專利名稱：一種三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇/核酸腦靶向膠束及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥基因治療領(lǐng)域，涉及新型高效非病毒載體的制備方法和技術(shù)，具體涉及一種由乙酰膽堿受體介導(dǎo)的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽/核酸腦靶向膠束及其制備方法。
背景技術(shù)：
世界上罹患神經(jīng)退行性等腦部疾病的人數(shù)正逐年增加，但治療此類疾病的有效藥物還為數(shù)不多。核酸類藥物因具有特異性高，作用迅速、安全、高效等優(yōu)點已成為醫(yī)藥領(lǐng)域研究的前沿。但核酸類藥物在應(yīng)用中存在著難以克服的問題:一是體內(nèi)存在大量核酸酶，它可以水解核酸的磷酸二酯鍵，使得藥物在到達靶點前就被降解而失效；二是核酸類藥物對細胞膜的通透性較差，難于通過細胞膜到達靶部位。目前解決上述問題的方法主要采用病毒或非病毒載體實現(xiàn)核酸類藥物的給藥。其中，以病毒外殼作載體則可能引起宿主的血清免疫反應(yīng)。相比之下，非病毒載體具有免疫源性低 、成本低、不限制基因藥物體積等諸多優(yōu)勢，已成為目前核酸類藥物載體的重要研究方向。目前研究的非病毒載體主要包括:脂質(zhì)體、納米粒及多聚陽離子等。此類載體載核酸多采用帶有高密度正電荷的陽離子脂質(zhì)或陽離子聚合材料與帶負電的核酸借助靜電作用形成脂質(zhì)體、納米粒、膠束等可控性強、毒性低的傳遞系統(tǒng)。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和體循環(huán)之間血腦屏障(BBB)的存在，限制了許多有潛力的藥物(尤其是核酸藥物)從血液進入腦部發(fā)揮作用。目前促進藥物透過BBB的方法主要有以下四種。其中，人為開啟BBB上的致密連接，會無選擇性的使有害物質(zhì)與藥物同時入腦；對藥物進行結(jié)構(gòu)改造可能導(dǎo)致藥物療效及體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)降低或改變；改變給藥途徑主要包括頸動脈輸注以及鼻腔給藥，前者易對腦造成傷害，后者生物利用度低，很難滿足臨床要求；通過受體介導(dǎo)則不存在上述缺點，是目前腦部藥物傳遞系統(tǒng)研究的熱點。2007年，Priti Kumar等(Kumar P，Wu HQ, McBride JL, et al.Transvasculardelivery of small interfering RNA to the central nervous system.Nature, 2007，448: 39-43)研究報道一種含有29個氨基酸的小肽RVG具有乙酰膽堿受體的靶向性，乙酰膽堿受體主要分布在腦細胞上，包括被用作BBB模型的腦毛細管內(nèi)皮細胞，這可使該肽修飾的載體同時具有高效透過BBB與靶向腦細胞的能力。實驗證明，該小肽不僅自己可通過BBB,而且通過在羧基端連接的9聚精氨酸可將FITC標(biāo)記的siRNA載帶入腦。靜脈注射給藥后，SiRNA有效實現(xiàn)靶基因沉默作用，而且在脾和肝中檢測不到FITC熒光，這表明該小肽具有強趨腦性和腦細胞靶向性。含PEG側(cè)鏈和聚陽離子主鏈的接枝共聚物與帶有負電荷的核酸可以通過靜電復(fù)合自組裝成聚離子復(fù)合膠束該膠束作為核酸類藥物腦靶向傳遞系統(tǒng)，具有以下優(yōu)點:核/殼結(jié)構(gòu)既能延長藥物在血液中的滯留時間，又能保護藥物避免與酶接觸；膠束粒徑小，穿透力強，穩(wěn)定性好，連接腦靶向功能肽后可實現(xiàn)主動靶向；可通過血腦屏障；制備過程溫和，可最大限度地保持藥物活性。綜上，本發(fā)明制備了具有腦靶向功能肽RVG修飾的核酸聚離子復(fù)合膠束，以實現(xiàn)核酸類藥物通過血腦屏障和腦主動靶向定位，并解決其在體內(nèi)易降解、不穩(wěn)定及轉(zhuǎn)染效率低等臨床應(yīng)用缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制備一種由乙酰膽堿受體介導(dǎo)的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽/核酸的腦靶向膠束，以實現(xiàn)核酸類藥物通過血腦屏障和腦主動靶向定位，并解決其在體內(nèi)易降解、不穩(wěn)定及轉(zhuǎn)染效率低等臨床應(yīng)用缺陷。本發(fā)明以針對阿爾茨海默癥設(shè)計的SiRNA (序列為5' -GUGCCUACCUGGACAAGAAdTdT-3')作為核酸類藥物的模型藥，采用的技術(shù)方案如下(如

圖1)。將殼聚糖(Chitosan)季銨化制得三甲基殼聚糖(TMC)，在三甲基殼聚糖上接入聚乙二醇制得三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇，然后，在聚乙二醇的另一端接入腦靶向功能肽RVG，制得乙酰膽堿受體 介導(dǎo)的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽(TMC-g-PEG-RVG)，使其具有透過血腦屏障與腦靶向的功能，最后，將該材料與荷負電的核酸通過靜電復(fù)合作用自組成腦主動靶向膠束。本發(fā)明所述的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽的制備包括如下步驟:
I)殼聚糖的純化:
本發(fā)明所述殼聚糖重均分子量為5 - 500kD,脫乙酰度為80% - 95%。具體純化步驟如下所述:
將殼聚糖溶于1%醋酸水溶液，抽濾后以氨水調(diào)節(jié)濾液PH值至7.0沉淀殼聚糖，抽濾后冷凍干燥。2)三甲基殼聚糖的制備:
本發(fā)明選用碘甲烷作為甲基化試劑，具體制備方法如下所述:
權(quán)利要求
1.一種三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽/核酸腦靶向膠束，其特征在于，所述的膠束由荷正電的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽與荷負電的核酸經(jīng)靜電復(fù)合作用自組裝而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽/核酸腦靶向膠束，其特征在于，所述的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽為殼聚糖依次經(jīng)季銨化修飾得到三甲基殼聚糖，三甲基殼聚糖的胺基與兩端活化聚乙二醇的一個活性基團反應(yīng)得到三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇，聚乙二醇另一活性基團與腦靶向功能肽反應(yīng)RVG所得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽/核酸腦靶向膠束，其特征在于，所述的殼聚糖重均分子量為10-150kD，脫乙酰度為80%-95%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽/核酸腦靶向膠束，其特征在于，季銨化率為10% - 99%，摩爾百分數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽/核酸腦靶向膠束，其特征在于，所述聚乙二醇的通式為R1- (CH2CH2O)n-R2,式中n=20 - 200，R1為可與氨基反應(yīng)生成聚乙二醇酰胺鍵的活性基團，包括琥珀酰亞胺基團、乙酸基團、乙醛基團、異氰酸基團、異氰硫酸基團、丙烯酸基團、硝基酚基團，R2為可與巰基反應(yīng)的活性基團，包括馬來酰亞胺基團、乙烯砜基團、硫醇基團。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽/核酸腦靶向膠束，其特征在于，所述腦靶向功能肽為RVG，含有29個氨基酸，其序列為YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG。
7.—種如權(quán)利要求1所述的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽/核酸腦靶向膠束的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 殼聚糖的純化； (2)三甲基殼聚糖的制備； (3)三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇的制備； (4)三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽的制備； (5)三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽可與荷負電的核酸自組裝成腦主動靶向膠束。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中反應(yīng)溫度為4- 50°C，反應(yīng)時間為3 - 480分鐘，聚乙二醇的接枝率為5% - 35% (摩爾百分數(shù))。
9.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中:三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇在pH6 - 9的磷酸鹽緩沖液中與腦靶向功能肽RVG反應(yīng)，反應(yīng)溫度為15 -30°C，反應(yīng)時間為8-24小時。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，將三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽溶解于DEPC處理過的水中，然后通過0.22 y m的濾膜除菌，將核酸溶于DEPC處理過的水中，將以上兩種溶液于室溫混合，渦旋5-30 s使之混合均勻。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述制備方法，其特征在于，所制備的膠束的粒徑分布為10-700nm，Zeta 電位為 +ImV - +15mV。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所制備膠束的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽與 核酸的+/-電荷比為1:4 - 64:1。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種由乙酰膽堿受體介導(dǎo)的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇/核酸腦靶向膠束及其制備方法。三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽為殼聚糖依次經(jīng)季銨化修飾得到三甲基殼聚糖，三甲基殼聚糖的胺基與兩端活化聚乙二醇的一個活性基團反應(yīng)得到三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇，聚乙二醇另一活性基團與腦靶向功能肽RVG反應(yīng)制得。本發(fā)明以離子復(fù)合物膠束作為載體，以腦靶向功能肽RVG作為靶向分子，實現(xiàn)核酸藥物通過血腦屏障和腦主動靶向定位。本發(fā)明的離子復(fù)合物膠束由荷正電的三甲基殼聚糖-接枝-聚乙二醇-腦靶向功能肽與荷負電的核酸經(jīng)靜電復(fù)合生成。本發(fā)明解決了核酸藥物在體內(nèi)易降解、不穩(wěn)定及轉(zhuǎn)染效率低的缺陷。
文檔編號A61K9/10GK103182087SQ20111045357
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者姜同英, 王思玲, 高亦鯤 申請人:沈陽藥科大學(xué)