專利名稱：一種具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種功能型檢測微針技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針及其制備方法。
背景技術(shù)：
監(jiān)測內(nèi)源或外源分子在靶器官中的分布比測定他們在血液中的濃度更有意義，包括理解生理機制如神經(jīng)信號傳導(dǎo)和評價藥物生物利用度如癌癥化療等領(lǐng)域。傳統(tǒng)的原位分析方法由于其侵入性或復(fù)雜的樣品制備，不能完全滿足這種監(jiān)測要求。拉曼光譜技術(shù)可以提供基于分子振動的化學(xué)和物理信息，因為拉曼檢測時不需考慮樣品的狀態(tài)，溫度，形態(tài)和大小等物理狀態(tài)，所以該技術(shù)是理想的實時原位監(jiān)測生物樣品的技術(shù)。通過對納米材料進(jìn)行設(shè)計和制造可以使納米材料具有表面增強拉曼散射(SERS)效應(yīng)，在樣品濃度較低時仍能得到強度較高的增強拉曼信號，因此這些納米材料常被作為定性或半定量的超靈敏檢測分析工具。目前科學(xué)家就使用拉曼光譜檢測體內(nèi)的目標(biāo)分子已進(jìn)行許多嘗試，但如何獲得活體樣本相關(guān)的表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)仍然是一個很大的挑戰(zhàn)。例如，如何在不損壞機體和材料的情況下，植入并取出具有增強拉曼信號的材料，如何避免機體對具有增強拉曼信號的材料產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，以及如何在活體中收集可分辨的增強拉曼信號。另外在一般情況下，紅外激光器往往作為激發(fā)源，它可以幾乎無衰減的穿透一些生物組織，但相應(yīng)的拉曼信號卻很難穿透這些組織。因此如何得到一定深度的皮下組織的增強拉曼信號也是一個不容忽視的問題。在中醫(yī)中通過將針灸針插入人體來進(jìn)行治療的方法已使用了幾千年，它的主要特點是治療過程中的微創(chuàng)性，所以針灸針是一種出入人體的理想的微創(chuàng)的工具。在這里，針灸針被用作載體荷載具有增強拉曼和熒光信號的活性納米材料形成出入人體的檢測微針。當(dāng)微針進(jìn)入體內(nèi)或組織時，組織液會擴散到金納米殼之間的間隙內(nèi)，當(dāng)微針被拔出時可以將組織液中的待測分子攜帶出來。體外的表面增強拉曼光譜檢測可避免增強拉曼信號在組織中的衰減，同時根據(jù)檢測微針刺入的深度可以得到一定深度的皮下組織的增強拉曼信號。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將醫(yī)用針灸針作為檢測微針的制備主體，利用檢測探針針身覆蓋的金屬納米材料的增強拉曼和熒光信號的作用測定探針表面生物分子的拉曼和熒光信號，發(fā)明一種可用于體外和體內(nèi)的快速微創(chuàng)的檢測方法。技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種具有增強拉曼和熒光信號的檢測探針及其制備方法，具有用于體內(nèi)或體外分子拉曼和熒光檢測的特點。技術(shù)方案本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
本發(fā)明所述的具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針，其針身和針尖部分的表面覆蓋有金屬納米材料層，金屬納米顆粒直徑為20-1000 nm，金屬納米材料層表面又覆蓋有高分子材料層。本發(fā)明所述的具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針制備方法
步驟1)在微針的針身和針尖表面至少修飾氨基、醛基、羧基和羥基中的一種基團得到功能化的微針，所用方法在本領(lǐng)域是已知的。所述的微針為臨床所用各種類型的針灸針。步驟2)將步驟1的針身和針尖插入濃度為IO8-IOw個粒子/升的金屬納米粒子懸浮液中靜置12-48小時后，取出微針即可；
所述的金屬納米粒子層為球形的納米粒子層，可以是單一的金屬納米粒子層包括金納米粒子層、銀納米粒子層、銅納米粒子層、鉬納米粒子層；可以是球形的復(fù)合納米粒子層包括金銀復(fù)合納米粒子層及金、銅和鉬復(fù)合納米粒子層；可以是球形的核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合納米粒子層包括銀核金殼復(fù)合納米粒子層、銅核金銀復(fù)合殼納米粒子層、銅核金銀雙層殼納米粒子層；可以是非金屬的SiO2核金殼、銀殼、銅殼、鉬殼或復(fù)合殼納米粒子層，所述的復(fù)合殼納米粒子為金、銀、銅和鉬中的兩種或兩種以上金屬復(fù)合的殼納米粒子。步驟3)將步驟2處理后的針身和針尖插入高分子溶液中的高分子質(zhì)量與溶液體積比為0. 1-10%的高分子溶液中靜置1-60秒后，取出即得檢測微針。所述的高分子溶液可以是聚苯乙烯溶液；可以是聚乳酸溶液；可以是聚氨酯溶液；可以是聚乙烯丙綸溶液。將上述制備的微針表面修飾特定的基團后，可以用于特定分子的體外檢測，所述的特定分子可以是核酸，可是蛋白質(zhì)。將上述制備的微針直接插入施針的部位，滯留一定時間后取出并作拉曼或熒光檢測，可以檢測施針部位組織液成分的改變。將上述制備的微針插入注射藥物的部位，并對針身和針尖的不同部位作拉曼或熒光檢測，可以測定分子藥物在組織中的擴散和分布情況，得到一定深度的皮下組織的拉曼信號。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點
(1)本項目利用結(jié)構(gòu)均一的納米粒子構(gòu)建增強拉曼和熒光信號的納米結(jié)構(gòu)，有利于獲得增強因子一致的納米結(jié)構(gòu)，最大程度上提高檢測信號；通過在納米粒子表面修飾不同的功能分子可進(jìn)行特異性檢測，也可以用于體內(nèi)不同分子的特異性微創(chuàng)檢測。(2)基于納米聚集體的拉曼增強效應(yīng)，建立快速超靈敏的檢測方法，不需對樣品進(jìn)行濃縮等前處理直接進(jìn)行分析，可以降低試劑的消耗和縮短檢測的時間。(3)利用檢測微針的特性在活體微創(chuàng)檢測時可以提供目標(biāo)分子的在皮下組織的深度分布信息，這是其他活體分析技術(shù)所難以具備的。


圖1是一種具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是一種具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針制備示意圖。圖3是一種具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針針身A-A橫截面示意圖。圖4是檢測微針表面吸附了金屬納米材料層的電鏡圖。圖5是檢測微針表面的金屬納米材料的電鏡圖。圖6是用檢測微針檢測尼羅藍(lán)A的拉曼光譜圖。
具體實施例方式實施例1
一種具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針，如圖1所示，檢測微針包括依次連接的針柄13、針身12及針尖11。如圖3所示，在針身12及針尖11的表面上覆蓋有金屬納米材料層2，在金屬納米材料層2上包覆有高分子材料層3。所述的金屬納米材料粒徑為20-1000 nm，參見圖5，針身和針尖表面覆蓋有1-2層金納米粒子層，金納米粒子直徑為180nm。在本實施例中，
所述高分子材料層為聚苯乙烯層、聚乳酸層、聚氨酯層或聚乙烯丙綸層中的一種。所述金屬納米材料層可以是下列之一
1)金屬納米材料層為金納米粒子層、銀納米粒子層、銅納米粒子層或鉬納米粒子層；
2)金屬納米材料層為球形復(fù)合納米粒子層，所述的球形復(fù)合納米粒子層為金、銀、銅和鉬的兩種或兩種以上的金屬復(fù)合納米粒子層。3)金屬納米材料層為球形的核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合納米粒子層，所述的球形的核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合納米粒子層包括銀核金殼復(fù)合納米粒子層、銅核金銀復(fù)合殼納米粒子層、銅核金銀雙層殼納米粒子層。4)金屬納米材料層為非金屬的S^2核金殼、銀殼、銅殼、鉬殼或復(fù)合殼納米粒子層，所述的復(fù)合殼納米粒子為金、銀、銅和鉬中的兩種或兩種以上金屬復(fù)合的殼納米粒子。實施例2
一種具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針的制備方法，步驟如下 步驟1)在微針的針身和針尖表面至少修飾氨基、醛基、羧基和羥基中的一種基團； 步驟2)將步驟1的針身和針尖插入濃度為IO8-IO18個粒子/升的金屬納米粒子懸浮液中靜置12-48小時后，取出微針即可；
步驟3)將步驟2處理后的針身和針尖插入高分子溶液中的高分子質(zhì)量與溶液體積比為0. 1-10%的高分子溶液中靜置1-60秒后，取出即得檢測微針。實施例3 —種具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針的制備
在檢測微針的針身和針尖表面修飾巰基得功能化的微針(修飾巰基的方法在本領(lǐng)域是已知的)，調(diào)節(jié)金納米粒子懸浮液使其濃度為IX 108_18個/升。再將功能化的微針在金納米粒子懸浮液中靜置12-48小時后取出。由于微針表面的巰基和金納米粒子的化學(xué)鍵作用， 金納米粒子會吸附在針灸針表面，如圖5所示，形成1-2層結(jié)構(gòu)均一的、有增強拉曼和熒光信號的納米結(jié)構(gòu)。參見圖2，金屬納米粒子層通過巰基或羥基等基團能夠與針身和針尖表面相連接。再將微針的覆蓋有金納米粒子的部分插入質(zhì)量與體積比0. 1-10%的聚苯乙烯溶液中靜置1-60秒后，取出室溫放置即可。形成的聚苯乙烯層可以在插入和取出針的過程中保護金納米粒子不被摩擦掉。實施例4具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針在體外檢測中的應(yīng)用——表面增強拉曼信號
將表面未經(jīng)過任何處理的微針和上述制備的微針同時浸泡在濃度為1微摩爾/升的尼羅藍(lán)A溶液中，浸泡30分鐘后取出，洗滌，拉曼光譜儀測定兩根微針表面的拉曼信號。所用方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可以加以利用。參考圖6，曲線1為表面未經(jīng)任何處理的微針表面的尼羅藍(lán)A分子的拉曼信號，曲線2表示上述制備的微針表面的尼羅藍(lán)A分子的拉曼
5信號，可以看出微針未經(jīng)處理時不具備放大拉曼信號的功能，而表面吸附有金屬納米粒子層的微針可以增強分子的拉曼信號。實施例5具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針在體外檢測中的應(yīng)用——核酸檢測(拉曼信號)
將上述制備的微針浸泡在10微升巰基化核酸探針分子(10納摩爾/升)，4°C過夜，洗去未反應(yīng)的核酸探針分子。再將該微針插入待測溶液中，72°C雜交5分鐘，再熱循環(huán)處理3 次(60°C/4°C)。37°C再加入核酸內(nèi)切酶處理5分鐘，洗滌，拉曼光譜儀測定核酸特征信號。 所用方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可以加以利用。實施例6具有增強拉曼和熒光信號的微針在體外檢測中的應(yīng)用——蛋白檢測 (拉曼信號)
將上述制備的微針浸泡在10微升巰基化葉酸分子(1納摩爾/升)中，4°C過夜，洗去未反應(yīng)的葉酸分子。再將該微針浸泡在細(xì)胞膜蛋白提取液中，37°C溫育30分鐘，洗滌，拉曼光譜儀測定葉酸受體蛋白分子的特征信號。所用方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可以加以利用。實施例7具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針在體外檢測中的應(yīng)用——核酸檢測(熒光信號)
將上述制備的微針浸泡10微升標(biāo)記熒光信號分子的巰基化核酸探針分子(10納摩爾/ 升)，4°C過夜，洗去未反應(yīng)的核酸分子，測定熒光的信號強度。再將該微針插入待測溶液中， 72°C雜交5分鐘，再熱循環(huán)處理3次(60°C /4°C )。37°C再加入單鏈核酸水解酶處理5分鐘， 洗滌，再次測定熒光的信號強度，計算熒光信號的衰減，得到結(jié)合核酸的量。所用方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可以加以利用。實施例8具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針在體內(nèi)檢測中的應(yīng)用——組織液成分檢測
將上述制備的微針直接插入需要檢測的組織中，并插到需要檢測的深度。滯留5-30分鐘，取出微針直接用拉曼光譜儀檢測微針表面的組織液的拉曼圖譜，然后和正常組織液的拉曼圖譜比較，分析施針前后組織液中分子的種類和數(shù)量的變化。所用方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可以加以利用。實施例9具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針在體內(nèi)檢測中的應(yīng)用——組織液葡萄糖檢測
將上述制備的微針浸泡5毫克/毫升的3-巰基苯硼酸溶液4°C過夜，洗去未反應(yīng)的 3-巰基苯硼酸后保存于生理鹽水中。直接插入需要檢測的組織中，并插到需要檢測的深度。 滯留5-30分鐘，取出直接用拉曼光譜儀檢測，測定的3-巰基苯硼酸結(jié)合的葡萄糖拉曼圖譜，由強度計算葡萄糖含量。按同樣的原理，在制備的微針上功能化其他特異性分子可以進(jìn)行其他的特異性檢測。所用方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可以加以利用。實施例10具有增強拉曼和熒光信號的微針在體內(nèi)檢測中的應(yīng)用——深度可分辨檢測
用劑量為50 mg/kg的戊巴比妥鈉對新西蘭雄性兔子進(jìn)行腹腔給藥進(jìn)行麻醉，在麻醉藥起作用后，將股外側(cè)肌腱上的毛發(fā)用剪刀剪去。將200 μ , 2X10-4 M的NBA溶液注入股外側(cè)肌腱中。5-10分鐘后，將上述制備的微針直接插入肌腱組織中，深度必須足夠深。滯留5-30分鐘后，取出微針直接用拉曼光譜對針尖、針體的不同部位檢測，并將光譜進(jìn)行比較，可以分析藥物在組織中擴散的程度。所用方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可以加以利用。
權(quán)利要求
1.一種具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針，包括依次連接的針柄(13)、針身(12) 及針尖(11)，其特征在于，在針身(12)及針尖(11)的表面上覆蓋有金屬納米材料層(2)，在金屬納米材料層(2)上包覆有高分子材料層(3)，所述的金屬納米材料粒徑為20-1000 nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針，其特征在于，金屬納米材料層為金納米粒子層、銀納米粒子層、銅納米粒子層或鉬納米粒子層。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針，其特征在于，金屬納米材料層為球形復(fù)合納米粒子層，所述的球形復(fù)合納米粒子層為金、銀、銅和鉬的兩種或兩種以上的金屬復(fù)合納米粒子層。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針，其特征在于，金屬納米材料層為球形的核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合納米粒子層，所述的球形的核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合納米粒子層包括銀核金殼復(fù)合納米粒子層、銅核金銀復(fù)合殼納米粒子層、銅核金銀雙層殼納米粒子層。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針，其特征在于，金屬納米材料層為非金屬的SiO2核金殼、銀殼、銅殼、鉬殼或復(fù)合殼納米粒子層，所述的復(fù)合殼納米粒子為金、銀、銅和鉬中的兩種或兩種以上金屬復(fù)合的殼納米粒子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針，其特征在于，高分子材料層為聚苯乙烯層、聚乳酸層、聚氨酯層或聚乙烯丙綸層中的一種。
7.—種權(quán)利要求1所述具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針的制備方法，其特征在于，步驟如下步驟1)在微針的針身和針尖表面至少修飾氨基、醛基、羧基和羥基中的一種基團；步驟2)將步驟1的針身和針尖插入濃度為IO8-IO18個粒子/升的金屬納米粒子懸浮液中靜置12-48小時后，取出微針即可；步驟3)將步驟2處理后的針身和針尖插入高分子溶液中的高分子質(zhì)量與溶液體積比為0. 1-10%的高分子溶液中靜置1-60秒后，取出即得檢測微針。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有增強拉曼和熒光信號的檢測微針及其制備方法，其特征在于將醫(yī)用針灸針作為制備基礎(chǔ)，在微針的針身和針尖部分的表面覆蓋有具有增強拉曼和熒光信號的金屬納米材料層以及高分子材料層。檢測微針的結(jié)構(gòu)包括表面巰基和氨基化的微針、金屬納米粒子層、高分子材料層。直徑為20-1000nm的金屬納米粒子通過共價鍵或靜電吸附作用包覆在針灸針表面。高分子層覆蓋在最外層保護金屬納米粒子。利用檢測微針的特點可以進(jìn)行體外樣品的拉曼和熒光檢測，也可以進(jìn)行生物體內(nèi)的微創(chuàng)取樣及拉曼和熒光檢測。本發(fā)明可以為體內(nèi)和體外的實驗研究、臨床診斷及大樣本篩查提供快速超靈敏檢測新方法。
文檔編號A61B5/00GK102525421SQ201110438268
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月18日
發(fā)明者唐棟梁, 董健, 袁倩倩, 許蓓蓓, 郭明德, 陶琴 申請人:東南大學(xué)