專利名稱：衍生自trem樣轉(zhuǎn)錄1(tlt-1)的抑制肽和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及衍生自蛋白質(zhì)TLT-1的多肽片段和它們用于治療炎性疾病和更具體地用于治療敗血癥的用途。
背景技術(shù)：
感染性休克(由對(duì)感染有害的和破壞性的宿主反應(yīng)產(chǎn)生的一種復(fù)雜的臨床綜合征)是重癥監(jiān)護(hù)病房中死亡率的主要原因。當(dāng)對(duì)全身性感染的初始適當(dāng)?shù)乃拗鞣磻?yīng)變得失調(diào)和過度放大，并帶有炎癥和凝血之間的親密串?dāng)_時(shí)，敗血癥逐漸形成了。在擔(dān)當(dāng)先天免疫反應(yīng)的放大器的候選物之中，一些屬于髓系細(xì)胞上表達(dá)的觸發(fā)受體(TREM)家族[Bouchon，A.等,2000 ；Bleharski, J.R.等，2003 ；Haselmayer, P.等，2007 ；Gibot, S.等，2007]。人TREM基因簇位于染色體6p21.1上，并編碼六種不同的蛋白質(zhì)，TREM 1-5和TLT-1 (TREM樣轉(zhuǎn)錄-1)。人TREM-1 (hTREM-Ι)由194個(gè)氨基酸(aa)殘基的胞外區(qū)、29個(gè)aa的跨膜區(qū)和5個(gè)aa的短胞質(zhì)尾組成。胞外樣Ig域包含對(duì)應(yīng)于V型Ig域的基序DxGxYxC。Ig域通過包含三個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的60個(gè)a a部分連接到跨膜區(qū)?？缒^(qū)(spanning region)包含與含ITAM的蛋白質(zhì)DAP12的跨膜域的Asp殘基形成鹽橋的Lys殘基，使TREM-1和其接頭蛋白之間能夠聯(lián)系[Bouchon, A.等，2000 ;Kelker，M.S.等，2004 ;Kelker，M.S.等，2004]。TREM的參與觸發(fā)了涉及ZAP70和SYK的信號(hào)傳導(dǎo)路徑和接頭分子例如GRB2的隨后補(bǔ)充和酪氨酸磷酸化，PI3K、PLC-Y、ERK-1、-2 和 p38MAPK 的活化[HaseImayer, P.等，2009 ；Gibot,S，2005]。最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-kB活化的這些路徑的活化通過CARD9-BCL10-MALT1調(diào)節(jié)[Hara,H.等，2007]。值得注意的是，雖然晶體學(xué)分析可以通過使用抗體-等效互補(bǔ)性決定區(qū)(OTR)循環(huán)(例如TCR、⑶8和CTLA-4)來預(yù)測TREM-1的識(shí)別，其天然配體尚未確定。使用TREM-1融合蛋白或使用為TREM-1的胞外域的⑶R3和“F” β鏈設(shè)計(jì)的肽的阻斷實(shí)驗(yàn)表明炎癥減少，導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥與多種微生物引起的敗血癥的鼠模型的存活率改善[Bouchon, A.等，2001 ；Gibot,S.等，2006]。調(diào)節(jié)TREM-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的保護(hù)性作用還體現(xiàn)在其它急性炎癥(缺血再灌注損傷、急性胰腺炎、出血性休克)或慢性炎癥(炎癥性腸疾病、炎癥性關(guān)節(jié)炎)的模型中。所有這些研究表明TREM-1在放大感染或無菌炎癥中的作用。除了 TREM-1，TREM基因簇包括TREM樣轉(zhuǎn)錄I (TLT-1)。TLT-1是豐富的，只在血小板和巨核細(xì)胞上表達(dá)并且在血小板α顆粒中隔離。一旦血小板活化，TLT-1易位到血小板表面[Washington, Α.V.等,2004]。TLT-1包含v組Ig型胞外域、跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾,所述胞質(zhì)尾包括基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)和聚脯氨酸富集域。不像其它TREM家族成員，TLT-1不與DAP12活化鏈耦合，鑒于其已經(jīng)證實(shí)提高了大鼠嗜堿性白血病(RBL)細(xì)胞中的Ca++信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，表明TLT-1是共活化受體[Barrow，A.D.等，2004]。TLT-1在血小板上表達(dá)的特異性表明其在止血和/或血栓形成中應(yīng)當(dāng)發(fā)揮獨(dú)特的作用。事實(shí)上，已經(jīng)提出TLT-1的調(diào)節(jié)可以在調(diào)節(jié)血小板功能中具有若干潛力，從而預(yù)防炎癥相關(guān)的高凝(但非直接炎癥)或血小板相關(guān)疾病(如出血或凝血障礙)[WashingtonAV.等，2009]。這種調(diào)節(jié)可以以直接(通過干擾TLT-1配體)或間接(通過調(diào)節(jié)TLT-1胞內(nèi)途徑)方式介導(dǎo)。在本文中，發(fā)明人首次報(bào)道了 TLT-1和TLT-1衍生肽通過特異性抑制TREM-1活性顯示出抗炎性質(zhì)。這種肽能夠抑制TREM-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并且因此具有天然存在的TREM-1抑制劑的特性。它們進(jìn)一步表明相同的肽，作為TREM-1和其胞內(nèi)路徑抑制的結(jié)果，還在體內(nèi)調(diào)節(jié)通過感染觸發(fā)的促炎癥級(jí)聯(lián)，從而在敗血癥期間抑制TREM-1相關(guān)的高反應(yīng)性和隨之而來的器官損傷和死亡。發(fā)明概述本發(fā)明基于TLT-1和TLT-1衍生肽能夠特異性抑制TREM-1的發(fā)現(xiàn)。發(fā)明人首次表明人TLT-1 (hTLT-Ι)和hTLT_l衍生肽能夠特異性識(shí)別和結(jié)合人TREM-1 配體。發(fā)明人還表明，作為hTLT-Ι和hTLT-Ι衍生肽結(jié)合hTREM_l配體的結(jié)果，hTLT_l和hTLT-Ι衍生肽能夠在體外和體內(nèi)減少hTREM-Ι誘導(dǎo)的人-TREM-1-表達(dá)細(xì)胞的激活，其特征在于胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)(磷酸化途徑)、CARD9-MALT1-BCL10復(fù)合物形成、NF- κ B激活(核易位)、ROS產(chǎn)生(活性氧種)和細(xì)胞因子/趨化因子表達(dá)(mRNA)和分泌(蛋白質(zhì))。發(fā)明人還表明TLT-1衍生肽能夠治療TREM-1相關(guān)的疾病，即其中TREM-1激活在病理生理過程中發(fā)揮作用的疾病，如急性炎性疾病(敗血癥、嚴(yán)重的敗血癥或敗血性休克、失血性休克、缺血再灌注損傷、胰腺炎)或慢性炎性疾病(炎癥性腸疾病、風(fēng)濕性疾病、癌癥)。因此，本發(fā)明涉及包含選自氨基酸序列SEQ ID NO I的至少6個(gè)連續(xù)的氨基酸的多肽片段或功能保守性變體以用于治療炎性病癥。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于一種藥物組合物，其包含至少一種如本文中所定義的多肽，或選擇性的包含編碼本發(fā)明多肽的核酸的載體。發(fā)明詳述定義:在整個(gè)說明書中，采用幾個(gè)術(shù)語并且在以下段落中定義。如本文使用的，用于“髓系細(xì)胞上表達(dá)的觸發(fā)受體I ”的術(shù)語“TREM-1 ”表示已經(jīng)在人和鼠多形核嗜中性粒細(xì)胞和成熟單核細(xì)胞上識(shí)別的細(xì)胞表面分子。它屬于免疫球蛋白超家族并且在稱為DAP12的接頭蛋白的幫助下激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。在細(xì)菌例如銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌的存在下，在細(xì)胞培養(yǎng)和感染患者組織樣品中，TREM-1在嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上的表達(dá)均極大地上調(diào)。形成鮮明對(duì)比的是，在來自患有非感染性炎性疾病例如牛皮癬、潰瘍性結(jié)腸炎或由免疫復(fù)合物引起的血管炎的患者的樣品中，TREM-1沒有上調(diào)。此外，當(dāng)TREM-1與其配體結(jié)合時(shí)，LPS的協(xié)同效果和促炎性細(xì)胞因子例如TNF-[ α ]的放大合成與IL-10產(chǎn)生的抑制一同被觀察到。如本文所使用，用于“TREM樣轉(zhuǎn)錄I”的術(shù)語“TLT-1”表示TREM家族的一個(gè)成員。Mcvicar小組最初的工 作[Washington A.V.等,2004]表明TLT-1是豐富的,對(duì)血小板和巨核細(xì)胞譜系具有特異性，并且在血小板α顆粒中被隔離。一旦血小板被凝血酶或LPS活化，TLT-1易位到血小板表面。TLT-1包含V組Ig型胞外域、跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾，所述胞質(zhì)尾包括基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)和聚脯氨酸富集域。不像其它TREM家族成員，TLT-1不與DAP12活化鏈耦合，鑒于其已經(jīng)證實(shí)提高了大鼠嗜堿性白血病(RBL)細(xì)胞中的Ca++信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，表明TLT-1是共活化受體。TLT-1的氨基酸序列如氨基酸序列SEQ ID NOI所描述。本發(fā)明的多肽在下表I中描述。
權(quán)利要求
1.一種多肽，包含選自氨基酸序列SEQ ID NO:1的至少6個(gè)連續(xù)氨基酸或功能保守性變體，用于治療炎性病癥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，包含選自SEQID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的6個(gè)連續(xù)氨基酸序列，用于治療炎性病癥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的多肽，包含如SEQID NO:9所示的氨基酸序列，用于治療炎性病癥。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的多肽，包含如SEQID NO:4所示的氨基酸序列，用于治療炎性病癥。
5.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1-4的多肽的分離的核酸序列。
6.一種質(zhì)粒,包含根據(jù)權(quán)利要求5的核酸序列。
7.—種表達(dá)載體，包含根據(jù)權(quán)利要求5的核酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4的多肽，其中所述炎性病癥是敗血癥。
9.一種藥物組合物，包含治療有效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-4的多肽、或根據(jù)權(quán)利要求5的核酸、或根據(jù)權(quán)利要求6的質(zhì)粒、或根據(jù)權(quán)利要求7的表達(dá)載體，和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑 。
全文摘要
本發(fā)明涉及衍生自蛋白質(zhì)TLT-1的多肽片段和它們?cè)谥委熝仔圆“Y和更具體地在治療敗血癥中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/17GK103153327SQ201180028906
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日
發(fā)明者塞巴斯蒂安·吉博, 馬爾克·德里夫 申請(qǐng)人:國家健康與醫(yī)學(xué)研究院, 洛林大學(xué)