專利名稱：用于治療間質(zhì)性肺病的因子xii抑制劑的制作方法
用于治療間質(zhì)性肺病的因子Xl I抑制劑本發(fā)明涉及因子XII和/或因子XIIa的細(xì)胞活性的非內(nèi)源抑制劑的用途，用于治療和/或預(yù)防纖維增生性間質(zhì)性肺病，例如特發(fā)性肺纖維化。
背景技術(shù)：
間質(zhì)性肺病(ILD)也稱為彌漫性實(shí)質(zhì)性肺病(DPLD)，指影響間質(zhì)組織(在肺的氣囊周圍的組織和腔)的一組肺病。它涉及肺泡上皮、肺毛細(xì)血管內(nèi)皮、基膜、血管周和淋巴周圍周組織。特發(fā)性肺纖維化(IPF)定義為局限于肺且與普通型間質(zhì)性肺炎(UIP)的組織學(xué)模式相關(guān)的、原因未知的區(qū)別性類型的慢性纖維性間質(zhì)性肺炎。IPF肺的特征在于體系結(jié)構(gòu)破壞、密集瘢痕形成伴隨蜂窩樣和分散的成纖維細(xì)胞病灶(密集的成纖維細(xì)胞增殖區(qū)域)。IPF具有進(jìn)行性且通常致命的過程，具有在診斷后2-3年的生存中值。具有IPF的患者通常為50 — 70歲，并且發(fā)病率是每年對于女性為7. 4個(gè)病例/100，000并且對于男性為10. 7個(gè)病例/100，000。發(fā)病率、流行率和死亡隨著年齡增加。迄今為止，大多數(shù)治療策略已基于消除或抑制炎性組分。沒有藥理學(xué)療法已證明是在IPF治療中有效的。在IPF中所有目前可用的治療試驗(yàn)嚴(yán)重受限于缺乏疾病病因?qū)W的明確了解。IPF的發(fā)病機(jī)理的最初假設(shè)是響應(yīng)未知病原學(xué)因子(特發(fā)性)的慢性炎癥導(dǎo)致傷口愈合應(yīng)答的組織破壞、起始和傳播，且隨后導(dǎo)致進(jìn)行性纖維化。近來提議指示炎癥是觸發(fā)纖維化過程起始所需的，但在疾病進(jìn)展中起很小作用。與其他形式的慢性間質(zhì)性肺病例如肉瘤樣病和過敏性肺炎形成對比，IPF的特征在于僅有限的炎癥。近來，已提出IPF主要是肺泡上皮損傷、異常肺泡傷口修復(fù)和重塑的病癥。轉(zhuǎn)化生長因子- β I (TGF-β I)是高度多效的細(xì)胞因子，其在傷口愈合、胚胎發(fā)育和與炎癥和增殖相關(guān)的疾病狀態(tài)例如組織纖維化中起基本作用。在成年小鼠中，在肺中的TGF-β過表達(dá)導(dǎo)致進(jìn)行性肺纖維化。認(rèn)為TGF-β促進(jìn)肺中的纖維化應(yīng)答，主要是由于對肺泡上皮細(xì)胞增殖的抑制，成纖維細(xì)胞增殖的刺激，駐留肺細(xì)胞包括上皮細(xì)胞的激活，其分化成膠原產(chǎn)生成肌纖維細(xì)胞。TGF-β I增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)組分的合成且抑制其降解。此外，近期研究暗示TGF-β I可以通過調(diào)節(jié)促凝血和纖維蛋白溶解活性促成纖維化狀況。特別地，已顯示TGF-β I在不同細(xì)胞群體包括成纖維細(xì)胞中上調(diào)組織因子(外因性凝血途徑的關(guān)鍵起始劑)和纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)-1的表達(dá)。對于TGF-β I的細(xì)胞應(yīng)答涉及配體與TGF-β受體II型(TPR-1I)的結(jié)合，其磷酸化TGF-β受體I型(T0R-1)。激活的TPR-1磷酸化受體結(jié)合的Smads (Smad 1、2、3、5和8),促進(jìn)其與共有介質(zhì)Smad (Smad 4)的異源二聚化和從細(xì)胞質(zhì)到核的易位。在核內(nèi)，Smad異源復(fù)合物與靶基因的典型smad結(jié)合元件(SBE)相互作用，以激活其轉(zhuǎn)錄。已顯示人Smad 3和Smad 4結(jié)合包含CAGA盒的SBE。已在IPF患者的肺中觀察到肺泡止血平衡的改變和肺泡內(nèi)纖維蛋白的過度沉積。在這些條件下觀察到的肺泡內(nèi)纖維蛋白累積出現(xiàn)于在局部產(chǎn)生的促和抗凝血因子之間的失調(diào)，結(jié)合血漿蛋白質(zhì)(包括纖維蛋白原)滲漏到肺泡腔內(nèi)。在具有IPF的患者的支氣管肺泡灌洗(BAL)液中增加的促凝血活性伴隨減少的纖維蛋白溶解活性。已在肺纖維化的博來霉素動(dòng)物模型中觀察到在肺泡腔中的止血平衡的等同改變。在臨床和實(shí)驗(yàn)性肺纖維化中，促凝血應(yīng)答主要可歸于與因子Vila相關(guān)的組織因子(TF)，而減少的纖維蛋白溶解活性歸于通過纖溶酶原激活物抑制劑(PAI) -1對尿激酶型(u-PA)和組織型(t-PA)纖溶酶原激活物的抑制以及通過α 2-纖溶酶抑制劑對纖溶酶的封閉。盡管纖維蛋白是修復(fù)過程和正常傷口愈合所需的，但血管外纖維蛋白的持續(xù)和過度沉積被認(rèn)為以幾種方式促成纖維化肺病的病理機(jī)制。纖維蛋白可以充當(dāng)促纖維化生長因子的儲庫。它摻入且滅活肺表面活性物質(zhì)，對于維持低肺泡表面張力關(guān)鍵的肺脂蛋白復(fù)合物。表面活性劑功能障礙導(dǎo)致肺不張和肺順應(yīng)性的喪失。此外，表面活性劑系統(tǒng)的失活與通過纖維蛋白的鄰近肺泡壁的“膠合”結(jié)合，被認(rèn)為提供成纖維細(xì)胞在其上增殖且產(chǎn)生膠原的臨時(shí)基質(zhì)。此外，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附和細(xì)胞增殖，u-ΡΑ/ΡΑΙ-Ι系統(tǒng)可以促成肺纖維化的發(fā)展。此外，多種凝血蛋白酶例如凝血酶、因子Xa和TF/因子-VIIa復(fù)合物顯示出細(xì)胞活性，其還可以促成肺中的纖維化過程。大多數(shù)這些功能經(jīng)由蛋白酶激活受體(PAR)的蛋白酶解激活介導(dǎo)。例如，凝血酶和因子Xa以PAR-1依賴性方式刺激成纖維細(xì)胞增殖和前膠原生產(chǎn)。另外，凝血酶經(jīng)由PAR-1激活來誘導(dǎo)正常肺成纖維細(xì)胞分化為成肌纖維細(xì)胞。此夕卜，通過凝血酶、因子Xa和TF/因子VIIa復(fù)合物的PAR-1激活可以增加促纖維化和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。PAR-1在肺纖維化中的潛在作用通過近期發(fā)現(xiàn)得到強(qiáng)調(diào)，證實(shí)PAR-1缺陷小鼠被保護(hù)不受博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。在肺纖維化的發(fā)展中強(qiáng)調(diào)由止血因子介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)的重要性的另外證據(jù)來自近期觀察，指示在纖維蛋白原缺陷小鼠中沒有針對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的保護(hù)。發(fā)明概述本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)因子XII (FXII)在實(shí)驗(yàn)上誘導(dǎo)的肺損傷的纖維化時(shí)期過程中起作用。此外，觀察到通過ERK1/2途徑的藥理學(xué)封閉和通過FXIIa特異性抑制減弱對肺成纖維細(xì)胞增殖的FXII依賴性誘導(dǎo)。這些結(jié)果將FXII/FXIIa置于肺纖維化的病理學(xué)中的中心位置。因此，能夠干擾且封閉FXII激活或FXIIa活性的物質(zhì)可以適合于封閉肺中的纖維化過程及其臨床后果，即此類物質(zhì)可以適合于通過特異 性抑制FXII/FXIIa的細(xì)胞活性來限制肺成纖維細(xì)胞增殖。在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防纖維增生性間質(zhì)性肺病例如特發(fā)性肺纖維化的因子XII和/或因子XIIa (FXII/FXIIa)的細(xì)胞活性的非內(nèi)源抑制劑。本發(fā)明的第二個(gè)方面是治療和/或預(yù)防纖維增生性間質(zhì)性肺病例如特發(fā)性肺纖維化的方法，所述方法包括給個(gè)體施用藥學(xué)有效量的FXII和/或FXIIa的細(xì)胞活性的非內(nèi)源抑制劑。在本發(fā)明的一個(gè)特別方面，治療包括與治療間質(zhì)性肺病的第二種療法劑或治療原則的組合治療。所述第二種療法原則可以是氧療法。用于治療間質(zhì)性肺病的所述第二種療法劑可以是皮質(zhì)類固醇藥物、硫唑嘌呤、吡非尼酮、環(huán)磷酰胺、乙酰半胱氨酸和/或抗纖維化藥(ant1-f ibrotics)0本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面是延長患有纖維增生性間質(zhì)性肺病的患者的生存時(shí)間的方法，所述方法包括給所述患者施用藥學(xué)有效量的FXII和/或FXIIa的細(xì)胞活性的非內(nèi)源抑制劑。本發(fā)明的另外一個(gè)方面是減少與纖維增生性間質(zhì)性肺病例如特發(fā)性肺纖維化相關(guān)的癥狀的方法，所述方法包括給患者施用藥學(xué)有效量的FXII和/或FXIIa的細(xì)胞活性的非內(nèi)源抑制劑。本發(fā)明的另外一個(gè)方面是用于治療和/或預(yù)防纖維增生性間質(zhì)性肺病例如特發(fā)性肺纖維化的藥學(xué)試劑盒，所述試劑盒包含(I) FXII和/或FXIIa的細(xì)胞活性的非內(nèi)源抑制劑，和(2)用于治療間質(zhì)性肺病的其他藥物。所述其他藥物可以選自皮質(zhì)類固醇藥物、硫唑嘌呤、吡非尼酮、環(huán)磷酰胺、乙酰半胱氨酸和抗纖維化藥。附圖簡述

圖1 :FXI1、FXI和HMWK的mRNA水平在IPF患者的肺中是升高的。(A) FXII, FXI和HMWK mRNA的表達(dá)通過RT-PCR在供體和IPF肺組織勻漿物(LH)以及從供體(n=10)和IPF (n=10)肺中分離的肺成纖維細(xì)胞和肺泡上皮II型細(xì)胞(AT II)中進(jìn)行評估。給出的是與對于供體樣品獲得的值比較在IPF樣品中的mRNA表達(dá)中的倍數(shù)增加(對于β -肌動(dòng)蛋白表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化的)。(B)在IPF肺的健康(H)和纖維化(F)區(qū)域中FXI1、FXI和HMWK的表達(dá)。給出的是與對于供體樣品獲得的值比較在IPF樣品中的mRNA表達(dá)中的倍數(shù)增加(對于β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化的)。(C)結(jié)果呈現(xiàn)為平均值土s. e.m. ,*p<0. 05 ;斯氏t檢驗(yàn)。ND ；未檢測圖2 FXII,FXI和HMWK的蛋白質(zhì)水平在IPF患者的肺勻漿物中是增加的。(A)顯示在供體和IPF患者的肺勻漿物中的FXI1、FXI和HMWK表達(dá)的代表性免疫印跡。β -肌動(dòng)蛋白充當(dāng)上樣對照。(B)使用顯色底物(B)的FXII活性測定。玉米胰蛋白酶抑制劑用于特異性封閉FXII活性。結(jié)果來自10個(gè)供體和10個(gè)IPF患者。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為箱形圖，其中在每個(gè)盒內(nèi)的水平線代表中值，每個(gè)盒的界限代表四分位數(shù)間距，并且須代表最大和最小值。通過曼-懷二氏檢驗(yàn)來檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)顯著性。指示了顯著性水平。圖3 :在供體和IPF患者的肺組織中FXI1、FXI和HMWK的表達(dá)和定位。對得自供體和IPF患者的石蠟肺組織切片執(zhí)行免疫組織化學(xué)染色。顯示了每組的一個(gè)代表性IPF患者和五個(gè)中的一個(gè)對照。指示了條大小。

圖4 FXII,FXI和HMWK的mRNA水平在博來霉素處理的小鼠的肺中是升高的。在對照和博來霉素肺勻漿物以及從對照(n=10)和博來霉素攻擊的(n=10)小鼠的肺中分離的肺成纖維細(xì)胞和肺泡上皮II型細(xì)胞(AT II)中的FXI1、FXI和HMWK表達(dá)的定量RT-PCR分析。給出的是與對于對照肺獲得的值比較在博來霉素肺中的mRNA表達(dá)中的倍數(shù)增加(對于β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化的)。結(jié)果呈現(xiàn)為平均值土 s. e.m.，*〃ρ〈0. 0005，** ρ〈0. 005，*ρ〈0· 05 ;斯氏t檢驗(yàn)。圖5 :在對照和博來霉素攻擊的小鼠的肺勻漿物中FXI1、FXI和HMWK增加的蛋白質(zhì)水平。顯示在鹽水對照和博來霉素肺的肺勻漿物中的FXI1、FXI和HMWK表達(dá)的代表性免疫印跡。β_肌動(dòng)蛋白充當(dāng)上樣對照。圖6 :在對照和博來霉素處理的小鼠的肺中FXI1、FXI和HMWK的表達(dá)和定位。顯示在來自鹽水或博來霉素處理的小鼠的肺中的FXI1、FXI和HMWK免疫定位的代表性組織切片。顯示了每組的一個(gè)代表性博來霉素小鼠和十個(gè)中的一個(gè)對照。指示了條大小。圖7 =FXI1-/-小鼠被保護(hù)不受博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。在博來霉素攻擊后21天(A)野生型和(C) FXI1-/-小鼠的肺的蘇木精和伊紅染色。在博來霉素攻擊后21天(B)野生型和(D) FXI1-/-小鼠的三色染色。綠色指示膠原染色。指示了條大小。(E)存活曲線證實(shí)在博來霉素攻擊后WT和FXI1-/-小鼠的死亡率，η=20只小鼠/組。通過時(shí)序檢驗(yàn)的顯著性差異，P=O. 007FXI1-/-與WT存活相比較。圖8 =FXI1-/-小鼠的肺中的纖維蛋白沉積在博來霉素應(yīng)用后是未受損的。在博來霉素滴注后3周，來自博來霉素處理的WT和FXI1-/-小鼠的肺組織中的纖維蛋白免疫染色。紅色指示纖維蛋白。顯微照片選擇為舉例說明對于每個(gè)實(shí)驗(yàn)組在肺的異常和正常區(qū)域中纖維蛋白沉積的模式和程度。指示了條大小。圖9 =FXIIa抑制劑減弱博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。在(C，G)博來霉素或(A，E)鹽水應(yīng)用后21天時(shí)，肺的蘇木精和伊紅染色。在博來霉素(D，H)或鹽水(B，F(xiàn))滴注后21天時(shí)，肺的三色染色。綠色指示膠原染色。指示了條大小。(I)存活曲線證實(shí)在博來霉素攻擊后WT和FXI1-/-小鼠的死亡率，n=20只小鼠/組。通過時(shí)序檢驗(yàn)的顯著性差異，P=O. 007。(J)在博來霉素或鹽水施用后21天的順應(yīng)性測量。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為箱形圖，其中在每個(gè)盒內(nèi)的水平線代表中值，每個(gè)盒的界限代表四分位數(shù)間距，并且須代表最大和最小值。n=5只小鼠/ 組;***Ρ〈0· 05 ;AN0VA，Tukey’ s 事后檢驗(yàn)。圖10 B1B2-/-小鼠被保護(hù)不受博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。(A)在博來霉素滴注后21天WT和B1B2-/-處理的小鼠的肺的H&E和馬森-三色(Masson-Trichrom)染色。綠色指示膠原染色。指示了條大小。(B)存活曲線證實(shí)在博來霉素攻擊后WT和B1B2-/-小鼠的死亡率，n=20只小鼠/組。通過時(shí)序檢驗(yàn)的顯著性差異，p=0. 86。(C)在博來霉素施用后21后天的順應(yīng)性測量。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為箱形圖，其中在每個(gè)盒內(nèi)的水平線代表中值，每個(gè)盒的界限代表四分位數(shù)間距，并且須代表最大和最小值。n=20只小鼠/組；差異不顯著；曼-懷二氏檢驗(yàn)。圖11 =FXIIa刺激鼠肺成纖維細(xì)胞增殖。(A)在暴露于FXIIa的鼠肺成纖維細(xì)胞中的[3H]-胸苷摻入。值呈現(xiàn)為在至少3個(gè)中的一個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)執(zhí)行的四次測定的平均值土SEM。
** P<0. 0005 ； * P<0. 05 ；AN0VA, Tukey’ s 事后檢驗(yàn)(B)顯示在 6 μ g/ml FXIIa 刺激后 6 小時(shí)的鼠肺成纖維細(xì)胞中的細(xì)胞周期蛋白Dl表達(dá)的代表性免疫印跡。β_肌動(dòng)蛋白充當(dāng)上樣對照。圖12 :ρ44/42激酶調(diào)節(jié)FXII誘導(dǎo)的鼠肺成纖維細(xì)胞增殖。(A)鼠肺成纖維細(xì)胞用FXIIa處理所示時(shí)間點(diǎn)，并且通過蛋白質(zhì)印跡分析p44/42、JNK、c-jun、p38和Akt激酶的活性和表達(dá)。如所示的經(jīng)由磷特異性抗體檢測磷蛋白。經(jīng)由泛特異性抗體證實(shí)相等上樣。數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。(B)在FXIIa刺激前，在用JNK、PI3K、MEK和p38激酶的特異性抑制劑(分別為SP600125、渥曼青霉素、PD98059和SB203580)預(yù)處理的鼠肺成纖維細(xì)胞中的[3H]-胸苷摻入。值呈現(xiàn)為在至少三個(gè)中的一個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)執(zhí)行的四次測定的平均值土SEM;
*Ρ〈0· 05 ;AN0VA、Tukey’ s 事后檢驗(yàn)。圖13 :uPAR介導(dǎo)FXIIa誘導(dǎo)的鼠肺成纖維細(xì)胞增殖。(A)在FXIIa刺激前，在用uPAR封閉抗體或IgG同種型對照抗體預(yù)處理的鼠肺成纖維細(xì)胞中的[3H]-胸苷摻入。(B)在來自uPAR的結(jié)構(gòu)域2的肽(LRG或TCK)或隨機(jī)肽的存在下，在暴露于FXIIa后的鼠肺成纖維細(xì)胞中的[3H]-胸苷摻入。值呈現(xiàn)為在至少三個(gè)中的一個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)執(zhí)行的四次測定的平均值土SEM ；**P<0. 0005 ;*Ρ〈0· 05 ；AN0VA, Tukey，s 事后檢驗(yàn)。圖14 uPAR是FXIIa有絲分裂促進(jìn)活性所需的。(A)在FXIIa刺激后，從野生型(WT)或uPAR缺陷(uPAR-/-)小鼠中分離的鼠肺成纖維細(xì)胞中的[3H]-胸苷摻入。TGF^暴露充當(dāng)陽性對照。CTI，玉米胰蛋白酶抑制劑。值呈現(xiàn)為在至少三個(gè)中的一個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)執(zhí)行的四次測定的平均值土SEM。**P<0. 0005 ；ANOVA, TukeyJ s事后檢驗(yàn)。(B) FXII的免疫沉淀。對于uPAR特異性的抗體與來自用FXIIa刺激或未刺激的細(xì)胞的裂解產(chǎn)物一起溫育30分鐘。使用蛋白A-瓊脂糖珠沉淀免疫復(fù)合物，并且使用針對FXII的抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析。uPAR充當(dāng)上樣對照。IgG LCh，IgG輕鏈；IgGHCh, IgG重鏈。圖15 : α 5β I整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)FXIIa介導(dǎo)的鼠肺成纖維細(xì)胞增殖。(A)在FXIIa刺激前，在用(A) β I或(B) α 5整聯(lián)蛋白封閉抗體或IgG同種型對照抗體預(yù)處理的鼠肺成纖維細(xì)胞中的[3H]-胸苷摻入。值呈現(xiàn)為在至少三個(gè)中的一個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)執(zhí)行的四次測定的平均值土SEM ；***ρ<0. 0005 ；**ρ<0. 005 ；*ρ<0. 05 ；ANOVA, Tukey，s 事后檢驗(yàn)。圖16 :TGF-P I上調(diào)HLF中的FXII表達(dá)。(A，B)如通過(A)實(shí)時(shí)PCR和(B)蛋白質(zhì)印跡評估的，在TGF-β I刺激后的HLF中FXII表達(dá)的時(shí)間過程。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果表示為與對于未刺激的細(xì)胞獲得的值比較在FXII表達(dá)中的倍數(shù)增加(對于β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化的)，并且是平均值±30;11=3;〃？〈0.01。舉例說明了三個(gè)中的代表性印跡。(C)在(B)中呈現(xiàn)的印跡的密度計(jì)分析；〃Ρ〈0. 01。圖17 =TGF-β I 誘導(dǎo) MAPK、Akt 和 Smad3 的磷酸化。(A) HLF 用 TGF-β I 處理所示時(shí)間點(diǎn)，并且通過蛋白質(zhì)印跡分析p44/42、JNK、p38和Akt激酶的活性和表達(dá)。如所示的經(jīng)由磷特異性抗體檢測磷蛋白。經(jīng)由泛特異性抗體證實(shí)相等上樣。數(shù)據(jù)是四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。(B)磷酸-Smad 3的TGF-β I依賴性易位 至核。HLF與TGF-β I 一起溫育I小時(shí)，隨后洗漆，固定且用磷酸-Smad 3抗體染色。箭頭指示Smad 3的核定位。原始放大率40' /1. 25-0. 75油-物鏡。條大小10 μ m。數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。(C)磷酸-Smad3的TGF-β I驅(qū)動(dòng)易位至核的蛋白質(zhì)印跡分析。HLF用TGF-β I處理I小時(shí)，制備核提取物且用針對磷酸-Smad 3、核纖層蛋白B和微管蛋白的抗體免疫印跡。核纖層蛋白B和微管蛋白用作上樣對照以評估核餾分的純度。數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。圖18 =Smad 3和JNK激酶調(diào)節(jié)TGF- β1-誘導(dǎo)的HLF中的FXII表達(dá)。(A)在HLF中TGF-β I誘導(dǎo)的FXII表達(dá)的蛋白質(zhì)印記分析。在與TGF-β I —起溫育48小時(shí)前，HLF用SB431542、SP600125、渥曼青霉素(Wort)、PD98059或SB203580處理I小時(shí)。制備細(xì)胞裂解產(chǎn)物且檢查FXII表達(dá)。β-肌動(dòng)蛋白用作上樣對照。舉例說明了三個(gè)中的代表性印跡。(B)在(A)中呈現(xiàn)的印跡的密度計(jì)分析；〃 p〈0. 01 ；***ρ<0. 001。(C，F(xiàn))通過經(jīng)由蛋白質(zhì)印跡針對(C) JNKl或(F)Smad 3的siRNA轉(zhuǎn)染測定在HLF中的敲減(knockdown)效率。數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。(D，G) (D) JNKl或(G) Smad 3敲減對HLF中TGF-β I誘導(dǎo)的FXII表達(dá)的作用。數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。(Ε，Η)分別為(D)和(G)中呈現(xiàn)的印跡的密度計(jì)分析；*Ρ〈0· 05 ；** ρ<0. 01, ***ρ<0. 001。siR,零亂 siRNA ;wort,渥曼青霉素。圖19 JNKl激酶不調(diào)節(jié)Smad3磷酸化和易位至核。(A，B)如所示的，HLF在(A)JNK抑制劑(3 600125)或(8)1^1 1抑制劑(SB431542)的不存在或存在下用TGF-β I處理，并且通過蛋白質(zhì)印跡分析Smad 3和JNK的活性和表達(dá)。數(shù)據(jù)是四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。(C)磷酸-Smad 3的TGF-β I驅(qū)動(dòng)易位至核的蛋白質(zhì)印跡分析。HLF用SB431542或SP600125預(yù)處理，并且隨后未刺激或用TGF- β I刺激I小時(shí)，制備核提取物且用針對磷酸-Smad 3、核纖層蛋白B和微管蛋白的抗體進(jìn)行免疫印跡。核纖層蛋白B和微管蛋白用作上樣對照以評估核餾分的純度。數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。圖20 =TGF-β I經(jīng)由位于位置-272上的SBE誘導(dǎo)FXII啟動(dòng)子活性。(A)FXII啟動(dòng)子缺失螢光素酶報(bào)道分子構(gòu)建體的圖示。成角的箭頭指示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。(B)NIH3T3細(xì)胞用所示FXII啟動(dòng)子缺失構(gòu)建體轉(zhuǎn)染且未刺激(白色條)或用TGF-β I刺激(黑色條)。如“實(shí)驗(yàn)程序”中所述測量螢光素酶活性。數(shù)據(jù)代表來自四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土SD，各自一式三份地執(zhí)行P〈0. 01。(C)含有在-272位置上的假定smad結(jié)合位點(diǎn)(SBE)的FXII啟動(dòng)子區(qū)的圖示。PGL3-299C/T代表其中SBE-272通過在位置-273上的C殘基替換為T進(jìn)行突變的構(gòu)建體。(D)NIH3T3細(xì)胞用pGL3-299或pGL3-299C/T構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在未處理(白色條)和TGF-β I處理(黑色條)的細(xì)胞中測定螢光素酶活性。數(shù)據(jù)代表來自四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土SD，各自一式三份地執(zhí)行；〃ρ〈0.01。圖21 =TGF-β I經(jīng)由位于位置-272上的SBE誘導(dǎo)FXII啟動(dòng)子活性。(A)pGL3_299構(gòu)建體和缺乏SBE-272的構(gòu)建體(pGL3-183DSBE-272)的圖示。(B)NIH3T3細(xì)胞用pGL3_299或PGL3-183DSBE-272轉(zhuǎn)染，且在未刺激(白色條)和TGF-β I刺激(黑色條)的細(xì)胞中測定螢光素酶活性。數(shù)據(jù)代表來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土 SD，各自一式三份地執(zhí)行；* *p〈0. Ol0 (C)在與TGF- β I 一起溫育前，用pGL3-399構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的ΝΙΗ3Τ3細(xì)胞用SB431542、SP600125、渥曼青霉素(Wort)、PD98059或SB203580預(yù)處理I小時(shí)。在未處理(白色條)和TGF-β I處理(黑色條)的細(xì)胞中測定螢光素酶活性。數(shù)據(jù)代表來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土SD，各自一式三份地執(zhí)行；*ρ<0. 05 ；**ρ<0.01 ;***ρ〈0·001。wort，渥曼青霉素。圖22 =Smad 3-SBE-272相互作用在JNK抑制劑的存在下是被抑制的。(A) HLF是未刺激的或用TGF-β I刺激的，并且使用Smad 3抗體或同種型IgG對照執(zhí)行ChIP分析。如“實(shí)驗(yàn)程序”中所述用免疫沉淀的DNA執(zhí)行PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，并且通過用溴化乙啶染色檢測。數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。(B)來自未處理或TGF-βΙ處理的細(xì)胞的核提取物與生物素化的模板(SBE-283/-258或SBE-283/-258C/T)—起溫育，并且通過蛋白質(zhì)印跡檢測Smad 3。數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。(C)在與TGF-β I —起溫育前，HLF用SB431542 或SP600125預(yù)處理I小時(shí)。使用Smad 3抗體或同種型IgG對照執(zhí)行ChIP分析。如“實(shí)驗(yàn)程序”中所述用免疫沉淀的染色質(zhì)執(zhí)行PCR。數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。(D)在加入TGF-β I前，HLF與SB431542或SP600125 —起預(yù)溫育I小時(shí)。制備核提取物且隨后與生物素化的模板(SBE-283/-258)—起溫育。通過蛋白質(zhì)印跡檢測Smad 3。數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。圖23 :在小鼠中的實(shí)驗(yàn)性肺纖維化中FXII的表達(dá)和分布。(A)博來霉素應(yīng)用用于在小鼠中誘導(dǎo)特發(fā)性肺纖維化(IPF)型疾病，并且對處理的動(dòng)物的支氣管肺泡灌洗液中的FXII濃度進(jìn)行定量。(B)顯示了小鼠用博來霉素處理后第14天和第21天時(shí)的小鼠肺中的FXII表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡分析)。(C)顯示了在博來霉素處理的小鼠中與β-肌動(dòng)蛋白mRNA有關(guān)的FXII mRNA的表達(dá)，還指示在博來霉素應(yīng)用后第14天和第21天時(shí)的倍數(shù)增加。(D，E)證實(shí)了在博來霉素處理的小鼠中的組織體系結(jié)構(gòu)和FXII (紅色)的分布。圖24 =FXII缺陷對小鼠中博來霉素誘導(dǎo)的IPF的影響。(A)顯示了在野生型(WT)和FXII缺陷動(dòng)物中因子XII(紅色)的分布。此外，記錄了膠原沉積的分布。注在FXII缺陷小鼠中，肺組織體系結(jié)構(gòu)幾乎不受影響且類似生理學(xué)情況，不可見主要膠原沉積。(B)對于博來霉素處理的組記錄了與FXII缺陷小鼠相比較，野生型小鼠的存活曲線(Kaplan-Meier曲線)。(C)記錄了博來霉素處理的野生型或FXII缺陷小鼠的肺功能的順應(yīng)性，指示FXII缺陷小鼠不受IPF情況的幾乎完全保護(hù)。(D，E)與野生型組相比較，隔膜厚度以及膠原含量在博來霉素處理的FXII缺陷小鼠中是不擴(kuò)大的。圖25 =FXIIa抑制劑“玉米胰蛋白酶抑制劑”(CTI)的施用在小鼠中保護(hù)不受博來霉素誘導(dǎo)的IPF情況。(A)在博來霉素施用后，未處理的野生型小鼠顯示出顯著增加的FXII表達(dá)以及膠原沉積，而CTI處理的小鼠在很大程度上被保護(hù)不受肺重塑和膠原沉積。(B)存活曲線(Kaplan-Meier曲線)指示接受FXII抑制劑CTI的博來霉素處理的小鼠被顯著保護(hù)不受IPF型肺纖維化。(C)在接受CTI的處理組中，肺順應(yīng)性得到顯著改善。(D，E)通過博來霉素應(yīng)用引起的在隔膜厚度和膠原含量中的增加在小鼠的治療性CTI組中得到顯著阻止。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防間質(zhì)性肺病的方法，所述方法包括給受試者施用藥學(xué)有效量的FXII/FXIIa的細(xì)胞活性的非內(nèi)源抑制劑，即施用此類抑制劑預(yù)防和/或限制肺成纖維細(xì)胞的增殖。同樣地，本發(fā)明涉及非內(nèi)源細(xì)胞FXII抑制劑用于制造用于治療和/或預(yù)防間質(zhì)性肺病的藥物中的用途。因子XIIFXII是作為單鏈78kD酶原在肝中產(chǎn)生的多肽。在激活后，F(xiàn)XII轉(zhuǎn)化為由重和輕鏈組成的兩鏈形式。重鏈含有下述結(jié)構(gòu)域引導(dǎo)肽、纖連蛋白II型結(jié)構(gòu)域、表皮生長因子(EGF)結(jié)構(gòu)域、纖連蛋白I型結(jié)構(gòu)域、kringle結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域,其對于FXII是獨(dú)特的。輕鏈含有對于絲氨酸蛋白酶一般的催化結(jié)構(gòu)域，由此FXII具有與絲氨酸蛋白酶家族的其他成員相似的結(jié)構(gòu)域組構(gòu)，例如組織型纖溶酶原激活物(t-PA)、尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA)或因子VII激活的蛋白酶。重鏈含有沿著纖連蛋白I型區(qū)關(guān)于位于氨基末端上的帶負(fù)電表面的結(jié)合區(qū)，并且可能位于第二個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域或kringle結(jié)構(gòu)域上。在輕鏈中的FXII活性位點(diǎn)由典型催化三分子組成，包括His40、Asp89和Serl91殘基。這個(gè)位點(diǎn)還是關(guān)于主要內(nèi)因性凝血途徑抑制劑，Cl抑制劑的靶。FXII通過激肽釋放酶的切割或其自體活化導(dǎo)致FXII酶原中 結(jié)合的Arg353-Val354的分裂，導(dǎo)致活性a XIIa形式的生成，其含有由二硫鍵連接的重和輕鏈。在aXIIa形式中兩個(gè)另外肽鍵的水解生成30kDi3XIIa，含有輕鏈和重鏈的截短片段。a XHa能夠結(jié)合帶負(fù)電的表面且激活FXI和前激肽釋放酶(ΡΚ)。β XIIa不具有表面結(jié)合能力但可以激活ΡΚ。如本文使用的，術(shù)語“因子XII”或“FXII”指因子XII的上述形式中的任何。特別地，該術(shù)語包括激活型因子XIIa (FXIIa)。間質(zhì)性肺病間質(zhì)性肺病(ILD)也稱為彌漫性實(shí)質(zhì)性肺病(DPLD)，指影響間質(zhì)組織(在肺的氣囊周圍的組織和腔)的一組肺病。它涉及肺泡上皮、肺毛細(xì)血管內(nèi)皮、基膜、血管周和淋巴周圍周組織。在本申請的意義上的ILD特別涉及肺成纖維細(xì)胞增殖且因此使用術(shù)語“纖維增生性ILD”。這種肺成纖維細(xì)胞增殖應(yīng)通過本發(fā)明進(jìn)行治療和/或預(yù)防。優(yōu)選地，依照本發(fā)明待治療的ILD是肺纖維化。最優(yōu)選地，肺纖維化是特發(fā)性肺纖維化。特發(fā)性肺纖維化(IPF)定義為局限于肺且與普通型間質(zhì)性肺炎(UIP)的組織學(xué)模式相關(guān)的、原因未知的區(qū)別性類型的慢性纖維性間質(zhì)性肺炎。IPF肺的特征在于體系結(jié)構(gòu)破壞、密集瘢痕形成伴隨蜂窩樣和分散的成纖維細(xì)胞病灶(密集的成纖維細(xì)胞增殖區(qū)域)。FXII的細(xì)胞活性的非內(nèi)源抑制劑
術(shù)語“FXII的細(xì)胞活性的非內(nèi)源抑制劑”或“非內(nèi)源細(xì)胞FXII抑制劑”指能夠減少FXII和/或FXIIa的細(xì)胞活性或其量的任何非內(nèi)源化合物。在本發(fā)明的意義上的FXII抑制劑包括干擾FXIIa的催化活性的化合物。進(jìn)一步包括的是能夠在體內(nèi)減少FXII或FXIIa的量的化合物。此類抑制劑包括能夠減少FXII的表達(dá)的化合物。進(jìn)一步地，包括的是干擾FXII轉(zhuǎn)化成FXIIa的抑制劑。此類抑制劑將FXII和/或FXIIa的生物學(xué)功能減少至少50%、優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少90%且更加優(yōu)選至少95%例如至少98%或甚至至少99%。生物學(xué)功能指示FXII/FXIIa的任何已知細(xì)胞效應(yīng)。所述細(xì)胞功能的例子是對細(xì)胞特別是肺成纖維細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞的增殖和/或促有絲分裂作用。在本發(fā)明的意義上上的“非內(nèi)源”抑制劑是在其中FXII/FXIIa應(yīng)被抑制的物種中并非天然存在的FXII/FXIIa抑制劑。FXII/FXIIa的內(nèi)源抑制劑是例如抗凝血酶、Cl抑制齊U、α -1蛋白酶抑制劑。本發(fā)明的非內(nèi)源FXII/FXIIa抑制劑比內(nèi)源FXII/FXIIa抑制劑特異得多，即根據(jù)本發(fā)明的抑制劑對于FXII/FXIIa是非常特異性的。這種特異性可以表示為例如獲得FXII/FXIIa活性的50%減少所需的特異性抑制劑與FXII/FXIIa的摩爾比。這稱為在本發(fā)明的意義上的摩爾抑制比。O. 5的摩爾抑制比意指加入lpmol FXII/FXIIa中的O. 5pmol抑制劑導(dǎo)致FXII/FXIIa活性的50%減少。本發(fā)明的特定的即非內(nèi)源抑制劑是具有小于或等于10、或者優(yōu)選小于或等于5或者更優(yōu)選小于或等于2或者更加優(yōu)選小于或等于I例如小于或等于O. 5的摩爾抑制比的抑制劑。用于測定FXIIa 的催化活性的測試在 Kannemeier C, Shibamiya A, Nakazawa F,Trusheim H，Ruppert C，Markart P，Song Y，Tzima E，Kennerknecht E,NiepmannM,BruehlML, Sedding D，Massberg S，Giinther A，Engelmann B，Preissner KT. Extracellular RNAconstitutes a natural procoagulant cofactor in blood coagulation. Proc Natl AcadSci USA. 104:6388-6393,2007中描述。簡言之，將FXIIa樣品和顯色底物肽混合，并且在光度計(jì)中在405nm處隨著時(shí)間過去跟蹤對硝基苯胺的釋放。如果化合物能夠在那個(gè)測定中以顯著方式將催化活性減少優(yōu)選至少10%、更優(yōu)選至少25%、最優(yōu)選至少50%例如至少75%或甚至至少90%，那么它作為F XIIa的催化特別是酶促活性的抑制劑是合適的。用于測定FXII轉(zhuǎn)化成FXIIa的程度的測試通過在顯色肽測定中跟蹤FXIIa的增力口，以與上文描述相似的方式進(jìn)行描述。如果化合物根據(jù)那個(gè)測定能夠?qū)⑦@種轉(zhuǎn)化抑制至顯著程度；優(yōu)選地，受抑制劑影響的轉(zhuǎn)化中的減少是至少10%、更優(yōu)選至少25%、最優(yōu)選至少50%，那么化合物作為干擾FXII轉(zhuǎn)化成FXIIa的抑制劑是合適的。描述了測定FXII和/或FXIIa的量的方法，其中FXII/FXIIa的總量使用FXII特異性抗體通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)進(jìn)行定量，并且通過經(jīng)由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析樣品測定被激活的FXII的部分，隨后為蛋白質(zhì)印跡以定量蛋白質(zhì)條帶模式。此類方法包括蛋白質(zhì)檢測的已知方法例如ELISA和其他免疫學(xué)技術(shù)?？笷XII 抗體針對FXII和/或FXIIa的抗體可以用于抑制FXIIa的功能。此類抗體包括例如抗FXII抗體，包括多和單克隆抗體?？贵w還可以是保留抑制活性的相同或模擬的片段，例如如公開于美國專利6，613，890特別是第4 一 8欄中的淀粉樣蛋白前體蛋白的Kunitz蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域的類似物。蛋白酶抑制劑抑制FXIIa活性的有效方法是使用特異性、非內(nèi)源蛋白酶抑制劑例如絲氨酸蛋白酶抑制劑。例子包括抑肽酶，Z-Pro-Pro-醛-二甲基乙酸酯，DX88 (Dyax Inc.,300Technology Square, Cambridge, MA 02139, USA ;引用于Williams A.和 BairdLG.，Transfus Apheresis Sc1. 2003Dec :29 (3) :255-8)，脯氨酰寡肽酶的抑制劑例如Fmoc-Ala-Pyr-CN，玉米胰蛋白酶抑制劑(CTI )，牛胰胰蛋白酶抑制劑突變體和Pro-Phe-Arg-氣甲基-麗(PCK )。其他合適的抑制劑可以是如由H.1sawa等人(J Biol Chem277:27651-27658,2002)公開的Hamadarin。合適的玉米胰蛋白酶抑制劑及其生產(chǎn)方法公開于Z. Y. Chen等人(Appl Environm Microbiol65:1320-1324，1999和同處引用的參考文獻(xiàn)19)中。引用的所有參考文獻(xiàn)包括其在本申請中的完整內(nèi)容通過引用合并。最后但并非最不重要的，例如經(jīng)由使用FXII各自的FXIIa抑制作為選擇基于其上的測定分離的小分子，以及其在上文或下文描述的各自用途是本發(fā)明的部分。這些小分子FXIIa抑制劑可以在FXII的晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行設(shè)計(jì)。因此，幾個(gè)FXII結(jié)構(gòu)域或輕鏈可以在表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)，所述表達(dá)系統(tǒng)例如大腸桿菌(E. coli )、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。隨后使用如對于FXII底物FXI描述的標(biāo)準(zhǔn)程序純化且結(jié)晶蛋白質(zhì)(Jin L等人J Biol Chem. 280:4704-4712,2005)。與大腸桿菌素(ecotin)突變體復(fù)合的FXIa催化結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)揭示底物樣相互作用。備選地，可以包括小分子絲氨酸蛋白酶抑制劑以穩(wěn)定FXII結(jié)構(gòu)。近來，F(xiàn)XII/FXIIa的新型抑制劑在昆蟲中發(fā)現(xiàn)來自騷擾錐蝽(Triatomainfestans)(一種吸血昆蟲)的中腸的 Infestin 結(jié)構(gòu)域 3-4 (Infestin 3-4)和 Infestin結(jié)構(gòu)域 4( Infestin_4)(Campos ITN 等人 2002.1nfestin, a thrombin inhibitor presentin Triatoma infestans midgut, a Chagas' disease vector gene cloning, expressionand characterization of the inhibitor.1nsect Biochem. Mol. Biol.32:991-997 ；Campos ITN 等人 2004.1dentification and characterization of a novel factorXIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera Reduviidae). FEBS Lett. 577:512-516)。這些蛋白質(zhì)稱為Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑的有力FXIIa抑制劑，將活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間延長約三倍。在國際專利申請 W02008/098720 中，描述了 Infestin 3-4 和 Infestin-4 以及Infestin 4的白蛋白融合蛋白(rHA-1nfestin_4)作為FXIIa的有力抑制劑的用途以及這些分子本身。此外，與Infestin-4具有極高相似性的人蛋白質(zhì)描述為SPINK-1，在胰腺中表達(dá)的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑(也稱為胰分泌性胰蛋白酶抑制劑，PSTD0基于野生型SPINK-1序列，已描述了三種不同的突變體，伴隨與Infestin-4具有增加的同源性的SPINK-1序列。成熟SPINK-1野生型蛋白質(zhì)的氨基酸序列、三種突變體和Infestin-4作為SEQ ID NO 29-33給出。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的FXII抑制劑包含來自SPINK-1的突變型Kazal抑制劑，其中抑制劑具有對Infestin-4增加的同源性。術(shù)語“具有增加的各自增加的同源性的SPINK-1突變體”指含有與Infestin-4具有超過20個(gè)等同氨基酸的突變體，或保守置換代替同一性意指保守置換代替等同氨基酸。優(yōu)選地，所述突變型Kazal抑制劑與被抑制的FXIIa的接觸位點(diǎn)來自Kazal型抑制劑Infestin的結(jié)構(gòu)域4。W02008/098720的完整描述在此通過引用合并入本申請。因此，infestin或其片段、或者 Infestin 3-4 或 Infestin-4、或來自 SPINK-1 的所述突變型Kazal抑制劑，其中抑制劑與Infestin-4具有增加的同源性，和如下所述的融合蛋白rHA-1nfestin-4是根據(jù)本發(fā)明的FXII/FXIIa的細(xì)胞活性的合適非內(nèi)源抑制劑。換言之,在一個(gè)實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┝税琁nfestin結(jié)構(gòu)域4, Infestin-4的FXII抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑包含Infestin-4的變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)XII抑制劑包含Infestin結(jié)構(gòu)域4，和任選的Infestin結(jié)構(gòu)域1、2和/或3 ;這些蛋白質(zhì)已知是FXII的有力抑制劑。提供了 Infestin-4的野生型多肽序列(SEQ ID NO:33)。如本文使用的，術(shù)語“變體”指具有氨基酸突變的多肽，其中“突變”定義為對于野生型Infestin-4序列的置換、缺失或添加，其中此類變化不改變多肽抑制FXII的功能能力。術(shù)語“變體”包括野生型或突變型Infestin-4序列的片段。此類變體的進(jìn)一步例子在下文提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，Infestin-4變體包含野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13，和導(dǎo)致與野生型Infestin-4序列的差異在N末端氨基酸外的至少一個(gè)并直到五個(gè)氨基酸突變，或六個(gè)保守的半胱氨酸殘基和與野生型Infestin-4序列至少70%的同源性。Infestin-4序列的N末端氨基酸2_13對于結(jié)合FXII可以是重要的，基于關(guān)于與凝血酶結(jié)合的有關(guān)抑制劑長紅錐蝽(Rhodnius prolixus) (PDB :1 TS0)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)分析,和與胰凝乳蛋白酶結(jié)合的SPINK-1的分析，其共享在N末端區(qū)域中的接觸位點(diǎn)累積的共同特征。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，Infestin-4的變體包含野生型Infestin-4序列的氨基酸2_13的保守N末端區(qū)域，和導(dǎo)致與野生型Infestin-4序列的差異在這些保守N末端氨基酸外的至少一個(gè)并直到五個(gè)氨基酸突變。突變可以是置換、缺失或添加。如本文使用的，術(shù)語“在所述N末端氨基酸外”指沿著變體的多肽鏈除包含序列VRNPCACFRNYV的氨基酸的鄰接段(即來自野生型Infestin-4序列的氨基酸2_13)外的任何氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Infestin-4變體包含六個(gè)保守的半胱氨酸殘基且與野生型Infestin-4序列具有至少70%的同源性。在一個(gè)實(shí)施方案中，六個(gè)保守的半胱氨酸殘基是在野生型Infestin-4序列的位置6、8、16、27、31和48上 的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，變體包含最終保守的半胱氨酸。在其他實(shí)施方案中，由于在Infestin-4變體中的插入或缺失，半胱氨酸殘基的確切位置和與彼此的相對位置可以與野生型Infestin-4序列的位置6、8、16、27、31和48不同。然而，在這些實(shí)施方案中，Infestin-4變體包含所有六個(gè)半胱氨酸,并且可以與野生型Infestin-4序列共享 70%、75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同源性。在實(shí)施方案中，Infestin-4的變體的特征在于它抑制FXII。抑制FXII的功能活性可以例如通過體外和/或體內(nèi)表征進(jìn)行評估，包括測試FXII酶活性的抑制、延長的凝血時(shí)間即活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(aPTT)的直接測定，或估計(jì)凝血的體內(nèi)方法。Infestin-4變體的進(jìn)一步例子是下文描述的SPINK-1突變體。一個(gè)實(shí)施方案涉及用于在人中的治療用途的FXII抑制劑。可以采用與Infestin-4具有高相似性的人蛋白質(zhì)。例如,與Infestin-4具有最高相似性的人蛋白質(zhì)是SPINK-1，在胰腺中表達(dá)的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑(也稱為胰腺分泌性胰蛋白酶抑制齊IJ，PSTI)。Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族是絲氨酸蛋白酶抑制劑的眾多家族之一。來自不同物種的許多蛋白質(zhì)已得到描述(Laskowski M和Kato 1,49Ann. Rev. Biochem. 593-626,1980)。在Infestin-4和SPINK-1之間的氨基酸序列相似性在圖12中概括?；谝吧蚐PINK-1序列(SEQ ID NO :29)，可以生成不同變體，以便增加SPINK-1序列與Infestin-4的同源性。短語“與Infestin-4增加的同源性”指由此對SPINK-1作出氨基酸突變的過程，以使SPINK-1序列更接近于Infestin-4序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，SPINK-1是突變的，以包含野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13 ;給出多肽序列且稱為Kl (SEQ ID NO :30)。如上所述，Infestin-4序列的N末端部分被認(rèn)為對于FXII抑制功能是重要的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，突變的SPINK-1的變體還包含野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13，和導(dǎo)致與野生型SPINK-1序列的差異在所述N末端氨基酸外的至少一個(gè)并直到五個(gè)氨基酸突變，并且其增加變體與野生型Infestin-4序列的同源性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，突變的SPINK-1的變體包含六個(gè)保守的半胱氨酸殘基且與野生型SPINK-1序列具有至少70%的同源性。突變可以是置換、缺失或添加。如上定義的，術(shù)語“在所述N末端氨基酸外”指沿著變體的多肽鏈除包含序列VRNPCACFRNYV的氨基酸的鄰接段(即來自野生型Infestin-4序列的氨基酸2_13)外的任何氨基酸。術(shù)語“變體”包括所述突變的SPINK-1序列的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，六個(gè)保守的半胱氨酸殘基可以是在野生型SPINK-1序列的位置9、16、24、35、38和56上的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，變體包含最終保守的半胱氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，由于在SPINK-1變體中的插入或缺失，半胱氨酸的確切位置和與彼此的相對位置可以與野生型SPINK-1序列的位置9、16、24、35、38和56不同。然而，在這些實(shí)施方案中，SPINK-1變體包含所有六個(gè)半胱氨酸。在實(shí)施方案中，SPINK-1變體的特征還在于它抑制FXII。給出此類SPINK-1變體的例子且命名為K2和K3 (分別為SEQ ID NO :31和32)。在SPINK-1變體K2和K3中，制備在N末端外的進(jìn)一步氨基酸置換，以便增加與Infestin-4的同源性，其中變體的特 征還在于它們抑制FXII活性。參見W02008/098720。在SPINK-1變體K3的情況下，制備五個(gè)氨基酸置換，以增加與Infestin-4的同源性。因此，在實(shí)施方案中，SPINK-1 變體可以與野生型 SPINK-1 序列共享 70%、75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同源性。具有延長半衰期的抑制劑本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是基于具有延長半衰期的Infestin同系物或其片段的FXII/FXIIa抑制劑，特別是Infestin-4和經(jīng)修飾的哺乳動(dòng)物Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑的使用。因?yàn)镵azal型絲氨酸蛋白酶抑制劑是相當(dāng)小的蛋白質(zhì)，所以可以預(yù)期如對于其他小蛋白質(zhì)公開的快速腎清除率(Werle M.和Bernkop-Schnurch A. 2006. Strategiesto improve plasma half-life time of peptide and protein drugs. Amino Acids30:351-367)?？朔嚯幕衔锏亩萄獫{半衰期的一種方法是反復(fù)地或經(jīng)由連續(xù)輸注將其注射。優(yōu)選地，多肽自身的固有血漿半衰期是增加的。因此優(yōu)選使用融合至半衰期延長蛋白質(zhì)(HLEP)的FXII抑制劑，特別是絲氨酸蛋白酶抑制劑。如本文使用的HLEP選自白蛋白、白蛋白家族成員、免疫球蛋白G的恒定區(qū)及其片段，和在生理?xiàng)l件下能夠結(jié)合白蛋白、白蛋白家族成員以及免疫球蛋白恒定區(qū)的部分的多肽。作為特異性例子，白蛋白和免疫球蛋白及其片段或衍生物已描述為HLEP。Ballance等人(W001/79271)描述了許多不同治療性多肽的融合多肽，當(dāng)融合至人血清白蛋白時(shí)，其預(yù)期具有體內(nèi)增加的功能半衰期和延長的保存期限。治療性蛋白質(zhì)可以直接或經(jīng)由肽接頭融合至白蛋白部分，并且描述了 C和N末端融合物。術(shù)語人血清白蛋白(HSA)和人白蛋白(HA)在本申請中是可互換使用的。術(shù)語“白蛋白”和“血清白蛋白”是更廣泛的，并且包含人血清白蛋白(及其片段和變體)以及來自其他物種的白蛋白(及其片段和變體)。 如本文使用的，“白蛋白”共同指白蛋白多肽或氨基酸序列，或具有白蛋白的一種或多種功能活性(例如生物學(xué)活性)的白蛋白片段或變體。特別地，“白蛋白”指人白蛋白或其片段，尤其是如本文SEQ ID No:34中所示的成熟形式的人白蛋白，或來自其他脊椎動(dòng)物的白蛋白或其片段，或這些分子或其片段的類似物或變體。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以包含如上所述的HA序列的全長，或可以包括其能夠穩(wěn)定或延長治療活性的一個(gè)或多個(gè)片段。此類片段可以是長度10個(gè)或更多個(gè)氨基酸，或可以包括來自HA序列的約15、20、25、30、50個(gè)或更多個(gè)鄰接氨基酸，或可以包括HA的特異性結(jié)構(gòu)域的部分或全部?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以是正常HA的變體。本發(fā)明的融合蛋白的治療性多肽部分還可以是如本文描述的相應(yīng)治療性多肽的變體。術(shù)語“變體”包括保守或非保守的插入、缺失和置換，其中此類變化基本上不改變活性位點(diǎn)或活性結(jié)構(gòu)域，其賦予治療性多肽的治療活性。特別地，可以根據(jù)本發(fā)明使用的白蛋白融合蛋白可以包括人白蛋白的天然存在的多態(tài)變體和人白蛋白的片段。白蛋白可以來自任何脊椎動(dòng)物，尤其是任何哺乳動(dòng)物，例如人、猴、牛、綿羊或豬。非哺乳動(dòng)物白蛋白包括但不限于來自母雞和鮭魚的白蛋白。白蛋白連接的多肽的白蛋白部分可以來自與治療性多肽部分不同的動(dòng)物?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以包含HA的至少一個(gè)亞結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域或其保守修飾。一般來說，白蛋白片段或變體將是至少20、優(yōu)選至少40、最優(yōu)選超過70個(gè)氨基酸長。白蛋白變體可以優(yōu)選由 白蛋白的至少一個(gè)完整結(jié)構(gòu)域或所述結(jié)構(gòu)域的片段組成，或備選地包含白蛋白的至少一個(gè)完整結(jié)構(gòu)域或所述結(jié)構(gòu)域的片段,例如結(jié)構(gòu)域1(SEQ ID NO 34的氨基酸 1_194)、2(SEQ ID NO 34 的氨基酸 195_387)、3(SEQ ID NO 34 的氨基酸388-585)、1+2 (SEQ ID NO 34 的 1-387)、2+3 (SEQ ID N034 的 195-585)或 1+3 (SEQ ID NO 34 的氨基酸1-194+SEQ ID NO 34的氨基酸388-585)。每個(gè)結(jié)構(gòu)域自身由兩個(gè)同源亞結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，即 1-105、120-194、195-291、316-387、388-491 和 512-585，伴隨包含殘基 Lysl06_Glull9、Glu292-Val315和Glu492_Ala511的彈性亞結(jié)構(gòu)域間接頭區(qū)。除白蛋白外，甲胎蛋白，白蛋白家族的另一個(gè)成員，已聲稱在體內(nèi)延長附著的治療性多肽的半衰期(W02005/024044)。蛋白質(zhì)的白蛋白家族，進(jìn)化上相關(guān)的血清轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由白蛋白、甲胎蛋白(AFP ;Beattie & Dugaiczyk 1982. Structure and evolutionof human alpha-fetoprotein deduced from partial sequence of cloned cDNA. Gene20:415-422)、afamin (AFM ;Lichenstein 等人 1994. Afamin is a new member of thealbumin, alpha-fetoprotein, and vitamin D—binding protein gene family. J. Biol.Chem. 269:18149-18154)和維生素 D 結(jié)合蛋白(DBP;Cooke & David 1985. Serum vitaminD—binding protein is a third member of the albumin and alpha fetoprotein genefamily. J. Clin.1nvest. 76:2420-2424)組成。它們的基因代表與人、小鼠和大鼠中的相同染色體區(qū)具有結(jié)構(gòu)和功能相似性映射的多基因簇。白蛋白家族成員的結(jié)構(gòu)相似性暗示其作為HLEP的可用性。因此本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是使用此類白蛋白家族成員、其片段和變體作為HLEP。術(shù)語“變體”包括保守或非保守的插入、缺失和置換，其中此類變化基本上不改變活性位點(diǎn)或活性結(jié)構(gòu)域，其賦予治療性多肽的治療活性。白蛋白家族成員可以包含各蛋白質(zhì)AFP、AFM和DBP的全長，或可以包括其能夠穩(wěn)定化或延長治療活性的一個(gè)或多個(gè)片段。此類片段可以是長度10個(gè)或更多個(gè)氨基酸，或可以包括各蛋白質(zhì)序列的約15、20、25、30、50個(gè)或更多個(gè)鄰接氨基酸，或可以包括各自蛋白質(zhì)的特異性結(jié)構(gòu)域的部分或全部。本發(fā)明的白蛋白家族成員融合蛋白可以包括AFP、AFM和DBP的天然存在的多態(tài)變體。蛋白質(zhì)可以來自任何脊椎動(dòng)物，尤其是任何哺乳動(dòng)物，例如人、猴、牛、綿羊或豬。非哺乳動(dòng)物白蛋白家族成員包括但不限于來自母雞和鮭魚的那種。IgG和不含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的IgG片段也可以用作HLEP。治療性多肽部分優(yōu)選經(jīng)由抗體的鉸鏈區(qū)或肽接頭連接至IgG或IgG片段，其甚至可以是可切割的。幾個(gè)專利和專利申請描述了治療性蛋白質(zhì)與免疫球蛋白恒定區(qū)的融合，以延長治療性蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期。US2004/0087778和W02005/001025描述了 Fe結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白恒定區(qū)的至少部分與增加肽的半衰期的生物學(xué)活性肽的融合蛋白，其否則將在體內(nèi)快速降解。描述了 Fc-1FN-β融合蛋白，其實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的生物學(xué)活性、延長的循環(huán)半衰期和更大的可溶性(W02006/000448 )。公開了具有延長的血清半衰期和增加的體內(nèi)效力的Fc-EPO蛋白質(zhì)(TO2005/063808)，以及與 G-CSF (W02003/076567)、胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)(W02005/000892)、凝血因子(W02004/101740)和白細(xì)胞介素-10 (US6, 403，077)的 Fe 融合物，都具有半衰期延長性質(zhì)。因此，此類免疫球蛋白序列優(yōu)選其Fe片段和變體可以用作HLEP。Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑如Infestin-4和對于FXIIa具有增強(qiáng)的抑制特異性的經(jīng)修飾的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑如SPI NK-1突變體可以融合至作為HLEP的Fe結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白恒定區(qū)的至少部分，且在大腸桿菌、酵母、昆蟲、植物或脊椎動(dòng)物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)。SPINK-K2-FC融合蛋白示例性顯示于SEQ ID No 53中。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的FXII抑制劑是融合蛋白，將Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑如Infestin-4和經(jīng)修飾的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑如SPINK-1突變體或其片段或變體連接至HLEP或其片段或變體的N或C末端，從而使得與未連接至HLEP的相應(yīng)Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑相比較，所形成的融合蛋白具有增加的體內(nèi)半衰期。間插肽接頭可以引入治療性多肽和HLEP之間。如果HLEP例如通過立體阻礙干擾治療性多肽的比活性，那么可以引入可切割接頭。用于接頭切割的優(yōu)選酶是內(nèi)因性凝血途徑的凝血蛋白酶，F(xiàn)XIIa、FXIa、FIXa, FVIIIa或FXa，其中最優(yōu)選的切割酶是FXIIa。Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族是絲氨酸蛋白酶抑制劑的眾多家族之一。來自不同物種的許多蛋白質(zhì)已得到描述(Laskowski M和Kato1. 1980. Protein inhibitors ofproteinases. Ann. Rev. Biochem. 49 :593-626)。在上文定義內(nèi)的“Infestin-4和經(jīng)修飾的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑”包括具有天然氨基酸序列或SEQ ID 30-33或49-52的多肽。然而，此類定義還包括具有輕微修飾的氨基酸序列的多肽，例如包括末端氨基酸缺失或添加的經(jīng)修飾的N末端或C末端，只要這些多肽基本上保留各自Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑的活性。在上文定義內(nèi)的“Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑”還包括天然等位基因變異，其可以從一個(gè)個(gè)體到另一個(gè)存在且出現(xiàn)。在上文定義內(nèi)的“Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑”進(jìn)一步包括Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑的變體。此類變體在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中不同于野生型序列。此類差異的例子可以包括通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(例如1- 10個(gè)氨基酸殘基)的N和/或C末端平截，或在N和/或C末端上的一個(gè)或多個(gè)額外殘基添加，以及保守氨基酸置換，即在具有相似特征的氨基酸組內(nèi)執(zhí)行的置換，例如(I)小氨基酸、(2)酸性氨基酸、(3)極性氨基酸、(4)堿性氨基酸、(5)疏水性氨基酸和(6)芳香族氨基酸。此類保守置換的例子顯示于表I中。表1:
權(quán)利要求
1.用于治療和/或預(yù)防纖維增生性間質(zhì)性肺病的因子XII和/或因子XIIa(FXII/FXIIa)的細(xì)胞活性的非內(nèi)源抑制劑。
2.權(quán)利要求1的抑制劑，其是能夠抑制因子XIIa的催化活性的化合物。
3.權(quán)利要求1的抑制劑，其是能夠減少或取消細(xì)胞中因子XII的表達(dá)的化合物。
4.權(quán)利要求1的抑制劑，其是能夠抑制因子XII轉(zhuǎn)化成因子XIIa的化合物。
5.權(quán)利要求1- 4的抑制劑，其是絲氨酸蛋白酶抑制劑。
6.權(quán)利要求1- 5的抑制劑，其選自 (i)野生型Infestin-4多肽序列(SEQID NO 33)或其變體，其中變體包含 Ca)野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13,和導(dǎo)致與所述野生型Infestin-4序列的差異在所述N末端氨基酸外的至少一個(gè)并直到五個(gè)氨基酸突變； 和/或 (b)來自所述野生型Infestin-4序列的六個(gè)保守的半胱氨酸殘基和與所述野生型Infestin-4序列至少70%的同源性； (ii)SPINK-l(SEQ ID NO:29)，其是突變的以包括所述野生型Infestin-4多肽序列的N末端氨基酸2-13或所述突變的SPINK-1的變體，其中變體包含 a)所述野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2_13;和導(dǎo)致與所述野生型SPINK-1序列的差異在所述N末端氨基酸外的至少一個(gè)并直到五個(gè)氨基酸突變，并且其增加所述變體與所述野生型Infestin-4序列的同源性； 和/或 b)來自所述野生型SPINK-1序列的六個(gè)保守的半胱氨酸殘基和與野生型SPINK-1序列至少70%的同源性；(iii)SPINK K1、K2 或 K3 (SEQ ID NO :30、31 或 32)； (iv)抑肽酶、玉米胰蛋白酶抑制劑(CTI)、牛胰胰蛋白酶抑制劑的突變體、和Pro-Phe-Arg-氣甲基麗(PCK)； (V)能夠結(jié)合所述FXII/FXIIa的抗體。
7.權(quán)利要求6的抑制劑，其中所述抑制劑連接至半衰期增強(qiáng)多肽，其中所述半衰期增強(qiáng)肽任選是白蛋白、afamin、甲胎蛋白或維生素D結(jié)合蛋白、人白蛋白或其變體、免疫球蛋白或其變體、IgG的Fe。
8.權(quán)利要求7的抑制劑，其中所述半衰期增強(qiáng)多肽經(jīng)由接頭連接至所述FXII抑制劑。
9.權(quán)利要求8的抑制劑，其中所述接頭是 (i)可切割的； (i i )可通過內(nèi)因性、外因性或普通凝血途徑的凝血蛋白酶切割的； (iii)可通過FXIIa切割的。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抑制劑，其中所述纖維增生性間質(zhì)性肺病是肺纖維化。
11.權(quán)利要求10的抑制劑，其中所述肺纖維化是特發(fā)性肺纖維化。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抑制劑，其中所述治療包括與第二種療法的組合治療，所述第二種療法包含皮質(zhì)類固醇藥物、吡非尼酮、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、乙酰半胱氨酸、抗纖維化藥和/或氧療法的施用。
13.一種治療和/或預(yù)防纖維增生性間質(zhì)性肺病的方法，其包括給個(gè)體施用藥學(xué)有效量的FXII/FXIIa的細(xì)胞活性的非內(nèi)源抑制劑。
14.一種延長患有纖維增生性間質(zhì)性肺病的患者的生存時(shí)間的方法，其包括給所述患者施用藥學(xué)有效量的FXII/FXIIa的細(xì)胞活性的非內(nèi)源抑制劑。
15.權(quán)利要求13- 14中任一項(xiàng)的抑制劑的使用方法，其中所述纖維增生性間質(zhì)性肺病是特發(fā)性肺纖維化。
16.一種用于治療間質(zhì)性肺病的藥物試劑盒，其包含F(xiàn)XII/FXIIa的細(xì)胞活性的非內(nèi)源抑制劑和用于治療和/或預(yù)防纖維增生性間質(zhì)性肺病的其他藥物。
17.權(quán)利要求16的藥物試劑盒，其中用于治療和/或預(yù)防纖維增生性間質(zhì)性肺病的所述其他藥物選自皮質(zhì)類固醇藥物、硫唑嘌呤、吡非尼酮、環(huán)磷酰胺、乙酰半胱氨酸和抗纖維化藥。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于治療間質(zhì)性肺病的方法，其包括給個(gè)體施用有效量的凝血因子XII的抑制劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于那種治療的用途和藥物試劑盒。
文檔編號A61K38/00GK103068845SQ201180017178
公開日2013年4月24日 申請日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月1日
發(fā)明者E·亞布隆斯卡, K·普雷斯納, M·維格雷卡 申請人:尤斯圖斯-李比希-吉森大學(xué)