專利名稱：與b7-h3反應(yīng)性的抗體、其免疫學(xué)活性片段及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對哺乳動(dòng)物，且更特別地對人B7-H3受體具有免疫反應(yīng)性的抗體及其片段，且涉及其用途，特別是在治療癌癥和炎癥中的用途。因此本發(fā)明特別地涉及能夠介導(dǎo)，且更優(yōu)選地能夠加強(qiáng)活化針對與多種人類癌癥有關(guān)的癌細(xì)胞的免疫系統(tǒng)的人源化B7-H3-反應(yīng)性抗體及其免疫反應(yīng)性片段。相關(guān)技術(shù)說明腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移在很大程度上取決于其逃避宿主免疫監(jiān)視并戰(zhàn)勝宿主防御的能力。雖然大部分腫瘤表達(dá)可在不同程度上被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的抗原，但是在許多情況下，由于效應(yīng)T細(xì)胞的低效活化而引發(fā)不充分的免疫反應(yīng)(Khawli，L.A.等人(2008) “Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for theImmunotherapy of Solid Tumors,，，Exper. Pharmacol. 181 :291-328)。CD4+T-淋巴細(xì)胞是大多數(shù)哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)的主要組織者(Dong, C.等人(2003) “Immune Regulation by Novel CostimulatoryMolecules, ” Immunolog. Res. 28 (I) :39-48)。已發(fā)現(xiàn)通過抗原遞呈細(xì)胞與幼稚CD4+T-淋巴細(xì)胞之間的共刺激相互作用介導(dǎo)CD4+輔助性T-細(xì)胞的活化。需要兩種相互作用(Viglietta, V.等人(2007) “Modulating Co-Stimulation, ”Neurotherapeutics 4:666-675 ；Korman, A. J.等人(2007) “Checkpoint Blockade in CancerImmunotherapy, ”Adv. Immunol. 90 :297-339)。在第一種相互作用中，抗原遞呈細(xì)胞必須展示結(jié)合至細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合物，使得其可結(jié)合幼稚CD4+T-淋巴細(xì)胞的T-細(xì)胞受體(“TCR”)。在第二種相互作用中，抗原遞呈細(xì)胞的配體必須結(jié)合⑶4+T-淋巴細(xì)胞的 CD28 受體(Dong, C.等人(2003) “Immune Regulation by Novel CostimulatoryMolecules,，，Immunolog. Res. 28 (I) :39-48 ；Lindley, P. S.等人(2009) “The ClinicalUtility Of Inhibiting CD28_Mediated Costimulation，”Immunol.Rev. 229 :307-321)。然后經(jīng)歷兩種刺激信號(hào)的CD4輔助性T-細(xì)胞能夠響應(yīng)于細(xì)胞因子(例如白介素-2和白介素-12)以發(fā)育成Thl細(xì)胞。這些細(xì)胞產(chǎn)生介導(dǎo)對表達(dá)靶抗原的靶細(xì)胞的炎癥反應(yīng)的干擾素-Y (IFN- Y )和腫瘤壞死因子-a (TNF- α )。還發(fā)生B-細(xì)胞活化和增殖，導(dǎo)致靶抗原特異性抗體的產(chǎn)生(Bernard，A.等人(2005)“T and B Cell Cooperation A Dance of Lifeand Death，” Transplantation 79:S8_S11)。TCR銜接期間，在無兩種共剌激信號(hào)存在下，T細(xì)胞進(jìn)入稱為克隆無反應(yīng)性的功能上無響應(yīng)狀態(tài)(Khawli，L.A.等人(2008) “Cytokine，Chemokine， and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of SolidTumors，”Exper. Pharmacol. 181 :291-328)。在病理狀態(tài)下，Thl細(xì)胞是多種器官特異性自身免疫疾病，例如I型糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化的關(guān)鍵參與者(Dong，C.等人(2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules，，，Immunolog.Res. 28(1) :39-48)。I. B7 超家族和 B7-H3對⑶28受體的配體的研究已促成對稱為B7超家族的一組相關(guān)分子的表征(Coyle, A. J.等人(2001) “The Expanding B7 Superfamily-Increasing ComplexlyIn Costimulatory Signals Regulating T Cell Function，，，Nature Immunol. 2 (3) 203-209 ；Sharpe, A. H.等人(2002) “The B7_CD28Superfamily，’’Nature Rev. Immunol. 2 116-126 ；Greenwald, R. J.等人(2005) “The B7 Family Revisited，，，Ann. Rev.Immunol. 23 :515-548 ；Collins, M.等人(2005) “The B7 Family Of Immune-RegulatoryLigands，，，Genome Biol. 6 :223. 1-223. 7 ;Loke，P.等人(2004) “Emerging MechanismsOf Immune Regulation The Extended B7 Family And Regulatory T Cells.，’ArthritisRes. Ther. 6 :208-214 ；Korman, A. J.等人(2007) “Checkpoint Blockade in CancerImmunotherapy, ” Adv. Immunol. 90 :297-339 ;Flies，D. B.等人(2007) “The New B7s Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity，，，J. Immunother. 30 (3) :251-260 ;Agarwal，A.等人(2008) “The Role Of Positive Costimulatory Molecules In TransplantationAnd Tolerance，，’Curr. Opin. Organ Transplant. 13 :366-372 ;Lenschow，D. J.等人(1996) “CD28/B7 System of T Cell Costimulation，” Ann. Rev. Immunol. 14 :233-258 ；Wang, S.等人(2004) uCo-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In PositiveAnd Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses，Microbes Infect. 6 :759-766)。目前存在七種已知的該家族的成員B7. 1(CD80)、B7.2(CD86)、可誘導(dǎo)的共剌激因子的配體(ICOS-L)、程序性死亡-I配體(PD-Ll)、程序性死亡-2配體(PD-L2)、B7-H3和B7-H4(Collins,M.等人(2005) “The B7Familt Of Immune-Regulatory Ligands，，，GenomeBiol. 6 223. 1-223. 7)。B7家族成員是具有免疫球蛋白-V樣結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白-C樣結(jié)構(gòu)域(例如，IgV-IgC)的免疫球蛋白超家族成員(Sharpe, A. H.等人(2002) “The B7-CD28Superfamily, ” Nature Rev. Immunol. 2 :116-126)。B7 家族成員的 IgV 和 IgC 結(jié)構(gòu)域各自由單一外顯子編碼，另外的外顯子編碼前導(dǎo)序列、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域是短的，長度在19至62個(gè)氨基酸殘基范圍內(nèi)且可由多個(gè)外顯子編碼(Collins，Μ.等人(2005)“The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands，，，Genome Biol. 6 :223. 1-223.7)。B7-H3的獨(dú)特之處在于其主要人類形式包含兩個(gè)細(xì)胞外串聯(lián)的IgV-IgC結(jié)構(gòu)域(即，IgV-IgC-IgV-IgC)(Collins， Μ·等人(2005) “The B7 Family Of Immune-RegulatoryLigands，’’Genome Biol. 6 :223. 1-223. 7)。B7家族的成員被預(yù)測為在細(xì)胞表面形成背靠背、非共價(jià)的同二聚體，且已發(fā)現(xiàn)這些二聚體與B7-l(⑶80)和B7-2(⑶86)有關(guān)。
B7-1(CD80)和B7_2 (CD86)顯示出具有對刺激性CD28受體和抑制性 CTLA-4(CD152)受體的雙特異性(Sharpe，A. H.等人(2002) “TheB7-CD28Superfamily, ” Nature Rev. Tmmunol. 2 :116-126)。雖然最初認(rèn)為僅包含2個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域(IgV-IgC) (Chapoval,A.等人(2001)“B7_H3 A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-Y Production,，，NatureTmmunol. 2 :269-274 ；Sun, M.等人(2002) “Characterization of Mouse and HumanB7-H3Genes, ” J. Immunol. 168 :6294-6297),已鑒定到四個(gè)免疫球蛋白胞外域的變體(“4Ig-B7-H3”)并發(fā)現(xiàn)其是更常見的人蛋白質(zhì)形式(Sharpe，A. H.等人(2002) “TheB7-CD28 Superfamily, ” Nature Rev. Immunol. 2 :116-126)。因?yàn)樘烊坏男∈笮问?2Ig)和人4Ig形式顯示出相似的功能,未觀察到這兩種形式之間的功能差異(Hofmeyer, K.等人(2008) “The Contrasting Role Of B7-H3，，，Proc. Natl. Acad. Sci.(美國)105 (30)10277-10278)。4Ig-B7_H3分子抑制自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的癌細(xì)胞裂解(Castriconi，R.等人“Identification Of 4Ig-B7_H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That ExertsA Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis, Proc. Natl. Acad. Sci.(美·國)101(34) :12640-12645)。已發(fā)現(xiàn)人B7-H3 (2Ig形式)通過結(jié)合活化的T細(xì)胞上的推定受體促進(jìn) T-細(xì)胞活化和 IFN-Y 產(chǎn)生(Chapoval,A.等人(2001)“B7_H3 A CostimulatoryMolecule For T Cell Activation and IFN-y Production,Mature Tmmunol. 2 :269-274 ；Xu, H.等人(2009) “MicroRNAmiR-29 Modulates Expression of ImmunoinhibitoryMolecule B7-H3 !Potential Implications for Immune Based Therapy of Human SolidTumors, ^Cancer Res. 69(15) :5275-6281)。B7-H4 和 B7-H1 當(dāng)表達(dá)在腫瘤細(xì)胞上時(shí)都是免疫功能的有效抑制劑(Flies, D. B.等人(2007) “The New B7s =Playing a Pivotal Rolein Tumor Immunity,，’J. Immunother. 30(3) :251-260)。當(dāng)B7-H3介導(dǎo)T細(xì)胞共刺激和共抑制時(shí)，該蛋白質(zhì)的作用方式是復(fù)雜的(Hofmeyer, K.等人(2008)^The Contrasting Role Of B7-H3, jTroc. Natl. Acad. Sci.(美國)105 (30) :10277-10278 ；Martin-0rozco, N.等人(2007) “Inhibitory CostimulationAnd Anti-Tumor Immunity,，，Semin. Cancer Biol. 17 (4) :288-298 ；Subudhi, S. K.等人
(2005)“The Balance Of Immune Responses Costimulation Verse Coinhibition,，，J.Mol. Med. 83 :193-202)。B7-H3結(jié)合(TREM)-樣轉(zhuǎn)錄物2 (TLT-2)并共刺激T細(xì)胞活化，而且結(jié)合至今仍未確認(rèn)的受體來介導(dǎo)T細(xì)胞的共抑制。另外，通過與未知受體的相互作用，B7-H3成為自然殺傷細(xì)胞和成骨細(xì)胞的抑制因子(Hofmeyer，K.等人(2008) “TheContrasting Role Of B7-H3，”Proc. Natl. Acad. Sci.(美國)105 (30) :10277-10278)。該抑制可通過與大多數(shù)信號(hào)通路的成員的相互作用進(jìn)行，T細(xì)胞受體(TCR)通過這些信號(hào)通路調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄(例如NFTA、NF- K B或AP-I因子)。B7-H3共刺激CD4+和CD8+T-細(xì)胞的增殖。B7-H3還刺激IFN- Y產(chǎn)生和CD8+的裂解活性(Chapoval, A.等人(2001) “B7-H3 A Costimulatory Molecule For T CellActivation and IFN- y Production,，，Nature Tmmunol. 2 :269-274 ；Sharpe, A. H.等人(2002) “The B7_CD28Superfamily, ”Nature Rev. Immunol. 2 :116-126)。然而，該蛋白質(zhì)還可能通過NFAT (用于活化的T細(xì)胞的核因子)、NF- K B (核因子K B)和AP-I (激活蛋白 _1)因子來抑制 T 細(xì)胞活化(Yi. K. H.等人(2009)“Fine Tuning The Immune ResponseThrough B7-H3 And B7-H4，’’Immunol. Rev. 229 :145-151)。B7-H3 還被認(rèn)為體內(nèi)抑制 Thl、Th2 或 Thl7 (Prasad，D. V.等人(2004) “Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of TCells，”J. Immunol. 173 :2500-2506 ;Fukushima，A.等人(2007) “B7-H3 Regulates TheDevelopment Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice，，，Immunol. Lett. 113 :52-57 ；Yi. Κ. H.等人(2009) “Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 AndB7-H4，” Immunol. Rev. 229 :145-151)。多個(gè)獨(dú)立研究已表明人惡性腫瘤細(xì)胞在B7-H3蛋白表達(dá)方面表現(xiàn)出顯著的增加且這種表達(dá)增加與疾病嚴(yán)重度的增加有關(guān)(Zang，X.等人(2007) “The B7 Family And Cancer Therapy Costimulation And Coinhibition，”Clin.Cancer Res. 13 :5271-5279)，表明B7-H3被腫瘤作為免疫逃避通路利用(Hofmeyer，K.等人(2008) “The Contrasting Role Of B7-H3，”Proc. Natl. Acad. Sci.(美國)105(30)10277-10278)。阻礙B7分子結(jié)合T-細(xì)胞受體(例如，CD28)的能力的分子抑制免疫系統(tǒng)且已被建議作為用于自身免疫疾病的治療(Linsley，P. S.等人(2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28_Mediated Co-Stimulation, ” Immunolog. Rev. 229 :307-321)。經(jīng)抗4Ig-B7-H3抗體處理的表達(dá)4Ig-B7-H3的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞對NK細(xì)胞更敏感。然而，不清楚這種活性是否可歸因于只針對4Ig-B7-H3形式的抗體，因?yàn)獒槍?Ig-B7-H3產(chǎn)生的所有已報(bào)道的抗體還結(jié)合兩個(gè)Ig樣形式的B7H3(Steinberger，P.等人(2004) “MolecularCharacterization of Human 4Ig_B7_H3，a Member of the B7 Family with Four Ig-LikeDomains，，，J. Immunol. 172(4) :2352-2359 和 Castriconi 等人(2004) “IdentificationOf 4Ig_B7_H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A ProtectiveRole From An NK Cell-Mediated Lysis，” Proc. Natl. Acad. Sci.(美國)101(34)12640-12645)。雖然B7-H3未表達(dá)在靜息B或T細(xì)胞、單核細(xì)胞、或樹突細(xì)胞上，但是其可通過IFN-Y在樹突細(xì)胞上被誘導(dǎo)或通過GM-CSF在單核細(xì)胞上被誘導(dǎo)(Sharpe，A. H.等人(2002) “The B7-CD28 SuperfamiIy，” Nature Rev. Immunol. 2 :116-126) 0 結(jié)合 B7-H3的受體未被充分表征。早期工作表明這樣的一種受體將需要在活化后的T細(xì)胞上快速且短暫地上調(diào)(Loke，P.等人(2004) “Emerging Mechanisms Of Immune Regulation TheExtended B7Family And Regulatory T Cells. ”Arthritis Res. Ther. 6 :208-214)。近來，已表明表達(dá)在骨髓細(xì)胞上的(TREM)-樣轉(zhuǎn)錄物2(TLT-2或TREML2)受體(King，R. G.等人
(2006)uTrem-Like Transcript 2 Is Expressed On Cells Of The Myeloid/GranuloidAnd B Lymphoid Lineage And Is Up-Regulated In Response To Inflammation,J.Immunol. 176 :6012-6021 ;Klesney_Tait，J.等人(2006) “The TREMReceptor Family AndSignal Integration，，，Nat. Immunol. 7 :1266-1273 ;Yi. Κ. H.等人(2009) “Fine TuningThe Immune Response Through B7-H3 And B7-H4，”Immunol. Rev. 229 :145-151)能夠結(jié)合B7-H3且從而能夠共剌激特別是CD8+T細(xì)胞的活化(Zang，X.等人(2003) “B7x :A WidelyExpressed B7 Family Member That Inhibits T Cell Activation, Troc. Natl. Acad. Sci.(美國)100 :10388_10392 ;Hashiguchi，M.等人(2008)uTriggering Receptor ExpressedOn Myeloid Cell-Like Transcript 2(TLT-2)Is A Counter-Receptor For B7-H3 AndEnhances T Cell Responses，，，Proc. Natl. Acad. Sci.(美國)105(30) :10495-10500;Hofmeyer, K.等人(2008) “The Contrasting Role Of B7-H3, jTroc. Natl. Acad. Sci.(美國)105(30) :10277-10278)。人B7-H3除了表達(dá)在成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞上，還已知其表達(dá)在多種其他癌細(xì)胞(例如，胃癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌)上。已在腫瘤細(xì)胞系中通過免疫組織化學(xué)檢測到B7-H3 蛋白的表達(dá)(Chapoval, A.等人(2001) “B7-H3 :A Costimulatory Molecule ForT Cell Activation and IFN-γ Production,，，Nature Immunol. 2 :269-274 ;Saatian,B.等人(2004) “Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands ByNasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation, ^Amer.J.Physiol.Lung Cell. Mol. Physiol. 287 L217-L225 ；Castriconi 等人(2004) “IdentificationOf 4Ig_B7_H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A ProtectiveRole From An NK Cell-Mediated Lysis, ^Proc. Natl. Acad. Sci.(美國)101(34)12640-12645) ；Sun, M.等人(2002) “Characterization of Mouse and Human B7-H3Genes, ”J. Immunol. 168 :6294-6297)。已在心臟、腎、睪丸、肺、肝、胰、前列腺、結(jié)腸和成骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn) mRNA 的表達(dá)(Collins,M.等人(2005) “The B7 Family Of Immune-RegulatoryLigands, ”Genome Biol. 6 :223. 1-223. 7)。在蛋白質(zhì)水平上，在人的肝、肺、膀胱、睪丸、前列腺、乳房、胎盤和淋巴器官中發(fā)現(xiàn)了 B7-H3 (Hofmeyer, K.等人(2008) “The ContrastingRole Of B7-H3，” Proc. Nat I .Acad. Sci.(美國)105(30) : 10277-10278)。II.治療性抗體除了其在診斷方面的已知用途，還表明抗體作為治療劑是有用的。例如，近年來免疫治療或抗體用于治療性目的的用途已被用來治療癌癥。被動(dòng)免疫治療包括在癌癥治療中
使用單克隆抗體(參見例如，DEVita, Hellman,狐！ RosENBEEGi s CAncee Peinciples^Peactice OF Ongqlqgy，EighthEdition(2008)，DeVita, V.等人編輯，Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA,第537-547頁，2979-2990)。這些抗體可能通過直接抑制腫瘤細(xì)胞生長或存活和通過其補(bǔ)充身體免疫系統(tǒng)的天然細(xì)胞的殺傷活性的能力而具備固有的治療性生物活性。這些劑可單 獨(dú)施用或聯(lián)合放射或化療劑施用。分別被批準(zhǔn)用于治療非霍奇金淋巴瘤和乳腺癌的利妥昔單抗和曲妥珠單抗是這些治療劑的實(shí)例?？蛇x擇地，抗體可用來制備抗體偶聯(lián)物，其中抗體與毒劑連接并通過與腫瘤特異性結(jié)合將該劑導(dǎo)向腫瘤。吉妥珠單抗奧佐米星是被批準(zhǔn)用于治療白血病的抗體偶聯(lián)物的實(shí)例。已公開了結(jié)合癌細(xì)胞并具有潛在的診斷和治療用途的單克隆抗體(參見，例如，以下專利申請，其特別地公開了靶蛋白的大約分子量美國專利第6，054，561號(hào)(200kD的c-erbB-2 (Her2)和大小為40-200KD的其他未知抗原)和美國專利第5，656，444號(hào)(50kD和55kD的癌胚蛋白))。臨床試驗(yàn)中和/或被批準(zhǔn)用于治療實(shí)體瘤的抗體的實(shí)例包括曲妥珠單抗(抗原180kD，HER2/neu)、依決洛單抗(抗原40_50kD，Ep-CAM)、抗人奶脂肪球(HMFGl)(抗原&gt ；200kD, HMW黏蛋白)、西妥昔單抗(抗原150kD和170kD，EGF受體)、阿侖單抗(抗原21-28kD,⑶52)、和利妥昔單抗(抗原35kD,⑶20)。用來治療乳腺癌的曲妥珠單抗(Her-2受體)和在臨床試驗(yàn)中用于治療多種癌癥的西妥昔單抗(EGF受體)的抗原靶以某種可檢測水平存在于大量的正常人成體組織，包括皮膚、結(jié)腸、肺、卵巢、肝和胰中。使用這些治療劑的安全邊際可能由這些部位的抗原表達(dá)水平或抗體的接近或活性的差異提供。
另一種類型的免疫治療是主動(dòng)免疫治療,或稱疫苗接種,其利用存在于特定癌癥上的抗原或指導(dǎo)抗原表達(dá)的DNA構(gòu)建體，然后它們引起個(gè)體的免疫反應(yīng)，S卩引發(fā)個(gè)體主動(dòng)產(chǎn)生針對其自身癌癥的抗體。主動(dòng)免疫不像被動(dòng)免疫治療或免疫毒素那樣經(jīng)常使用。已指示了疾病(包括癌癥)進(jìn)展的多種模型。理論包括從由單一的感染/轉(zhuǎn)化事件到越來越“疾病樣”或“癌癥樣”的組織類型的演變，最終促成具有完全致病或惡化能力的一種組織類型。有人認(rèn)為對于癌癥，例如，單一的突變事件足以導(dǎo)致惡性，而其他人認(rèn)為隨后的變化也是必要的。一些人已提出通過細(xì)胞水平的一連串的突變-選擇事件，越來越高的突變負(fù)荷和腫瘤等級對于腫瘤形成的引發(fā)以及進(jìn)展是必要的。某些癌癥靶僅發(fā)現(xiàn)于腫瘤組織中，而其他的靶存在于正常組織中并在腫瘤組織中被上調(diào)和/或過表達(dá)。在這些情況下，某些研究者已提出過表達(dá)與惡性的獲得有關(guān)，而其他人提出過表達(dá)僅是向越來越病態(tài)的途徑發(fā)展趨勢的標(biāo)志。已表明在某些情況下，癌癥靶例如腫瘤中表達(dá)或過表達(dá)的癌蛋白質(zhì)存在于胚胎和胎兒發(fā)育期間并用作生長和分化的調(diào)節(jié)劑。某些研究者已發(fā)現(xiàn)這些癌蛋白質(zhì)在胚胎和胎兒發(fā)育期間的表達(dá)呈現(xiàn)出局限于特定組織且也局限于特定的發(fā)育階段。相比而言，已表明這 些癌蛋白質(zhì)在成體中的表達(dá)與在腫瘤生長中的過表達(dá)和/或腫瘤抑制蛋白質(zhì)的功能失常有關(guān)。理想的診斷性和/或治療性抗體將特異性地針對存在于大量的癌癥上但在任何正常組織上不存在或僅以低水平存在的抗原。能夠結(jié)合與癌癥特異性地相關(guān)的抗原的新型抗體的發(fā)現(xiàn)、表征和分離將在許多方面是有用的。首先，抗體將具有針對這些癌細(xì)胞的生物活性且能夠補(bǔ)充免疫系統(tǒng)的反應(yīng)從而治療該疾病?？贵w可以以單獨(dú)的治療劑施用或與目前的治療組合施用或用來制備與毒劑連接的免疫偶聯(lián)物。具有相同的特異性但當(dāng)單獨(dú)施用時(shí)具有低的生物活性或無生物活性的抗體也可能是有用的，因?yàn)榭贵w可用來制備與放射性同位素、毒素或化療劑或包含化療劑的脂質(zhì)體的免疫偶聯(lián)物，偶聯(lián)形式是生物學(xué)上有活性的，憑借抗體將毒素導(dǎo)向包含抗原的細(xì)胞。如以上討論的，已描述了特異性結(jié)合B7-H3的抗體和其他分子(參見，美國專利第7，527，969 -J, 368，554 -J, 358，354 ；和7，279，567號(hào)；美國專利申請公布第US 20090087416 ；US 20090022747 ；US 20090018315 ；US2008116219 ；US20080081346 ；US 20050202536 ；US20030103963 ；US20020168762 號(hào)；PCT 公布第 WO 2008/116219 ；W02006/016276 ；W0 2004/093894 ；W0 04/001381 ；W0 2002/32375 ；W0 2002/10187 和 WO2001/094413 號(hào)；EP 1292619B ；Modak, S.等人(1999 年 3 月)“Disialoganglioside GD2And Antigen 8H9 Potential Targets For Antibody-Based Immunotherapy AgainstDesmoplastic Small Round Cell Tumor(DSRCT)And Rhabdomyosarcoma(RMS)，”Proceedings Of The American Association For Cancer Research Annual Meeting，第 40 卷474 (美國癌癥研究協(xié)會(huì)第 90 次年會(huì)；Philadelphia，Pennsylvania，US ；1999 年 4 月 10-14日；Modak，S.等人(2OOO 年 3 月)“Radioimmunotargeting To Human RhabdomyosarcomaUsing Monoclonal Antibody 8H9，，，Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 41 :724 ;Modak，S.等人(2001) “Monoclonal Antibody 8H9Targets A Novel Cell Surface Antigen ExpressedBy A Wide Spectrum Of Human Solid Tumors，，，Cancer Res. 61 (10) :4048-4054;Steinberger, P.等人(2004) “Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3， aMember of the B7 Family with Four Ig-Like Domains,，，J. Tmmunol · 172(4) :2352-2359 ；Xu, H.等人(2009) “MicroRNA miR-29 Modulates Expression of ImmunoinhibitoryMolecule B7-H3 !Potential Implications for Immune Based Therapy of Human SolidTumors, ” Cancer Res. 69(15) :5275-6281)。然而，理想的診斷性和/或治療性抗體所期望的一個(gè)方面將是能夠介導(dǎo)，且特別地能夠加強(qiáng)活化針對與多種人類癌癥有關(guān)的癌細(xì)胞(尤其是人的癌細(xì)胞)的免疫系統(tǒng)的新型抗體的發(fā)現(xiàn)和表征。這些組合物對于藥物發(fā)現(xiàn)(例如，小分子)并對于細(xì)胞調(diào)控、生長和分化的進(jìn)一步表征也將是有用的。因此，盡管有了所有之前的進(jìn)展，仍需要能夠結(jié)合癌細(xì)胞并能夠促進(jìn)或介導(dǎo)針對癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)的改進(jìn)的組合物。這些組合物可用來診斷和治療這些癌癥?；诒疚墓_的發(fā)現(xiàn)，存在對新型組合物的進(jìn)一步需要，該新型組合物特異性地識(shí)別細(xì)胞表面上的雙重靶，并從而可通過減弱或增強(qiáng)B7-H3介導(dǎo)T細(xì)胞活化的能力或通過識(shí)別并殺傷表達(dá)B7-H3的癌細(xì)胞來調(diào)節(jié)B7-H3介導(dǎo)T細(xì)胞活化的能力。本發(fā)明的目的是鑒定這些組合物。另一個(gè) 目的是提供用于測定B7-H3表達(dá)的新型化合物。如以下詳細(xì)描述的，本發(fā)明涉及能夠影響T-細(xì)胞活化的新型抗體，特別是包括包含B7-H3 T-細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)劑的雙親和再祀向試劑(dual affinity retargetingreagent) ( “DART ”)，以及結(jié)合癌細(xì)胞的B7-H3受體并促進(jìn)或介導(dǎo)這些細(xì)胞的死亡的新型抗體。本發(fā)明涉及這些組合物并涉及其在診斷和治療疾病例如癌癥中的用途。發(fā)明概述本發(fā)明涉及對哺乳動(dòng)物，且更特別地人B7-H3受體具有免疫反應(yīng)性的抗體及其片段，且涉及其用途，特別是在治療癌癥和炎癥中的用途。因此本發(fā)明特別地涉及能夠介導(dǎo)，且更優(yōu)選地能夠加強(qiáng)活化針對與多種人類癌癥有關(guān)的癌細(xì)胞的免疫系統(tǒng)的人源化B7-H3反應(yīng)性抗體及其免疫反應(yīng)性片段。詳細(xì)地，本發(fā)明涉及分離的抗體或其免疫反應(yīng)性片段，其中分離的抗體或片段包含特異性結(jié)合B7-H3的胞外域的可變域，其中抗體與抗體BRCA69D、BRCA84D或PRCA157中的任何一種競爭結(jié)合B7-H3。本發(fā)明還涉及上述分離的抗體或其免疫反應(yīng)性片段，其中所述抗體或片段包括可變域，所述可變域包含(A) BRCA69D 的輕鏈的 CDR1 (SEQ ID NO :21)、CDR2 (SEQ ID NO 23)和 CDR3 (SEQ IDNO 25)和 BRCA69D 的重鏈的 CDRJSEQ ID NO :29)、CDR2 (SEQ ID NO :31)和 CDR3 (SEQ IDNO 33)；(B)BRCA84D 的輕鏈的 CDRJSEQ ID NO :5)、CDR2 (SEQ ID NO :7)和 CDR3 (SEQ IDNO 9)和BRCA84D的重鏈的CDR1(SEQ ID NO : 13)、CDR2 (SEQ ID NO :15)和 CDR3 (SEQ ID NO:17);或(C)PRCA157 的輕鏈的 CDRJSEQ ID NO :37)、CDR2 (SEQ IDNO :39)和 CDR3 (SEQ IDNO 41)和 PRCA157 的重鏈的 CDR1 (SEQ IDNO :45)、CDR2 (SEQ ID NO :47)和 CDR3 (SEQ ID NO 49)。本發(fā)明還涉及上述分離的抗體或其免疫反應(yīng)性片段中的任何一種，其中抗體結(jié)合癌細(xì)胞表面上內(nèi)源表達(dá)的B7-H3。
本發(fā)明還涉及上述分離的抗體或其免疫反應(yīng)性片段中的任何一種，其中該抗體結(jié)合B7-H3，該抗體在結(jié)合表達(dá)在癌細(xì)胞表面上的B7-H3后被內(nèi)化。本發(fā)明還涉及上述分離的抗體或其免疫反應(yīng)性片段中的任何一種，該抗體為人源化的單克隆抗體。本發(fā)明還涉及上述分離的抗體或其免疫反應(yīng)性片段中的任何一種，其中抗體是包含變體IgGlFc區(qū)域的修飾過的抗體，其中變體IgGl Fe區(qū)域相對于抗體親本的Fe區(qū)域包含至少一個(gè)氨基酸修飾，該氨基酸修飾包括改變變體Fe區(qū)域結(jié)合Fe Y R的親和力或親合力的氨基酸修飾，使得修飾過的抗體相對于親本抗體表現(xiàn)出增強(qiáng)的效應(yīng)功能。本發(fā)明還涉及上述分離的抗體或其免疫反應(yīng)性片段中的任何一種，其中Fe區(qū)域的修飾包括⑷選自由下列組成的組的至少一種置換
(1)F243L ； (5)Y300L ；(2)D270E ； (6)V305I ；(3) R292P ； (7) A330V ;和(4)S298N ； (8)P396L ；(B)至少一種兩氨基酸殘基置換，所述置換選自由下列組成的組(1)F243L 和 P396L ;(2)F243L 和 R292P ;和(3)R292P 和 V305I ;(C)至少一種三氨基酸殘基置換，所述置換選自由下列組成的組(I) F243L、R292P 和 Y300L ；(2) F243L、R292P 和 V305I ；(3) F243L、R292P 和 P396L ;和(4) R292P、V305I 和 P396L ；(D)至少一種四氨基酸殘基置換，所述置換選自由下列組成的組(I) F243L、R292P、Y300L 和 P396L ;和(2) F243L、R292P、V305I 和 P396L ；或(E)至少五個(gè)氨基酸殘基的置換F243L、R292P、Y300L、V305I和P396。本發(fā)明還涉及上述抗體，其中所述抗體包含以下置換(A) F243L、R292P 和 Y300L ；(B) L235V、F243L、R292P、Y300L 和 P396L ;或(C)F243L、R292P、Y300L、V305I和 P396L。本發(fā)明還涉及上述抗體，其中所述抗體包含(A)可變域，其包含 BRCA84D 的輕鏈的 CDR1 (SEQ ID NO 5)、CDR2 (SEQ ID NO 7)和 CDR3 (SEQ ID NO 9)和 BRCA84D 的重鏈的 CDR1 (SEQ ID NO : 13)、CDR2 (SEQ ID NO: 15)和CDR3 (SEQ ID NO 17);和(B)Fe 區(qū)域的修飾，其包括以下置換L235V、F243L、R292P、Y300L 和 P396L。本發(fā)明還涉及上述抗體,其中所述抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
本發(fā)明還涉及上述分離的抗體或其免疫反應(yīng)性片段，其中所述抗體包含(A)可變輕鏈，其具有hBRCA84D-2VL的氨基酸序列(SEQ IDNO 89)；(B)可變重鏈，其具有hBRCA84D-2VH的氨基酸序列(SEQ IDNO 99);和(C) Fe-區(qū)域，其具有下列置換L235V、F243L、R292P、Y300L 和 P396L。本發(fā)明還涉及分泌特異性結(jié)合B7-H3的胞外域的單克隆抗體的雜交瘤，其中所述抗體與BRCA69D、BRCA84D或PRCA157中的任何一種抗體競爭結(jié)合B7-H3。本發(fā)明還涉及編碼上述分離的抗體或免疫反應(yīng)性片段中的任何一種的核酸分子。
本發(fā)明還涉及雙親和再靶向試劑(DART )，所述試劑包含(A)多肽鏈I，其包含特異性結(jié)合B7-H3的免疫球蛋白VL表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和特異性結(jié)合不同于B7-H3的分子的VH表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(B)多肽鏈II，其包含特異性結(jié)合B7-H3的免疫球蛋白VH表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和特異性結(jié)合所述不同于B7-H3的分子VL表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域；其中多肽鏈I和II結(jié)合在一起以形成能夠結(jié)合B7-H3和所述不同于B7-H3的分子的功能性表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還涉及上述雙親和再靶向試劑(DART )，其中可被DART 結(jié)合的不同于B7-H3的分子是半抗原，且特別地其中所述半抗原是異硫氰酸熒光素。本發(fā)明還涉及上述雙親和再靶向試劑(DART )，其中可被DART 結(jié)合的不同于B7-H3的分子是T細(xì)胞受體或NKG2D受體。本發(fā)明還涉及上述雙親和再靶向試劑(DART )，其中可被DART 結(jié)合的不同于B7-H3的分子是腫瘤相關(guān)抗原，且特別地，其中所述腫瘤相關(guān)抗原選自由以下組成的組A33 ；ADAM-9 ；ALCAM ；BAGE ； β -連環(huán)蛋白；CA125 ;羧肽酶 M ;CD103 ;CD19 ;CD20 ;CD22 ;CD23 ；CD25 ；CD27 ；CD28 ；CD36 ;CD40/CD154 ；CD45 ；CD46 ；CD5 ；CD56 ；CD79a/CD79b ;CDK4 ；CEA ；CTLA4 ;細(xì)胞角蛋白 8 ；EGF-R ；EphA2 ；ErbBI ；ErbB3 ；ErbB4 ；GAGE-1 ；GAGE-2 ⑶3/GM2 ；gplOO ；HER-2/neu ;人乳頭瘤病毒-E6 ;人乳頭瘤病毒-E7 ;整聯(lián)蛋白α -V-β -6 ;JAM_3 ；KID3 ；KID31 ；KSA(17-1A) ；LUCA-2 ；MAGE-I ；MAGE-3 ；MART ；MUC-I ；MUM-I ；N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶；制癌蛋白 M ;pl5 ;PIPA ;PSA ;PSMA ;R0R1 ;sTn JNF-β 受體；TNF-α 受體；TNF-γ 受體；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體；和VEGF受體。本發(fā)明還涉及編碼上述雙親和再靶向試劑(DART )中的任何一種的多肽鏈的核酸分子。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物,該藥物組合物包含(i)治療有效量的上述分離的抗體或免疫反應(yīng)性片段或雙親和再靶向試劑(DART )中的任何一種，和(ii)藥學(xué)可接受的載體。本發(fā)明還涉及上述藥物組合物，其中所述抗體是人源化抗體，其包含(A)可變域，其包含 BRCA84D 的輕鏈的 CDR1 (SEQ ID NO 5)、CDR2 (SEQ ID NO 7)和 CDR3 (SEQ ID NO 9)和 BRCA84D 的重鏈的 CDR1 (SEQ ID NO : 13)、CDR2 (SEQ ID NO: 15)和CDR3 (SEQ IDNO 17);和(B)Fe 區(qū)域的修飾，其包括以下置換L235V、F243L、R292P、Y300L 和 P396L。本發(fā)明還涉及上述藥物組合物，其中所述抗體是人源化抗體，其包含
(A)可變輕鏈，其具有hBRCA84D-2VL的氨基酸序列(SEQ IDNO 89)；(B)可變重鏈，其具有hBRCA84D-2VH的氨基酸序列(SEQ IDNO 99);和(C) Fe-區(qū)域，其具有下列置換L235V、F243L, R292P, Y3OOL 和 P396Ltl本發(fā)明還涉及上述藥物組合物中還包含一種或多種另外的抗癌劑的任何一種，且特別地其中另外的抗癌劑是化療劑、放射治療劑、激素治療劑或免疫治療劑。
·
本發(fā)明還涉及上述抗體或免疫反應(yīng)性片段或雙親和再靶向試劑(DART )中的任何一種在癌癥診斷中的用途，其中分離的抗體、免疫反應(yīng)性片段或DART 被可測檢測地標(biāo)記。本發(fā)明還涉及上述用途，特征在于所述癌癥通過癌細(xì)胞的存在來表征，所述癌細(xì)胞選自由以下組成的組腎上腺腫瘤、AIDS-相關(guān)癌癥、腺泡狀軟組織肉瘤、星形細(xì)胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉(zhuǎn)移性腦瘤、乳腺癌、頸動(dòng)脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細(xì)胞癌、透明細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、皮膚良性纖維性組織細(xì)胞瘤、促結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞腫瘤、室管膜細(xì)胞瘤、尤文腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維發(fā)育不全(fibrogenesis imperfecta ossium)、骨纖維性發(fā)育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞病、生殖細(xì)胞瘤、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、胰島細(xì)胞瘤、卡波西肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤性腫瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤性腫瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、多發(fā)性內(nèi)分泌瘤病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺瘤、小兒癌癥、外周神經(jīng)鞘瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑色素瘤、罕見血液病、腎轉(zhuǎn)移性癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉(zhuǎn)移性癌和子宮癌的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及上述抗體或免疫反應(yīng)性片段或雙親和再靶向試劑(DART )中的任何一種在制備用于治療或預(yù)防患者的癌癥的藥劑中的用途。本發(fā)明還涉及這些用途，特征在于所述癌癥通過癌細(xì)胞的存在來表征，所述癌細(xì)胞選自由以下組成的組腎上腺腫瘤、AIDS-相關(guān)癌癥、腺泡狀軟組織肉瘤、星形細(xì)胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉(zhuǎn)移性腦瘤、乳腺癌、頸動(dòng)脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細(xì)胞癌、透明細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、皮膚良性纖維性組織細(xì)胞瘤、促結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞腫瘤、室管膜細(xì)胞瘤、尤文腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維發(fā)育不全、骨纖維性發(fā)育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞病、生殖細(xì)胞瘤、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、胰島細(xì)胞瘤、卡波西肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤性腫瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤性腫瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、多發(fā)性內(nèi)分泌瘤病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺瘤、小兒癌癥、外周神經(jīng)鞘瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑色素瘤、罕見血液病、腎轉(zhuǎn)移性癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉(zhuǎn)移性癌和子宮癌的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及上述用途，特征在于該用途還包括施用選自由化療、免疫治療、放射治療、激素治療和手術(shù)組成的組的一種或多種另外的癌癥治療。附圖簡述

圖1A-1B示出了使用正常的胰、肝、肺和結(jié)腸組織樣本以O(shè). 625 μ g/ml和O. 078 μ g/ml的BRCA84D(圖1A)和使用正常的心臟、腎和腎上腺組織以O(shè). 625 μ g/ml的BRCA84D (圖1B)進(jìn)行IHC研究的結(jié)果。圖2示出了使用癌性的胰、乳房、結(jié)腸和肺組織樣本以O(shè). 625 μ g/ml和O. 078 μ g/ml的BRCA84D進(jìn)行IHC研究的結(jié)果。圖3A-3D示出了由本發(fā)明的抗體介導(dǎo)的劑量依賴性的再導(dǎo)向殺傷。圖3A-3B示出了針對B7-H3反應(yīng)性的單克隆抗體(效應(yīng)子靶比為20 I)對A498腎癌細(xì)胞的劑量依賴性再導(dǎo)向殺傷(在 18 小時(shí)的靜息 PBMC(LDH))(圖 3A :BRCA68D、BRCA69D、PRCA157、GB8、TCR-4420 ;圖 3B :0VCA22、BRCA84D、TDH6、TES7、TCR_4420)。圖 3C-3D 示出了針對 B7-H3 反應(yīng)性的單克隆抗體(效應(yīng)子靶比為30 I)對A549肺癌細(xì)胞的劑量依賴性的再導(dǎo)向殺傷(在 18 小時(shí)的靜息 PBMC (LDH))(圖 3C :BRCA84D、0VCA22、PRCA157、TES7 ;圖 3D :TDH6、BRCA68D.BRCA69D)。圖4A-4B示出了抗B7-H3抗體結(jié)合可溶性B7H3_2Ig(圖4A)和可溶性B7H3_4Ig·B7-H3 (圖 4B)的能力(抗體濃度為 IOOnM)。圖例(A)BLA8 ； (B)BRCA165 ； (C)BRCA68D ； (D)BRCA69D ； (E)BRCA84D ； (F)GB8 ； (G)LUCAl ； (H)LUCA50 ； (I)0VCA21 ； (J)0VCA22 ； (K)PA20 ；(L) PRCA123 ； (M) SG24 ； (N) SG27 ； (0) ST09 ； (P) TDH4 (184-192) ； (Q) TDH4 ； (R) TDH5 ； (S)TES7。圖例的垂直位置與相應(yīng)曲線的位置關(guān)聯(lián)。圖5A-5S展示了溶液中的抗原與被捕獲的單克隆抗體之間的結(jié)合親和力(實(shí)線；B7-H3 (4Ig) IOOnM ;虛線；B7_H3，IOOnM)。圖6A-6I示出了固定的B7-H3抗體與B7-H3-2Ig (灰色虛線)或B7_H3_4Ig (黑色實(shí)線)的BIAC0RE 分析的結(jié)果。從O. 063 μ M至I μ M滴定抗體。時(shí)間以秒計(jì)。圖 7 提供了抗體 PRCA157、BRCA69D、BLA8、ΡΑ20、BRCA84D、GB8 和 SG27 的對比BIAC0RE 分析。圖8提供了 BIAC0RE 分析，該分析表明抗體BRCA68D、BRCA69D和PRCA157不與BRCA84D競爭結(jié)合人Β7-Η3。圖9Α-9Β示出了關(guān)于本發(fā)明的抗Β7-Η3抗體在結(jié)合癌細(xì)胞后被內(nèi)化的能力的研究結(jié)果(圖9Α，前列腺CSC細(xì)胞；圖9Β, Hs700t胰細(xì)胞)。圖10A-10F示出了本發(fā)明的抗B7-H3抗體互相交叉阻礙的能力，從而揭露出重疊或獨(dú)特的表位。使用十倍過量的競爭抗體。圖11A-11B示出了 BRCA84D和其人源化衍生物hBRCA84D的可變輕鏈(圖11A)或可變重鏈(圖11B)的氨基酸殘基的比對。圖 12 示出了 hBRCA84D 輕鏈衍生物 BRCA84D_3VL、BRCA84D_4VL 和 BRCA84D-5VL 對人B7-H3的相對結(jié)合親和力。圖 13 示出了 hBRCA84D 重鏈衍生物 BRCA84D-2VH、BRCA84D_3VH 和 BRCA84D-4VH 對人B7-H3的相對結(jié)合親和力。圖14 示出了(I)包含 hBRCA84D-2VL 與 hBRCA84D_2VH 的抗體(試驗(yàn) I 和 2)，
(2)嵌合的BRCA84D，(3)包含hBRCA84D_5VL與嵌合的BRCA84D-HC的抗體和⑷包含hBRCA84D-5VL與hBRCA84D_2VH的抗體的相對結(jié)合親和力。圖15示出了在鼠異種移植模型系統(tǒng)中，F(xiàn)e-修飾的人源化抗B7-H3抗體體內(nèi)抑制HT-1197膀胱癌細(xì)胞的腫瘤生長的能力。植入癌細(xì)胞后7天、14天、21天和28天，對小鼠(以I μ g/kg、10 μ g/kg或20 μ g/kg的劑量)施用Fe-修飾的hBRCA84D_2抗體(包含F(xiàn)e修飾 L235V、F243L、R292P、Y300L 和 P396L)。圖16示出了在鼠異種移植模型系統(tǒng)中，F(xiàn)e-修飾的人源化抗B7-H3抗體體內(nèi)抑制A498腎癌細(xì)胞的腫瘤生長的能力。植入癌細(xì)胞后7天、14天、21天和28天，對小鼠(以I μ g/kg、10 μ g/kg或20 μ g/kg的劑量)施用Fe-修飾的hBRCA84D_2抗體(包含F(xiàn)e修飾L235V、F243L、R292P、Y300L 和 P396L)。圖17A-17D 示出了 hBRCA84D_2/ 抗 TCR DART ( “T-DART ”)介導(dǎo)對 SK-MES-1 肺癌細(xì)胞、A498腎癌細(xì)胞、LNCaP前列腺癌細(xì)胞和UACC-62黑色素瘤細(xì)胞的再導(dǎo)向殺傷的能力。圖18A-18C 示出了抗 B7-H3Mabl 在雄性無腫瘤的雄性 mCD16-/-，hCD16A FOXNl 小鼠的血清中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)衰變(圖18A-18B)。圖18C示出了使用2室模型從5mg/kg 劑量的參數(shù)推測出的在O. 1,0. 5、1、5和10mg/kg下產(chǎn)生的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征。圖19示出了 HT-1197膀胱癌細(xì)胞系的HER2和PRCA135的相對表達(dá)。圖20示出了抗B7-H3抗體hBRCA84D變體對HT-1197細(xì)胞的結(jié)合親和力。圖21A-21C示出了 HT-1197的鼠異種移植分析的結(jié)果。數(shù)組8只雌性小鼠接受介質(zhì)或10mg/kg的IgG對照，或1、5或15mg/kg劑量的西妥昔單抗或O. 1、0· 5、1、5或10mg/kg劑量的抗B7-H3抗體Mabl (Q7Dx5)。每3_4天進(jìn)行腫瘤測量。圖21A示出了抗B7-H3抗體Mabl在鼠異種移植模型中阻止或抑制腫瘤發(fā)育的能力。與IgG對照的比較來自第51天的Mabl (I和5mg/kg)對IgG對照林* ;來自第48天的Mabl (10mg/kg)對IgG對照圖21B示出了西妥昔單抗在鼠異種移植模型中阻止或抑制腫瘤發(fā)育的能力。來自第51天的西妥昔單抗(7mg/kg)對IgG對照** ;來自第58天的西妥昔單抗(15mg/kg)對IgG對照***。圖21C比較了在所測試的最大劑量時(shí)獲得的結(jié)果。圖22A-22B示出了 HT-1376膀胱癌細(xì)胞系的HER2和PMSA的相對表達(dá)。圖23示出了 HT-1376的鼠異種移植分析的結(jié)果。數(shù)組小鼠接受介質(zhì)或I. Omg/kg的抗 B7-H3 抗體 Mabl (Q7D x4)。圖24示出了 AGS的鼠異種移植分析的結(jié)果。數(shù)組小鼠接受介質(zhì)或O. 5、1、5或I Omg/kg 劑量的 10mg/kg 的抗 B7-H3 抗體 Mabl (Q7D x5)。圖25 示出了在與 hBRCA84D、chBRCA84D 和 hBRCA84 (Fe VarI)變體抗 B7-H3 抗體(E T比=25 I ;效應(yīng)子=人PBMC ;LDH測定讀出值)孵育后的A549肺癌細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性測定的結(jié)果。圖26示出了 A549的鼠異種移植分析的結(jié)果。數(shù)組小鼠接受介質(zhì)或I. Omg/kg的抗 B7-H3 抗體 Mabl (Q7D x4)。圖27示出了 CaLu3的鼠異種移植分析的結(jié)果。數(shù)組小鼠接受介質(zhì)或O. 5、l*5mg/kg(Q7D x5)的抗 B7-H3 抗體 Mabl 或 IgG 對照(10mg/ml)。圖28A-28C示出了 LOX-MVI黑色素瘤癌細(xì)胞的鼠異種移植分析的結(jié)果。數(shù)組8只雌性小鼠接受介質(zhì)或5mg/kg的IgG對照或5、10或20mg/kg劑量的多西他賽或O. 5、1、5或10mg/kg劑量的抗B7-H3抗體Mabl。圖28A示出了抗B7-H3抗體Mabl在鼠異種移植模型中阻止或抑制腫瘤發(fā)育的能力。圖28B示出了多西他賽在鼠異種移植模型中阻止或抑制腫瘤發(fā)育的能力。圖28C比較了在所測試的最大劑量時(shí)獲得的結(jié)果。
圖29示出了 UACC-62黑色素瘤癌細(xì)胞的鼠異種移植分析的結(jié)果。數(shù)組小鼠接受介質(zhì)或5mg/kg的IgG對照或O. 5、1、5或10mg/kg劑量的抗B7-H3抗體Mabl。圖30A-30C示出了 2rv前列腺腺癌細(xì)胞的鼠異種移植分析的結(jié)果。數(shù)組8只雌性小鼠接受介質(zhì)或10mg/kg的IgG對照或1、7或15mg/kg劑量的曲妥珠單抗或O. 5、1、5或I Omg/kg劑量的抗B7-H3抗體Mabl。圖30A示出了抗B7-H3抗體Mabl在鼠異種移植模型中阻止或抑制腫瘤發(fā)育的能力。圖30B示出了曲妥珠單抗在鼠異種移植模型中阻止或抑制腫瘤發(fā)育的能力。圖30C比較了在所測試的最大劑量時(shí)獲得的結(jié)果。圖31 示出了在與 hBRCA84D、chBRCA84D 和 hBRCA84 (Fe VarI)變體抗 B7-H3 抗體(E T比=25 I ;效應(yīng)子=人PBMC5LDH測定讀出值)孵育后的A498腎癌細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性分析的結(jié)果。圖32示出了 A498腎癌細(xì)胞的鼠異種移植分析的結(jié)果。數(shù)組小鼠接受介質(zhì)或IOmg/ kg的IgG對照或O. 1,0. 5、1、5或I Omg/kg劑量的抗B7-H3抗體Mabl。對對照組的小鼠施用1、7或15mg/kg劑量的西妥昔單抗(抗EGRF抗體)。圖33A-33B對比西妥昔單抗示出了 786-0腎癌細(xì)胞的鼠異種移植分析的結(jié)果。數(shù)組小鼠接受介質(zhì)或I Omg/kg的IgG對照或O. 1,0. 5、1、5或I Omg/kg劑量的抗B7-H3抗體Mabl。對對照組的小鼠施用1、7或15mg/kg劑量的西妥昔單抗(抗EGRF抗體)。圖34對比紫杉醇示出了 786-0腎癌細(xì)胞的鼠異種移植分析的結(jié)果。數(shù)組小鼠接受介質(zhì)或5mg/kg的IgG對照或O. 1、0· 5、1、5或I Omg/kg劑量的抗B7-H3抗體Mabl。對對照組的8只這樣的小鼠施用2. 5mg/kg劑量的紫杉醇。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及對哺乳動(dòng)物，且更特別地對人B7-H3受體具有免疫反應(yīng)性的抗體及其片段，并涉及其用途，特別是在治療癌癥和炎癥中的用途。因此本發(fā)明特別地涉及能夠介導(dǎo)且更優(yōu)選地能夠加強(qiáng)活化針對與多種人類癌癥有關(guān)的癌細(xì)胞的免疫系統(tǒng)的人源化B7-H3反應(yīng)性抗體和其免疫反應(yīng)性片段。I.常規(guī)技術(shù)除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)踐將采用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的傳統(tǒng)技術(shù)。以下文獻(xiàn)中充分地解釋了這些技術(shù)，例如，Mou5ajuii Cloning ALaboeatoey Manual, Third Edition (Sambrook 等人編輯，2001)Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY ;Oligonucleotide Synthesis Methods ANDApplications (Methods in Molecular Biology), Herdewi jn, P. , Ed. , Humana Press, Totowa,NJ ; Oligonucleotide Synthesis (Gait，M. J.，編車耳，1984) ；Methods in Molecular Biology， Humana Press,Totowa，NJ ；Cell B皿qgy ANqtebook (C 11 is J. E.，編 1998) Academic Press，New York，NY ;Animal Cell Culture(Freshney，R. I.，編車耳，I987) ;Introduction to Cell 麵 TissueCulture (Mather, J. P.和 Roberts, P. E.，編輯，1998) Plenum Press, New York, NY ；CELL MDTjssue Culture * Laboratory Procedures (Doyle，A.等人，編 1993-8) John Wiley 和 Sons，Hoboken，NJ ;Meth0Ds in Enzymology(Academic Press，Inc.)New York，NY ；WEIR S Handbook of ExpeeimentalImmunology(Herzenberg, LA.等人編輯 1997)Wiley-Blackwell Publishers, New York, NY ；Gene Teansfer Vectoes FOr Mammalian Cells (MiIIer，J. M.等人編車耳，1987) Cold Spring HarborPress j Cold Spring Harbor NY ； Cueeent Protocols in Molecular Biology (Ausube I，F(xiàn). M.等人，編輯，1987)Greene Pub. Associates, New York, NY ;PCR :The Polymeease Chain Reaction, (Mullis,K.等人,編輯，1994) BirklKiiiscrjBoston MA ；Cueeent Protocols in Iffluma；Y(Coligan, J. E 等人，編1991) John Wiley 和 Sons，Hoboken，NJ ;SHQRT Protocols in Molecular ^iology(John Wiley 和Sons, 1999) Hoboken, NJ ;Immunqbiqlqgy 7 (Janeway, C. A.等人 2007) Garland Science, London,UK ；Antibodies (P. Finch, 1997) Stride Publications, Devoran, UK ;Antibodies :A PeacticalApproach(D. Catty.,編輯，1989) Oxford University Press, USA, New York NY) ；MonoclonalAnt1Bodies :A Practical Appeoach(Shepherd, P.等人編輯，2000) Oxford University Press, USA,New York NY ；USING Antibodies A Laboeatoey Manual(Harlow, E.等人編輯，1998)Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ；THE Antibodies(Zanetti, M.等人編輯1995)Harwood Academic Publishers, London, UK);和 DeVita, Hriiman, AND Rosenberg, s Cancee Principles & Practice of Oncology, Eighth Edition, DeVita，V.等人編車耳 2008，Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, PA。II.定義
如本文所用的，術(shù)語“B7-H3”指人B7家族的蛋白質(zhì)的成員，一種也稱為⑶276的具有Ig樣結(jié)構(gòu)域的I型膜蛋白。術(shù)語“2Ig-B7-H3”表示僅包含兩個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域的B7-H3形式；術(shù)語“4Ig-B7-H3”表示包含四個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域的B7-H3形式(參見，Sun，M.等人(2002) “Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes,，，J. Immunol. 168 :6294-6297 ；Steinberger 等人(2004), “Molecular Characterization Of Human4Ig-B7-H3,A Member Of The B7 Family With Four Ig-Like Domains,”J. Tmmunol · 2004,172(4) :2352-2359 和 Castriconi 等人(2004) “Identification Of 4Ig_B7_H3 AsANeuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NKCell-Mediated Lysis，”Proc.Natl. Acad. Sci.(美國) 101(34) : 12640-12645)?？乖癟ES7”(W0 2008/066691)是共有4Ig_B7_H3的特征的抗原。因此，特異性結(jié)合TES7的抗體結(jié)合4Ig-B7-H3。TES7抗原可具有不止一個(gè)的不同表位，且表位可以是非線性的。已知多種抗B7-H3抗體結(jié)合非線性表位，包括僅存在于4Ig-B7-H3同種型上的某些表位。目前認(rèn)為與它們的正常組織的對應(yīng)物相比，TES7可能在某些癌細(xì)胞中過表達(dá)。B7-H3功能的激動(dòng)劑、拮抗劑和其他調(diào)節(jié)劑被明確地包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些激動(dòng)劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑是包含B7-H3的一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇位點(diǎn)或包含這些位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)片段，這些位點(diǎn)的變體或這些位點(diǎn)的類肽的多肽。這些激動(dòng)劑、拮抗劑和B7-H3的調(diào)節(jié)性化合物以線性或環(huán)化形式提供，且任選地包含至少一個(gè)自然界中不經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基或至少一個(gè)酰胺電子等排體。這些化合物可被糖基化。更具體地，如本文所用的術(shù)語“B7-H3調(diào)節(jié)劑”被定義為(I)能夠破壞或阻礙人B7-H3和其天然配體或抗B7-H3抗體之間的相互作用；(2)能夠結(jié)合人B7-H3和其天然配體或抗B7-H3抗體；(3)包含可用于產(chǎn)生能夠結(jié)合人B7-H3和其天然配體或抗B7-H3抗體的抗體的抗原位點(diǎn)；(4)包含可用于篩選能夠結(jié)合人B7-H3和其天然配體或抗B7-H3抗體的抗體的抗原位點(diǎn)；(5)包含可用于產(chǎn)生能夠破壞或阻礙人B7-H3和其天然配體或抗B7-H3抗體之間的相互作用的抗體的抗原位點(diǎn)；(6)包含可用于篩選能夠破壞或阻礙人B7-H3和其天然配體或抗B7-H3抗體之間的相互作用的抗體的抗原位點(diǎn)的任何化合物。取決于其活性是否分別增強(qiáng)T細(xì)胞活化或抑制T細(xì)胞活化，B7-H3調(diào)節(jié)劑可以是“B7-H3激動(dòng)劑”或“B7-H3拮抗劑”。B7-H3激動(dòng)劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑包括B7-H3變體、B7-H3肽拮抗劑、類肽物和小分子、抗B7-H3抗體和免疫球蛋白變體、人B7-H3的氨基酸變體，包括氨基酸置換、缺失和添加的變體或其任何組合及嵌合免疫球蛋白。本發(fā)明的B7-H3激動(dòng)劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑基于參與將人B7-H3結(jié)合到其天然配體或抗B7-H3抗體的B7-H3結(jié)構(gòu)域的鑒定。因此，本發(fā)明提供了具有復(fù)制或模仿人B7-H3的一個(gè)或多個(gè)抗B7-H3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分子結(jié)構(gòu)的B7-H3激動(dòng)齊U、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑。如本文所用的，術(shù)語“B7-H3變體”表示人B7-H3的任何氨基酸變體，包括氨基酸置換、缺失和添加的變體或其任何組合。該定義包括嵌合分子例如人B7-H3/非人嵌合體和其他雜交分子。該定義還包括B7-H3變體分子的任何片段，該片段包含該分子的變異區(qū)域或 雜交區(qū)域。如本文所用的，“抗體”是免疫球蛋白分子，其能夠通過位于該免疫球蛋白分子的可變區(qū)的至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)特異性結(jié)合靶例如碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等。如本文所用的，該術(shù)語不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，而且包括其片段(例如Fab、Fab'、F(ab' ) 2 Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、天然存在的變體、包含具有所需特異性的抗原識(shí)別位點(diǎn)的抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體、“BrrEs(T\“DARTTM”分子和包含具有所需特異性的抗原識(shí)別位點(diǎn)的任何其他修飾的免疫球蛋白分子構(gòu)型。術(shù)語“BiTE”(雙特異性T細(xì)胞銜接子)是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的單個(gè)多肽鏈分子，其中一個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合T-細(xì)胞抗原且其第二個(gè)結(jié)合存在于靶的表面上的抗原(W0 05/061547 ；Baeuerle, P 等人(2008廠/ ///', K A New Class OfAntibodies That Recruit T Cells,，，Drugs of the Future 33 :137-147 ;Bargou,等人2008)^Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-EngagingAntibody，，，Science 321:974-977)。術(shù)語“DART ” (雙親和再靶向試劑)指包含結(jié)合在一起(尤其是通過共價(jià)相互作用)形成可識(shí)別相同或不同表位的至少兩個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)的至少兩條多肽鏈的免疫球蛋白分子。DART 的每條多肽鏈包含免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)和免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)，但是這些區(qū)域不會(huì)相互作用形成表位結(jié)合位點(diǎn)。更確切地，DART 的多肽鏈中的一條(例如，第一條)的免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)與不同的(例如，第二條)DART 多肽鏈的免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)相互作用形成表位結(jié)合位點(diǎn)。相似地，DART 的多肽鏈中的一條(例如，第一條)的免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)與不同的(例如，第二條)DART 多肽鏈的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)相互作用形成表位結(jié)合位點(diǎn)。DART 可以是單特異性、雙特異性、三特異性的等等，從而能夠同時(shí)結(jié)合一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)不同的表位(其可以是相同或不同抗原的表位)。另外DART 可以是單價(jià)、二價(jià)、三價(jià)、四價(jià)、五價(jià)、六價(jià)的等等，從而能夠同時(shí)結(jié)合一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或更多個(gè)分子。DART 的這兩個(gè)特性，S卩，特異性程度和化合價(jià)可被組合例如以產(chǎn)生四價(jià)(即，能夠結(jié)合四組表位)的雙特異性抗體(即，能夠結(jié)合兩個(gè)表位)，等等。PCT 公布 WO 2006/113665、WO 2008/157379 和 W02010/080538 中公開了DART 分子。術(shù)語“單克隆抗體”指同源抗體群，其中單克隆抗體包括參與選擇性結(jié)合抗原的氨基酸(天然存在和非天然存在的氨基酸)。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原位點(diǎn)定位。術(shù)語“單克隆抗體”不僅包括完整的單克隆抗體和全長單克隆抗體，而且包括其片段(例如Fab、Fab' ,F(ab/ ) 2 Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合單克隆抗體、和包含具有所需特異性和結(jié)合抗原的能力的抗原識(shí)別位點(diǎn)的任何其他修飾的免疫球蛋白分子構(gòu)型。關(guān)于抗體的來源或其制備方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體篩選、重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等)，不期望被限制。該術(shù)語包括以上在“抗體”的定義下描述的完整免疫球蛋白以及片段等。術(shù)語“人源化抗體”指一種嵌合分子，該嵌合分子通常使用重組技術(shù)制備，具有衍生自來自非人類物種的免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)，且該分子剩余的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)基于人免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和/或序列?？乖Y(jié)合位點(diǎn)可包含融合到恒定域的完整可變域或僅包含嫁接到可變域中的合適框架區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)可以是野生型或經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換修飾。這去除了在人類個(gè)體中作為免疫原的恒定區(qū)，但是對外來可變區(qū)的免疫反應(yīng)的可能性仍存在(LoBuglio, A. F.等人(1989) “Mouse/HumanChimeric Monoclonal Antibody In Man Kinetics And Immune Response，，，Proc. Natl.Acad. Sci.(美國)86 :4220-4224)。另一種方法不僅集中在提供人來源的恒定區(qū)，而且還對可變區(qū)進(jìn)行修飾以盡可能接近人形式地對其重塑。已知重鏈和輕鏈的可變區(qū)都包含三 個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，這些互補(bǔ)決定區(qū)在對目的抗原的反應(yīng)方面不同并決定結(jié)合能力，其側(cè)翼有在給定物種中相對保守并推定地為CDR提供支架的四個(gè)框架區(qū)(FR)。當(dāng)制備相對于特定抗原的非人類抗體時(shí)，可通過將衍生自非人類抗體的CDR嫁接到待修飾的人類抗體中存在的FR上來對可變區(qū)“重塑”或“人源化”。Sato, K.等人(1993) Cancer Res 53:851-856 ;Riechmann，L 等人(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy, Mature332 :323-327 ；Verhoeyen, M.等人(1988) “Reshaping Human Antibodies !GraftingAn Antilysozyme Activity，，，Science 239 :1534-1536 ;Kettleborough，C. A.等人(1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting TheImportance Of Framework Residues On Loop Conformation，，，Protein Engineering 4:773-3783 ;Maeda，H.等人(1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies WithHIV-Neutralizing Activity, , Human Antibodies Hybridoma 2:124-134 ；Gorman, S. D.等人(1991) “Reshaping A TherapeuticCD4 Antibody，”Proc. Natl. Acad. Sci.(美國)88:4181-4185 ;Tempest，P. R.等人(1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody ToInhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo，’^Bio/Technology 9:266-271 ;Co，M.S.等人(1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy，，，Proc.Natl. Acad. Sci.(美國)88 :2869-2873 ；Carter, P.等人(1992) “Humanization Of AnAnti-pl85her2 Antibody For Human Cancer Therapy, Proc. Natl. Acad. Sci.(美國)89 :4285-4289 ;和 Co,M. S.等人(1992) “Chimeric And Humanized Antibodies WithSpecificity For The CD33 Antigen，，，J. Immunol. 148 :1149-1154 已報(bào)道了該方法在多種抗體中的應(yīng)用。在某些實(shí)施方式中，人源化抗體保留了全部的CDR序列(例如，包含來自小鼠抗體的全部六個(gè)CDR的人源化小鼠抗體)。在其他實(shí)施方式中，人源化抗體具有相對于原始抗體已被改變的一個(gè)或多個(gè)⑶R(—、二、三、四、五、六個(gè))，這些⑶R也被稱為“衍生自”原始抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR的一個(gè)或多個(gè)CDR。如本文所用的，如果抗體或多肽相對于替代表位更頻繁、更快速、以更長的持續(xù)時(shí)間和/或以更大的親和力結(jié)合該表位的話，則該抗體或多肽被表述成“特異性地”結(jié)合另一個(gè)分子的區(qū)域(即，表位)。例如，特異性結(jié)合B7-H3表位的抗體是與結(jié)合其他B7-H3表位或非B7-H3表位相比，其以更大的親和力、親合力，更容易地，和/或以更長的持續(xù)時(shí)間結(jié)合該B7-H3表位。通過閱讀該定義還應(yīng)理解，例如，特異性結(jié)合第一靶的抗體(或部分或表位)可能或可能不特異性或優(yōu)先地結(jié)合第二靶。因此，“特異性結(jié)合”不一定需要(雖然其可以包括)專一結(jié)合。通常，但不一定地，述及結(jié)合是指“特異性的”結(jié)合。如本文所用的，有關(guān)表位是或“保持免疫學(xué)上有活性的”的術(shù)語“免疫學(xué)上有活性的”是指抗體(例如，抗B7-H3抗體)在不同條件下例如，表位已經(jīng)受還原和變性條件之后結(jié)合該表位的能力。不同的生物學(xué)功能與抗B7-H3抗體有關(guān)，包括，但不限于下列一種或多種特異性結(jié)合B7-H3(且特別是表達(dá)在包括但不限于腎癌、前列腺癌或肺癌細(xì)胞的癌細(xì)胞的表面上的B7-H3分子)的能力；競爭性地抑制已知抗B7-H3抗體優(yōu)先結(jié)合B7-H3的能力，包括優(yōu)先結(jié)合原始抗體優(yōu)先結(jié)合的同一 B7-H3表位的能力；體外或體內(nèi)結(jié)合B7-H3暴露在活細(xì)胞表 面上的部分的能力；體外或體內(nèi)結(jié)合B7-H3的暴露在例如但不限于前列腺、肺或腎癌細(xì)胞 的活的癌細(xì)胞的表面上的部分的能力；向其表面上表達(dá)B7-H3的癌性細(xì)胞(例如，腎癌、前列腺癌或肺癌細(xì)胞)遞送化療劑的能力；和/或向其表面上表達(dá)B7-H3的癌細(xì)胞遞送化療劑或可檢測標(biāo)志的能力。如本文所討論的，本發(fā)明的多肽(包括抗體)可具有這些特征中的任何一種或多種。“抗B7-H3等效抗體”或“抗B7-H3等效多肽”指具有與抗B7-H3抗體相關(guān)的一種或多種生物功能，諸如例如結(jié)合特異性的抗體或多肽。如本文所用的，術(shù)語“劑”指生物學(xué)、藥學(xué)或化學(xué)的化合物。非限制性實(shí)例包括簡單或復(fù)雜的有機(jī)或無機(jī)分子、肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、抗體、抗體衍生物、抗體片段、維生素衍生物、碳水化合物、毒素或化療性化合物?？珊铣啥喾N化合物，例如，小分子和低聚體(例如，寡肽和寡核苷酸)和基于不同的核心結(jié)構(gòu)的合成有機(jī)化合物。另外，多種自然來源例如植物或動(dòng)物提取物及類似物可提供用于篩選的化合物?？呻S機(jī)選擇或合理選擇或設(shè)計(jì)本發(fā)明的方法中使用的劑。如本文所用的，當(dāng)不在先考慮或了解參與分子與其天然結(jié)合配體或已知抗體的結(jié)合的具體氨基酸或其他化學(xué)部分而選擇劑時(shí)，劑被表述為被隨機(jī)選擇。隨機(jī)選擇的劑的實(shí)例是通過使用并篩選化合物庫或肽組合庫鑒定到的劑。如本文所用的，當(dāng)在考慮了與劑的作用有關(guān)的靶位點(diǎn)的序列和/或其構(gòu)型的非隨機(jī)基礎(chǔ)上選擇劑時(shí)，劑被表述為被合理地選擇或設(shè)計(jì)。關(guān)于抗B7-H3的劑，目前認(rèn)為B7-H3上存在針對其可產(chǎn)生抗體的至少三種表位且因此對于阻礙B7-H3/抗B7-H3相互作用的劑存在至少三個(gè)作用部位。本發(fā)明還包括在B7-H3和其天然結(jié)合配體的相互作用位點(diǎn)處發(fā)揮作用的劑，但是無論是目前已知的還是隨后鑒定到的其他配體和其有效B7-H3-相互作用位點(diǎn)也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？赏ㄟ^利用組成受體/配體和/或B7-H3/抗B7-H3抗體復(fù)合物的接觸位點(diǎn)的肽序列來合理地選擇或合理地設(shè)計(jì)劑。例如，合理選擇的肽劑可以是這種肽，當(dāng)該肽在其天然環(huán)境中暴露于活細(xì)胞表面時(shí)，其氨基酸序列與呈現(xiàn)在B7-H3上的表位相同。如所期望的，這種劑將通過結(jié)合抗B7-H3抗體或結(jié)合天然配體，減弱或妨礙抗B7-H3抗體與B7-H3的結(jié)合，或B7-H3與其天然配體的結(jié)合。
如本文所用的，關(guān)于抗體的術(shù)語“標(biāo)記的”意在包括通過將可檢測的物質(zhì)例如放射劑或熒光團(tuán)(例如，藻紅蛋白(PE)或異硫氰酸熒光素(還稱為熒光異硫氰酸酯或FITC)偶聯(lián)到(即，物理交聯(lián))抗體上來直接標(biāo)記抗體，以及通過與可檢測物質(zhì)的反應(yīng)性間接標(biāo)記探針或抗體。如本文所用的，關(guān)于抗體的術(shù)語“結(jié)合”包括劑(例如，化療劑)與抗體的共價(jià)和非共價(jià)連接或結(jié)合。抗體與劑(例如，化療劑)的結(jié)合可通過直接結(jié)合或經(jīng)連接至共同的平臺(tái)間接結(jié)合，使得抗體將劑定位到該抗體結(jié)合的癌性細(xì)胞，且其中抗體和劑在生理?xiàng)l件下基本上不會(huì)解離，使得劑不會(huì)被靶向到抗體結(jié)合的同一癌性細(xì)胞或使得劑的效價(jià)不被降低。術(shù)語“生物樣品”包括從個(gè)體獲得的多種樣品類型并可用于診斷或監(jiān)測測定中。該定義包括生物來源的唾液、血液和其他液態(tài)樣品、固態(tài)組織樣品例如活組織檢查樣本或組織培養(yǎng)物或從其獲得的細(xì)胞，和其后代，例如，從收集自疑似患癌癥的個(gè)體的組織樣品，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，從卵巢、肺、前列腺、胰、結(jié)腸和乳房組織獲得的細(xì)胞。該定義還包括在 獲得它們以后已以任何方式操作過的樣品，例如通過用試劑處理、增溶或富集某些組分例如蛋白質(zhì)或多核苷酸或?yàn)榱饲衅康陌竦桨牍腆w或固體基質(zhì)中。術(shù)語“生物樣品”包括臨床樣品，且還包括正在培養(yǎng)的細(xì)胞、細(xì)胞上清液、細(xì)胞裂解液、血清、血漿、生物學(xué)流體和組織樣品。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括可以是或已經(jīng)是用于整合多核苷酸插入物的載體的接受體的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。宿主細(xì)胞包括單個(gè)宿主細(xì)胞的后代，且由于天然的、偶然的或故意的突變該后代可能不一定與原始親本細(xì)胞完全相同(在形態(tài)方面或在基因組DNA互補(bǔ)方面)。宿主細(xì)胞包括用本發(fā)明的多核苷酸體內(nèi)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。如本文所用的，術(shù)語“延遲轉(zhuǎn)移的形成”含義是推遲、阻礙、減緩、阻滯、穩(wěn)定和/或延緩轉(zhuǎn)移的形成。取決于待治療的癌癥和/或個(gè)體的病史，這種延遲可以是不同的時(shí)間長度。如對本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的，足夠或顯著的延遲實(shí)際上可包括預(yù)防，因?yàn)閭€(gè)體未形成轉(zhuǎn)移。如本文所用的，在一個(gè)實(shí)施方式中，藥物組合物的“有效量”是足以實(shí)現(xiàn)有益或期望結(jié)果的量，所述結(jié)果包括但不限于臨床結(jié)果，例如縮小腫瘤的尺寸(就癌癥例如乳腺癌或前列腺癌來講)、阻滯癌性細(xì)胞的生長、延遲轉(zhuǎn)移的形成、減少由疾病產(chǎn)生的癥狀、提高患該疾病的個(gè)體的生活質(zhì)量、減少治療該疾病所需的其他藥劑的劑量、例如通過靶向和/或內(nèi)化增強(qiáng)另一種藥物的療效、延遲疾病的進(jìn)展和/或延長個(gè)體的存活期。有效量可以以一次或多次施用來施用。為了本發(fā)明的目的，藥物、化合物或藥物組合物的有效量是足以降低癌性細(xì)胞的增殖(或破壞癌性細(xì)胞)并足以直接或間接地減少和/或延遲癌性細(xì)胞轉(zhuǎn)移的形成或增長。在某些實(shí)施方式中，藥物、化合物或藥物組合物的有效量可以或可以不聯(lián)合另一種藥物、化合物或藥物組合物來達(dá)到。因此，可在施用一種或多種化療劑的情況中考慮“有效量”，且如果聯(lián)合一種或多種其他劑可能實(shí)現(xiàn)或?qū)崿F(xiàn)期望的結(jié)果，可考慮以有效量給予單一的劑。雖然個(gè)體的需要不同，每種組分的有效量的最佳范圍的確定是本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)的。典型的劑量包括O. I至100mg/kg/體重。優(yōu)選的劑量包括I至100mg/kg/體重。最優(yōu)選的劑量包括10至100mg/kg/體重。如本文所用的，當(dāng)核酸分子、劑、抗體、組合物或細(xì)胞等基本上與其原始來源中天然存在的污染性核酸分子、抗體、劑、組合物或細(xì)胞等分離時(shí)，該核酸分子或劑、抗體、組合物或細(xì)胞等被表述成“分離的”。術(shù)語“個(gè)體”指脊椎動(dòng)物，優(yōu)選地哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不限于人、家畜、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物、寵物、靈長類、小鼠和大鼠。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，術(shù)語個(gè)體表示人。本文中可互換地使用術(shù)語“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”以表示任何長度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直鏈的或支鏈的，其可包含修飾過的氨基酸，且其中可以插入非氨基酸。該術(shù)語還包括已天然地或通過干預(yù)例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；⒘姿峄蛉魏纹渌僮骰蛐揎?，例如與標(biāo)記組分偶聯(lián)而被修飾的氨基酸聚合物。還包括在該定義內(nèi)的是例如，包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括，例如，非天然氨基酸等)以及本領(lǐng)域已知的其他修飾的多肽。應(yīng)理解，因?yàn)楸景l(fā)明的多肽是基于抗體的，該多肽可形成為單鏈或結(jié)合在一起的鏈。還包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是本文所述的B7-H3肽激動(dòng)劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑(包括抗B7-H3抗體)的類肽物。這些類肽物包括其中至少一個(gè)氨基酸殘基被自然界中不經(jīng)常·發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基(例如氨基酸的D型異構(gòu)體或氨基酸的N-烷基化的物類)置換的肽。在其他實(shí)施方式中，類肽物通過用酰胺電子等排體取代B7-H3肽激動(dòng)劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑中的至少一個(gè)酰胺鍵(_C( = 0)-ΝΗ-)來構(gòu)建。合適的酰胺電子等排體包括-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-S(O)-、-CH2-S(O)2-、-CH2-CH2-、-CH = CH-(E 或 Z 形式)、_C( = O)-CH2-、-CH(CN)-NH-、-C (OH) -CH2-和-O-C ( = O) -NH-0為用于被酰胺電子等排體替代的合適候選的B7-H3肽激動(dòng)劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑中的酰胺鍵包括可被B7-H3肽激動(dòng)劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑治療的預(yù)期受治療者的內(nèi)源酯酶或蛋白酶水解的鍵。如本文所用的，術(shù)語“基本純”是指至少50%純(即，不含污染物)，更優(yōu)選地至少90%純，更優(yōu)選地至少95%純，更優(yōu)選地至少98%純，更優(yōu)選地至少99%純且最優(yōu)選地大于99%純的材料。如本文所用的，術(shù)語“毒素”指在細(xì)胞內(nèi)造成不利反應(yīng)的任何物質(zhì)。例如，定位到癌性細(xì)胞的毒素將對癌性細(xì)胞產(chǎn)生不利的、有時(shí)有害的作用。毒素的實(shí)例包括但不限于紫杉燒、美登木素、auristatin (例如，單甲基auristatin (MMAE)、單甲基auristatinF(MMAF)、auristatin E(AE)等)(例如在美國專利第 5, 208, 020 ;5，416，064 ;6，333，410 ；6，340，701 ;6，372，738 ;6，436，931 ;6，441，163 ;6，596，757 ;7，276，497 ;7，585，857 ；或7，851，432號(hào)中公開的auristatin)、卡奇霉素、蒽環(huán)(例如，阿霉素)、CC-1065類似物、多西他賽；組織蛋白酶B或E ;蓖麻毒素、多花白樹毒蛋白、假單胞菌(Pseudomonas)外毒素、白喉毒素和RNA酶；放射標(biāo)記的抗體(例如，tiuxetan-偶聯(lián)的或標(biāo)記有毒性放射性同位素(例如，9°Y、131I、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi、213Bi、225AC 等)。如本文所用的，術(shù)語“治療(treatment) ”或“治療(treating) ”表示用于獲得有益的或期望的結(jié)果、包括且優(yōu)選地是有益或期望的臨床結(jié)果的方法。這些有益或期望的臨床結(jié)果包括但不限于以下一種或多種減少癌性細(xì)胞或其他病態(tài)細(xì)胞的增殖(或破壞)、減少癌癥中發(fā)現(xiàn)的癌性細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、縮小腫瘤的尺寸、減少由疾病產(chǎn)生的癥狀、提高患該疾病的個(gè)體的生活質(zhì)量、減少治療該疾病所需的其他藥劑的劑量、延遲疾病的進(jìn)展和/或延長個(gè)體的存活期。如本文所用的，術(shù)語癌癥預(yù)期包括由癌細(xì)胞的存在表征的癌癥，所述癌細(xì)胞選自由以下組成的組腎上腺腫瘤、AIDS-相關(guān)癌癥、腺泡狀軟組織肉瘤、星形細(xì)胞瘤、膀胱癌(鱗狀細(xì)胞癌和移行細(xì)胞癌)、骨癌(造釉細(xì)胞瘤、動(dòng)脈瘤骨囊腫、骨軟骨瘤、骨肉瘤)、腦和脊髓癌、轉(zhuǎn)移性腦瘤、乳腺癌、頸動(dòng)脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細(xì)胞癌、透明細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、皮膚良性纖維性組織細(xì)胞瘤、促結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞腫瘤、室管膜細(xì)胞瘤、尤文腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維發(fā)育不全、骨纖維性發(fā)育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞病、生殖細(xì)胞瘤、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、胰島細(xì)胞瘤、卡波西肉瘤、腎癌(腎胚細(xì)胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤性腫瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤性腫瘤、肝癌(肝胚細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌)、淋巴瘤、肺癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、多發(fā)性內(nèi)分泌瘤病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺瘤、小兒癌癥、外周神經(jīng)鞘瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑色素瘤、罕見血液病、腎轉(zhuǎn)移性癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉(zhuǎn)移性癌和子宮癌(宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和平滑肌瘤)的細(xì)胞。III.制備抗體和多肽的方法 制備單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域已知的?？刹捎玫囊环N方法是Kohler，G.等人(1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of PredefinedSpecificity, Mature 256 :495-497的方法或其修改版。通常，在非人類物種，例如小鼠中研發(fā)單克隆抗體。一般地，使用小鼠或大鼠用于免疫但是也可使用其他動(dòng)物?？贵w通過用免疫原量的包含人B7-H3的細(xì)胞、細(xì)胞提取物或蛋白質(zhì)制劑免疫小鼠而產(chǎn)生。免疫原可以是但不限于原代細(xì)胞、培養(yǎng)的細(xì)胞系、癌性細(xì)胞、核酸或組織。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用了人肺癌細(xì)胞。用于免疫的細(xì)胞，例如人的睪丸或胰腺癌或胃細(xì)胞在它們用作免疫原之前，可培養(yǎng)一段時(shí)間(例如，至少24小時(shí))。可使用細(xì)胞(例如,人的睪丸、胃或胰的腺癌細(xì)胞)本身或與不變性的佐劑例如Ribi組合作為免疫原。一般地，細(xì)胞應(yīng)保持完好且優(yōu)選地當(dāng)用作免疫原時(shí)是存活的。相比破損的細(xì)胞，完好的細(xì)胞可允許免疫過的動(dòng)物更好地檢測抗原。變性或苛刻的佐劑，例如弗氏佐劑的使用可損壞細(xì)胞且因此不被提倡。免疫原可以以周期性的間隔例如每兩周或每周地多次施用，或可以以維持動(dòng)物存活力(例如，在組織重組體中)的那種方式施用。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過使用過表達(dá)B7-H3的宿主細(xì)胞作為免疫原獲得結(jié)合B7-H3的單克隆抗體。示例性而非限制地，這些細(xì)胞包括人肺癌細(xì)胞和人結(jié)腸癌細(xì)胞。為監(jiān)測抗體反應(yīng)，可從動(dòng)物獲得小份的生物樣品(例如，血液)并測試其對免疫原的抗體滴度。可取出脾和/或幾個(gè)大的淋巴結(jié)并離解成單個(gè)細(xì)胞。如需要的話，可通過將細(xì)胞懸浮液涂到包被有抗原的板或孔來篩選脾細(xì)胞(去除非特異性粘附細(xì)胞之后)。表達(dá)抗原特異性的膜結(jié)合免疫球蛋白的B細(xì)胞將結(jié)合該培養(yǎng)板，且不會(huì)被剩余的懸浮液沖洗掉。然后所得的B細(xì)胞或所有分開的脾細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞(例如，X63-Ag8. 653和來自SaIk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, CA 的那些細(xì)胞)融合。聚乙二醇(PEG)可用來將脾或淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤。然后可在選擇性培養(yǎng)基(例如，次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷培養(yǎng)基，以另外的方式稱為“HAT培養(yǎng)基”)中培養(yǎng)雜交瘤。然后通過有限稀釋將所得的雜交瘤鋪到培養(yǎng)板上并使用例如FACS (熒光激活細(xì)胞分選術(shù))或免疫組織化學(xué)(IHC)篩選來測定特異性結(jié)合免疫原的抗體的產(chǎn)生。然后體外(例如，在組織培養(yǎng)瓶或中空的纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(例如，作為小鼠體內(nèi)的腹水)培養(yǎng)所選擇的分泌單克隆抗體的雜交瘤。作為細(xì)胞融合技術(shù)的另一種替代方案，Epstein-Barr病毒(EBV)永生化的B細(xì)胞可用來產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體。如需要的話，對雜交瘤進(jìn)行擴(kuò)增和亞克隆，并通過傳統(tǒng)的測定方法(例如，F(xiàn)ACS、IHC、放射免疫檢定、酶免疫測定、熒光免疫測定等)測定上清液的抗免疫原活性。在另一個(gè)替代方案中，抗B7-H3單克隆抗體和任何其他等效抗體可被測序并通過本領(lǐng)域已知的任何手段(例如，人源化、使用轉(zhuǎn)基因小鼠來產(chǎn)生完整的人抗體、噬菌體展示技術(shù)等)重組產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方式中，對抗B7-H3單克隆抗體測序并然后將多核苷酸序列克隆到用于表達(dá)或增殖的載體中。編碼目的抗體的序列可保持在宿主細(xì)胞內(nèi)的載體中且然后可擴(kuò)增該宿主細(xì)胞并將其冷凍以將來使用。
抗B7-H3單克隆抗體和任何其他等效抗體的多核苷酸序列可用于基因操作以產(chǎn)生“人源化的”抗體以提高抗體的親和力或其他特征。人源化一種抗體的通用原理包括保留該抗體的抗原結(jié)合部分的基礎(chǔ)序列，同時(shí)用人抗體序列取代抗體的非人類的剩余部分。有四個(gè)常規(guī)步驟來人源化單克隆抗體。這四個(gè)步驟是(I)確定初始抗體輕鏈和重鏈可變域的核苷酸和預(yù)測的氨基酸序列(2)設(shè)計(jì)人源化的抗體，即決定在人源化過程期間使用哪種抗體框架區(qū)(3)實(shí)際的人源化方法學(xué)/技術(shù)和(4)人源化抗體的轉(zhuǎn)染和表達(dá)。參見，例如，美國專利第 4，816，567 ;5，807，715 ;5，866，692 ;和 6，331，415 號(hào)。已描述了包含衍生自非人類的免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)的許多“人源化的”抗體分子，包括具有融合到人恒定域的嚙齒動(dòng)物V區(qū)或修飾過的嚙齒動(dòng)物V區(qū)及其有關(guān)的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)的嵌合抗體(參見，例如，Winter等人(1991) “Man-madeAnditbodies, ”Nature 349 :293-299 ;Lobuglio 等人(1989) “Mouse/Human ChimericMonoclonal Antibody In Man Kinetics And Immune Response, Proc. Natl. Acad.Sci.(美國)86 :4220-4224(1989), Shaw 等人(1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody(17-1A)To A Colon Cancer Tumor-AssociatedAntigen,，，J. Immunol. 138 :4534-4538,和 Brown 等人(1987) “Tumor-SpecificGenetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,，，CancerRes. 47 :3577-3583) 0其他參考文獻(xiàn)描述了在與合適的人抗體恒定域融合之前被嫁接到人支撐框架區(qū)(FR)的哨齒動(dòng)物⑶R(參見,例如,Riechmann, L.等人(1988)“Reshaping HumanAntibodies for Therapy, Mature 332:323-327 ；Verhoeyen,M.等人(1988) “ReshapingHuman Antibodies Grafting An Antilysozyme Activity,，，Science 239 :1534-1536 ;和Jones 等人(1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A HumanAntibody With Those From A Mouse, ” Nature 321:522-525)。另一參考文獻(xiàn)描述了被重組鑲嵌的嚙齒動(dòng)物框架區(qū)支撐的嚙齒動(dòng)物CDR。參見，例如，歐洲專利公布第519，596號(hào)。這些“人源化的”分子被設(shè)計(jì)成將不想要的針對嚙齒動(dòng)物抗人抗體分子的免疫反應(yīng)最小化，這種不想要的免疫反應(yīng)限制了那些部分在人類接受體中的治療應(yīng)用的持續(xù)期和有效性。Daugherty 等人(1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning,CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal AntibodyDirectedAgainst The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,，H Acids Res. 19:2471-2476和美國專利第6，180，377 ;6，054，297 ;5，997，867 ;和5，866，692號(hào)中公開了還可使用的人源化抗體的其他方法。本發(fā)明還包括本發(fā)明的抗體，例如鼠抗B7-H3的單鏈可變區(qū)片段(“scFv”)。通過借助于使用短的連接肽連接輕鏈和/或重鏈可變區(qū)制備單鏈可變區(qū)片段。Bird等人(1988) ( “Single-Chain Antigen-Binding Proteins, ” Science 242:423-426)描述了在一個(gè)可變區(qū)的羧基端和另一個(gè)可變區(qū)的氨基端之間橋接了約3. 5nm的連接肽的實(shí)例。已設(shè)計(jì)并使用了其他序列的接頭(Bird等人(1988) “Single-Chain Antigen-BindingProteins, ” Science 242 :423-426)。為了另外的功能,例如,連接藥物或連接至固體支持體，可進(jìn)而對接頭進(jìn)行修飾。單鏈變體可通過重組或合成產(chǎn)生。對于scFv的合成生產(chǎn)，可使用自動(dòng)合成儀。對于scFv的重組生產(chǎn)，可將包含編碼該scFv的多核苷酸的合適質(zhì)粒引入到合適的宿主細(xì)胞，例如真核細(xì)胞，例如酵母、植物、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或原核細(xì)胞例如大腸桿菌(E. coli.)。編碼目的scFv的多核苷酸可通過常規(guī)操作例如連接多核苷酸來制備?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)分離所得的scFv。
本發(fā)明包括對結(jié)合B7-H3的抗體和多肽和B7-H3激動(dòng)劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑的修飾，包括不明顯影響其特性的功能上等效的抗體和多肽和具有增強(qiáng)或降低的活性的變體的修飾。多肽的修飾是本領(lǐng)域常規(guī)的做法且本文不必詳細(xì)描述。修飾過的多肽的實(shí)例包括不明顯有害地改變功能活性或化學(xué)類似物的用途的具有保守氨基酸殘基置換、一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失或添加的多肽?？杀幌嗷ケＪ刂脫Q的氨基酸殘基包括但不限于甘氨酸/丙氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；絲氨酸/蘇氨酸；賴氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸。這些多肽還包括糖基化和未糖基化的多肽，以及具有其他轉(zhuǎn)錄后修飾，諸如例如，使用不同糖的糖基化、乙?；土姿峄亩嚯?。優(yōu)選地，氨基酸置換將是保守的，即，取代的氨基酸將具有與原始氨基酸的化學(xué)性質(zhì)相似的化學(xué)性質(zhì)。這些保守置換是本領(lǐng)域已知的，且以上已提供了實(shí)例。氨基酸修飾范圍可從改變或修飾一個(gè)或多個(gè)氨基酸至一個(gè)區(qū)域例如可變區(qū)的完全重新設(shè)計(jì)。可變區(qū)的變化可改變結(jié)合親和力和/或特異性。其他修飾方法包括使用本領(lǐng)域已知的偶聯(lián)技術(shù)，包括但不限于酶學(xué)手段、氧化型置換和螯合。修飾可被用于例如連接用于免疫測定的標(biāo)簽，例如連接用于放射免疫測定的放射性部分。使用本領(lǐng)域建立的方法制備修飾過的多肽，且可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測定篩選這些多肽。本發(fā)明還包括包含來自本發(fā)明的多肽和抗體的一個(gè)或多個(gè)片段或區(qū)域的融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了包含輕鏈可變區(qū)的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸和重鏈可變區(qū)的至少10個(gè)氨基酸的融合多肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，融合多肽包含異源免疫球蛋白的恒定區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，融合多肽包含由公開保藏的雜交瘤產(chǎn)生的抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。為了本發(fā)明的目的，抗體融合蛋白包含特異性結(jié)合B7-H3的一個(gè)或多個(gè)多肽結(jié)構(gòu)域和在天然分子中其未連接的另一氨基酸序列，例如來自另一個(gè)區(qū)域的異源序列或同源序列?？笲7-H3多肽和其他B7-H3激動(dòng)劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑可通過本領(lǐng)域已知的方法，例如通過合成或重組制備。產(chǎn)生B7-H3肽激動(dòng)劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑的一種方法包括化學(xué)合成該多肽，然后在適合獲得天然構(gòu)型，也就是，正確的二硫鍵連接的氧化條件下處理。這可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法學(xué)實(shí)現(xiàn)(參見，例如，Kelley, R. F.等人(1990)在GENETrcEngineering Principles 麵 Methods，Setlow J. K. Ed.，Plenum Press，N. Y.，弟 12 卷，弟 1_19 頁中；Stewart，J. M 等人(1984) Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co. , Rockford, IL ;還參見美國專利第 4，105，603 ；3, 972，859 ；3, 842，067 ;和 3，862,925 號(hào))。本發(fā)明的肽可常規(guī)地使用固相肽合成法制備(Merrifield, B. (1986) “SolidPhase Synthesis,’’Science 232(4748) :341-347 ；Houghten, R. A. (1985)“General MethodFor The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides SpecificityOf Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,，，Proc.Natl. Acad. Sci.(美國)82(15) :5131-5135 ;Ganesan，A. (2006) “Solid-Phase SynthesisIn The Twenty-First Century,，，Mini Rev. Med. Chem. 6 (I) :3-10)。還在另一種替代方案中，完整的人抗體可通過使用已被構(gòu)建成表達(dá)特定人免疫球蛋白蛋白質(zhì)的商購小鼠來獲得。被設(shè)計(jì)成產(chǎn)生更期望(例如，完整的人抗體)或更強(qiáng)健的免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還可用于產(chǎn)生人源化抗體或人抗體。該技術(shù)的實(shí)例是 XEN_USETM(AbgeniX，Inc.，F(xiàn)remont, CA)及 HuMAB-M.O.(JSE 和 TC MOUSE (都來自Medarex, Inc. , Princeton, NJ)。 在替代方案中，抗體可通過重組制備并使用本領(lǐng)域已知的任何方法表達(dá)。可通過先分離由宿主動(dòng)物制備的抗體，獲得基因序列，并使用該基因序列在宿主細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞)中重組表達(dá)抗體來通過重組制備抗體?？刹捎玫牧硪环N方法是在植物(例如，煙草)或轉(zhuǎn)基因奶中表達(dá)抗體序列。已公開了用于在植物或奶中重組表達(dá)抗體的合適方法(參見，例如，Peeters 等人(2001) “Production Of Antibodies And Antibody Fragments InPlants, Vaccine 19 :2756 ;Lonberg,N.等人(1995)“Human Antibodies From TransgenicMice,，，Int. Rev. Tmmunol 13 :65-93 ；和 Pollock 等人(1999) “Transgenic Milk As AMethod For The Production Of Recombinant Antibodies,，，J.Immunol Methods 231 147-157)。制備抗體衍生物例如人源化的抗體、單鏈抗體等的合適方法是本領(lǐng)域已知的。在另一種替代方案中，抗體可通過噬菌體展示技術(shù)重組制備(參見，例如美國專利第5，565，332 ;5，580，717 ;5，733，743 ;6，265，150 號(hào)；和 Winter, G.等人(1994) “MakingAntibodies By Phage Display Technology, ^Annu. Rev. Immunol. 12. 433-455)。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的Edman降解法對目的抗體或蛋白質(zhì)進(jìn)行測序?？墒褂脧馁|(zhì)譜或Edman降解產(chǎn)生的肽信息設(shè)計(jì)用來克隆目的蛋白質(zhì)的探針或引物?？寺∧康牡鞍踪|(zhì)的替代方法是通過使用純化的B7-H3或其部分來“淘選”表達(dá)目的抗體或蛋白質(zhì)的細(xì)胞。B7-H3以“2Ig”形式和“4Ig”形式存在。人B7-H3的“2Ig”形式的氨基酸序列是(SEQ ID N01)MLRRRGSPGM GVHVGAALGA LffFCLTGALE VQVPEDPVVA LVGTDATLCCSFSPEPGFSL AQLNLIffQLT DTKQLVHSFA EGQDQGSAYA NRTALFPDLLAQGNASLRLQ RVRVADEGSF TCFVSIRDFG SAAVSLQVAA PYSKPSMTLEPNKDLRP⑶T VTITCSSYRG YPEAEVFffQD GQGVPLTGNV TTSQMANEQGLFDVHSVLRV VLGANGTYSC LVRNPVLQQD AHGSVTITGQ PMTFPPEALffVTVGLSVCLI ALLVALAFVC WRKIKQSCEE ENAGAEDQDG EGEGSKTALQPLKHSDSKED DGOEIA編碼人B7-H3 的 “2Ig” 形式的 cDNA 序列是(SEQ ID NO 2)
atgctgcgtc ggcggggcagccctggcatg ggtgtgcatg tgggtgcagc cctgggagcactgtggttct gcctcacaggagccctggag gtccaggtcc ctgaagaccc agtggtggcactggtgggca ccgatgccaccctgtgctgc tccttctccc ctgagcctgg cttcagcctggcacagctca acctcatctggcagctgaca gataccaaac agctggtgca cagctttgctgagggccagg accagggcagcgcctatgcc aaccgcacgg ccctcttccc ggacctgctggcacagggca acgcatccctgaggctgcag cgcgtgcgtg tggcggacga gggcagcttcacctgcttcg tgagcatccgggatttcggc agcgctgccg tcagcctgca ggtggccgct
ccctactcga agcccagcatgaccctggag cccaacaagg acctgcggcc aggggacacggtgaccatca cgtgctccagctaccggggc taccctgagg ctgaggtgtt ctggcaggatgggcagggtg tgcccctgactggcaacgtg accacgtcgc agatggccaa cgagcagggcttgtttgatg tgcacagcgtcctgcgggtg gtgctgggtg cgaatggcac ctacagctgcctggtgcgca accccgtgctgcagcaggat gcgcacggct ctgtcaccat cacagggcagcctatgacat tccccccagaggccctgtgg gtgaccgtgg ggctgtctgt ctgtctcattgcactgctgg tggccctggctttcgtgtgc tggagaaaga tcaaacagag ctgtgaggaggagaatgcag gagctgaggaccaggatggg gagggagaag gctccaagac agccctgcagcctctgaaac actctgacagcaaagaagat gatggacaag aaatagcc人B7-H3的“2Ig”形式的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)(下文以加粗并加下劃線方式示出)完全包括在人B7-H3的“4Ig”形式內(nèi)(SEQ ID NO 76)MLRRRGSPGM GVHVGAALGALffFCLTGALE VQVPEDPVVA LVGTDATLCCSFSPEPGFSL AQLNLIWQLTDTKQLVHSFA EGQDQGSAYA NRTALFPDLLAQGNASLRLQ RVRVADEGSFTCFVSIRDFG SAAVSLQVAA PYSKPSMTLEPNKDLRP⑶T VTITCSSYQGYPEAEVFWQD GQGVPLTGNV TTSQMANEQGLFDVHSILRV VLGANGTYSCLVRNPVLQQD AHSSVTITPQ RSPTGAVEVQVPEDPVVALV GTDATLRCSFSPEPGFSLAQ LNLIffQLTDT KQLVHSFTEGRDQGSAYANR TALFPDLLAQGNASLRLQRV RVADEGSFTC FVSIRDFGSAAVSLQVAAPY SKPSMTLEPN KDLRPGDTVT ITCSSYRGYP EAEVFffQDGQGVPLTGNVTT SQMANEQGLFDVHSVLRVVL GANGTYSCLV RNPVLQQDAHGSVTITGQPM TFPPEALffVTVGLSVCLIAL LVALAFVCffR KIKQSCEEENAGAEDQDGEG EGSKTALQPLKHSDSKEDDG QEIA編碼人B7-H3的“4Ig”形式的cDNA序列是(SEQ ID NO :77);以加粗并加下劃線方式示出了編碼B&-H3的“2Ig”形式的殘基atRCtRCRtC RRCRRRRCaRCCCtRRCatR RRtRtRCatR tRRRtRCaRC CCtRRRaRCactRtRRttct RcctcacaRRaRccctRRaR gtccaggtcc ctgaagaccc agtggtggcactggtgggca ccgatgccaccctgtgctgc tccttctccc ctgagcctgg cttcagcctggcacagctca acctcatctggcagctgaca gataccaaac agctggtgca cagctttgctgagggccagg accagggcagcgcctatgcc aaccgcacgg ccctcttccc ggacctgctggcacagggca acgcatccctgaggctgcag cgcgtgcgtg tggcggacga gggcagcttcacctgcttcg tgagcatccgggatttcggc agcgctgccg tcagcctgca ggtggccgctccctactcga agcccagcatgaccctggag cccaacaagg acctgcggcc aggggacacg
gtgaccatca cgtgctccag ctaccagggc taccctgagg ctgaggtgtt ctggcaggatgggcagggtg tgcccctgac tggcaacgtg accacgtcgc agatggccaa cgagcagggcttgtttgatg tgcacagcat cctgcgggtg gtgctgggtg caaatggcac ctacagctgcctggtgcgca accccgtgct gcagcaggat gcgcacagct ctgtcaccat cacaccccagagaagcccca caggagccgt ggaggtccag gtccctgagg acccggtggt ggccctagtgRRcaccgatg ccaccctgcg ctgctccttc tcccccgagc ctggcttcag cctggcacagctcaacctca tctggcagct gacagacacc aaacagctgg tgcacagttt caccgaaggccgggaccagg gcagcgccta tgccaaccgc acggccctct tcccggacct gctggcacaa RRcaatgcat ccctgaggct gcagcgcgtg cgtgtggcgg acgagggcag cttcacctgcttcgtgagca tccgggattt cggcagcgct gccgtcagcc tgcaggtggc cgctccctactcgaagccca gcatgaccct ggagcccaac aaggacctgc ggccagggga cacggtgaccatcacgtgct ccagctaccg gggctaccct gaggctgagg tgttctggca ggatgggcagggtgtgcccc tgactggcaa cgtgaccacg tcgcagatgg ccaacgagca gggcttgtttgatgtgcaca gcgtcctgcg ggtggtgctg ggtgcgaatg gcacctacag ctgcctggtgcgcaaccccg tgctgcagca ggatgcgcac ggctctgtca ccatcacagg gcagcctatgacattccccc cagaggccct gtgggtgacc gtggggctgt ctgtctgtct cattgcactgctggtggccc tggctttcgt gtgctggaga aagatcaaac agagctgtga ggaggagaatgcaggagctg aggaccagga tggggaggga gaaggctcca agacagccct gcagcctctgaaacactctg acagcaaaga agatgatgga caagaaatag cc“淘選”方法可通過以下步驟進(jìn)行從表達(dá)B7-H3的組織或細(xì)胞獲得cDNA文庫，在第二種細(xì)胞類型中過表達(dá)該cDNA并篩選特異性結(jié)合B7-H3的第二種細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染細(xì)胞?？稍诂F(xiàn)有技術(shù)中找到通過“淘選”來克隆編碼細(xì)胞表面蛋白的哺乳動(dòng)物基因中使用的方法的詳細(xì)描述(參見，例如，Aruffo, A.等人(1987) “Molecular Cloning Of A CD28 cDNABy A High-Efficiency COS Cell Expression System, , Proc. Natl. Acad. Sci.(美國)84:8573-8577 和 Stephan，J.等人(1999) “Selective Cloning Of Cell Surface ProteinsInvolved In Organ Development !Epithelial Glycoprotein Is Involved In NormalEpithelial Differentiation，，’Endocrinol. 140 :5841-5854)。編碼抗B7-H3抗體和其他B7_H3肽激動(dòng)劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑的cDNA可通過根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法反轉(zhuǎn)錄來自特定細(xì)胞類型的mRNA獲得。具體地，mRNA可使用各種裂解酶或化學(xué)溶液根據(jù)Sambrook等人(同上)提供的方法分離或遵循廠家(例如，Qiagen,Invitrogen,Promega)提供的附隨說明書用商購核酸結(jié)合樹脂提取。然后將合成的cDNA引入到表達(dá)載體中以在第二種類型的細(xì)胞中產(chǎn)生目的抗體或蛋白質(zhì)。這意味著作為游離體或作為染色體DNA的組成部分的表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中必須是可復(fù)制的。合適的表達(dá)載體包括但不限于質(zhì)粒、包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒的病毒載體和黏端質(zhì)粒?？赏ㄟ^許多合適的手段中的任何一種將包含目的多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞，包括電穿孔法、使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質(zhì)轉(zhuǎn)染；基因槍轉(zhuǎn)化法；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；和感染(例如，當(dāng)載體是致病原例如牛痘病毒時(shí))。引入載體或多核苷酸的選擇將經(jīng)常取決于宿主細(xì)胞的特征。能夠過表達(dá)異源DNA的任何宿主細(xì)胞可用于分離編碼目的抗體、多肽或蛋白質(zhì)的基因的目的。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括但不限于COS、HeLa和CHO細(xì)胞。優(yōu)選地，與宿主細(xì)胞中相應(yīng)內(nèi)源目的抗體或蛋白質(zhì)(如果存在的話)的表達(dá)水平相比，宿主細(xì)胞以高出約5倍，更優(yōu)選地高出10倍，甚至更優(yōu)選地高出20倍的水平表達(dá)cDNA。特異性結(jié)合B7-H3的宿主細(xì)胞的篩選通過免疫測定或FACS實(shí)現(xiàn)?？设b定到過表達(dá)目的抗體或蛋白質(zhì)的細(xì)胞?，F(xiàn)在可被利用以產(chǎn)生編碼所得蛋白質(zhì)相對于親本B7-H3肽激動(dòng)劑、拮抗劑或調(diào)節(jié)劑的添加、缺失或氨基酸序列變化的突變B7-H3肽激動(dòng)劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑的多種技術(shù)也是可獲得的。本發(fā)明包括包含本發(fā)明的抗體的氨基酸序列的多肽?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法制備本發(fā)明的多肽?？赏ㄟ^抗體的蛋白酶解或其他降解，通過上述重組方法(即，單一或融合多肽)或通過化學(xué)合成產(chǎn)生多肽。通常通過化學(xué)合成制備抗體的多肽，尤其是多達(dá)約50個(gè)氨基酸的較短的多肽。化學(xué)合成的方法是本領(lǐng)域已知的并且是商購的。例如，可通過自動(dòng)多肽合成儀使用固相方法產(chǎn)生抗B7-H3多肽?！?br> IV.用于篩選多肽和單克隆抗體的方法多種方法可用來篩選結(jié)合B7-H3的多肽和單克隆抗體。應(yīng)理解“結(jié)合”是指生物學(xué)或免疫學(xué)上有關(guān)的特異性結(jié)合，而不是指例如當(dāng)針對非特異性的靶以非常高的濃度使用免疫球蛋白時(shí)可能發(fā)生的非特異性結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用標(biāo)準(zhǔn)篩選技術(shù)篩選結(jié)合B7-H3的單克隆抗體。以這種方式獲得了抗B7-H3單克隆抗體。本發(fā)明的優(yōu)選雜交瘤是產(chǎn)生抗體BRCA69D、BRCA84D或PRCA157的雜交瘤?？设b定到結(jié)合B7-H3的另外的單克隆抗體。為了該目的，根據(jù)其結(jié)合癌組織而不結(jié)合非癌性細(xì)胞的差異化能力來篩選單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，選擇到結(jié)合B7-H3并還與人的癌性細(xì)胞或組織交叉反應(yīng)但不在相同程度上與正常細(xì)胞或組織交叉反應(yīng)的單克隆抗體?？杀挥糜诤Y選的一種方法是免疫組織化學(xué)(IHC)。標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。參見，例如，Anima1j Cell Cultuee Methqds(J. P. Mather和D. Barnes,編輯，Academic Press, NY,第57卷,第18和19章,第314-350頁，1998)。生物樣品(例如，組織)可從活組織檢查、尸體解剖或尸體剖檢獲得。為了確定B7-H3是否只存在于癌性細(xì)胞上，可使用抗B7-H3抗體檢測B7-H3在來自患癌癥的個(gè)體的組織上的存在，而來自患癌癥的該個(gè)體的其他非癌性組織或來自未患癌癥的個(gè)體的組織用作對照?？蓪⒔M織包埋到防止冷凍期間的損壞的固體或半固體物質(zhì)中(例如，瓊脂糖凝膠或OCT)并然后切片以染色。來自不同器官和處于不同級別的癌癥可用來篩選單克隆抗體?？捎糜诤Y選目的的組織的實(shí)例包括但不限于卵巢、乳房、肺、前列腺、結(jié)腸、腎、皮膚、甲狀腺、腦、心臟、肝、胃、神經(jīng)、血管、骨、上消化道和胰?？捎糜诤Y選目的的不同癌癥類型的實(shí)例包括但不限于癌、腺癌、肉瘤、腺肉瘤、淋巴瘤和白血病。又在另一替代方案中，癌性細(xì)胞系例如HMEC(Bio Whittaker CC-2251)、HUVEC(原代內(nèi)皮細(xì)胞)、BT-474 (ATCC# HTB-20)、MCF7 (ATCC# HTB22)、MDA-MB-175-VII (ATCC#HB-25)、MDA-MB-361 (ATCC# HB-27)、SKBR3 (ATCC# HTB-30)、A549 (ATCC# CCL-185)、Calu-3 (ATCC# HTB-55)、SKMES-I (ATCC# HTB-58)、ES-2 (ATCC# CRL-1978)、SK0V3 (ATCC#HTB-77)、Panc-I(ATCC#CRL-1469)、AsPC-I(ATCC# CRL-1682)、HPAF-II(ATCC# CRL-1997)、Hs700T (ATCC# HTB-174), Colo205 (ATCC# CCL-222)、HT-29 (ATCC# HTB-38), SW480 (ATCC#CCL-228)、SW948(ATCC# CCL-237)、293(ATCC # CRL-1573)、786-0(ATCC# CRL-1932)、A498 (ATCC# HTB-44)、Caki-2 (ATCC# HTB-47)、COS-7 (ATCC# CRL-1651)、RL-65 (ATCC#CRL-10345)、SV-T2 (ATCC# CCL-163. I)、22RV1 (ATCC# CRL-2505)、DU145 (ATCC# HTB-81)、LNCaP (ATCC# CRL-1740)、PC-3 (ATCC# CRL-1435)、HT29 (ATCC# HTB-38)、Hs746T (ATCC#HTB-135)、NCI-N87(ATCC# CRL-5822)和來自其相應(yīng)組織的正常細(xì)胞可用來篩選特異性針對癌性組織的單克隆抗體。來源于不同器官(包括但不限于腎、卵巢、乳房、肺、前列腺、結(jié)腸、腎、皮膚、甲狀腺、主動(dòng)脈平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞)的正常組織的原代或低傳代的細(xì)胞培養(yǎng)物可用作陰性對照。癌性或非癌性細(xì)胞可在載玻片或蓋玻片或在塑料表面上生長，或在如WO 01/43869中所述的CellArray 裝置中制備并使用以上對組織描述的IHC根據(jù)抗體的結(jié)合來篩選?？蛇x擇地，可使用非蛋白水解的手段從生長表面上取出細(xì)胞并離心成沉淀，然后將該沉淀作為組織包埋并處理用于上述IHC分析?？蓪⒓?xì)胞接種到免疫缺陷的動(dòng)物體內(nèi)，允許生長成腫瘤，并然后收集該腫瘤，包埋并用作IHC分析的組織來源。在另一種替代方案中，可通過與一抗一起孵育連接至熒光分子的“報(bào)告” 二抗來篩選單細(xì)胞并然后使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)設(shè)備分析?？墒褂枚喾N不同的檢測系統(tǒng)中的任何一種檢測抗體與組織切片的結(jié)合。通常，免 疫組織化學(xué)包括一抗與組織的結(jié)合且然后產(chǎn)生對來自一抗的物質(zhì)反應(yīng)的二抗并將二抗偶聯(lián)到可檢測標(biāo)志(例如，辣根過氧化物酶，HRP，或二氨基聯(lián)苯胺，DAB)上?？墒褂玫囊环N替代方法是多克隆鏡像互補(bǔ)的抗體或polyMICA (多克隆鏡像互補(bǔ)的抗體；The Binding SiteLimited, Birmingham, UK ；Mangham, D. C.等人(1999) “A Novel ImmunohistochemicalDetection System Using Mirror Image Complementary Antibodies(MICA), Tiistopathology 35(2) :129-33)。PolyMICA 技術(shù)可用來測試一抗(例如，抗B7-H3抗體)與正常組織和癌性組織的結(jié)合。多種類型的PolyMICA 檢測試劑盒是商購的產(chǎn)品編號(hào)HK004. D是使用DAB發(fā)色團(tuán)的PoIyMICA 檢測試劑盒；產(chǎn)品編號(hào)HK004. A是使用AEC發(fā)色團(tuán)的polyMICA 檢測試劑盒?？蛇x擇地，可用可檢測標(biāo)志直接標(biāo)記一抗。為篩選合適的抗體的IHC篩選中的第一步驟是小鼠中產(chǎn)生的一抗(例如，抗B7-H3抗體)與一種或多種免疫原(例如，細(xì)胞或組織樣品)的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方式中，組織樣品是來自不同器官的冷凍組織的切片。所述細(xì)胞或組織樣品可以是癌性或非癌性的?？芍苽淅鋬鼋M織，將其經(jīng)固定或不經(jīng)固定地切片并通過熟悉本領(lǐng)域的人員已知的幾種方法中的任何一種進(jìn)行IHC(參見,例如Stephan等人(1999) “Distribution AndFunction Of The Adhesion Molecule BEN During Rat Development,Dev. Biol. 212 264-277 和 Stephan 等人(1999) “Selective Cloning Of Cell Surface ProteinsInvolved In Organ Development !Epithelial Glycoprotein Is Involved In NormalEpithelial Differentiation，，，Endocrinology 140:5841-5854)。V.表征抗B7-H3抗體的方法可使用多種方法中的任何一種來表征抗B7-H3抗體。一種方法是鑒定其結(jié)合的表位。表位作圖是可從各種來源商購的，例如Pepscan Systems (Lelystad, TheNetherlands)。表位作圖可用來確定抗B7-H3抗體結(jié)合的序列。表位可以是線性表位，即，包含在單串氨基酸中或可以是由可能不一定包含在單串中的氨基酸的三維相互作用形成的構(gòu)象表位。
可分離或合成(例如，通過重組)不同長度(例如，優(yōu)選地，至少4-6個(gè)氨基酸長)的肽并用于抗B7-H3抗體的結(jié)合測定?？赏ㄟ^使用衍生自胞外序列的重疊肽并測定抗B7-H3抗體的結(jié)合而在系統(tǒng)篩選中確定抗B7-H3抗體結(jié)合的表位?？捎脕肀碚骺笲7-H3抗體的又一種方法是利用競爭測定，使用已知結(jié)合相同抗原，S卩，B7-H3的其他抗體，來確定抗B7-H3抗體是否與其他抗體結(jié)合相同的表位。商購的針對B7-H3的抗體的實(shí)例可能是可用的并可使用本文教導(dǎo)的結(jié)合測定鑒定。競爭測定是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并在實(shí)施例中進(jìn)一步詳述了這些方法和示出的數(shù)據(jù)?？笲7-H3抗體還可由其結(jié)合的組織、癌癥類型或腫瘤類型進(jìn)一步表征。另一種表征抗B7-H3抗體的方法是通過其結(jié)合的抗原。將抗B7-H3抗體與來自各種人類癌癥的細(xì)胞裂解液一起用于蛋白質(zhì)印跡中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,蛋白質(zhì)印跡可包括在變性或非變性凝膠上對細(xì)胞裂解液和/或細(xì)胞級分進(jìn)行電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素紙上，并然后用抗體(例如，抗B7-H3抗體)探測印跡以觀察該抗體結(jié)合哪些蛋白質(zhì)。B7-H3與不同組織(包括但不限于結(jié)腸、乳房、卵巢、胰和肺)的各種人類癌癥有關(guān)。
VI.使用抗B7-H3抗體和B7-H3調(diào)節(jié)劑診斷癌癥的方法為了診斷目的，通過本文公開的方法制備的針對B7-H3的單克隆抗體可用來確定多種組織(包括但不限于卵巢、乳房、肺、前列腺、結(jié)腸、腎、胰、皮膚、甲狀腺、腦、心臟、肝、胃、神經(jīng)、血管、骨骼、和上消化道)中存在或不存在癌性細(xì)胞。通過本文公開的方法制備的針對B7-H3的抗體還可用來確定在其從實(shí)體瘤中釋放之后循環(huán)在血液中的癌性細(xì)胞的存在或不存在或其水平。這些循環(huán)的抗原可以是完整的B7-H3抗原，或其保留了根據(jù)本文教導(dǎo)的方法可被檢測到的能力的片段。這種檢測可使用本領(lǐng)域通常使用的標(biāo)準(zhǔn)方法通過FACS分析實(shí)現(xiàn)。這些用途可包括在B7-H3和特異性結(jié)合B7-H3的抗體之間形成復(fù)合物。這些抗體的實(shí)例包括但不限于由雜交瘤BRCA84D、BRCA69D和PRCA157產(chǎn)生的抗B7-H3單克隆抗體。該復(fù)合物可在體外或體內(nèi)形成。不被理論束縛地，單克隆抗體抗B7-H3可通過B7-H3的胞外域與B7-H3結(jié)合且然后可被內(nèi)化。在本發(fā)明的診斷方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體帶有可檢測標(biāo)簽?？墒褂玫臉?biāo)簽的實(shí)例包括放射劑或熒光團(tuán)，例如藻紅蛋白或異硫氰酸熒光素(也稱作熒光異硫氰酸酯或FITC)。與商業(yè)上用于診斷和治療目的的其他已知抗體一樣，本發(fā)明的靶抗原廣泛表達(dá)在正常組織中。在某些腫瘤中其還被上調(diào)。因此，用于診斷劑或治療劑的本發(fā)明的抗體的具體劑量和遞送途徑將根據(jù)所處理的特定腫瘤或疾病狀態(tài)以及待治療的特定個(gè)體來調(diào)整。為了診斷使用這些抗體的一種方法是通過將該抗體連接到放射劑或不透射線劑上，對個(gè)體施用該抗體并使用X-射線或其他成像設(shè)備顯示標(biāo)記的抗體在表達(dá)抗原的癌細(xì)胞表面上的位置的體內(nèi)腫瘤成像。以促進(jìn)在生理?xiàng)l件下的結(jié)合的濃度施用抗體。用于檢測B7-H3的體外技術(shù)是本領(lǐng)域中常用的，且包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、免疫沉淀、免疫熒光、酶免疫測定(EIA)、放射免疫測定(RIA)和蛋白質(zhì)印跡分析。在本發(fā)明的方面中，對腫瘤或贅生物進(jìn)行放射成像或測量用放射標(biāo)記的抗體進(jìn)行治療的方法的有效性的方法包括根據(jù)本發(fā)明的實(shí)踐對個(gè)體施用放射標(biāo)記的、腫瘤特異性抗體的步驟。放射標(biāo)記的抗體可以是包含優(yōu)選地選自由锝-99m、銦-111、碘-131、錸-186、錸-188、釤-153、镥-177、銅-64、鈧-47、釔-90組成的組的放射標(biāo)記的單克隆或多克隆抗體。標(biāo)記有治療性放射性核素例如碘-131、錸-188、欽-166、釤-153和鈧-47的不損害抗體的免疫反應(yīng)性且不被體內(nèi)分解的單克隆抗體是特別優(yōu)選的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解其他放射性同位素是已知的，且可適合用于特定應(yīng)用。放射成像可使用單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像(SPECT)、正電子成像術(shù)(PET)、計(jì)算機(jī)斷層攝影(CT)或核磁共振成像(MRI)進(jìn)行。還設(shè)想了允許通過放射免疫成像定位的轉(zhuǎn)移位置的更多解剖學(xué)界定的相關(guān)成像。在其他方法中，取出癌性細(xì)胞并通過本領(lǐng)域熟知的方法(例如，包埋到冷凍化合物中，冷凍并經(jīng)固定或不經(jīng)固定地切片；經(jīng)過或不經(jīng)抗原修復(fù)的多種方法來進(jìn)行固定和石蠟包埋并復(fù)染)制備用于免疫組織化學(xué)的組織。單克隆抗體還可用來鑒定不同發(fā)育階段的癌細(xì)胞。這些抗體還可用來確定哪些個(gè)體的腫瘤在其表面上以預(yù)定的水平表達(dá)抗原且因此成為使用針對所述抗原定位的抗體進(jìn)行免疫治療的候選者?？贵w可識(shí)別表達(dá)B7-H3的原發(fā)和轉(zhuǎn)移性癌癥。如本文所用的，檢測可包括定性和/或定量檢測且可包括將所測量的水平與正常細(xì)胞對比以獲得B7-H3在癌性細(xì)胞中的增加的表達(dá)水平。 使用結(jié)合B7-H3的任何抗體和可用來確定B7-H3的表達(dá)水平的任何其他方法，本發(fā)明還提供了幫助診斷癌癥的方法，所述癌癥通過個(gè)體內(nèi)表達(dá)B7-H3的癌細(xì)胞表征。如本文所用的，用于“幫助診斷”的方法是指這些方法有助于進(jìn)行有關(guān)癌癥的分類或性質(zhì)的臨床確定，且關(guān)于確定性診斷可能或可能不是論斷性的。因此，幫助診斷癌癥的方法可包括檢測B7-H3在來自個(gè)體的生物樣品中的水平和/或確定B7-H3在樣品中的表達(dá)水平的步驟。識(shí)別抗原或其部分的抗體還可用來進(jìn)行診斷性免疫測定以檢測由存活或死亡的癌細(xì)胞釋放或分泌到體液(包括但不限于血液、唾液、尿液、肺液或腹水)中的抗原。并不是特定的目的腫瘤中的所有細(xì)胞都將表達(dá)B7-H3，且其他組織中的癌性細(xì)胞可能表達(dá)B7-H3，因此應(yīng)篩選個(gè)體的癌性細(xì)胞上存在或不存在B7-H3以確定免疫治療在該個(gè)體內(nèi)的有用性。通過本文公開的方法制備的抗B7-H3抗體可用來確定被診斷患癌癥的個(gè)體是否可以被認(rèn)定為使用針對B7-H3定位的抗體的免疫治療的候選者。在一個(gè)實(shí)施方式中，可使用針對B7-H3定位的抗體檢測癌性腫瘤或活組織檢查樣品的B7-H3表達(dá)。具有表達(dá)B7-H3的癌細(xì)胞的個(gè)體是使用針對B7-H3定位的抗體的免疫治療的合適候選者。用抗B7-H3抗體染色還可用來區(qū)分癌性組織和正常組織。對于確定哪些腫瘤最有可能對特定治療響應(yīng)，對患癌癥的個(gè)體的預(yù)后，腫瘤的亞型或轉(zhuǎn)移性疾病的起源和疾病的進(jìn)展或?qū)χ委煹姆磻?yīng)，使用抗B7-H3抗體用于診斷目的的方法在任何形式的抗癌治療例如，化療或放射治療之前或之后都是有用的。本發(fā)明的組合物還適合使用以上概述的方法應(yīng)用于其他患病(非癌性)細(xì)胞來診斷除了癌癥以外的病態(tài)。適合用于本發(fā)明的方法中的病態(tài)包括但不限于與個(gè)體的炎癥或自身免疫反應(yīng)有關(guān)的疾病或紊亂。上述方法可用于調(diào)控個(gè)體的炎癥或自身免疫反應(yīng)。示例性而非限制性地，可使用本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)行診斷和/或治療的由炎癥和自身免疫紊亂造成的疾病和病癥包括多發(fā)性硬化、腦膜炎、腦炎、中風(fēng)、其他腦創(chuàng)傷、炎性腸病(包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅氏病)、重癥肌無力、狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮喘、急性青少年誘發(fā)型糖尿病、AIDS癡呆、動(dòng)脈粥樣硬化、腎炎、視網(wǎng)膜炎、過敏性皮炎、銀屑病、心肌缺血和急性白細(xì)胞介導(dǎo)的肺損傷。本發(fā)明的抗體和其他治療劑診斷和/或治療用途的其他適應(yīng)癥包括對處于器官或移植物排斥風(fēng)險(xiǎn)之中的個(gè)體施用。近些年來，在關(guān)于移植組織和器官例如皮膚、腎、肝、心臟、肺、胰和骨髓的手術(shù)技術(shù)的效率方面已有極大的提高?？赡苤饕伙@的問題是缺乏用于在接受體內(nèi)誘導(dǎo)對移植的同種異體移植物或器官的免疫耐受的滿意的劑。當(dāng)將同種異體細(xì)胞或器官移植到宿主體內(nèi)(即，供體和受體是來自同一種類的不同個(gè)體)，宿主免疫系統(tǒng)可能引發(fā)對移植物中的外來抗原的免疫反應(yīng)(宿主抗移植物疾病)，造成移植組織的破壞。本申請任何地方描述的抗B7-H3抗體的用途還包括本文所述的其他B7-H3激動(dòng)齊U、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑的用途。在這些實(shí)施方式中，B7-H3激動(dòng)劑、拮抗劑和其他非抗體調(diào)節(jié)劑在所述步驟中替換B7-H3抗體，并進(jìn)行普通的技術(shù)從業(yè)者范圍內(nèi)的改變以將該方法調(diào)整成適應(yīng)替換的B7-H3調(diào)節(jié)組合物。通過本文公開的方法制備的針對B7-H3的單克隆抗體可用來確定人類癌癥干細(xì)胞在多種組織中的存在或不存在。已假設(shè)癌癥干細(xì)胞(CSC)在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中起作用(Ghotra, V. P.等人(2009) “The Cancer Stem Cell MicroenvironmentAnd Anti-Cancer Therapy, ” Int. J. Radiat. Biol. 85 (11) :955-962 ;Gupta, P. B.等人(2009) “Cancer Stem Cells Mirage Or Reality ，^Nat. Med. 15(9) 1010-1012 ；Lawson,J. C.等人(2009) “Cancer Stem Cells In Breast Cancer And Metastasis,，，Breast·Cancer Res.Treat. 118 (2) :241-254 ；Hermann, P. C.等人(2009) “PancreaticCancer Stem Cells—Insights And Perspectives,，，Expert Opin. Biol. Ther. 9 (10)1271-1278 ；Schatton, T.等人(2009) “Identification And Targeting Of Cancer StemCells，Tioessays 31(10) :1038-1049 ；Mittal,S.等人(2009) “Cancer Stem Cells TheOther Face Of Janus，，，Amer. J. Med. Sci. 338 (2) :107-112 ;Alison，M. R.等人(2009)“StemCellsAnd Lung Cancer Future Therapeutic Targets ’’Expert Opin. Biol. Ther. 9 (9)1127-1141 ；Charafe-Jauffret, E.等人(2009) “Breast Cancer Stem Cells Tools AndModels To Rely On,BMC Cancer 9 :202 ;Scopelliti, A.等人(2009) “TherapeuticImplications Of Cancer Initiating Cells, Expert Opin. Biol. Ther. 9 (8) :1005-1016;PCT公布WO 2008/091908)。根據(jù)該假設(shè)，CSC在每種腫瘤內(nèi)提供了能夠無限期自我更新并發(fā)育成更多的在復(fù)制能力方面相對有限的成體腫瘤細(xì)胞的一小組獨(dú)特的細(xì)胞。已假設(shè)這些癌癥干細(xì)胞可能更能抵抗化療劑、放射或其他毒性條件，且因此在臨床治療之后仍存活且后來長成繼發(fā)性腫瘤、轉(zhuǎn)移或造成復(fù)發(fā)。已表明CSC可從‘正?！M織干細(xì)胞或從更加分化的組織祖細(xì)胞產(chǎn)生。人類癌性干細(xì)胞具有多種確定的特征。PCT公布WO 2008/091908中描述了這些特征且在此通過引用并入。針對癌癥干細(xì)胞上的細(xì)胞表面靶的單克隆抗體可用來確定癌癥干細(xì)胞在多種組織中的存在或不存在。通過本文公開的方法制備的針對B7-H3的單克隆抗體還可用來確定癌癥干細(xì)胞的存在或不存在或癌癥干細(xì)胞在樣品或組織中或從實(shí)體瘤中釋放之后在血液循環(huán)中的水平。這種循環(huán)的抗原可以是完整的B7-H3抗原，或是保留根據(jù)本文教導(dǎo)的方法檢測的能力的片段。這種檢測可使用本領(lǐng)域通常使用的標(biāo)準(zhǔn)方法通過FACS分析實(shí)現(xiàn)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，這種檢測可使用本領(lǐng)域通常使用的標(biāo)準(zhǔn)方法通過組織樣品的免疫組織化學(xué)分析實(shí)現(xiàn)。這些用途可包括在B7-H3和特異性結(jié)合癌癥干細(xì)胞上的B7-H3的抗體之間形成復(fù)合物。這些抗體的實(shí)例包括但不限于由雜交瘤BRCA84D、BRCA69D和PRCA157產(chǎn)生的那些抗B7-H3單克隆抗體。該復(fù)合物可以體外或體內(nèi)形成。提及它們用于抗B7-H3抗體的用途的本申請中描述的用途還包括本文所述的其他B7-H3激動(dòng)劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑用于癌癥干細(xì)胞的鑒定和治療的用途。在這些實(shí)施方式中，使用與所述方法相似的方法使用抗B7-H3抗體和其他B7-H3激動(dòng)劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑用于癌癥干細(xì)胞的鑒定、診斷或治療性治療，并進(jìn)行普通的技術(shù)從業(yè)者范圍內(nèi)的改變以將該方法調(diào)整成適合鑒定/診斷或治療癌癥干細(xì)胞。VII.本發(fā)明的優(yōu)選組合物本發(fā)明包括組合物，包括包含抗B7-H3抗體、衍生自抗B7-H3抗體的多肽、包含編碼抗B7-H3抗體的序列的多核苷酸和本文所述的其他劑的藥物組合物。如本文所用的，組合物還包含結(jié)合B7-H3的一種或多種抗體、多肽和蛋白質(zhì)、B7-H3激動(dòng)劑、拮抗劑、調(diào)節(jié)劑，和/或包含編碼結(jié)合B7-H3的一種或多種抗體、多肽和蛋白質(zhì)的序列的一種或多種多核苷
酸。 本發(fā)明還提供了任何B7-H3肽激動(dòng)劑、拮抗劑或調(diào)節(jié)劑的偶聯(lián)物和支持特定B7-H3肽激動(dòng)劑、拮抗劑或調(diào)節(jié)劑的期望的一種功能或多種功能的其他化學(xué)結(jié)構(gòu)。這些偶聯(lián)物包括共價(jià)結(jié)合本文討論的診斷、篩選或純化方法中使用的大分子例如任何不溶性的固體支持基質(zhì)的B7-H3肽激動(dòng)劑、拮抗劑或調(diào)節(jié)劑?？扇苄曰|(zhì)材料包括化學(xué)上惰性，具有高的孔隙度并具有大量的能夠與肽配體形成共價(jià)鍵的官能團(tuán)的任何物質(zhì)。在 Dean 等人(編 $耳)Affinity Chrqmtqgraphy A Practical Approach H Press (1985)；Lowe, “An Introduction to Affinity Chromatography，，，在 Work 等人(編輯)LabqeatoryTechniques in Biochemistry and Mqlegular Biqlqgy,弟 7 卷，部分 II，North-Holland(1979) ；Porath 等人，“Biospecific Affinity Chromatography，，，在 Neurath, H.等人(編輯)，THE Peoteins,第 3 版,第 I 卷，第 95-178 頁(1975);和 Schott, H. Affinity Cheomatogeaphy, Macel Dekker, Inc.NY(1984)中描述了基質(zhì)材料和用于制備基質(zhì)-配體的偶聯(lián)物的方法的實(shí)例。本文還提供了 B7-H3肽激動(dòng)劑、拮抗劑或調(diào)節(jié)劑與用于本文討論的診斷方法中的任何報(bào)告部分的偶聯(lián)物。還通過下列標(biāo)準(zhǔn)中的任何(一種或多種)鑒定并表征了本發(fā)明的B7-H3肽激動(dòng)劑、拮抗劑或調(diào)節(jié)劑、多肽和蛋白質(zhì)，包括抗B7-H3抗體(a)特異性結(jié)合B7-H3 (且特別是表達(dá)在包括但不限于腎、前列腺或肺的癌細(xì)胞的癌細(xì)胞表面上的B7-H3分子)的能力；(b)競爭性抑制已知的抗B7-H3抗體優(yōu)先結(jié)合B7-H3的能力，包括優(yōu)先結(jié)合原始抗體優(yōu)先結(jié)合的相同B7-H3表位的能力；(c)體外或體內(nèi)結(jié)合B7-H3的暴露于活細(xì)胞表面上的部分的能力；(d)結(jié)合B7-H3的暴露于表達(dá)B7-H3的活的癌細(xì)胞表面上的部分的能力；(e)將化療劑遞送至其表面上表達(dá)B7-H3的癌性細(xì)胞(例如，腎、前列腺或肺癌細(xì)胞)的能力；和/或(f)將治療劑或可檢測標(biāo)志遞送至其表面上表達(dá)B7-H3的癌細(xì)胞(例如但不限于前列腺癌細(xì)胞)的能力。本發(fā)明的優(yōu)選抗體將相對于正常的非癌性組織顯示出對腫瘤組織的差異性IHC染色，且此外將能夠在靈長類(且特別是食蟹獼猴)模型中測試抗體療效。另外本發(fā)明的優(yōu)選抗體將顯示出期望的親和力和抗原特異性水平。另外本發(fā)明的優(yōu)選抗體將顯示出期望的免疫調(diào)節(jié)活性和細(xì)胞內(nèi)化水平。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是由雜交瘤BRCA84D、BRCA69D或PRCA157或其后代產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明還包括由這些保藏的雜交瘤產(chǎn)生的抗體和其等效抗體或多肽片段(例如Fab、Fabi , F(ab/ )2Fv、Fe等)、嵌合抗體、單鏈(ScFv)、突變體、包含抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、和這些抗體或包含具有所需特異性的抗原(B3-H7)識(shí)別位點(diǎn)的等效抗體中的任何一種的任何其他修飾的構(gòu)型。本發(fā)明還提供了展現(xiàn)出抗B7-H3家族成員的一種或多種生物學(xué)特征的人類抗體。通過以上描述的五種標(biāo)準(zhǔn)中的任何(一種或多種)鑒定并表征了抗B7-H3家族的等效抗體(包括人源化抗體和人類抗體)、多肽片段和包含這些片段中的任何一種的多肽。PCT公布WO 2008/066691中提供了抗B7-H3抗體的鼠可變域和示例性的人源化的可變域的序列。示例性而非限制性地提供了這些序列，且不同的序列以及所提供的序列的片段和變體被包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。由于其相對于其他抗體的較為干凈的正常組織IHC特征，較強(qiáng)的腫瘤/正常IHC 差異，中到強(qiáng)的結(jié)合(BIAC0RE )/IHC)、與食蟹獼猴的B7-H3的交叉反應(yīng)性和對通用DART 分子(“UDART ”)的有效活性，BRCA84D、BRCA69D和PRCA157是本發(fā)明的優(yōu)選的B7-H3抗體。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括這些優(yōu)選抗體的嵌合和人源化變體以及具有下述修飾的Fe區(qū)域的這些優(yōu)選抗體的天然的和嵌合的及人源化的變體。另外本發(fā)明包括具有這些抗體的表位結(jié)合區(qū)域，特別是與結(jié)合T細(xì)胞受體、NKG2D受體或腫瘤相關(guān)抗原或半抗原例如熒光素(例如異硫氰酸熒光素(也稱為熒光異硫氰酸酯或FITC)的表位結(jié)合區(qū)域一致的表位結(jié)合區(qū)域的DART 分子。在某些實(shí)施方式中，結(jié)合B7-H3的本發(fā)明的抗體、多肽和蛋白質(zhì)是競爭性抑制本文指出的抗B7-H3抗體與B7-H3的優(yōu)先結(jié)合的抗體、多肽和蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，這些抗體、多肽和蛋白質(zhì)優(yōu)先結(jié)合B7-H3上與抗體小鼠抗B7-H3優(yōu)先結(jié)合的表位相同的表位。因此，本發(fā)明提供了以下任何一種(或包含以下任一種的組合物，包括藥物組合物)(a)由具有以上指出的保藏編號(hào)的宿主細(xì)胞或其子代產(chǎn)生的抗體；(b)該抗體的人源化形式；(C)包含該抗體的一個(gè)或多個(gè)輕鏈和/或重鏈可變區(qū)的抗體；(d)包含與該抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)同源或從其衍生的可變區(qū)和與人類抗體的重鏈和輕鏈的恒定區(qū)同源或從其衍生的恒定區(qū)的嵌合抗體；(e)包含該抗體的一個(gè)或多個(gè)輕鏈和/或重鏈CDR(至少一、二、三、四、五或六個(gè))的抗體；(f)包含該抗體的重鏈和/或輕鏈的人類抗體；(g)與該抗體等效的人類抗體。該抗體的人源化形式可以或可以不具有與該原始抗體或由具有以上指出的保藏編號(hào)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體相同的CDR。CDR區(qū)域的確定是本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)熟知的。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含與由一種以上指出的保藏的雜交瘤產(chǎn)生的抗體或由具有以上指出的保藏編號(hào)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的至少一個(gè)⑶R、至少二個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少5個(gè)CDR基本上同源(或，在某些實(shí)施方式中，與這些抗體中的一種的全部6個(gè)⑶R基本同源或衍生自這些抗體中的一種)的至少一個(gè)⑶R的抗體。其他實(shí)施方式包括具有與由本文指出的保藏的雜交瘤產(chǎn)生的抗體的至少二、三、四、五或六個(gè)CDR基本上同源或衍生自該抗體的至少二、三、四、五或六個(gè)⑶R的抗體。應(yīng)理解，為了本發(fā)明的目的，結(jié)合特異性和/或整體活性(其可依據(jù)將化療劑遞送到或進(jìn)入癌性細(xì)胞以減少癌細(xì)胞的生長和/或增殖以在癌細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞死亡而延遲轉(zhuǎn)移的形成和/或姑息治療)通常被保持，但是活性程度與由保藏的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體相比可變化(可更大或更小)。本發(fā)明還提供了制備這些抗體中的任何一種的方法。制備抗體的方法是本領(lǐng)域已知的并且在本文描述。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的抗體的氨基酸序列的多肽。在某些實(shí)施方式中，多肽包含抗體的一個(gè)或多個(gè)輕鏈和/或重鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，多肽包含抗體的一個(gè)或多個(gè)輕鏈和/或重鏈CDR。在某些實(shí)施方式中，多肽包含抗體的輕鏈和/或重鏈的三個(gè)CDR。在某些實(shí)施方式中，多肽包含具有下列任何一種的抗體氨基酸序列原始抗體序列的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸、至少8個(gè)連續(xù)氨基酸、至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸、至少約15個(gè)連續(xù)氨基酸、至少約20個(gè)連續(xù)氨基酸、至少約25個(gè)連續(xù)氨基酸、至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，其中這些氨基酸中的至少3個(gè)來自抗體的可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，可變區(qū)來自原始抗體的輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可變區(qū)來自抗體的重鏈。在另一個(gè)實(shí)施方式中，5個(gè)(或更多個(gè))連續(xù)氨基酸來自抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，表達(dá)B7-H3、B7_H3的部分、抗B7-H3抗體或本發(fā)明的 其他B7-H3結(jié)合多肽的本發(fā)明的細(xì)胞被直接施用到個(gè)體以調(diào)節(jié)B7-H3的體內(nèi)生物活性。本發(fā)明的優(yōu)選抗B7-H3抗體是BRCA84D、BRCA69D和PRCA157，所有這些抗體是對人B7-H3分子反應(yīng)性的小鼠抗體。以下示出了 BRCA84D、BRCA69D和PRCA157的可變輕鏈和可變重鏈以及每條鏈的各自CDRp CDR2和CDR3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和編碼多核苷酸序列。因此本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠構(gòu)建具有這些⑶R的能夠結(jié)合被BRCA84D、BRCA69D和PRCA157識(shí)別的表位的抗體以及其衍生物。A. BRCA84D 的序列(1)BRCA84D 輕鏈序列BRCA84D可變輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 3)DIAMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVD TNVAffYQQKP GQSPKALIYSASYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFCQQ YNNYPFTFGSGTKLEIK編碼BRCA84D可變輕鏈的多核苷酸序列(SEQ ID NO 4)gacattgcga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagcgtcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaatgtag cctggtatca acagaaaccagggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgatcgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaacaa tgtgcagtctgaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacaact atccattcac gttcggctcggggacaaagt tggaaataaa aBRCA84D 可變輕鏈的 CDRJSEQ ID NO 5) KASQNVDTNVA編碼BRCA84D可變輕鏈的CDR1的多核苷酸序列(SEQ ID NO 6)aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gccBRCA84D 可變輕鏈的 CDR2(SEQ ID NO 7) SASYRYS編碼BRCA84D可變輕鏈的CDR2的多核苷酸序列(SEQ ID NO 8)tcggcatcct accggtacag tBRCA84D 可變輕鏈的 CDR3(SEQ ID NO 9) QQYNNYPFT編碼BRCA84D可變輕鏈的CDR3的多核苷酸序列(SEQ ID NO 10)
cagcaatata acaactatcc attcacg(2) BRCA84D 重鏈序列BRCA84D可變重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 11)DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PEKGLEffVAYISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCGRGRENIYYGSRLD YffGQGTTLTV SS編碼BRCA84D可變重鏈的多核苷酸序列(SEQ ID NO 12)gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc·tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggctccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg acagtagtgc catctactatgcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttcctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgg aagagggagggaaaacattt actacggtag taggcttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtctcctcaBRCA84D 可變重鏈的 CDRJSEQ ID NO :13) FGMH編碼BRCA84D可變重鏈的CDR1的多核苷酸序列(SEQ ID NO 14)tttggaatgcacBRCA84D 可變重鏈的 CDR2(SEQ ID NO :15)YISSDSSAIYYADTVK編碼BRCA84D可變重鏈的CDR2的多核苷酸序列(SEQ ID NO 16)tacattagta gtgacagtag tgccatctac tatgcagaca cagtgaagBRCA84D 可變重鏈的 CDR3(SEQ ID NO :17) GRENIYYGSRLDY編碼BRCA84D可變重鏈的CDR3的多核苷酸序列(SEQ ID NO 18)gggagggaaa acatttacta cggtagtagg cttgactacB. BRCA69D 的序列(1)BRCA69D 輕鏈序列BRCA69D可變輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 19)DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYYTSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIDNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPPTFGGGTKLEIK編碼BRCA69D可變輕鏈的多核苷酸序列(SEQ ID NO 20)gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcaccatcagttgca gggcaagtca ggacattagt aattatttaa actggtatca gcagaaaccagatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcacgat tacactcagg agtcccatcaaggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattgacaa cctggagcaagaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttcctccgac gttcggtggaggcaccaaac tggaaatcaa aBRCA69D 可變輕鏈的 CDRJSEQ ID NO :21) =RASQDISNYLN編碼BRCA69D可變輕鏈的CDR1的多核苷酸序列(SEQ ID NO 22)
agggcaagtc aggacattag taattattta aacBRCA69D 可變輕鏈的 CDR2(SEQ ID NO :23) YTSRLHS編碼BRCA69D可變輕鏈的CDR2的多核苷酸序列(SEQ ID NO 24)tacacatcac gattacactc aBRCA69D 可變輕鏈的 CDR3(SEQ ID NO :25) QQGNTLPPT編碼BRCA69D可變輕鏈的CDR3的多核苷酸序列(SEQ ID NO 26)caacagggta atacgcttcc tccgacg(2) BRCA69D 重鏈序列 BRCA69D可變重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 27)QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT SYWMQffVKQR PGQGLEffIGTIYP⑶⑶TRY TQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCARRGIPRLffYFDVff GAGTTVTVS S編碼BRCA69D可變重鏈的多核苷酸序列(SEQ ID NO 28)caggttcagc tccagcagtc tggggctgag ctggcaagac ctggggcttc agtgaagttgtcctgcaagg cttctggcta cacctttact agctactgga tgcagtgggt aaaacagaggcctggacagg gtctggaatg gattgggact atttatcctg gagatggtga tactaggtacactcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagata aatcctccag cacagcctacatgcaactca gcagcttggc atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaagagggattccacggc tttggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctcaBRCA69D 可變重鏈的 CDRJSEQ ID NO :29) =SYWMQ編碼BRCA69D可變重鏈的CDR1的多核苷酸序列(SEQ ID NO 30)agctactgga tgcagBRCA69D 可變重鏈的 CDR2(SEQ ID NO :31) :TIYP⑶⑶TRYTQKFKG編碼BRCA69D可變重鏈的CDR2的多核苷酸序列(SEQ ID NO 32)actatttatc ctggagatgg tgatactagg tacactcag aagttcaagg gc BRCA69D 可變重鏈的 CDR3(SEQ ID NO :33) =RGIPRLffYFD V編碼BRCA69D可變重鏈的CDR3的多核苷酸序列(SEQ ID NO 34)agagggattc cacggctttg gtacttcgat gtcC. PRCA157 的序列(1)PRCA157 輕鏈序列PRCA157的可變輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 35)DIQMTQSPAS LSVSVGETVT ITCRASESIY SYLAffYQQKQ GKSPQLLVYNTKTLPEGVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYCQH HYGTPPffTFGGGTNLEIK編碼PRCA157可變輕鏈的多核苷酸序列(SEQ ID NO 36)gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggagaaactgtcacc attacatgtc gagcaagtga gagtatttac agttatttagcatggtatca gcagaaacag ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat
acaaaaacct taccagaggg tgtgccatca aggttcagtg gcagtggatcaggcacacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct gaagattttgggagatatta ctgtcaacat cattatggta ctcctccgtg gacgttcggtggaggcacca acctggaaat caaaPRCA157 可變輕鏈的 CDRJSEQ ID NO :37) RASESIYSYLA編碼PRCA157可變輕鏈的CDR1的多核苷酸序列(SEQ ID NO 38)cgagcaagtg agagtattta cagttattta gcaPRCAl57 可變輕鏈的 CDR2 (SEQ ID NO 39) NTKTLPE
編碼PRCA157可變輕鏈的CDR2的多核苷酸序列(SEQ ID NO 40)aatacaaaaa ccttaccaga gPRCA157 可變輕鏈的 CDR3(SEQ ID NO :41) =QHHYGTPPff編碼PRCA157可變輕鏈的CDR3的多核苷酸序列(SEQ ID NO 42)caacatcatt atggtactcc tccgtgg(2)PRCA157 重鏈序列PRCA157的可變重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 43)EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMSffVRQT PDKRLEffVATINSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCARHDGGAMDYffGQG TSVTVSS編碼PRCA157可變重鏈的多核苷酸序列(SEQ ID NO 44)gaggtgcagc aggtggagtc ggggggagac ttagtgaagc ctggagggtccctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt tcctatggcatgtcttgggt tcgccagact ccagacaaga ggctggagtg ggtcgcaaccattaatagtg gtggaagtaa cacctactat ccagacagtt tgaaggggcgattcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctttac ctgcaaatgcgcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagacatgacgggggagcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc aPRCA157 可變重鏈的 CDR1 (SEQ ID NO 45) =SYGMS編碼PRCA157可變重鏈的CDR1的多核苷酸序列(SEQ ID NO 46)tcctatggca tgtctPRCA157 可變重鏈的 CDR2(SEQ ID NO :47) VATINSGGSN TYYPDSLKG編碼PRCA157可變重鏈的CDR2的多核苷酸序列(SEQ ID NO 48)gtcgcaacca ttaatagtgg tggaagtaac acctactatc cagacagttt gaaggggPRCA157 可變重鏈的 CDR3 (SEQ ID NO 49) HDGGAMDY編碼PRCA157可變重鏈的CDR3的多核苷酸序列(SEQ ID NO 50)catgacgggg gagctatgga ctacD. Fe-改造的 B7-H3 抗體在常規(guī)的免疫功能中，抗體-抗原復(fù)合物與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的相互作用導(dǎo)致大量的反應(yīng)，范圍從效應(yīng)功能例如抗體依賴的細(xì)胞毒性、肥大細(xì)胞脫粒和吞噬作用，到免疫調(diào)節(jié)信號(hào)例如調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的增殖和抗體的分泌。所有這些相互作用通過抗體或免疫復(fù)合物的Fe結(jié)構(gòu)域與造血細(xì)胞上專門的細(xì)胞表面受體的結(jié)合而引發(fā)。由抗體和免疫復(fù)合物引發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)的多樣性由三種Fe受體=Fc Y RI (CD64)、Fc y RII (CD32)和Fe y RIII (CD16)的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性產(chǎn)生。Fe Y RI (CD64), Fe y RIIA(CD32A)和Fe Y RIII (CD16)是活化型(即，免疫系統(tǒng)增強(qiáng)型)受體；FcyRIIB(CD32B)是抑制型(即，免疫系統(tǒng)抑制型)受體。以下示出了IgGlFc區(qū)域的氨基酸序列(根據(jù)明確地通過引用并入本文且下文稱為“Kabat EU”的Kabat
等人，Seq腳CE ofProteins of Immunological Interest,弟 5 版 Public Health Service, NIH, MD (1991)編號(hào)為 SEQ ID NO 51)SEQ ID NO 51PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV230240250260270
DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDffLNGKEY KCKVSNKALP280290300310320APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV330340350360370EffESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRffQQ GNVFSCSVMH380390400410420EALHNHYTQK SLSLSPGK430440殘基230-341是Fe的CH2區(qū)域。殘基342-447是Fe的CH3區(qū)域。本發(fā)明包括特異性結(jié)合B7-H3的抗體，該抗體包含在一個(gè)或多個(gè)部分具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(例如，置換、缺失、插入)的變體Fe區(qū)域，這些修飾增強(qiáng)了變體Fe區(qū)域?qū)e Y R(包括活化型和抑制型Fe YR)的親和力和親合力。在某些實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾增強(qiáng)了變體Fe區(qū)域?qū)e Y RIIIA和/或Fe Y RIIA的親和力。在另一個(gè)實(shí)施方式中，變體Fe區(qū)域還以比相當(dāng)?shù)挠H本抗體(即，除了 Fe區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，與本發(fā)明的抗體具有相同的氨基酸序列的抗體)的Fe區(qū)域結(jié)合Fe Y RIIB的親和力低的親和力特異性地結(jié)合Fe Y RIIB。在某些實(shí)施方式中，相對于親本抗體，這些修飾增強(qiáng)了變體Fe區(qū)域?qū)e Y RIIIA和/或Fe Y RIIA的親和力且還增強(qiáng)了變體Fe區(qū)域?qū)e Y RIIB的親和力。在其他實(shí)施方式中，相對于親本抗體的Fe區(qū)域，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾增強(qiáng)了變體Fe區(qū)域?qū)e Y RIIIA和/或Fe Y RIIA的親和力但未改變變體Fe區(qū)域?qū)e y RIIB的親和力。在另一個(gè)實(shí)施方式中，相對于親本抗體，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾增強(qiáng)了變體Fe區(qū)域?qū)e Y RIIIA和/或Fe YRIIA的親和力但減弱了對Fe Y RIIB的親和力。當(dāng)在細(xì)胞中不能檢測到親本分子(沒有修飾過的Fe區(qū)域)的結(jié)合活性時(shí)，增強(qiáng)的親和力和/或親合力在表達(dá)低水平的Fe Y R的細(xì)胞中導(dǎo)致可檢測到的與Fe Y R或Fe Y R有關(guān)的結(jié)合活性。在其他實(shí)施方式中，修飾過的分子在以30，000至20，000分子/細(xì)胞的密度，以20，000至10，000分子/細(xì)胞的密度，以10，000至5，000分子/細(xì)胞的密度，以5，000至1，000分子/細(xì)胞的密度，以1，000至200分子/細(xì)胞的密度或以200分子/細(xì)胞或更小的密度(但至少10、50、100或150分子/細(xì)胞)表達(dá)非Fe Y R受體靶抗原的細(xì)胞中顯示出可檢測到的結(jié)
八
口 ο在另一個(gè)實(shí)施方式中，對Fe區(qū)域的氨基酸的所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾減弱了抗體對一種或多種Fe Y R受體的親和力和親合力。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含變體Fe區(qū)域的抗體，其中相對于野生型Fe區(qū)域所述變體Fe區(qū)域包含至少一個(gè)氨基酸修飾，該變體Fe區(qū)域只結(jié)合一種Fe Y R，其中所述Fe Y R是Fe Y RIIIA。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含變體Fe區(qū)域的抗體，其中相對于野生型Fe區(qū)域所述變體Fe區(qū)域包含至少一個(gè)氨基酸修飾，該變體Fe區(qū)域只結(jié)合一種Fe Y R，其中所述Fe Y R是Fe Y RIIA。優(yōu)選地，本發(fā)明的分子的結(jié)合特征通過用于確定一種或多種Fe Y R介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞功能的體外功能測定來表征(參見5. 2. 7部分)?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的用于測定抗體-抗原或Fc-Fc Y R相互作用的體外測定(基于生化或免疫學(xué)的測定)來測定本發(fā)明的分子例如抗體對Fe Y R的親和力和結(jié)合特性，即分別是抗原與抗體的特異性結(jié)合或Fe區(qū)域與Fe Y R的特異性結(jié)合，所述體外測定包括但不限于ELISA測定、表面等離子體共振測定、免疫沉淀測定。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，在體內(nèi)模型(例如本文描述并公開的模型)中本發(fā)明的分子具有與基于體外的測定中的結(jié)合特性相似的結(jié)合特性。然而，本發(fā)明不排除在基于體外的測定中未表現(xiàn)出期望的表型而在體內(nèi)表現(xiàn)出期望的表型的本發(fā)明的分子。 在某些實(shí)施方式中，包含變體Fe區(qū)域的本發(fā)明的分子在被定義為從氨基酸342-447延伸的Fe區(qū)域的CH3結(jié)構(gòu)域中包含至少一個(gè)氨基酸修飾(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多個(gè)氨基酸修飾)。在其他實(shí)施方式中，包含變體Fe區(qū)域的本發(fā)明的分子在被定義為從氨基酸231-341延伸的Fe區(qū)域的CH2結(jié)構(gòu)域中包含至少一個(gè)氨基酸修飾(例如，具有I、2、3、4、5、6、7、8、9或更多個(gè)氨基酸修飾)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分子包含至少兩個(gè)氨基酸修飾(例如，具有2、3、4、5、6、7、8、9或更多個(gè)氨基酸修飾)，其中至少一個(gè)修飾位于CH3區(qū)域且至少一個(gè)修飾在CH2區(qū)域。本發(fā)明還包括鉸鏈區(qū)的氨基酸修飾。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括被定義為從氨基酸216-230延伸的Fe區(qū)域的CHl結(jié)構(gòu)域的氨基酸修飾。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含變體Fe區(qū)域的分子，其中如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并被本文例示的方法測量的，所述變體給予或具有增加的ADCC活性和/或增加的與Fe Y RIIA (⑶32A)的結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的方法使用的ADCC測定可以是NK依賴性或巨噬細(xì)胞依賴性的。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含變體Fe區(qū)域的分子，其中如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員并被本文例示的方法測量的，所述變體給予或具有增加的ADCC活性和/或增加的與FcyRIIIA(CD3216A)的結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的方法使用的ADCC測定可以是NK依賴性或巨噬細(xì)胞依賴性的。本發(fā)明的Fe變體可與其他Fe修飾組合，所述Fe修飾例如在美國專利第7，632，497 ;7，521，542 ;7，425，619 ;7，416，727 ;7，371，826 ;7，355，008 ;7，335，742 ；7，332，581 ;7，183，387 ;7，122，637 ；和 6，737，056 號(hào)；在 PCT 公布第 WO 2008/105886 ；WO 2008/002933 ;TO 2007/021841 ;TO 2007/106707 ;W0 06/088494 ;W0 05/115452 ；WO 05/110474 ；W0 04/1032269 號(hào)；和在 WO 04/063351 中；和在 Presta，L. G.等人(2002) “Engineering therapeutic antibodies for improved function, ^Biochem.Soc. Trans. 30 (4) :487-490 ;Shields, R. L.等人(2002) “Lack of fucose on humanIgGl N-Iinked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII andantibody-dependent cellular toxicity,，，J. Biol. Chem. 26 ;277 (30) :26733-26740和 Shields, R. L.等人(2001) “High resolution mapping of the binding site onhuman IgGl for Fe gamma RI, Fe gamma RII, Fe gamma RIII, and FcRn and design ofIgGl variants with improved binding to the Fe gamma R,，，J. Biol. Chem. 276 (9)6591-6604)中公開的修飾。本發(fā)明包括將本發(fā)明的Fe變體與其他Fe修飾組合以為修飾過的抗體提供加合的、協(xié)同的或新型的特性。優(yōu)選地，本發(fā)明的Fe變體增強(qiáng)了與其組合的修飾的表型。例如，如果本發(fā)明的Fe變體與已知以比相當(dāng)?shù)囊吧虵e區(qū)域高的親和力與Fe YRIIIA結(jié)合的突變體組合，與本發(fā)明的突變體的組合導(dǎo)致Fe YRIIIA親和力的更高倍數(shù)的增強(qiáng)。本發(fā)明包括特異性結(jié)合B7-H3的抗體，該抗體包含變體Fe區(qū)域，其中相對于野生型Fe區(qū)域該變體Fe區(qū)域包含至少一個(gè)氨基酸修飾(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多個(gè)氨基酸修飾)，使得該分子相對于包含野生型Fe區(qū)域的分子具有增強(qiáng)的效應(yīng)功能，條件是該變體Fe區(qū)域不僅僅具有以下位置的任何一種或多種置換或不僅僅是以下位置的任何一種或多種置換:243、255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438、439。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含變體Fe區(qū)域的那些抗體，其中相對于·野生型Fe區(qū)域該變體Fe區(qū)域包含至少一個(gè)氨基酸修飾(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多個(gè)氨基酸修飾)，使得該分子相對于包含野生型Fe區(qū)域的分子以改變的親和力結(jié)合Fe Y R,條件是該變體Fe區(qū)域不僅僅具有以下位置的任何一種或多種置換或不僅僅是以下位置的任何一種或多種置換243、255、258、267、269、270、276、278、280、283、285、289、292、293、294、295、296、300、303、305、307、309、320、322、329、332、331、337、338、340、373、376、416、419、434、435、437、438、439，且在位置 256、290、298、312、326、333、334、359、360 或 430中的任何一個(gè)不具有丙氨酸；在位置268不具有天冬酰胺；在位置272不具有谷氨酰胺；在位置286不具有谷氨酰胺、絲氨酸或天冬氨酸；在位置290不具有絲氨酸；在位置301不具有甲硫氨酸；在位置320不具有甲硫氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或精氨酸；在位置322不具有谷氨酸；在位置326不具有天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；在位置330不具有賴氨酸；在位置334不具有谷氨酰胺；在位置334不具有谷氨酸；在位置334不具有甲硫氨酸；在位置334不具有組氨酸；在位置334不具有纈氨酸；在位置334不具有亮氨酸；在位置335不具有谷氨酰胺；在位置335不具有賴氨酸；或在位置339不具有蘇氨酸。本發(fā)明還包括特異性結(jié)合B7-H3的抗體，該抗體包含變體Fe區(qū)域，其中該變體Fe區(qū)域構(gòu)成含有變體Fe區(qū)域的那些抗體，其中該變體Fe區(qū)域不僅僅具有以下位置的任何一種或多種置換或不僅僅是以下位置的任何一種或多種置換268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、320、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438 或 439，且在位置 280 不具有組氨酸、谷氨酰胺或酪氨酸；在位置290不具有絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸或酪氨酸，在位置294不具有天冬酰胺，在位置295不具有賴氨酸；在位置296不具有脯氨酸；在位置298不具有脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸或纈氨酸；或在位置300不具有亮氨酸或異亮氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含變體Fe區(qū)域的那些抗體，其中相對于野生型Fe區(qū)域該變體Fe區(qū)域包含至少一個(gè)氨基酸修飾，使得該分子相對于包含野生型Fe區(qū)域的分子以降低的親和力結(jié)合Fe y R,條件是該變體Fe區(qū)域不僅僅具有以下位置的任何一種或多種置換或不僅僅是以下位置的任何一種或多種置換243、252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439。又在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含變體Fe區(qū)域的那些抗體，其中相對于野生型Fe區(qū)域該變體Fe區(qū)域包含至少一個(gè)氨基酸修飾，使得該分子相對于包含野生型Fe區(qū)域的分子以增強(qiáng)的親和力結(jié)合Fe Y R，條件是該變體Fe區(qū)域不僅僅具有以下位置的任何一種或多種置換或不僅僅是以下位置的任何一種或多種置換280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398 或 430。本發(fā)明還包括特異性結(jié)合B7-H3的抗體，該抗體包含變體Fe區(qū)域，其中該變體Fe區(qū)域不僅僅包括以下位置的任何一種或多種置換或不僅僅是以下位置的任何一種或多種置換:330、243、247、298、241、240、244、263、262、235、269 或 328，且在位置 243 不具有亮氨酸，在位置298不具有天冬酰胺,在位置241不具有亮氨酸,且在位置240不具有異亮氨酸或丙氨酸，在位置244不具有組氨酸、在位置330不具有纈氨酸或在位置328不具有異亮氨酸。
本發(fā)明特別地包括特異性結(jié)合B7-H3的抗體，該抗體包含具有增強(qiáng)的效應(yīng)功能和/或改變的對活化型和/或抑制型受體的親和力的變體Fe區(qū)域，其中所述變體Fe區(qū)域包含(a)下列置換的任意 1、2、3、4、5 或 6 種:S239D、S298A、A330L、I332E、E333A 或 K334A ;或(b)以下置換組合的任何一種:(1)S298A、E333A和 K334A ;(2)S239D和 I332E ;或(3)S239D、A330L 和 I332E。本發(fā)明特別地包括特異性結(jié)合B7-H3的抗體，該抗體包含具有增強(qiáng)的效應(yīng)功能和/或改變的對活化型和/或抑制型受體的親和力的變體Fe區(qū)域，其中所述變體Fe區(qū)域包含以下置換(I)在位置288被天冬酰胺置換，在位置330被絲氨酸置換并在位置396被亮氨酸置換；(2)在位置334被谷氨酸置換，在位置359被天冬酰胺置換并在位置366被絲氨酸置換；(3)在位置316被天冬氨酸置換，在位置378被纈氨酸胺置換并在位置399被谷氨酸置換；(4)在位置247被亮氨酸置換，并在位置421被賴氨酸置換；(5)在位置392被蘇氨酸置換，并在位置396被亮氨酸置換；(6)在位置221被谷氨酸置換，在位置270被谷氨酸置換，在位置308被丙氨酸置換，在位置311被組氨酸置換，在位置396被亮氨酸置換并在位置402被天冬氨酸置換；(7)在位置419被組氨酸置換，并在位置396被亮氨酸置換；(8)在位置240被丙氨酸置換，并在位置396被亮氨酸置換；(9)在位置410被組氨酸置換，并在位置396被亮氨酸置換；(10)在位置243被亮氨酸置換，在位置305被異亮氨酸置換，在位置378被天冬氨酸置換，在位置404被絲氨酸置換并在位置396被亮氨酸置換；(11)在位置255被異亮氨酸置換，并在位置396被亮氨酸置換；
(12)在位置370被谷氨酸置換，并在位置396被亮氨酸置換；(13)在位置270被谷氨酸置換，或(14)以上(1)-(12)的置換的任意組合。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括特異性結(jié)合B7-H3的抗體，該抗體包含含有以下置換的變體Fe區(qū)域F243L、R292P和Y300L。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括特異性結(jié)合B7-H3的抗體，該抗體包含含有以下置換的變體Fe區(qū)域L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。又在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括特異性結(jié)合B7-H3的抗體，該抗體包含含有以下置換的變體Fe區(qū)域F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L。
在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括特異性結(jié)合B7-H3的抗體，該抗體包含含有位置396處的亮氨酸置換、位置270處的谷氨酸置換和位置243處的亮氨酸置換的變體Fe區(qū)域。在另一個(gè)特定的實(shí)施方式中，該分子還包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，例如本文公開的氨基酸修飾。本發(fā)明特別地包括特異性結(jié)合B7-H3的抗體，該抗體包含具有增強(qiáng)的效應(yīng)功能和/或改變的對活化型和/或抑制型受體的親和力的變體Fe區(qū)域，該變體Fe區(qū)域在下列位置中的一個(gè)或多個(gè)具有氨基酸修飾119、125、132、133、141、142、147、149、162、166、185、192、202、205、210、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、227、229、231、232、233、235、240、241、242、243、244、246、247、248、250、251、252、253、254、255、256、258、261、262、263、268、269、270、272、274、275、276、279、280、281、282、284、287、288、289、290、291、292、293、295、298、301、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、315、316、317、318、319、320、323、326、327、328、330、333、334、335、337、339、340、343、344、345、347、348、352、353、354、355、358、359、360、361、362、365、366、367、369、370、371、372、375、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、404、406、407、408、409、410、411、412、414、415、416、417、419、420、421、422、423、424、427、428、431、433、435、436、438、440、441、442、443、446 或 447。優(yōu)選地，這些突變產(chǎn)生了已被賦予效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的功能并任選地具有如使用本文公開并例示且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測定的對Fe Y R的改變的親和力的分子。本發(fā)明特別地包括特異性結(jié)合B7-H3的抗體，該抗體包含具有增強(qiáng)的效應(yīng)功能和/或改變的對活化型和/或抑制型受體的親和力的變體Fe區(qū)域，該變體Fe區(qū)域具有(I)位于下列位置中的一個(gè)或多個(gè)的氨基酸修飾(a)235、240、241、243、244、247、262、263、269、298、328或330和更優(yōu)選地以下修飾中的一種或多種V240A、V240I、F241L、F243L、P244H、S298N、L328I、A330V ;其中相對于具有缺少該修飾的野生型Fe區(qū)域的抗體，這些抗體顯示出改變的效應(yīng)功能；(II)位于下列位置中的一個(gè)或多個(gè)處的氨基酸修飾268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439和更優(yōu)選地以下修飾中的一種或多種D280H、D280Q、D280Y、K290G、K290S、K290T、K290Y、E294N、Q295K、Y296P、S298D、S298N、S298P、S298V、Y300I、Y300L ;其中相對于具有缺少該修飾的野生型Fe區(qū)域的抗體，這些抗體顯示出改變的效應(yīng)功能；
(III)位于下列位置中的一個(gè)或多個(gè)處的氨基酸修飾255、256、258、267、268、
269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438、439 和更優(yōu)選地以下修飾中的一種或多種T256A、H268N、E272Q、N286D、N286Q、N286S、K290A、K290S、S298A、R301M、D312A、K320E、K320M、K320Q、K320R、K322E、K326A、K326D、K326E、K326N、K326S、A330K、A339T、E333A、K334A、K334E、K334H、K334L、K334M、K334Q、K334V、T335K、T335Q、T359A、K360A、E430A ;其中相對于具有缺少該修飾的野生型Fe區(qū)域的抗體，這些抗體顯示出改變的效應(yīng)功能；(IV)位于下列位置中的一個(gè)或多個(gè)處的氨基酸修飾252、254、265、268、269、
270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438 或 439 ;其中相對于具有缺少該修飾的野生型Fe區(qū)域的抗體,這些抗體顯示出降低的效應(yīng)功能；
(V)位于下列位置中的一個(gè)或多個(gè)處的氨基酸修飾280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398 或 430 ;其中相對于具有缺少該修飾的野生型Fe區(qū)域的抗體，這些抗體顯示出增強(qiáng)的效應(yīng)功能；或(VI)位于下列位置中的一個(gè)或多個(gè)處的氨基酸修飾R255A、T256A、E258A、S267A、H268A、H268N、E272A、E272Q、N276A、D280A、E283A、H285A、N286A、N286D、N286Q、N286S、K290A、K290S、R301M、K320E、K320M、K320Q、K320R、K322E、K326A、K326D、K326E、K326S、A330K、P331A、T335Q、S337A、E430A ;其中相對于具有缺少該修飾的野生型Fe區(qū)域的抗體，這些抗體顯示出增強(qiáng)的效應(yīng)功能。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明包括使用本領(lǐng)域已知的任何Fe變體例如，在下列文獻(xiàn)中公開的 Fe 變體Jefferis, B. J.等人(2002) “Interaction Sites On HumanIgG-Fc For FcgammaR Current Models,，，Immunol. Lett. 82 :57-65 ;Presta, L. G.等人(2002) “Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function, ^Biochem.Soc. Trans. 30 :487-90 ；Idusogie, E.E.等人(2001) “Engineered Antibodies WithIncreased Activity To Recruit Complement,，，J. Immunol. 166 :2571-75 ;Shields,R. L.等人(2001) “High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgGlFor Fe Gamma RI, Fe Gamma RII, Fe Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgGlVariants With Improved Binding To The Fe gamma R, ^J. Biol.Chem. 276 :6591-6604 ；Idusogie, E. E.等人(2000) “Mapping Of The Clq Binding Site On Rituxan, AChimeric Antibody With A Human IgG Fe, ”J.Immunol. 164 :4178-84 ;Reddy, M. P.等人(2000) “Elimination Of Fe Receptor-Dependent Effector Functions Of AModified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4,，，J. Immunol. 164 :1925-1933 ;Xu,D.等人(2000) “In Vitro Charracterrization of Five Humanized OKT3 EffectorFunction Variant Antibodies, Cell. Immunol. 200 16-26 ；Armour, K. L.等人(1999) “Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I BindingAnd Monocyte Triggerring Activities,，，Eur. J. Immunol. 29 :2613-24 ;Jefferis,R.等人(1996) “Modulation Of Fe(Gamma)R And Human Complement Activation ByIgG3_Core Oligosaccharide Interractions，，，Immunol. Lett. 54 :101-04 ;Lund，J.等人(1996)“Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can ModulateRecognition By Complement And Human Fe Gamma Receptor I And Influence TheSynthesis Of Its Oligosaccharide Chains，，’J. Immunol. 157 :4963-4969 ；Hutchins 等人(1995) “Improved Biodistribution,Tumor Targeting，And Reduced ImmunogenicityIn Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-IH，，，Proc. Natl. Acad. Sci.(美國)92:11980-84 ；Jefferis, R.等人(1995) “Recognition Sites On Human IgG For Fe GammaReceptors The Role Of Glycosylation，，，Immunol. Lett. 44 :111-17 ;Lund，J.等人(1995)“01igosaccharide-Protein Interractions In IgG Can Modulate Recognition ByFe Gamma ReceptorsinFASEB J. 9 :115-19 ;Alegre，M. L 等人(1994) “A Non-Activating"Humanized" Anti_CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive PropertiesIn Vivo, ^Transplantation 57 :1537-1543 ;Lund 等人(1992) “Multiple Binding SitesOn The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fe Gamma Rll, Immunol. 29 :53-59 ;Lund等人(1991)“Human Fe Gamma RI And Fe Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites OnHuman IgG, ”J. Immunol. 147 :2657-2662 ；Duncan, A. R.等人(1988)“LocalizationOf The Binding Site For The Human High-Affinity Fe Receptor On IgGjnNature 332 563-564 ;美國專利第 5，624，821 ;5，885，573 ;6，194，551 ;7，276，586 和 7，317，091 號(hào)及PCT公布 WO 00/42072 和 PCT WO 99/58572。本發(fā)明包括包含由以下在表I中列出的任何突變組成或包含那些突變的變體Fe
區(qū)域的分子。
權(quán)利要求
1.一種分離的抗體或其免疫反應(yīng)性片段，其中所述分離的抗體或所述片段包含特異性結(jié)合B7-H3的胞外域的可變域，其中所述抗體與抗體BRCA69D、BRCA84D或PRCA157中的任何一種競爭結(jié)合所述B7-H3。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離的抗體或其免疫反應(yīng)性片段，其中所述抗體或所述片段包含可變域，所述可變域包含(A)BRCA69D的輕鏈的 CDRJSEQ ID NO :21)、CDR2 (SEQ ID NO :23)和 CDR3 (SEQ ID NO:25)和 BRCA69D 的重鏈的 CDRJSEQ ID NO :29)、CDR2 (SEQ ID NO :31)和 CDR3 (SEQ ID NO:33)；(B)BRCA84D的輕鏈的 CDRJSEQ ID NO :5)、CDR2 (SEQ ID NO :7)和 CDR3 (SEQ ID NO :9)和 BRCA84D 的重鏈的 CDRJSEQ ID NO :13)、CDR2 (SEQ ID NO :15)和 CDR3(SEQ ID NO :17)；或(C)PRCA157 的輕鏈的 CDR1 (SEQ ID NO :37)、CDR2 (SEQ IDNO :39)和 CDR3 (SEQ ID NO 41)和 PRCA157 的重鏈的 CDRJSEQ ID NO :45)、CDR2 (SEQ ID NO :47)和 CDR3 (SEQ ID NO:49)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其免疫反應(yīng)性片段，其中所述抗體結(jié)合癌細(xì)胞表面上內(nèi)源表達(dá)的B7-H3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其免疫反應(yīng)性片段，其中所述抗體結(jié)合B7-H3，所述抗體在結(jié)合癌細(xì)胞表面上表達(dá)的B7-H3后被內(nèi)化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其免疫反應(yīng)性片段，其是人源化的單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的分離的抗體，其中所述抗體是包含變體人IgGlFc區(qū)域的修飾過的抗體，其中所述變體人IgGlFc區(qū)域相對于所述抗體的親本的Fe區(qū)域包含至少一個(gè)氨基酸修飾，所述氨基酸修飾包括改變所述變體Fe區(qū)域結(jié)合Fe Y R的親和力或親合力的氨基酸修飾，使得所述修飾過的抗體相對于所述親本抗體表現(xiàn)出增強(qiáng)的效應(yīng)功能。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體，其中所述Fe區(qū)域修飾包括 (A)選自由下列組成的組的至少一種置換(1)F243L；(2)D270E；(3)R292P；(4)S298N；(5)Y300L；(6)V305I；(7)A330V;和(8)P396L； (B)至少一種兩氨基酸殘基置換，所述置換選自由下列組成的組(1)F243L和P396L ；(2)F243L和 R292P ;和(3)R292P和 V305I； (C)至少一種三氨基酸殘基置換，所述置換選自由下列組成的組(1)F243L、R292P和 Y300L ；(2)F243L、R292P和 V305I ；(3)F243L、R292P 和 P396L ;和(4)R292P、V305I和 P396L ； (D)至少一種四氨基酸殘基置換，所述置換選自由下列組成的組(1)F243L、R292P、Y300L和P396L ;和(2)F243L、R292P、V305I和P396L； 或 (E)至少五個(gè)氨基酸殘基的置換F243L、R292P、Y300L、V305I和P396。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體，其中所述抗體包含以下置換(A)F243L.R292P和 Y300L ；(B)L235V、F243L、R292P、Y300L和 P396L ;或(C)F243L、R292P、Y300L、V305I 和 P396L。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體，其中所述抗體包含 (A)可變域，所述可變域包含BRCA84D的輕鏈的CDR1(SEQ ID NO : 5)、CDR2 (SEQ ID NO:7)和 CDR3 (SEQ ID NO 9)和 BRCA84D 的重鏈的 CDR1 (SEQ ID NO 13)、CDR2 (SEQ ID NO 15)和 CDR3 (SEQ ID NO 17);和 (B)Fc區(qū)域的修飾，所述Fe區(qū)域的修飾包括以下置換L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體，其中所述抗體是人源化抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離的抗體或其免疫反應(yīng)性片段，其中所述抗體包含 (A)可變輕鏈，所述可變輕鏈具有hBRCA84D-2VL的氨基酸序列(SEQID NO 89)； (B)可變重鏈，所述可變重鏈具有hBRCA84D-2VH的氨基酸序列(SEQID NO 99);和 (C)Fe-區(qū)域，所述Fe-區(qū)域具有以下置換L235V、F243L、R292P、Y300L 和 P396L。
13.一種分泌特異性結(jié)合B7-H3的胞外域的單克隆抗體的雜交瘤，其中所述抗體與抗體BRCA69D、BRCA84D或PRCA157中的任何一種競爭結(jié)合所述B7-H3。
14.一種編碼權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的免疫反應(yīng)性片段的核酸分子。
15.一種雙親和再靶向試劑(DART )，所述試劑包含 (A)多肽鏈I，所述多肽鏈I包含特異性結(jié)合B7-H3的免疫球蛋白VL表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域和特異性結(jié)合不同于B7-H3的分子的VH表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和 (B)多肽鏈II，所述多肽鏈II包含特異性結(jié)合B7-H3的免疫球蛋白VH表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和特異性結(jié)合所述不同于B7-H3的分子的VL表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域； 其中所述多肽鏈I和II結(jié)合在一起以形成能夠結(jié)合B7-H3和所述不同于B7-H3的分子的功能性表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙親和再靶向試劑(DART )，其中可被所述DART 結(jié)合的所述不同于B7-H3的分子是半抗原。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的雙親和再靶向試劑(DART )，其中所述半抗原是異硫氰酸熒光素。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙親和再靶向試劑(DART )，其中可被所述DART 結(jié)合的所述不同于B7-H3的分子是T細(xì)胞受體或NKG2D受體。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙親和再靶向試劑(DART )，其中可被所述DART 結(jié)合的所述不同于B7-H3的分子是腫瘤相關(guān)抗原。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的雙親和再靶向試劑(DART )，其中所述腫瘤相關(guān)抗原選自由以下組成的組A33 ；ADAM-9 ；ALCAM ；BAGE ； β -連環(huán)蛋白；CA125 ;羧肽酶 M ;CD103 ;CD19 ；CD20 ；CD22 ；CD23 ；CD25 ；CD27 ；CD28 ；CD36 ;CD40/CD154 ；CD45 ；CD46 ；CD5 ；CD56 ；CD79a/CD79b ;CDK4 ；CEA ；CTLA4 ;細(xì)胞角蛋白 8 ；EGF-R ；EphA2 ；ErbBI ；ErbB3 ；ErbB4 ;GAGE_1 ；GAGE-2 ⑶3/GM2 ；gpl00 ；HER-2/neu ;人乳頭瘤病毒_E6 ;人乳頭瘤病毒_E7 ;整聯(lián)蛋白 α-V-β-6；JAM-3 ；KID3 ；KID31 ;KSA(17_1A) ；LUCA-2 ；MAGE-1 ；MAGE-3；MART ；MUC-1 ；MUM-I ；N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶；制癌蛋白 M ；pl5 ；PIPA ；PSA ；PSMA ；R0R1 ；sTn JNF-β 受體；TNF- α受體；TNF- y受體；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體；和VEGF受體。
21.—種編碼權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)所述的雙親和再靶向試劑(DART )的多肽鏈的核酸分子。
22.—種藥物組合物，包含(i)治療有效量的權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的免疫反應(yīng)性片段或權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)所述的雙親和再靶向試劑(DART )和(ii)藥學(xué)可接受的載體。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的藥物組合物，其中所述抗體是人源化抗體，所述人源化抗體包含 (A)可變域，所述可變域包含BRCA84D的輕鏈的CDR1(SEQ ID NO : 5)、CDR2 (SEQ ID NO:7)和 CDR3 (SEQ ID NO 9)和 BRCA84D 的重鏈的 CDR1 (SEQ ID NO 13)、CDR2 (SEQ ID NO 15)和 CDR3 (SEQ ID NO 17);和 (B)Fc區(qū)域的修飾，所述Fe區(qū)域的修飾包括以下置換L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的藥物組合物，其中所述抗體是人源化抗體，所述人源化抗體包含 (A)可變輕鏈，所述可變輕鏈具有hBRCA84D-2VL的氨基酸序列(SEQID NO 89)； (B)可變重鏈，所述可變重鏈具有hBRCA84D-2VH的氨基酸序列(SEQID NO 99);和 (C)Fe-區(qū)域，所述 Fe-區(qū)域具有以下置換L235V、F243L、R292P、Y300L 和 P396L。
25.根據(jù)權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，所述藥物組合物還包含一種或多種另外的抗癌劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述另外的抗癌劑是化療齊U、放射治療劑、激素治療劑、毒素或免疫治療劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述另外的抗癌劑是選自由以下組成的組的毒素紫杉烷、美登木素生物堿、auristatin、卡奇霉素、蒽環(huán)霉素、CC-1065類似物、多西他賽、組織蛋白酶、蓖麻毒素、多花白樹毒蛋白、假單胞菌外毒素、白喉毒素、RNA酶和毒性放射性同位素。
28.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的免疫反應(yīng)性片段或權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)所述的雙親和再靶向試劑(DART )在診斷癌癥中的用途，其中所述分離的抗體、免疫反應(yīng)性片段或DART 被可檢測地標(biāo)記。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的用途，特征在于所述癌癥通過選自由以下組成的組的癌細(xì)胞的存在來表征腎上腺腫瘤、AIDS-相關(guān)癌癥、腺泡狀軟組織肉瘤、星形細(xì)胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉(zhuǎn)移性腦瘤、乳腺癌、頸動(dòng)脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細(xì)胞癌、透明細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、皮膚良性纖維性組織細(xì)胞瘤、促結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞腫瘤、室管膜細(xì)胞瘤、尤文腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維發(fā)育不全、骨纖維性發(fā)育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞病、生殖細(xì)胞瘤、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、胰島細(xì)胞瘤、卡波西肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤性腫瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤性腫瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、多發(fā)性內(nèi)分泌瘤病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺瘤、小兒癌癥、外周神經(jīng)鞘瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑色素瘤、罕見血液病、腎轉(zhuǎn)移性癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉(zhuǎn)移性癌和子宮癌的細(xì)胞。
30.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的免疫反應(yīng)性片段或權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)所述的雙親和再靶向試劑(DART )或權(quán)利要求22-27中任一項(xiàng)所述的藥物組合物在制備用于治療患者的癌癥的藥劑中的用途。
31.根據(jù)權(quán)利要求29-30中任一項(xiàng)所述的用途，特征在于所述癌癥通過選自由以下組成的組的癌細(xì)胞的存在來表征腎上腺腫瘤、AIDS-相關(guān)癌癥、腺泡狀軟組織肉瘤、星形細(xì)胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉(zhuǎn)移性腦瘤、乳腺癌、頸動(dòng)脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細(xì)胞癌、透明細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、皮膚良性纖維性組織細(xì)胞瘤、促結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞腫瘤、室管膜細(xì)胞瘤、尤文腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維發(fā)育不全、骨纖維性發(fā)育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞病、生殖細(xì)胞瘤、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、胰島細(xì)胞瘤、卡波西肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤性腫瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤性腫瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、多發(fā)性內(nèi)分泌瘤病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺瘤、小兒癌癥、外周神經(jīng)鞘瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑色素瘤、罕見血液病、腎轉(zhuǎn)移性癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉(zhuǎn)移性癌和子宮癌的細(xì)胞。
32.根據(jù)權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)所述的用途，特征在于所述用途還包括施用選自由化療、免疫治療、放射治療、激素治療和手術(shù)組成的組的一種或多種另外的癌癥治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及對哺乳動(dòng)物，且更特別地對人B7-H3受體具有免疫反應(yīng)性的抗體及其片段，且涉及其用途，特別是在治療癌癥和炎癥中的用途。因此本發(fā)明特別地涉及能夠介導(dǎo)，且更優(yōu)選地能夠加強(qiáng)活化針對與多種人類癌癥有關(guān)的癌細(xì)胞的免疫系統(tǒng)的人源化B7-H3-反應(yīng)性抗體及其免疫反應(yīng)性片段。
文檔編號(hào)A61K39/00GK102892426SQ201180022024
公開日2013年1月23日 申請日期2011年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月4日
發(fā)明者德瑞克·T·盧, 菱·黃, 保羅·A·摩爾, 弗朗辛·志芬·陳, 萊斯利·S·約翰遜 申請人:宏觀基因有限公司