專(zhuān)利名稱(chēng)：具有抗流感活性的扎那米韋膦酸酯同類(lèi)物及流感病毒的奧司他韋易感性的測(cè)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有效對(duì)抗流感病毒的新型化合物。本發(fā)明涉及抑制來(lái)自H1N1、H5N1和 H3N2流感病毒的野生型和奧司他韋耐藥性病毒株的流感病毒的神經(jīng)氨酸酶的新型膦酸酯化合物。本發(fā)明涉及抗藥病原體的檢測(cè)。具體地，本發(fā)明涉及奧司他韋耐藥性流感病毒的檢測(cè)。更具體地，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明公開(kāi)的新型化合物檢測(cè)奧司他韋耐藥性流感病毒。
背景技術(shù)：
甲型流感病毒的爆發(fā)持續(xù)引起世界范圍內(nèi)廣泛的發(fā)病率和死亡率。僅在美國(guó)，每年估計(jì)5-20%的人群感染甲型流感病毒，導(dǎo)致約200，000人住院治療和36，000人死亡。制定全面的接種疫苗政策已成為降低流感發(fā)病率的有效措施。然而，病毒的頻繁遺傳漂變需要每年都進(jìn)行疫苗的重配制，從而很可能導(dǎo)致接種疫苗中的病毒株與傳播中的病毒不匹配。
甲型流感病毒由9種結(jié)構(gòu)蛋白組成并且編碼具有調(diào)節(jié)功能的另外兩種非結(jié)構(gòu)NSl 蛋白。病毒基因組的節(jié)段性質(zhì)形成了在不同病毒株對(duì)細(xì)胞的交叉感染過(guò)程中發(fā)生基因重配 (基因組節(jié)段交換)的機(jī)制。根據(jù)其表面顯示的不同紅細(xì)胞凝集素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA) 病毒蛋白，將甲型流感病毒分成不同亞型。甲型流感病毒亞型通過(guò)兩種病毒表面糖蛋白，紅細(xì)胞凝集素(HA或H)和神經(jīng)氨酸酶(NA或N)來(lái)鑒定。每組流感病毒亞型均通過(guò)其H和N 蛋白組合來(lái)鑒定。有16種已知的HA亞型和9種已知的NA亞型。
流感病毒是可感染包括人在內(nèi)的很多動(dòng)物種類(lèi)的負(fù)鏈RNA片段病毒(negative sense segmented RNA virus)。流感基因組通過(guò)病毒編碼的RNA依賴(lài)性RNA聚合酶的復(fù)制是在所有時(shí)間都產(chǎn)生具有不同基因序列的子代的易出錯(cuò)過(guò)程?；蚋淖兊幕畈《颈环Q(chēng)為“抗原性漂變的”突變體。病毒基因組的節(jié)段性質(zhì)和感染不同動(dòng)物種類(lèi)的可能性可產(chǎn)生“抗原性漂變的”突變體(P. K. Cheng 等人，Emerg.1nfect. Dis. 15,966(2009))。在期望的條件下，顯性變異體可能成為針對(duì)人或動(dòng)物的突出病原菌。還不能完全了解導(dǎo)致突變體進(jìn)化的多步驟篩選方法(L. Cohen-Daniel等人，J. Clin. Virol. 44，138(2009) ;R. Wagner, M. Matrosovich, H. D. Klenk, Rev. Med. Virol. 12，159(2002))。然而，疫苗常被用于預(yù)防流感病毒感染，治療流感感染的最有用療法包括施用Tamiflu (奧司他韋乙酯的憐酸鹽，Roche Laboratories, Inc.)和 Rel enza (扎那米韋，Glaxo Wellcome, Inc.) (N. J. Cox, J. M. Hughes, N. Engl. J. Med. 341, 1387 (1999))。奧司他韋(oseltamivir)和扎那米韋(zanamivir)是防止子代病毒粒子在粘液分泌內(nèi)的釋放和散播并由此降低病毒感染性的病毒唾液酸酶(神經(jīng)氨酸酶)抑制劑。作為在流感病毒表面表達(dá)的糖蛋白，神經(jīng)氨酸酶 (NA)對(duì)病毒復(fù)制和通過(guò)斷裂宿主細(xì)胞的表面唾液酸受體(sialo-receptor)與子代病毒之間的鍵而產(chǎn)生的感染性至關(guān)重要。因此，基于結(jié)構(gòu)的策略來(lái)抑制NA已應(yīng)用于開(kāi)發(fā)抗流感藥。
扎那米韋(Relenza )(von Itzstein, Μ.等人，Naturel993, 363, 418. Dunn, C. J. ;Goa, K. L. Drugsl999, 58, 761.)是治療流感的流行藥?？肆鞲?Tamiflu)是前藥,該前藥易于被肝酯酶水解產(chǎn)生相應(yīng)的作為活性抑制劑的羧酸奧司他韋而與病毒的神經(jīng)氨酸酶 (NA)活性位點(diǎn)內(nèi)的3個(gè)精氨酸殘基相互作用(Argll8、Arg292和Arg371) (von Itzstein, Μ. 等人,Naturel993, 363, 418. Lew, ff.等人，Curr. Med. Chem. 2000, 7, 663. Russell, R. J.等人，Nature2006，443，45.)。奧司他韋和扎那米韋均通過(guò)斷裂宿主細(xì)胞的表面涎蛋白受體與子代病毒之間的鍵來(lái)抑制對(duì)病毒繁殖很重要的流感病毒NA。NA抑制劑設(shè)計(jì)為具有(氧雜) 環(huán)己烯支架以模擬唾液酸(N-乙酰神經(jīng)氨酸，其為用于與病毒NA的活性位點(diǎn)結(jié)合的細(xì)胞表面糖蛋白的最外糖)酶促裂解的氧鎗過(guò)渡態(tài)。為適應(yīng)與羧酸奧司他韋結(jié)合，需要生成大疏水袋的NA的誘導(dǎo)裝配，用于3-戊基側(cè)鏈(Collins, P. J.，等人，Nature2008, 453，1258.)。 相比之下，扎那米韋對(duì)新進(jìn)化的耐藥性病毒沒(méi)有奧司他韋磷酸鹽那樣易感。由于不需要生成疏水性結(jié)合袋，扎那米韋對(duì)NA突變體(例如，臨床相關(guān)的H274Y突變體)的抑制能力不變。
甲型流感(HlNl)病毒具有奧司他韋耐藥性，這歸功于神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白274 位組氨酸變?yōu)槔野彼?H274Y)的氨基酸變化。2008年洶涌而來(lái)的季節(jié)性HlNl中的奧司他韋耐藥性H274Y突變體(A. Moscona, N. Engl. J. Med. 360，953 (2009))令人困惑，因?yàn)檫@些突變的增長(zhǎng)在很多H274Y流行地區(qū)與奧司他韋的使用無(wú)關(guān)(J. Mossong等人，Antiviral Res. 84,91(2009) ;M. Jonges 等人，Antiviral Res. 83，290 (2009))。此外，在患者中報(bào)導(dǎo) 7 H274Y 奧司他韋耐藥性的全國(guó)流行性 HlNl (A. Gulland, Br. Med. J. 339，b4975(2009))和 H5N1突變體(Q. M. Le等人，Nature437, 1108 (2005))，這表明這些突變體會(huì)影響流感療法的選擇(1. Stephenson 等人,Clin.1nfect. Dis. 48, 389 (2009))。
通過(guò)修飾甘油基部分支架以模擬唾液酸酶裂解中的氧鎗過(guò)渡態(tài)，已經(jīng)制備了很多扎那米韋衍生物。膦酸酯基團(tuán)通常在藥物設(shè)計(jì)中用作羧酸鹽的生物電子等排體(White，C. L.等人，J. Mol. Biol. 1995，245，623. Schug, K. A. ; Lindner, ff. Chem. Rev. 2005，105，67. Streicher, H. ;Busseb, H. Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 1047.)。相比于羧酸鹽-狐鹽離子對(duì)，膦酸根離子會(huì)顯示與胍鹽離子更強(qiáng)的靜電作用。因此，期望扎那米韋膦酸酯同類(lèi)物可更強(qiáng)地對(duì)抗HlNl和H5N1病毒甚至H274Y突變體的神經(jīng)氨酸酶。親合力的增強(qiáng)可歸功于生理?xiàng)l件下膦酸酯基團(tuán)與3個(gè)精氨酸殘基(ArgllS、Arg292和Arg371)之間的強(qiáng)靜電作用。
溶液相的神經(jīng)氨酸酶抑制測(cè)定通常使用熒光底物2’-(4-甲基傘形酮基)-a -D-乙?；?神經(jīng)氨酸，其被神經(jīng)氨酸酶裂解而獲得可使用熒光計(jì)定量的熒光產(chǎn)物(Potier等人,Anal. Biochem. 94:287-296 (1979))，然而，該測(cè)定法不適于高通量模式。此外，由 于抗病毒株的快速出現(xiàn)(參見(jiàn)，McKimm-Breschkin, J. L. Antiviral Res. 2000, 47，1_17)，仍需要尋找新型流感病毒的神經(jīng)氨酸酶抑制劑。發(fā)明內(nèi)容
2008年奧司他韋耐藥性HlNl流感病毒的世界范圍的涌現(xiàn)推動(dòng)了對(duì)耐藥性突變體的研究和對(duì)研發(fā)快速測(cè)試奧司他韋易感性的需求。在潛在流行奧司他韋耐藥性HlNl病毒期間，需要用于快速評(píng)估就診患者樣本的奧司他韋易感性的“即時(shí)檢驗(yàn)”(point-of-care) 測(cè)試法，這將有益于治療方案的確定。
本文記載了新型膦酸酯化合物。所述化合物作為神經(jīng)氨酸酶抑制劑具有對(duì)抗 HlNU H5N1和H3N2流感病毒的野生型和奧司他韋耐藥性病毒株的活性。在一些實(shí)施方案中，奧司他韋耐藥性流感病毒株在神經(jīng)氨酸酶中含有H274Y突變。本公開(kāi)內(nèi)容還提供了通過(guò)唾液酸生成新型膦酸酯化合物的對(duì)映選擇性合成途徑。
根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的特點(diǎn)，公開(kāi)了根據(jù)式⑴的化合物，
權(quán)利要求
1.用于抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶的組合物，所述組合物包括 治療有效量的式(I)化合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述化合物選自以下化合物或治療有效的其鹽、酯或所述酯的鹽
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其包括以下化合物中的至少一種
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其包括以下化合物中的至少一種
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其包括以下化合物中的至少一種
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物與流感病毒株HlNl、H5N1和H3N2彡口口
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中，流感病毒的神經(jīng)氨酸酶是野生型或H274Y突變體。
8.制備式(I)化合物的方法，
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟(f)將中間體化合物(7)氫化，然后使其與1，3-雙(叔丁氧基羰基)-2-甲基異硫脲和 Et3N反應(yīng)以形成中間體化合物(8)
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟(g)依次用溴代三甲基硅烷和甲醇鈉處理中間體化合物(7)，然后氫化以形成化合物 (Ia)
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟(i)用乙醇鈉處理中間體化合物(7)，然后氫化以形成化合物(Ic)
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟(h)用溴代三甲基硅烷，然后用甲醇鈉處理中間體化合物(8)以形成化合物(Ib)
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟(j)用乙醇鈉，然后用三氟乙酸處理中間體化合物(8)以形成化合物(Id)
14.由權(quán)利要求8-13中任一項(xiàng)所述的方法制備的廣物。
15.一種用于治療流感感染的方法，所述方法包括給需要的受試者提供治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述化合物選自以下化合物或治療有效的其鹽、酯或所述酯的鹽
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述受試者是人或非人哺乳動(dòng)物。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述受試者疑似感染了流感病毒，所述流感病毒包括野生型或H274Y神經(jīng)氨酸酶突變體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述流感病毒株選自H1N1、H5N1和H3N2。
20.一種用于測(cè)定奧司他韋耐藥性流感病毒存在的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供疑似包括奧司他韋耐藥性流感病毒或病毒顆粒的樣品；(b)在存在和不存在羧酸奧司他韋(OC)的情況下，使所述樣品與含有流感神經(jīng)氨酸酶識(shí)別單位(R)的結(jié)合分子接觸；和(C)測(cè)定存在和不存在奧司他韋的情況下，結(jié)合分子與所述流感病毒或病毒顆粒在結(jié)合上的差別；其中，在奧司他韋存在下，相比于接觸奧司他韋敏感型流感病毒對(duì)照時(shí)識(shí)別單位(R) 結(jié)合水平的降低，如所述樣品未出現(xiàn)結(jié)合水平的降低，表明該樣品中存在奧司他韋耐藥性流感病毒。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述奧司他韋耐藥性流感病毒包括神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白的氨基酸位點(diǎn)274的突變。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述流感突變體對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑藥物有耐藥性，但是對(duì)本發(fā)明所述的識(shí)別單位(R)仍具敏感性。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述含流感病毒的樣品選自以下組成的組: 粘液、唾液、呼吸分泌物、洗喉液、洗鼻液、脊髓液、痰、尿、精液、汗、糞、血漿、血、支氣管肺泡液、陰道液、淚液和組織活檢。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述識(shí)別單位(R)與所述流感病毒的結(jié)合受同時(shí)與羧酸奧司他韋結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述識(shí)別單位(R)選自扎那米韋、或零流感胍單酯、或磷雜扎那米韋或其單酯、和它們的鹽、酯和衍生物。
26.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述識(shí)別單位(R)偶聯(lián)至可檢測(cè)的傳感單元⑶。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述識(shí)別單位(R)通過(guò)連接部(L)偶聯(lián)至所述傳感單元，以使所述結(jié)合分子具有R-L-S結(jié)構(gòu)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述連接部(L)選自脂肪族鏈、三唑、水溶性連接部和乙二醇連接部。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述傳感單元是可檢測(cè)部分，其選自熒光標(biāo)記、金標(biāo)記、酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記、量子點(diǎn)標(biāo)記、生物素-抗生物素蛋白類(lèi)標(biāo)記和蛋白標(biāo)記。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述熒光標(biāo)記選自以下組成的組熒光素、 BODIPY> Alexa Fluor、Cy3、Cy5、Oregon Green、四甲基若丹明、若丹明紅、德克薩斯紅、批啶基噁唑、苯并噁二唑衍生物、NBD鹵化物、碘代乙酰胺類(lèi)、SBD ;瑩黃、碘代乙酰胺；芪、香豆素、萘、氮丙唳、dapoxyl、花、bimanes、咕噸、花青、花、酞菁染料、藻膽蛋白、方酸菁染料、能量轉(zhuǎn)移染料組合，和它們的衍生物。
31.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述R-L-S分子選自以下化合物BMl :扎那米韋_(三唑連接部)_生物素
32.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，R是磷雜扎那米韋或其衍生物。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合羧酸奧司他韋的化合物R是式(I) 化合物，R人 § (I)，
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合羧酸奧司他韋的化合物R是選自以下化合物或其衍生物
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測(cè)耐藥病原菌和治療其感染的方法和組合物。還提供了用于利用非奧司他韋流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑和羧酸奧司他韋通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析來(lái)檢測(cè)奧司他韋耐藥性流感病毒的方法。本發(fā)明公開(kāi)了偶聯(lián)至傳感器且用于本發(fā)明方法中的流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑。還公開(kāi)了作為對(duì)抗H1N1、H5N1和H3N2病毒的野生型和奧司他韋耐藥性的流感病毒的神經(jīng)氨酸酶抑制劑的新型膦酸酯化合物。本發(fā)明還提供了通過(guò)唾液酸制備這些膦酸酯化合物的對(duì)映選擇性合成途徑。
文檔編號(hào)A61K31/00GK103068378SQ201180034218
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月10日
發(fā)明者齊暉·王, 方金民, 鄭義勛, 謝俊杰 申請(qǐng)人:中央研究院