專利名稱：針對her2表位的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對人表皮生長因子受體2(HER2)的單克隆抗體，和這類抗體的用途，尤其是它們在治療癌癥中的用途。
背景技術(shù)：
HER2是185-kDa的細胞表面受體酪氨酸激酶，是表皮生長因子受體(EGFR)家族的成員，該家族包括四種不同的受體:EGFR/ErbB-l，HER2/ErbB_2，HER3/ErbB_3和HER4/ErbB-4。EGFR家族的四個成員形成同源和異源二聚體，HER2是對于其他ErbB受體優(yōu)選并且最有效的二聚體伴侶(Graus-Porta 等，Embo J1997 ;16:1647-1655 ;Tao 等，J Cell Sci2008 ；121:3207-3217)。可以通過過表達或者通過與可以被配體結(jié)合而活化的其他ErbBs的異源二聚化而活化 HER2 (Riese 和 Stern, Bioessaysl998 ；20:41-48)。對于 HER2,沒有鑒別到任何配體。HER2活化導(dǎo)致受體磷酸化，這通過多種信號通路如MAPK、磷酸肌醇3-激酶/AKT、JAK/STAT和PKC觸發(fā)下游信號的級聯(lián)，這最終導(dǎo)致多種細胞功能如生長、生存和分化的調(diào)控(Huang 等，Expert Opin Biol Ther2009 ；9:97-110)。對HER2在腫瘤中的很多注意力集中在其在乳腺癌中的作用，其中報道了 HER2在約20%的病例中過表達并且HER2過表達與預(yù)后較差相關(guān)(Reese等，Stem Cellsl997 ；15: 1-8 ；Andrechek 等，Proc Natl Acad Sci U S A2000 ；97:3444-3449 ；和 Slamon等，Sciencel987 ;235:177-182)。除了乳腺癌，HER2表達還與其他人腫瘤類型，包括前列腺癌，非小細胞肺癌，膀胱癌，卵巢癌，胃癌，結(jié)腸癌，食管癌和頭部和頸部的鱗狀細胞癌相關(guān)(Garcia de Palazzo 等，Int J Biol Markers 1993 ；8:233-239 ；Ross 等，0ncologist2003 ；8:307-325 ；Osman 等，J Urol2005 ；174:2174-2177 ；Kapitanovic 等，Gastroentero1gy 1997 ；112:1103-1113 ；Turken 等，Neoplasma2003 ；50:257-261 ；和Oshima 等，Int J Biol M arkers200I；16:250-254)。曲妥珠單抗(Hcrccptin )是重組的人源化的單克隆抗體,其針對HER2蛋白的結(jié)
構(gòu)域IV，從而在高HER2過表達的細胞中阻斷配體非依賴性HER2同源二聚化，導(dǎo)致在更小的程度上HER2與其他家族成員的異源二聚化(Cho等，Nature2003 ；421 =756-760和Wehrman等，Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103:19063-19068)。在具有適度 HER2 表達水平的細胞中，發(fā)現(xiàn)曲妥珠單抗(trastuzumab)抑制HER2/EGFR異源二聚體的形成(Wehrman等，(2006)，同上；Schmitz 等.，Exp Cell Res2009 ；315:659-670)。曲妥珠單抗介導(dǎo)抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)并防止胞外結(jié)構(gòu)域脫落，否則胞外結(jié)構(gòu)域脫落可以導(dǎo)致HER2過表達細胞中截短的組成型活性的蛋白的形成。對于曲妥珠單抗也已經(jīng)報道了表達高水平的HER2的腫瘤細胞的體外和體內(nèi)增殖的抑制(Nahta和Esteva的綜述，0ncogene2007 ；26:
3637-3643)。已經(jīng)批準了Herceptin 用于HER2過表達的轉(zhuǎn)移性乳腺癌第一線和輔助治
療，或與化療相結(jié)合，或作為遵循一個或多個化療方案的單一藥物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)曲妥珠單抗僅在20-50%的HER2過表達的乳腺癌腫瘤患者中是有效的，許多初始應(yīng)答者在幾個月后表現(xiàn)復(fù)發(fā)(Dinh 等，Clin Adv Hematol 0ncol2007 ；5:707-717)。帕妥珠單抗(Omnitarg )是另一種針對HER2蛋白的結(jié)構(gòu)域II的單克隆抗體,導(dǎo)致配體誘導(dǎo)的異源二聚化(即，HER2與配體已經(jīng)結(jié)合的ErbB家族的另一個成員的二聚化)的抑制；據(jù)報道不嚴格地要求高HER2表達水平的機制(Franklin等.，Cancer Cell2004 ；5:317-328.)。盡管帕妥珠單抗也介導(dǎo)ADCC，帕妥珠單抗的作用的主要機制依賴于其二聚化阻斷(Hughes等，Mol Cancer Ther2009 ；8:1885-1892)。此外，發(fā)現(xiàn)帕妥珠單抗增強EGFR內(nèi)化并通過抑制EGFR/HER2異源二聚體的形成而增強下調(diào)，否則使EGFR拴系(tether)于質(zhì)膜(Hughes等，2009，同上)。這與EGFR 二聚體比EGFR/HER2 二聚體更有效地內(nèi)化這一觀察結(jié)果相關(guān)(Pedersen等，Mol Cancer Res2009 ;7:275_284。據(jù)報道，當在以前的曲妥珠單抗治療期間進展的患者中組合時，帕妥珠單抗和曲妥珠單抗的作用的互補機制導(dǎo)致增強的抗腫瘤效果和有效性(Baselga等，J Clin 0ncol2010 ;28:1138-1144)，評價在以前未治療的HER2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌中這種抗體與多西他賽(Docetaxel)共同組合的III期試驗正在進行中。
改進靶向抗體治療的另一種方法是通過將細胞毒性細胞或藥物特異性遞送至表達抗原的癌細胞。例如，所謂的三功能性抗體是雙特異性抗體，具有一個靶向腫瘤細胞上的抗原的臂以及另一個靶向T細胞上的抗原例如CD3的臂。結(jié)合后，形成結(jié)合Fe的T細胞、腫瘤細胞和效應(yīng)物細胞的復(fù)合物，導(dǎo)致殺死腫瘤細胞(Muller和Kontermann,BioDrugs2010 ；24:89-98)。Ertumaxomab就是這種針對HER2的三功能性抗體，其在低HER2表達的細胞系中誘導(dǎo)細胞毒性，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的II期臨床開發(fā)中(Jones等，Lancet 0ncol2009 ；10:1179-1187 和 Kiewe 等，Clin Cancer Res2006 ；12:3085-3091)。HER2抗體藥物綴合物(ADC)目前在臨床開發(fā)中。T-DM1由與真菌毒素maytansine綴合的曲妥珠單抗組成。(Krop等，2011，J Clin 0ncol2010 (在印刷前提前在線出版)和Lewis Phillips 等，Cancer Res2008 ；68:9280-9290)報道了在 II 期試驗中，嚴重預(yù)處理患者組群(包括以前的曲妥珠單抗和/或拉帕替尼(Iapatinib)治療)中的應(yīng)答。III期試驗正在進行中，其中評價T-DMl比卡培他濱+拉帕替尼在以前接受曲妥珠單抗治療的HER2-陽性的局部晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者中的療效和安全性。盡管許多因素參與選擇用于HER2靶向治療的合適的抗體，如果HER2-抗體復(fù)合物在抗體結(jié)合后有效地內(nèi)化，這對于ADC方法通常是一種優(yōu)勢。對于小鼠HER2抗體的研究顯示，抗體的某些組合促進HER2內(nèi)吞作用(Ben-Kasus等，PNAS2009 ；106:3294-9)。已經(jīng)報道人HER2抗體F5和Cl相對于它們自身迅速地內(nèi)化并結(jié)合相同的表位(W0 99/55367和WO2006/116107)。然而，與EGFR相比，HER2的內(nèi)化受損。事實上，EGFR同源二聚體的內(nèi)化效率遠遠高于 HER2 同源二聚體(Dinh 等，Clin Adv Hematol 0ncol2007 ；5:707-717)。EGFR,也還有HER3，可以分別通過形成EGFR/HER2和HER3/HER2異源二聚體而增加HER2的內(nèi)吞作用(Baulida等，J Biol Cheml996 ；271:5251-5257 ；Pedersen NM，等，Mol Cancer Res2009 ；7:275-84)。調(diào)節(jié)HER2的功能的復(fù)雜機制需要進一步研究針對這種原癌基因的新的并且優(yōu)化的治療策略。因此，對于治療HER2相關(guān)的疾病如癌癥，仍然需要有效和安全的產(chǎn)品。發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供用于醫(yī)療用途的新的高度特異的、有效的單克隆HER2抗體。本發(fā)明的抗體顯示與本領(lǐng)域中已有描述的抗體不同的HER2結(jié)合特性。具體而言，本發(fā)明的抗體結(jié)合HER2的不同區(qū)段，因為它們彼此阻斷與HER2的結(jié)合，但不阻斷曲妥珠單抗、帕妥珠單抗或F5/C1與HER2的結(jié)合。此外，與已知抗體相反，本發(fā)明的抗體可以在不促進細胞增殖的情況下有效地內(nèi)化進表達HER2的細胞。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體是完全人的，結(jié)合新的表位，和/或?qū)τ谌嘶颊咧械闹委熡猛揪哂衅渌欣奶匦浴Ｊ纠缘奶匦园ǖ幌抻?，與以高或低水平表達人HER2的癌細胞的有利的結(jié)合特性，特異性結(jié)合表達HER2直接同源物的獼猴上皮細胞，結(jié)合HER2后有效內(nèi)化，當作為抗體藥物綴合物(ADC)施用時殺死表達高或低水平HER2的癌細胞的高能力，對表達HER2的癌細胞的增殖沒有顯著的激動效果并提供表達HER2的細胞的有效的ADCC-介導(dǎo)的殺死，以及上述特性的任何組合。下面進一步詳細描述了本發(fā)明的這些和其他方面。附圖簡要說明

圖1:HuMab重鏈可變區(qū)(VH)序列與種系(參照)序列的比對(A-D)。在每個VH序列中，在特定位置與種系(參照)的那些氨基酸不同的氨基酸突出顯示。顯示共有VH序列，其中“X”表示可能有其他氨基酸(選自在指明位置比對的那些氨基酸)的位置。在每個VH序列中，⑶R1、⑶R2和⑶R3序列用下劃線表示。在表4中進一步定義了共有⑶R序列。圖2 =HuMab輕鏈可變區(qū)(VL)序列與種系(參照)序列的比對(A-B)。在每個VL序列中，在特定位置與種系(參照)的那些氨基酸不同的氨基酸突出顯示。在圖2A中，所有VL序列源自相同的V-區(qū)段(IgKV3-20-01)，但抗體間最接近的J-區(qū)段不同。顯示共有VL序列，其中“X”表示可能有其他氨基酸(選自在指明位置比對的那些氨基酸)的位置。在每個VL序列中，⑶R1XDR2和⑶R3序列用下劃線表示。在表4中進一步定義了共有⑶R序列。圖3:如實施例12中所述測定的，HER2抗體與(A)高(AU565)和(B)低(A431)表達HER2的細胞系的結(jié)合曲線。顯示數(shù)據(jù)是每種細胞系的一次代表性實驗的平均熒光強度(MFI)。EC5tl值表示表觀親和力。圖4:HER2抗體與上皮細胞上表達的HER2的結(jié)合。顯示數(shù)據(jù)是實施例13中所述的一次代表性實驗的平均熒光強度(MFI)。圖5:HER2抗體的鉻-釋放(ADCC)測定，顯示在與HER2抗體孵育后51Cr-標記的SK-BR-3細胞的PBMC-介導(dǎo)的裂解。顯示的值是來自用SK-BR-3細胞的一次代表性的體外ADCC實驗的平均最高百分比51Cr-釋放土標準偏差。詳細信息見實施例15。圖6:與未處理的細胞(設(shè)置為100% )相比，HER2抗體對AU565細胞的增殖的影響。顯示數(shù)據(jù)是在三次獨立的實驗中測定的與未處理的細胞相比的AU565細胞的百分比增殖土標準偏差。詳細信息見實施例16。圖7 =ADC測定， 顯示通過抗- K -ETA'-綴合的HER2抗體的AU565細胞(A)或A431細胞⑶的殺死。㈧顯示數(shù)據(jù)是使用以未綴合的和抗-K -ETA'-綴合的HER2抗體處理的AU565細胞的一次代表性實驗的平均熒光強度(MFI)。(B)顯示數(shù)據(jù)是使用以未綴合的和抗-K -ETA1-綴合的HER2抗體處理的A431細胞的一次代表性實驗的平均熒光強度(MFI)。詳細信息見實施例17。圖8:HER2的抗體誘導(dǎo)的下調(diào)。用10 μ g/mL mAb孵育3天后AU565細胞裂解物中表達的HER2的相對百分比。用HER2特異性捕獲ELISA定量HER2的量并表示為相對于未處理的細胞的百分比。顯示數(shù)據(jù)是三次實驗的平均值土標準偏差。詳細信息見實施例19。圖9:HER2抗體(FITC)與溶酶體標記LAMPl (Cy5)的共定位分析，顯示對于各種單特異性HER2抗體的與Cy5重疊的FITC像素強度。對于每種抗體繪制三個不同的圖像的LAMP I/Cy 5陽性像素的FITC像素強度?？贵w005表現(xiàn)出與抗體Herceptin和帕妥珠單抗相比LAMP1/Cy5陽性區(qū)域中更高的FITC像素強度。詳細信息見實施例20。圖10:借助流式細胞儀分析的HER2抗體與用不同的HER2E⑶構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的CHO-S細胞的結(jié)合。HU-HER2 =完全人HER2，Hu-HER2_ch (I) CRl =具有雞結(jié)構(gòu)域I的hu_HER2，Hu-HER2-ch(II)=具有雞結(jié)構(gòu)域 II 的 hu_HER2，hu-HER2_ch(III)=具有雞結(jié)構(gòu)域 III 的hu-HER2和Hu-HER2-ch (IV)=具有雞結(jié)構(gòu)域IV的hu_HER2。顯示數(shù)據(jù)是一種代表性抗體106的平均熒光強度(MFI)。詳細信息見實施例21。圖11:在雌性CB.17重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中NC1-N87人胃癌異種移植物模型中HER2-HuMab005的體內(nèi)效果。顯示數(shù)據(jù)是每組(n = 10只小鼠/組)的平均腫瘤大小土S.E.M.(A)和生存(B)。詳細信息見實施例22。發(fā)明的詳細說明定義當本文中使用時，術(shù)語“HER2” (也被稱為ErbB_2，NEU，HER-2和CD340)是指人表皮生長因子受體2 (SwissProt P04626)，包括細胞(包括腫瘤細胞)天然表達的或用HER2基因轉(zhuǎn)染的細胞上表達的HER2的任何變體、同種型和物種同源物。物種同源物包括獼猴HER2(獼猴；GenBank 登錄號 G1:109114897)。術(shù)語“免疫球蛋白”是指一類結(jié)構(gòu)上相關(guān)的糖蛋白，由兩對多肽鏈(一對輕(L)低分子量鏈和一對重(H)鏈)組成，所有四條鏈通過二硫鍵內(nèi)部連接。免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到充分表征。見例如 Fundamental Immunology 第 7 章(Paul, ff.，ed., 2nd ed.RavenPress, N.Y.(1989))。簡而言之，每條重鏈典型地由重鏈可變區(qū)(本文縮寫為Vh或VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)典型地由三個結(jié)構(gòu)域(CH1，(^和^^)組成。每條輕鏈典型地由輕鏈可變區(qū)(這里縮寫為'或VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)典型地由一個結(jié)構(gòu)域Q構(gòu)成。Vh和'區(qū)可以進一步再分成超可變性區(qū)(或超變區(qū)，其在結(jié)構(gòu)限定環(huán)的序列和/或形式中具有高度可變性)，也稱作互補決定區(qū)(CDRs)，它們之間散布著更保守的、稱作框架區(qū)(FRs)的區(qū)域。每個Vh和八典型地由3個CDR和4個FR組成，從氨基末端向羧基末端以下列順序排列:FR1, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (另見Chothia和Lesk T.Mol.Biol.196,901-917 (1987)) 0除非上下文另外指明或與之矛盾，根據(jù)MGT規(guī)則鑒別本文的 CDR 序列(Brochet X.，Nucl Acids Res.2008 ；36:W503-508 和 LefrancMP., Nucleic Acids Research 1999 ；27:209-212 ;也參見因特網(wǎng) http 地址 imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest Iivret = 0&0ption = humanlg。然而，也可以通過 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)中所述的方法進行抗體序列中氨基酸殘基的編號(本文中短語如“如Kabat中可變結(jié)構(gòu)域殘基編號”，“Kabat位置”或“根據(jù)Kabat”是指這種編號系統(tǒng))。具體而言，對于恒定區(qū)中氨基酸的編號，可以使用根據(jù)同上的Kabat等的EU索引編號系統(tǒng)。對于給定抗體，可以通過在該抗體序列與“標準”Kabat編號序列的同源區(qū)的 比對而確定殘基的Kabat編號。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“抗體”(Ab)是指免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子的片段，或其二者中任一種的衍生物，其在典型的生理條件下具有與抗原特異性結(jié)合的能力，具有顯著時間期間的半衰期，如至少約30分鐘，至少約45分鐘，至少約I小時，至少約2小時，至少約4小時，至少約8小時，至少約12小時，約24小時或者更長，約48小時或者更長，約3、4、5、6、7或更多天等，或者任何其他相關(guān)的功能上定義的期間(如足夠誘發(fā)、促進、提高和/或調(diào)節(jié)和抗體與抗原的結(jié)合關(guān)聯(lián)的生理應(yīng)答的時間，和/或足以供抗體招募效應(yīng)物活性的時間)。免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。抗體(Abs)的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如效應(yīng)細胞)和補體系統(tǒng)的組分，如補體活化經(jīng)典途徑中的第一組分Clq。HER2抗體也可以是雙特異性抗體、雙抗體(diabody)或類似分子(雙抗體的描述見例如PNASUSA90 (14), 64448(1993)).事實上，本發(fā)明提供的雙特異性抗體、雙抗體等除了結(jié)合HER2的一部分以外，還可以結(jié)合任何合適的目標。如前所述，除非上下文另外指明或與之明顯矛盾，本文的術(shù)語抗體包括抗體的片段，該抗體片段是抗原結(jié)合片段，即保持與抗原特異性結(jié)合能力。已經(jīng)顯示，可以由全長抗體的片段行使抗體的抗原結(jié)合功能。術(shù)語“抗體”中涵蓋的抗原結(jié)合片段的例子包括(i)Fab’或Fab片段，由\，VH, Cl和ChI結(jié)構(gòu)域組成的單價片段，或者如W02007059782 (Genmab)中描述的單價抗體；(ii) F (ab' )2片段，包含通過在鉸鏈區(qū)中的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)基本上由Vh和ChI結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)基本上由抗體的單一臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(V) dAb片段(Ward等，Nature341, 544-546 (1989)),其基本上由Vh結(jié)構(gòu)域組成，也稱作結(jié)構(gòu)域抗體(Holt等；Trends Biotechnol.2003Nov:21 (11):484-90) ； (vi)胳馬它抗體(came I id)或納米抗體(nanobodies) (Revets 等；Expert Opin Biol Ther.2005Jan ；5(1):111-24),和(vii)分離的互補決定區(qū)(CDR)。而且，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域'和Vh是由分別的基因編碼，但是可以通過合成的接頭用 重組方法將它們連接起來，該合成的接頭能夠使它們作為單一蛋白鏈制造出來，其中\(zhòng)和Vh區(qū)配對形成單價分子(被稱為單鏈抗體或單鏈Fv (scFv)，見例如 Bird 等.，Science242,423-426 (1988)和 Huston 等.，PNAS USA85,5879-5883(1988))。除非上下文另外指出或明顯指明，這種單鏈抗體涵蓋在術(shù)語抗體中。盡管這種片段通常包括在抗體的意義內(nèi)，它們共同地并且各自獨立地是本發(fā)明的獨特特征，顯示不同的生物學(xué)特性和效用。本文進一步討論了在本發(fā)明的上下文中的這些和其他有用的抗體片段以及這種片段的雙特異性形式。還應(yīng)當理解的是，除非另外指出，術(shù)語抗體還包括通過任何已知的技術(shù)如酶切割(enzymatic cleavage)、肽合成和重組技術(shù)提供的多克隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、抗體樣多肽，如嵌合抗體和人源化抗體，以及保留與抗原特異性結(jié)合能力的抗體片段(抗原結(jié)合片段)。產(chǎn)生的抗體可以具有任何同種型。如本文所使用的，“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的免疫球蛋白類型(例如IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgD, IgA, IgE，或 IgM)。術(shù)語“單價抗體”在本發(fā)明的上下文中意味著抗體分子能夠結(jié)合單個抗原分子，因此不能夠抗原交聯(lián)?！靶?yīng)物功能缺陷的抗體”或“效應(yīng)物功能缺陷抗體”是指如下抗體，其具有顯著降低的活化一種或多種效應(yīng)物機制(如補體活化或Fe受體結(jié)合)的能力或者沒有該能力。因此，效應(yīng)物功能缺陷抗體具有顯著降低的介導(dǎo)抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴的細胞毒性(CDC)的能力或者沒有該能力。這種抗體的一個例子是IgG4。“HER2抗體”或“抗-HER2抗體”是如上所述的抗體，其與抗原HER2特異性結(jié)合。如本文所使用的，術(shù)語“人抗體”意圖包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機或定點誘變或通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變)。然而，如本文所使用的，術(shù)語“人抗體”并不意圖包括如下抗體，其中源自另一種哺乳動物物種(如小鼠)種系的CDR序列被接枝到人框架序列上。如本文所使用的，如果抗體是從使用人免疫球蛋白序列的系統(tǒng)獲得的(例如通過免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或者通過篩選人免疫球蛋白基因文庫)，并且其中選擇的人抗體在氨基酸序列與由該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列具有至少90 %，如至少95 %，例如至少96 %，如至少97 %，例如至少98 %，或者如至少99 %相同，則人抗體“源自”特定的種系序列。典型地，除了重鏈CDR3，源自特定人種系序列的人抗體與由該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列相比，顯示不超過20個氨基酸的差異，例如不超過10個氨基酸的差異，例如不超過9、8、7、6或5個，例如不超過4、3、2或I個氨基酸的差
巳在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體是分離的。如本文所使用的，“分離的抗體”意圖是指如下抗體， 其基本上不含其他具有不同抗原特異性的抗體(例如，特異性結(jié)合HER2的分離抗體基本上不含特異性結(jié)合除HER2以外的抗原的抗體)。然而，特異性結(jié)合HER2的表位、同種型或變體的分離的抗體可以與其他相關(guān)抗原，例如來自其他物種的抗原(例如HER2種間同源物)具有交叉反應(yīng)性。而且，分離的抗體可以基本上不含其他細胞材料和/或化學(xué)劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，兩種或多種具有不同抗原結(jié)合特異性的“分離的”單克隆抗體被組合在良好定義的組合物中。當本文中在兩種或更多種抗體的上下文中使用時，術(shù)語“與...競爭”或“與...交叉競爭”表明，兩種或更多種抗體競爭結(jié)合HER2，例如在實施例14中所述的測定中競爭結(jié)合HER2。如果抗體競爭一種或多種其他抗體25%或更高時，抗體“阻斷”或“交叉阻斷”一種或多種其他抗體結(jié)合HER2，25% -74%代表“部分阻斷”，75% -100%代表“完全阻斷”，優(yōu)選使用實施例14的測定來確定。對于一些抗體對，實施例的測定中的競爭或阻斷只有在將一種抗體包被在平板上，而用另一種進行競爭時才能觀察到，但反之則不行。除非上下文另外定義或否定，當在本文中使用時，術(shù)語“與...競爭”，“與...交叉競爭”，“阻斷”或“交叉阻斷”還意圖涵蓋這種抗體對。術(shù)語“表位”是指能夠特異性結(jié)合抗體的蛋白決定簇。表位通常由分子的表面基團如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特定的帶電特征。構(gòu)象表位和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于，在變性劑存在的情況下，與前者的結(jié)合消失，而與后者的結(jié)合不消失。表位可以包括直接參與結(jié)合的氨基酸殘基(也稱作表位的免疫顯性組分(immunodominant component)),和其他不直接參與結(jié)合的氨基酸殘基,如可以被特異性抗原結(jié)合肽有效阻斷的氨基酸殘基(換言之，這些氨基酸殘基位于特異抗原結(jié)合肽的足跡(footprint)內(nèi))。如本文所使用的，術(shù)語“單克隆抗體”是指具有單一分子組成的抗體分子的制備物。單克隆抗體組合物顯示對特定表位的單一的結(jié)合特異性和親和力。因此，術(shù)語“人單克隆抗體”是指顯示單一結(jié)合特異性的抗體，其具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。人單克隆抗體可以通過雜交瘤產(chǎn)生，雜交瘤包括與永生化細胞融合的、從轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體非人類動物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)獲得的B細胞，該動物具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。如本文所使用的，在抗體與預(yù)定抗原的結(jié)合的上下文中，術(shù)語“結(jié)合”典型地是其以對應(yīng)于約10_7M或者更小，如約10_8M或者更小，如約10_9M或者更小，約ΙΟ,Μ或者更小，或者約10_ηΜ或者甚至更小的Kd的親和力結(jié)合(當通過例如在BIACore3000設(shè)備中用抗原作為配體、以抗體作為分析物通過表面等離子體共振(SPR)技術(shù)進行測定時)，并且與除預(yù)定抗原或密切相關(guān)的抗原之外的非特異性抗原(例如BSA或酪蛋白)結(jié)合的其親和力相t匕，其與預(yù)定抗原結(jié)合的親和力對應(yīng)的Kd低至少10倍，如至少低100倍，例如至少低1，000倍，如至少低10，000 倍，例如至少低100，000倍。親和力低出的量取決于抗體的KD，因此當抗體的Kd非常低時(即抗體是高度特異性的)，對抗原的親和力低于對非特異性抗原的親和力的量可以是至少10，000倍。如本文所使用的，術(shù)語“kd” (sec-1)是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率常數(shù)。所述值也稱作I^ff值。如本文所使用的，術(shù)語“k/’W X sec-1)是指特定抗體_抗原相互作用的結(jié)合速率常數(shù)。如本文所使用的，術(shù)語“KD” (M)是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)。如本文所使用的，術(shù)語“KA” (Μ-1)是指特定抗體-抗原相互作用的結(jié)合平衡常數(shù)，并且通過ka除以kd獲得。如本文所使用的，術(shù)語“抑制增殖”(例如涉及細胞，如腫瘤細胞)意圖包括當與HER2抗體接觸時，和不與HER2抗體接觸的相同細胞的增殖相比，細胞增殖的任何明顯的降低，例如，抑制細胞培養(yǎng)物增殖至少約10%，至少約20%或至少約30%，或至少與參照抗體如曲妥珠單抗一樣，例如，通過實施例中的測定所確定的。如本文所使用的，術(shù)語“促進增殖”(例如涉及細胞，如腫瘤細胞)意圖包括當與HER2抗體接觸時，和不與HER2抗體接觸的相同細胞的增殖相比，細胞增殖的任何明顯的增力口，例如，促進細胞培養(yǎng)物增殖至少約10%，至少約20%或至少約30%，或至少與參照抗體如F5 —樣，例如，通過實施例中的測定所確定的。如本文所使用的，當本文中在HER2抗體的上下文中使用時，“內(nèi)化”包括其中所述抗體從細胞表面和/或從周圍培養(yǎng)基內(nèi)化進表達HER-2的細胞的任何機制，例如，通過內(nèi)吞作用?？梢允褂脺y量內(nèi)化抗體的量的直接測定(如，例如，實施例18中所述的fab-CypHer5E測定)或其中測定內(nèi)化的抗體-毒素綴合物的作用的間接測定(如，例如，實施例17的抗-K -ETA,測定)評價抗體的內(nèi)化。本發(fā)明還提供了包括實施例抗體的 '區(qū)、Vh區(qū)、或一個或多個⑶R的功能變體的抗體。在HER2抗體的上下文中使用的\、\或CDR的功能變體仍然允許該抗體保留母體抗體(parent antibody)的親和力(affinity)/親合力(avidity)和/或特異性/選擇性的至少相當部分(至少約50 %，60%，70%，80%，90%，95%或更多)，在一些情況下，與母體抗體相比，這種HER2抗體可以與更大的親和力、選擇性和/或特異性相關(guān)。這些功能變體典型地保留與母體抗體的顯著的序列同一性。兩條序列之間的百分比同一性是序列所共享的相同位置的數(shù)量的函數(shù)(即，％同源性=相同位置數(shù)/位置的總數(shù)X 100)，同時考慮缺口的數(shù)量和每個缺口的長度，需要引入缺口是為了在兩條序列間進行最佳比對?？梢酝ㄟ^ E.Meyers 和 W.Miller, Comput.Appl.Biosci4,11-17 (1988)的算法(其已經(jīng)被引入到ALIGN程序(2.0版)中)，使用PAM120加權(quán)殘基表、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分確定兩條核苷酸或氨基酸序列之間的百分比同一性。此外，可以使用Needleman和Wunsch, J.Mol.Biol.48,444-453 (1970)算法確定兩個氛基酸序列之間的百分比同一'I"生。示例性的變體包括在一個或更多個“變體”氨基酸位置(在對應(yīng)的共有序列表示為“X”)與圖1和2所示的母體抗體VH和/或VL序列不同的那些。優(yōu)選的變體是其中的新的氨基酸選自在圖1或2中比對序列之一的對應(yīng)位置的那些氨基酸(關(guān)于CDR序列變體的詳細信息，見表4)。另外地或額外地，VH，VL或CDR變體的序列可以主要通過保守的取代而與母體抗體序列的VH，VL或⑶R序列不同；例如變體中的至少10個，如至少9、8、7、6、5、4、3、2或I個取代是保守的氨基酸殘基替換。在本發(fā)明的上下文中，可以通過下列表格中反映的氨基酸類型內(nèi)的取代定義保守取代。對于保守取代的氨基酸殘基類型
權(quán)利要求
1.單克隆抗體，任選地當如實施例14中所述測定時，所述單克隆抗體阻斷參照抗體與可溶性人表皮生長因子受體2 (HER2)的結(jié)合，其中所述參照抗體包含選自如下的重鏈可變(VH)區(qū)和輕鏈可變(VL)區(qū): a)包含序列SEQID NO:1的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:5的VL區(qū)(005)； b)包含序列SEQID NO:8的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:12的VL區(qū)(006)； c)包含序列SEQID NO:15的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:19的VL區(qū)(059)； d)包含序列SEQID NO:22的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:26的VL區(qū)(060)； e)包含序列SEQID NO:29的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:33的VL區(qū)(106);和 f)包含序列SEQID NO:36的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:40的VL區(qū)(111)。
2.權(quán)利要求1的抗體，所述抗體阻斷(a)至(f)中的至少兩種，優(yōu)選至少3種參照抗體的結(jié)合。
3.權(quán)利要求1的抗體，所述抗體阻斷(a)至(f)中的參照抗體的結(jié)合。
4.權(quán)利要求1的抗體，所述抗體阻斷(a)中的參照抗體、(f)中的參照抗體或兩者的結(jié)口 o
5.權(quán)利要求1-4中任一項的抗體，其中所述參照抗體是固定化的。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的抗體，所述抗體完全阻斷所述參照抗體的結(jié)合。
7.前述任一權(quán)利要求的抗體，所述抗體與包含選自如下的VH和VL區(qū)的參照抗體結(jié)合HER2上相同的表位: a)包含序列SEQID NO:1的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:5的VL區(qū)(005)； b)包含序列SEQID NO:8的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:12的VL區(qū)(006)； c)包含序列SEQID NO:15的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:19的VL區(qū)(059)； d)包含序列SEQID NO:22的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:26的VL區(qū)(060)； e)包含序列SEQID NO:29的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:33的VL區(qū)(106)； f)包含序列SEQID NO:36的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:40的VL區(qū)(111)； g)包含序列SEQID NO:43的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:44的VL區(qū)(041)； h)包含序列SEQID NO:45的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:46的VL區(qū)(150)； i)包含序列SEQID NO:47的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:48的VL區(qū)(067)； j)包含序列SEQ ID NO:49的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:50的VL區(qū)(072)； k)包含序列SEQ ID NO:51的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:52的VL區(qū)(163)；I)包含序列SEQ ID NO:53的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:54的VL區(qū)(093);和 m)包含序列SEQ ID NO:55的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:56的VL區(qū)(044)。
8.權(quán)利要求7的抗體，所述抗體與(a)或(f)中的參照抗體結(jié)合HER2上相同的表位。
9.前述任一權(quán)利要求的抗體，所述抗體包含VH區(qū)，所述VH區(qū)包含選自如下的⑶R3序列 a)SEQ ID NO:59，如選自 SEQ ID No:4、25 和 32 (005、060、106)的序列；b)SEQID NO:62，如 SEQ ID NO:11(006)；c)SEQID NO:65，如 SEQ ID NO:18(059);和d)SEQ ID NO:67 JBSEQ ID NO:39(111)。
10.抗體，所述抗體包含VH區(qū)，所述VH區(qū)包含選自如下的CDR3序列a)SEQ ID N0:59，如選自 SEQ ID No:4、25 和 32 (005、060、106)的序列；b)SEQID NO:62，如 SEQ ID NO:11(006)； c)SEQID NO:65，如 SEQ ID NO:18(059);和d)SEQ ID NO:67，如 SEQ ID NO:39(111)。
11.權(quán)利要求9或10的抗體，所述抗體包含VH區(qū)，所述VH區(qū)包含選自如下的⑶RUCDR2、CDR3 序列:a)分別地，SEQID NO:57、58和59，其中所述VH區(qū)任選地源自IgHV5_51_l種系；b)分別地，SEQID NO:60,61和62，其中所述VH區(qū)任選地源自IgHV3_23_l種系； c)分別地，SEQID NO:63,64和65，其中所述VH區(qū)任選地源自IgHVl-18-l種系；和d)分別地，SEQID NO:66,38和67，其中所述VH區(qū)任選地源自IgHV1-69-4種系。
12.權(quán)利要求11的抗體，所述抗體包含VH區(qū)，所述VH區(qū)包含選自如下的⑶R1、⑶R2、CBR3序列: a)分別地，SEQID NO:2、3 和 4(005)； b)分別地，SEQID NO:23,24 和 25(060)； c)分別地，SEQID NO:30,31 和 32(106)； d)分別地，SEQID NO:9,10 和 11(006)； e)分別地，SEQID NO:16、17 和 18(059);和 f)分別地，SEQID NO:37,38 和 39(111)。
13.權(quán)利要求12的抗體，所述抗體包含選自如下的VH區(qū)和VL區(qū): a)包含分別地SEQID NO:2、3和4的CDR1、CDR2和CDR3序列的VH區(qū)；以及包含分別地 SEQ ID NO:6、GAS 和 SEQ ID NO:7 的 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列的 VL 區(qū)(005)； b)包含分別地SEQID NO:9,10和11的CDR1、CDR2和CDR3序列的VH區(qū)；以及包含分別地 SEQ ID NO:13、DAS 和 SEQ ID NO:14 的 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列的 VL 區(qū)(006)； c)包含分別地SEQID NO:16,17和18的CDRl、CDR2和CDR3序列的VH區(qū)；以及包含分別地 SEQ ID NO:20, GAS 和 SEQ ID NO:21 的 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列的 VL 區(qū)(059)； d)包含分別地SEQID NO:23,24和25的CDRU CDR2和CDR3序列的VH區(qū)；以及包含分別地 SEQ ID NO:27, GAS 和 SEQ ID NO:28 的 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列的 VL 區(qū)(060)； e)包含分別地SEQID NO:30、31和32的CDRU CDR2和CDR3序列的VH區(qū)；以及包含分別地 SEQ ID NO:34,GAS 和 SEQ ID NO:35 的 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列的 VL 區(qū)(106);和 f)包含分別地SEQID NO:37,38和39的CDRU CDR2和CDR3序列的VH區(qū)；以及包含分別地 SEQ ID NO:4U GAS 和 SEQ ID NO:42 的 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列的 VL 區(qū)(111)。
14.前述任一權(quán)利要求的抗體，所述抗體包含選自如下的VH區(qū)和VL區(qū)a)包含序列SEQID NO:1的VH區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列SEQ ID NO:5的VL區(qū)(005)；b)包含序列SEQID NO:8的VH區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列SEQ ID NO:11的VL區(qū)(006)；c)包含序列SEQID NO: 15的VH區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列SEQ ID NO: 19的VL區(qū)(059)；d)包含序列SEQID NO:22的VH區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列SEQ ID NO:26的VL區(qū)(060)；e)包含序列SEQID NO:29的VH區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列SEQ ID NO:33的VL區(qū)(106)；f)包含序列SEQID NO:36的VH區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列SEQ ID NO:40的VL區(qū)(111)；g)包含序列SEQID NO:43的VH區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列SEQ ID NO:44的VL區(qū)(041)h)包含序列SEQID NO:45的VH區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列SEQ ID NO:46的VL區(qū)(150)， i)包含序列SEQID NO:47的VH區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列SEQ ID NO:48的VL區(qū)(067)， j)包含序列SEQ ID NO:49的VH區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列SEQ ID NO:50的VL區(qū)(072)， k)包含序列SEQ ID NO:51的VH區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列SEQ ID NO:52的VL區(qū)(163)， I)包含序列SEQ ID NO:53的VH區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列SEQ ID NO:54的VL區(qū)(093)， m)包含序列SEQ ID NO:55的VH區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列SEQ ID NO:56的VL區(qū)(044)，和 η)所述抗體中任一種的變體，其中所述變體優(yōu)選地具有最多1、2或3個氨基酸修飾，更優(yōu)選氨基酸取代，如保守的氨基酸取代，以及其中新的氨基酸是在圖1或2中比對的序列的相同位置處，尤其是在對應(yīng)的共有序列中通過“X”表示的位置處的氨基酸的取代。
15.人抗體，當如實施例14中所述測定時，所述抗體不阻斷參照抗體與可溶性HER2的結(jié)合，其中參照抗體包含曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、Fl和C5中任一種的VH和VL序列。
16.前述任一權(quán)利要求的抗體，當如實施例12中所述測定時,所述抗體對于結(jié)合表達HER2的細胞具有低于0.80 μ g/ml，優(yōu)選低于0.50 μ g/ml的EC5tl值，優(yōu)選地，所述抗體阻斷參照抗體與可溶性HER2的結(jié)合，所述參照抗體包含選自如下的VH和VL區(qū) a)包含序列SEQID NO:1的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:5的VL區(qū)(005)； b)包含序列SEQID NO:8的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO: 11的VL區(qū)(006);和 c)包含序列SEQID NO:15的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:19的VL區(qū)(059)。
17.前述任一權(quán)利要求的抗體，當如實施例13中所述測定時,所述抗體特異性結(jié)合HER2陽性的獼猴上皮細胞，優(yōu)選地`，所述抗體阻斷參照抗體與可溶性HER2的結(jié)合，所述參照抗體包含選自如下的VH和VL區(qū): a)包含序列SEQID NO:1的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:5的VL區(qū)(005)； b)包含序列SEQID NO:8的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:11的VL區(qū)(006)； c)包含序列SEQID NO:15的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:19的VL區(qū)(059)； d)包含序列SEQID NO:22的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:26的VL區(qū)(060)； e)包含序列SEQID NO:29的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:33的VL區(qū)(106);和 f)包含序列SEQID NO:36的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:40的VL區(qū)(111)。
18.前述任一權(quán)利要求的抗體，當如實施例16中所述測定時,所述抗體特異性結(jié)合表達HER2的AU565細胞，但是對于細胞的配體-非依賴性增殖的促進要弱于F5，優(yōu)選地，所述抗體阻斷參照抗體與可溶性HER2的結(jié)合，所述參照抗體包含選自如下的VH和VL區(qū): a)包含序列SEQID NO:1的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:5的VL區(qū)(005);和 b)包含序列SEQID NO:22的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:26的VL區(qū)(060)。
19.前述任一權(quán)利要求的抗體，其中，當如實施例17中所述測定時，當所述抗體綴合于治療部分如假單胞菌-外毒素A的截短形式時，所述抗體殺死至少60%，優(yōu)選至少70%的表達HER2的腫瘤細胞系，優(yōu)選地，所述抗體阻斷參照抗體與可溶性HER2的結(jié)合，所述參照抗體包含選自如下的VH和VL區(qū): a)包含序列SEQID NO:1的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:5的VL區(qū)(005) b)含有包含序列SEQID NO:22的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:26的VL區(qū)的抗體(060)c)包含序列SEQID NO:15的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:19的VL區(qū)(059)，和 d)包含序列SEQID NO:36的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:40的VL區(qū)(111)。
20.權(quán)利要求19的抗體，其中所述表達HER2的腫瘤細胞系表達少于平均約30000HER2分子/細胞，其中所述抗體優(yōu)選地阻斷參照抗體與可溶性HER2的結(jié)合，所述參照抗體包含選自如下的VH和VL區(qū): a)包含序列SEQID NO:1的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:5的VL區(qū)(005);和 b)含有包含序列SEQID NO:22的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:26的VL區(qū)的抗體(060)。
21.前述任一權(quán)利要求的抗體，其中當如實施例18中所述測定時，與曲妥珠單抗相比，更高量的所述抗體被表達HER2的腫瘤細胞系內(nèi)化，其中所述抗體優(yōu)選地交叉阻斷參照抗體，所述參照抗體包含選自如下的VH和VL區(qū): a)包含序列SEQID NO:1的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:5的VL區(qū)(005)； b)包含序列SEQID NO:8的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO: 11的VL區(qū)(006)； c)包含序列SEQID NO:15的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:19的VL區(qū)(059)； d)包含序列SEQID NO:22的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:26的VL區(qū)(060)； e)包含序列SEQID NO:29的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:33的VL區(qū)(106);和 f)包含序列SEQID NO:36的VH區(qū)和包含序列SEQ ID NO:40的VL區(qū)(111)。
22.權(quán)利要求16-21中任一項的抗體，所述抗體完全阻斷所述參照抗體與可溶性HER2的結(jié)合，優(yōu)選地，其中所述抗體與所述參照抗體結(jié)合相同的表位。
23.前述權(quán)利要求中任一項的抗體，其中所述抗體是二價抗體。
24.前述權(quán)利要求中任一項的抗體，其中所述抗體是抗原結(jié)合片段。
25.前述權(quán)利要求中任一項的抗體，其中所述抗體是全長抗體，優(yōu)選IgGl抗體，尤其是IgGl，K 抗體。
26.前述權(quán)利要求中任一項的抗體，其中所述抗體是效應(yīng)物功能缺陷抗體，例如穩(wěn)定化的人IgG4抗體，如其中用賴氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸,優(yōu)選賴氨酸取代人IgG4的重鏈恒定區(qū)409位的精氨酸的抗體,和/或其中鉸鏈區(qū)包含Cys-Pro-Pro-Cys序列的抗體。
27.前述權(quán)利要求中任一項的抗體，其中所述抗體是單價抗體。
28.權(quán)利要求27的抗體，其中所述單價抗體包含 (i)權(quán)利要求1-25的抗體的可變區(qū)或所述區(qū)的抗原結(jié)合部分，和 ( )免疫球蛋白Ch區(qū)或其包括Ch2和Ch3區(qū)的片段，其中所述Ch區(qū)或其片段已經(jīng)修飾，使得對應(yīng)于鉸鏈區(qū)的區(qū)域，以及，如果所述免疫球蛋白不是IgG4亞型，Ch區(qū)的其它區(qū)域，如Ch3區(qū)，不包含任何如下氨基酸殘基:在多克隆人IgG存在的情況下，所述氨基酸殘基能夠與相同的Ch區(qū)形成二硫鍵或者與相同的Ch區(qū)形成其它共價的或穩(wěn)定的非共價重鏈間鍵。
29.權(quán)利要求28的抗體，其中步驟ii)中涉及的免疫球蛋白是IgG4亞型的。
30.權(quán)利要求29的抗體，其中所述重鏈已經(jīng)修飾，使得整個鉸鏈區(qū)已經(jīng)缺失。
31.前述權(quán)利要求中任一項的抗體，其中所述抗體是雙特異性抗體，其包括如前述權(quán)利要求中任一項所定義的抗體的第一抗原結(jié)合區(qū)，和具有不同結(jié)合特異性，如對人效應(yīng)細胞、人Fe受體或B細胞受體或HER2的非阻斷表位的結(jié)合特異性，的第二抗原結(jié)合位點。
32.前述權(quán)利要求中任一項的抗體，其中所述抗體與另一個部分如細胞毒性部分、放射性同位素、藥物或細胞因子相綴合。
33.權(quán)利要求32的抗體，其中所述細胞毒性部分選自紫杉醇；細胞松弛素B;短桿菌肽D ;溴化乙錠；依米丁 ；絲裂霉素；依托泊苷；鬼白噻吩苷；長春新堿；長春花堿；秋水仙堿；多柔比星；柔紅霉素；二羥炭疽菌素二酮；微管蛋白抑制劑如美登素I或其類似物或衍生物；米托蒽醌；光神霉素；放線菌素D ；1-去氫睪酮；糖皮質(zhì)激素；普魯卡因；丁卡因；利多卡因；普萘洛爾；嘌呤霉素；卡里奇霉素或其類似物或衍生物；抗代謝物如氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟達拉賓、5-氟脲嘧唆、達卡巴嗪、羥基脲、天冬酰胺酶、吉西他濱或克拉屈濱；烷化劑如氮芥、thioepa、苯丁酸氮芥、美法侖、卡氮芥(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素、達卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、絲裂霉素C、順鉬、卡鉬、duocarmycin A>duocarmycin SA、雷查霉素(CC-1065)或其類似物或衍生物；抗生素如放線菌素D、博來霉素、柔紅霉素、阿霉素、伊達比星、光神霉素、絲裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素、安曲霉素(AMC));抗有絲分裂劑如monomethyl auristatin E或F或其類似物或衍生物；白喉毒素和相關(guān)分子如白喉A鏈及其活性片段和雜合分子、蓖麻毒蛋白毒素如蓖麻毒蛋白A或脫糖基化蓖麻毒蛋白A鏈毒素、霍亂毒素、志賀樣毒素如SLT 1、SLTII>SLT IIV、LT毒素、C3毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風(fēng)毒素、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制劑、假單胞菌外毒素、alorin、皂苷、蒴蓮素、gelanin、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮素A鏈、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白如PAP1、PAPII和PAP S、苦瓜抑制劑、麻風(fēng)樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制劑、白樹毒素、mi toge 11 in、局限曲霉素、酚霉素和依諾霉素毒素；核糖核酸酶(RNase) ；DNase 1、葡萄球菌內(nèi)毒素A ;美洲商陸抗病毒蛋白；白喉毒素；和假單胞菌內(nèi)毒素。
34.權(quán)利要求32的抗體，所述抗體與選自如下的細胞毒性部分綴合:美登素1、卡里奇霉素、duocarmycin、雷查霉素(CC-1065)、monomethyl auristatin E或其任一種的類似物、衍生物或前藥。
35.權(quán)利要求32的抗體，所述抗體與選自如下的細胞因子綴合:IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23、IL-24、IL-27、IL_28a、IL_28b、IL-29、KGF、IFNa、IFN^、IFN γ、GM-CSF、CD40L、Flt3 配體、干細胞因子、安西司亭和 TNFa。
36.權(quán)利要求32的抗體，所述抗體與放射性同位素綴合。
37.核酸序列，其編碼選自如下的氨基酸序列中的一種或多種:SEQIDN0:l、5、8、12、15、19、22、26、29、33、36、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55 和 56。
38.表達載體，其包含權(quán)利要求37的核苷酸序列，其中所述載體進一步編碼可操作連接的抗體的輕鏈恒定區(qū)、重鏈恒定區(qū)、或輕鏈和重鏈二者的恒定區(qū)。
39.重組的真核生物或原核生物宿主細胞，其產(chǎn)生權(quán)利要求1-31中任一項定義的抗體。
40.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-31中任一項定義的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
41.藥物，其包含權(quán)利要求32-36中任一項定義的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
42.權(quán)利要求1-31中任一項的抗體，其用作藥物。
43.權(quán)利要求32-36中任一項的抗體，其用作藥物。
44.權(quán)利要求1-31中任一項的抗體，其用于癌癥的治療中。
45.權(quán)利要求32-36中任一項的抗體，其用于癌癥的治療中。
46.抗體，其用于權(quán)利要求44和45中任一項中的用途，其中所述癌癥選自:乳腺癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、食道癌、頭部和頸部的鱗狀細胞癌、子宮頸癌、胰腺癌、睪丸癌、惡性黑色素瘤和軟組織癌。
47.抗體，其用于權(quán)利要求44-46中任一項中的用途，其中所述抗體用于和一種或多種進一步的治療劑如化療劑組合以治療癌癥。
48.權(quán)利要求1-36中任一項的抗體在制備用于治療癌癥的藥物中的用途，其任選地包括權(quán)利要求46和/或47的進一步的特征。
49.用于抑制一種或多種表達HER2的腫瘤細胞的生長和/或增殖的方法，包括將權(quán)利要求1-36中任一項的抗體施用于需要其的個體。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述抗體包括權(quán)利要求31-36中任一項的特征，所述一種或多種腫瘤細胞共表達HER2和EGFR和/或HER3。
51.治療癌癥的方法，包括 a)選擇患有癌癥的受試者，所述癌癥包括共表達HER2和EGFR和/或HER3的腫瘤細胞，和 b)將權(quán)利要求1-36中任一項的抗體施用于所述受試者。
52.權(quán)利要求51的方法，其中癌癥選自乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜/子宮頸癌、肺癌、惡性黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、睪丸癌、軟組織腫瘤如滑膜肉瘤和膀胱癌。
53.用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-36中任一項的抗體的方法，所述方法包括下列步驟 a)培養(yǎng)權(quán)利要求39的 宿主細胞，以及 b)從培養(yǎng)基純化所述抗體。
54.用于檢測樣品中HER2的存在的方法，包括: -在允許抗體與HER2之間形成復(fù)合物的條件下，將所述樣品與權(quán)利要求1-36中任一項的抗體接觸；和 -分析是否已經(jīng)形成了復(fù)合物。
55.用于檢測樣品中HER2的存在的試劑盒，包括 -權(quán)利要求1-36中任一項的抗體；以及 -所述試劑盒的使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明公開了結(jié)合人表皮生長因子受體2(HER2)的分離的單克隆抗體，以及基于相關(guān)抗體的組合物和分子。本發(fā)明還公開了包含該抗體的藥物組合物和使用該抗體的治療和診斷方法。
文檔編號A61K39/395GK103153339SQ201180036931
公開日2013年6月12日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者B.d.戈艾杰, E.N.v.d.布林克, S.海杰, T.里德爾, R.霍埃特, O.巴德斯加爾德, D.薩蒂恩, J.v.d.溫克爾, P.帕倫 申請人:根馬布股份公司