhì)的凝縮區(qū)域在細(xì)胞核周圍被誘導(dǎo)(圖4d和補(bǔ)充圖12)。在四種已知能夠催化H3K9三甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶中，我們顯示了 SUV39H1和SUV39H231，但不是SETDB132或G9a與AElB_55k感染細(xì)胞核中形成離體H3K9me3異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異相關(guān)(圖4e)。SUV39H1/2相關(guān)H3K9me3異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域的形成需要E4-0RF3，在模擬物或者AElB-55k/AE4-0RF3感染細(xì)胞中不發(fā)生(補(bǔ)充圖13-16)。這些數(shù)據(jù)顯示，E4-0RF3誘導(dǎo)新的SUV39H1和SUV39H2H3K9me3異染色質(zhì)形成，這使得P53能夠接近內(nèi)源靶啟動(dòng)子。為了直接測(cè)試這一點(diǎn)，我們進(jìn)行了 p53和H3K9me3ChIPs。E4-0RF3所誘導(dǎo)的抑制性異染色質(zhì)與總組蛋白H3或H3K9me3的全面上調(diào)無關(guān)，所述總組蛋白H3或H3K9me3在模擬物、A ElB_55k和A ElB_55k/ A E4-0RF3感染裂解物中的水平相似(圖5a)。在AElB-55k/AE4-0RF3感染細(xì)胞中，我們顯示當(dāng)H3K9me3處于IgG水平(圖5a和補(bǔ)充圖17)時(shí)，p53被誘導(dǎo)結(jié)合在p21和MDM2啟動(dòng)子位點(diǎn)(與圖4c 一致)。相反，在A ElB-55k感染細(xì)胞中，在p21和MDM2啟動(dòng)子中誘導(dǎo)了 H3K9me3并阻止p53的結(jié)合。在p21啟動(dòng)子中，還在-5kb區(qū)誘導(dǎo)了 H3K9me3，而不是只限于p53結(jié)合位點(diǎn)(補(bǔ)充圖17)。因此在表達(dá)E4-0RF3的細(xì)胞中 ，p53和H3K9me3之間在p53調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子上有負(fù)相關(guān)性。A ElB_55k感染細(xì)胞中被抑制的其他P53靶得到同樣的結(jié)論，包括GADD45A、FAS、PUMA和PIG3 (補(bǔ)充圖17-19)。相反，與模擬物相比，在AElB-55k感染細(xì)胞中不會(huì)誘導(dǎo)在諸如肌動(dòng)蛋白和P0LR2的非P53調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子中的H3K9me3(補(bǔ)充圖17和19)。在A ElB_55k/A E4-0RF3感染的細(xì)胞中，這些啟動(dòng)子上的基礎(chǔ)H3K9me3被降低，表明E4-0RF3可以在病毒感染中還限制了全面去甲基酶活性。我們得到結(jié)論，E4-0RF3通過誘導(dǎo)p53靶啟動(dòng)子處的離體H3K9me3異染色質(zhì)沉默來滅活P53，由于不能靠近靶位點(diǎn)，p53無力活化下游效應(yīng)子的轉(zhuǎn)錄。對(duì)哺乳動(dòng)物和癌癥中異染色質(zhì)形成的誘導(dǎo)仍然只有很少的理解。因此，主要問題是E4-0RF3是如何直接參與誘導(dǎo)p53靶啟動(dòng)子處的抑制性H3K9me3異染色質(zhì)。E4-0RF3不與P53共定位，在細(xì)胞核中形成獨(dú)特的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充圖8)。我們顯示E4-0RF3限定了AElB-55k感染的腫瘤和原代細(xì)胞中離體H3K9me3異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域的形成。在細(xì)胞核中的正交切片揭示E4-0RF3多數(shù)情況與H3K9me3相鄰，表明它作為新的平臺(tái)通過瞬時(shí)或者長距離相互作用催化異染色質(zhì)形成(圖5b-c和補(bǔ)充圖20-21)。利用高分辨率共聚焦顯微鏡，我們顯示E4-0RF3形成了連貫性的支架，隨著它在細(xì)胞核中的織結(jié)能夠組織并限定離體異染色質(zhì)的組裝(圖5d)。這些數(shù)據(jù)顯示E4-0RF3在協(xié)調(diào)p53靶啟動(dòng)子的H3K9me3異染色質(zhì)沉默中的直接作用。而且，它們揭示了一個(gè)特別的核支架，所述核支架或者是建立在已有的組織細(xì)胞DNA的架構(gòu)上,或者是將異染色質(zhì)組裝祀向到p53祀啟動(dòng)子的新的病毒結(jié)構(gòu)。這些數(shù)據(jù)提出了關(guān)于E4-0RF3對(duì)p53靶物的沉默的特異性和這一機(jī)制對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的整體后果的問題。因此，為了確定E4-0RF3對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的特異性和整體性生理后果，我們?cè)谠遂o止期SAECs上進(jìn)行了全基因組表達(dá)分析(補(bǔ)充圖22和23)。這些研究顯示E4-0RF3是當(dāng)靜止期SAECs感染病毒時(shí)誘發(fā)的全面轉(zhuǎn)錄變化中的單獨(dú)的參與者。在A 55k和A 55k/ A 0RF3相對(duì)模擬物感染的SAECs中，共有1730個(gè)重疊基因被上調(diào)或下調(diào)log倍數(shù)改變超過2，這些基因的調(diào)控方式類似，反映了共同的轉(zhuǎn)錄程序(圖6a)。我們顯示基因表達(dá)中的這些整體變化與細(xì)胞周期和E2F激活有關(guān)，這預(yù)期是由于ElA對(duì)腫瘤抑制蛋白R(shí)B家族的滅活。這些數(shù)據(jù)與ElA經(jīng)由p300和PCAF在參與細(xì)胞生長、分裂和DNA合成的基因的啟動(dòng)子處誘導(dǎo)活性組蛋白標(biāo)記組蛋白H3賴氨酸18乙?；?H3K18ac)的富集一致。因此，E4-0RF3誘導(dǎo)的異染色質(zhì)沉默，以及它在整個(gè)細(xì)胞核內(nèi)形成的支架不影響病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物的全面活化。為了明確E4-0RF3特異靶向的基因，我們比較了 A ElB_55k/ A E4-0RF3對(duì)AElB-55k感染的細(xì)胞。E4-0RF3在A ElB_55k感染細(xì)胞中以log倍數(shù)改變2或以上阻止了 263個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄活化。為了估計(jì)這些中有多少可以受到p53的調(diào)控，我們采用了兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn):它們的啟動(dòng)子中存在共有P53DNA結(jié)合位點(diǎn)，和是否相同基因在MDM2拮抗劑nutlin處理的細(xì)胞中也被上調(diào)(圖6b)。我們顯示2 65個(gè)被差別上調(diào)的基因中71%在應(yīng)答nutlin時(shí)被誘導(dǎo)和/或具有預(yù)測(cè)的P53結(jié)合位點(diǎn)。應(yīng)答A ElB-55k/ A E4-0RF3和nutlin時(shí)被上調(diào)的領(lǐng)先轉(zhuǎn)錄物的熱點(diǎn)圖包括與生長抑制和細(xì)胞凋亡有關(guān)的眾所周知的P53靶(MDM2、FAS、PIG3、TP53INP1、BTG2、LRDD/PIDD)，以及新發(fā)現(xiàn)的靶(HRH1、RNASE7、JMJD 1C)(圖 6c 和補(bǔ)充圖24)。有76個(gè)被上調(diào)的基因既沒有預(yù)期的p53結(jié)合位點(diǎn)，應(yīng)答nutlin時(shí)也未被上調(diào)。對(duì)E4-0RF3調(diào)控的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行的途徑分析表明除了 p53途徑，還有顯著高的與免疫調(diào)節(jié)和組織/血管重塑有關(guān)的基因。這些數(shù)據(jù)表明可以作為整體抗病毒轉(zhuǎn)錄沉默程序的一部分，E4-0RF3靶向p53啟動(dòng)子，這與A ElB_55k/ A E4-0RF3的高度缺陷性復(fù)制一致(補(bǔ)充圖25)。我們的研究結(jié)論挑戰(zhàn)了一般的假設(shè)，即p53誘導(dǎo)和磷酸化等同于p53活性，這一假設(shè)正是幾種針對(duì)P53的癌癥療法的前提。我們的數(shù)據(jù)揭示p53滅活的一種新的和主要的機(jī)制，這種機(jī)制通過人類體細(xì)胞中P53靶啟動(dòng)子的定向表觀遺傳沉默發(fā)揮作用。我們鑒定到了病毒蛋白E4-0RF3，該蛋白形成新的貫穿細(xì)胞核的支架并引導(dǎo)在p53靶啟動(dòng)子處的SUV39Hl/2H3K9me3異染色質(zhì)的組裝從而在應(yīng)答基因毒性和癌基因脅迫時(shí)沉默p53活化的轉(zhuǎn)錄(圖6d)。不尋常的是這個(gè)抑制性的細(xì)胞核網(wǎng)能夠選擇性地捕獲p53和抗病毒基因，在推動(dòng)病理性細(xì)胞和病毒復(fù)制的整體轉(zhuǎn)錄變化的背景下進(jìn)行。腺病毒E1B-55K靶向p53進(jìn)行蛋白酶體降解。然而，E4-0RF3通過沉默p53靶啟動(dòng)子獨(dú)立于E1B-55K滅活p53。因此，要活化腺病毒感染細(xì)胞中的p53需要將E1B-55K和E4-0RF3都缺失。申請(qǐng)人的結(jié)構(gòu)和寡聚化研究揭示有活性地折疊形成了 E4-0RF3N82A突變蛋白，但它采取了會(huì)阻止更高階寡聚化的閉合構(gòu)型。因此為了確定是否E4-0RF3的更高階組裝是P53滅活所必需的，我們構(gòu)建了新的腺病毒，其中的E1B-55K被無效并且表達(dá)E4-0RF3N82A替代野生型E4-0RF3。E4-0RF3阻止AE1B-55K感染細(xì)胞中p53激活p21和MDM2的轉(zhuǎn)錄(圖32A)。相反，在A E1B-55K/E4-0RF3N82A感染的細(xì)胞中，E4-0RF3不能進(jìn)行更高階寡聚化和滅活p53(圖32A)。在不同類型的p53靶分子中得到了類似的結(jié)論。因此，E4-0RF3N82A表現(xiàn)為一個(gè)完全無效突變。申請(qǐng)人得到結(jié)論是E4-0RF3的更高階寡聚化對(duì)滅活P53介導(dǎo)的基因表達(dá)非常關(guān)鍵。腺病毒早期蛋白和腫瘤突變之間有深厚的功能重疊，這一點(diǎn)導(dǎo)致鑒定到許多關(guān)鍵的生長調(diào)控機(jī)制，包括E2F和p300/CBP組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶。因此，一個(gè)主要問題是E4-0RF3是否反映或昭示了一個(gè)還審查著正常細(xì)胞或腫瘤發(fā)生中P53轉(zhuǎn)錄活性的已有機(jī)制和核結(jié)構(gòu)。驚人的是E4-0RF3的所有已知細(xì)胞靶_PML39、MRE11/RAD50/NBS1 (MRN)DNA損傷/修復(fù)復(fù)合體和Tifl a也被腫瘤突變破壞。一個(gè)有趣的猜測(cè)是E4-0RF3將幾個(gè)已知和可以尚待發(fā)現(xiàn)的癌癥途徑突變的抑制效應(yīng)進(jìn)行了物理上的整合，這些抑制效應(yīng)一起在沉默P53活性中具有新型的功能。與利用病毒蛋白發(fā)現(xiàn)P53類似，E4-0RF3提供了一個(gè)有力的動(dòng)態(tài)探測(cè)分子，可以用于確定在人類體細(xì)胞中誘導(dǎo)P53靶啟動(dòng)子的離體和定向表觀遺傳沉默的關(guān)鍵細(xì)胞因素。這對(duì)于理解高P53水平如何在癌細(xì)胞中可以也被滅活以及腫瘤發(fā)生中誘導(dǎo)腫瘤抑制基因座的異常表觀遺傳沉默有重要的含義。最后，我們對(duì)E4-0RF3的鑒定改變了 p53在腺病毒感染細(xì)胞中是如何被滅活的基本概念，這是一個(gè)重要的機(jī)械洞察，利用它現(xiàn)在可以合理地開發(fā)真正的P 53腫瘤選擇性腺病毒療法。
權(quán)利要求
1.P53復(fù)制受損和E4-0RF3受損的腺病毒。
2.如權(quán)利要求1所述的腺病毒，其中所述腺病毒是分離的。
3.如權(quán)利要求1所述的腺病毒，其中所述腺病毒是重組腺病毒。
4.如權(quán)利要求1所述的腺病毒，包含被突變的E4-0RF3基因。
5.如權(quán)利要求4所述的腺病毒，其中E4-0RF3基因或者其功能部分被缺失。
6.如權(quán)利要求1所述的腺病毒，其中所述E4-0RF3受損的腺病毒也是ElB-55k受損的。
7.如權(quán)利要求6所述的腺病毒，包含被突變的ElB-55k基因。
8.如權(quán)利要求7所述的腺病毒，其中ElB-55k基因或其功能部分被缺失。
9.感染了權(quán)利要求1所述的E4-0RF3受損的腺病毒的細(xì)胞。
10.癌癥治療方法，所述方法包括將有效量的權(quán)利要求1所述腺病毒給予需要的受試對(duì)象。
11.如權(quán)利要求10 所述的方法，其中所述癌癥是p53相關(guān)癌癥。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述癌癥是肺癌、皮膚癌或者乳腺癌。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述要治療的癌癥是惡化前乳腺癌。
全文摘要
本文提供了抗癌腺病毒、其使用方法和制備方法。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103180448SQ201180050032
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者C.奧謝, C.鮑爾斯 申請(qǐng)人:薩克生物研究學(xué)院