專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)給予神經(jīng)生長(zhǎng)因子拮抗劑及其組合物來(lái)治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗-NGF抗體(如抗-NGF拮抗劑抗體)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用拮抗劑(如抗體)用于治療及/或預(yù)防疼痛，包括手術(shù)后疼痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛和骨關(guān)節(jié)炎疼痛的用途。
背景技術(shù)：
神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是第一個(gè)確認(rèn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(neurotrophin),并已經(jīng)完全定出其在周?chē)椭袠猩窠?jīng)的發(fā)育和存活中的作用。已經(jīng)顯示NGF是在周?chē)桓猩窠?jīng)和胚胎感覺(jué)神經(jīng)元與基底前腦膽堿能神經(jīng)元發(fā)育上關(guān)鍵性的存活和維持因子。Smeyne等人，Nature368 =246-249(1994)和 Crowley 等人，Cell 76:1001_1011 (1994)。NGF上調(diào)(up-regulate)神經(jīng)肽在感覺(jué)神經(jīng)元中的表達(dá)(Lindsay和Harmer, Nature 337:362_364 (1989)),并經(jīng)由兩個(gè)不同的膜-結(jié)合受體，TrkA酪氨酸激酶受體和P75共同神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體(有時(shí)分別稱(chēng)為"高親和性"和"低親和性"NGF受 體)調(diào)節(jié)其活性。p75受體在結(jié)構(gòu)上與腫瘤壞死因子受體家族的其他成員有關(guān)(Chao等人，Science 232:518-521 (1986))。關(guān)于NGF的綜述，參見(jiàn) Huang 等人，Annu.Rev.Neurosc1.24:677_736 (2001) ；Bibel 等人，Genes Dev.14:2919-2937 (2000)。已經(jīng)定出NGF的結(jié)晶結(jié)構(gòu)和與trkA受體形成的復(fù)合物中的NGF的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。參見(jiàn) Nature 254:411(1991) ；Mature 401:184-188(1996)。除了其在神經(jīng)系統(tǒng)上的作用之外，NGF已經(jīng)逐漸涉及神經(jīng)系統(tǒng)以外的過(guò)程。例如，已經(jīng)顯示NGF促進(jìn)了血管通透性(Otten等人，Eur J Pharmacol.106:199-201 (1984))，提高 T-和 B-細(xì)胞免疫反應(yīng)(Otten 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 86:10059-10063 (1989))，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分化和肥大細(xì)胞增殖，并引起從肥大細(xì)胞中釋放出可溶性生物信號(hào)(Matsuda 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:6508-6512(1988) ；Pearce等人，J.Physiol.372:379-393 (1986) ;Bischoff 等人，Blood 79:2662-2669(1992);Horigome 等人，J.Biol.Chem.268: 14881-14887 (1993))。雖然已經(jīng)顯示外源添加 NGF，能夠擁有全部的這些作用，但重要的是注意到在活體內(nèi)在任何的這些過(guò)程中，僅罕有地顯示內(nèi)源的NGF是重要的(Torcia等人，Cel1.85(3):345_56 (1996))。因此，即使有也不清楚是何種因素可能抑制了內(nèi)源NGF的生物活性。NGF由許多細(xì)胞類(lèi)型產(chǎn)生，包括肥大細(xì)胞(Leon等人，Proc.Natl.Acad Sc1.USA 91:3739-3743 (1994))、B-淋巴細(xì)胞(Torcia 等人，Cell 85:345_356 (1996))、角化細(xì)胞(Di Marco 等人，J.Biol.Chem.268:22838_22846))、平滑肌細(xì)胞(Ueyama 等人，J.Hypertens.11: 1061-1065 (1993))、纖維母細(xì)胞(Lindholm 等人，Eur.J.Neurosc1.2:795-801 (1990))、支氣管上皮細(xì)胞(Kassel 等人，Clin.Exp.Allergy 31:1432-40 (2001))、腎小球系膜細(xì)胞(Steiner等人，Am.J.Physiol.261:F792_798 (1991))和骨骼肌肌管(Schwartz 等人，J Photochem.Photobiol.B66:195-200 (2002))。已經(jīng)在神經(jīng)系統(tǒng)以外的各種細(xì)胞類(lèi)型上找到NGF受體。例如，已經(jīng)在人類(lèi)單核細(xì)胞、T-和B-淋巴細(xì)胞及肥大細(xì)胞上找到TrkA。已經(jīng)在人類(lèi)患者和數(shù)種動(dòng)物模式中觀察到在增加NGF含量與炎癥狀況之間的關(guān)聯(lián)。這些包括全身性紅斑性狼瘡(Bracc1-Laudiero等人，Neuroreport 4:563-565(1993))> 多發(fā)性硬化癥(Bracc1-Laudiero 等人，Neurosc1.Lett.147:9-12 (1992))、牛皮癖(Raychaudhuri 等人，Acta Derm.1 ' enereol.78:84_86 (1998))、關(guān)節(jié)炎(Falcim 等人，Ann.Rheum.Dis.55:745_748 (1996))、間質(zhì)性膀胱炎(Okragly等人，J.Urology 161:438-441 (1999))和哮喘(Braun 等人，Eur.J Immunol.28:3240-3251(1998))。同樣地，在周?chē)M織中升聞NGF含量與痛覺(jué)過(guò)敏和炎癥反應(yīng)有關(guān)，并已經(jīng)在許多形式的關(guān)節(jié)炎中觀察到。受風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎侵襲的患者的滑膜，表達(dá)高量的NGF，而已經(jīng)報(bào)告了在未發(fā)炎的滑膜中不可檢測(cè)到NGF(Aloe等人，Arch.Rheum.35:351_355 (1992))。在以實(shí)驗(yàn)方式誘發(fā)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的大鼠中，也看到類(lèi)似的結(jié)果(Aloe等人，Clin.Exp.Rheumatol.10:203_204(1992))。已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎老鼠中，報(bào)告了 NGF的含量升高，連同肥大細(xì)胞的數(shù)目增加(Aloe 等人，Int.J.Tissue Reactions-Exp.Clin.Aspects 15:139-143(1993))。PCT公開(kāi)第WO 02/096458號(hào)公開(kāi)了使用具有某些特性的抗-NGF抗體，治療各種NGF相關(guān)病癥，如炎癥狀況(例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)。已經(jīng)報(bào)告了將經(jīng)過(guò)純化的抗-NGF抗體注射到帶有人類(lèi)腫瘤壞死因子-α (TNF-α)基因的關(guān)節(jié)炎轉(zhuǎn)基因老鼠內(nèi)，導(dǎo)致肥大細(xì)胞數(shù)目減少，并減少了在關(guān)節(jié)炎老鼠的滑膜中組織胺和物質(zhì)P的含量(Aloe等人，Rheumatol.1nt.14:249_252 (1995))。已經(jīng)顯示外源給予NGF抗體，降低了發(fā)生在關(guān)節(jié)炎老鼠中的提高的 TNF-α 含量(Manni 等人，Rheumatol.1nt.18:97_102 (1998))。再者，已經(jīng)在人類(lèi)骨關(guān)節(jié)炎`軟骨細(xì)胞中觀察到NGF和高親和性NGF受體(TrkA)的增加表達(dá)(Iannone 等人，Rheumatology 41:1413-1418 (2002))。已經(jīng)報(bào)告了嚙齒類(lèi)抗-NGF拮抗劑抗體。參見(jiàn)，例如Hongo等人，Hybridoma(2000) 19(3):215-227 ；Ruberti 等人(1993)Cell.Molec.Neurobiol.13(5):559-568。然而，當(dāng)為了治療而將嚙齒類(lèi)抗體使用在人類(lèi)上時(shí)，在大量接受治療的個(gè)體中發(fā)展出人類(lèi)抗-老鼠抗體反應(yīng)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)老鼠抗體的效應(yīng)物功能，在人類(lèi)關(guān)系中是較低效力的。因此，人們非常需要一種抗-NGF拮抗劑抗體，包括人類(lèi)化的抗-NGF拮抗劑抗體。在本文中公開(kāi)的所有參考文獻(xiàn)、出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)，全部以引用的方式并入本文中。

發(fā)明內(nèi)容
在本文中公開(kāi)的本發(fā)明涉及對(duì)抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子的抗體。另一方面，本發(fā)明是人類(lèi)化的和親和性成熟的抗體E3，其特異性地結(jié)合人類(lèi)和嚙齒類(lèi)神經(jīng)生長(zhǎng)因子("NGF")。分別在

圖1A(SEQ ID NO:1)和1B(SEQ ID NO:2)中示出E3的重鏈和輕鏈可變區(qū)域的氨基酸序列。在圖1A和IB中以圖示表示抗體E3的CDR部分(包括Chothia和Kabat⑶Rs)。在下文中也示出E3重和輕鏈的氨基酸序列，以及個(gè)別的衍生⑶Rs (參見(jiàn)下文的"抗體序列)。另一方面，本發(fā)明是包括抗體E3的片段或區(qū)域的抗體(在本文中可互換地稱(chēng)為"E3")。在一具體實(shí)施例中，該片段是在圖1B中示出的抗體E3的輕鏈。在另一具體實(shí)施例中，該片段是在圖1A中示出的抗體E3的重鏈。在另一具體實(shí)施例中，該片段含有一或多個(gè)得自抗體E3的輕鏈及/或重鏈的可變區(qū)域。在另一具體實(shí)施例中，該片段含有一或多個(gè)得自在圖1A和IB中示出的抗體E3的輕鏈及/或重鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)。另一方面，本發(fā)明是包括輕鏈的抗體，該輕鏈?zhǔn)怯杀２鼐幪?hào)為ATCC第PTA-4893號(hào)或ATCC第PTA-4894號(hào)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多核苷酸編碼的。另一方面，本發(fā)明是包括重鏈的抗體，該重鏈?zhǔn)怯杀２鼐幪?hào)為ATCC第PTA-4895號(hào)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多核苷酸編碼的。另一方面，本發(fā)明是包括(a)輕鏈和(b)重鏈的抗體，其中該輕鏈?zhǔn)怯杀２鼐幪?hào)為ATCC第PTA-4894號(hào)或ATCC第PTA-4893號(hào)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多核苷酸編碼的，該重鏈?zhǔn)怯杀２鼐幪?hào)為ATCC第PTA-4895號(hào)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多核苷酸編碼的(在本文中為了方便，將由已保藏的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多核苷酸(們)稱(chēng)為具有ATCC第PTA-4894號(hào)、PTA-4893和PTA-4895號(hào)的保藏編號(hào))。另一方面，本發(fā)明·是包括輕鏈的輕鏈可變區(qū)的抗體，該輕鏈?zhǔn)怯删哂蠥TCC第PTA-4894號(hào)或ATCC第PTA-4893號(hào)的保藏編號(hào)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多核苷酸編碼的。另一方面，本發(fā)明是包括重鏈的重鏈可變區(qū)的抗體，該重鏈?zhǔn)怯删哂蠥TCC第PTA-4895號(hào)的保藏編號(hào)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多核苷酸編碼的。另一方面，本發(fā)明是包括(a)輕鏈的輕鏈可變區(qū)以及(b)重鏈的重鏈可變區(qū)的抗體，該輕鏈?zhǔn)怯删哂蠥TCC第PTA-4894號(hào)或ATCC第PTA-4893號(hào)的保藏編號(hào)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多核苷酸編碼的，該重鏈?zhǔn)怯删哂蠥TCC第PTA-4895號(hào)的保藏編號(hào)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多核苷酸編碼的。另一方面，本發(fā)明是包括一或多個(gè)CDR(S)的抗體，該CDR(S)是由(a)由具有ATCC第PTA-4894號(hào)的保藏編號(hào)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多核苷酸及/或(b)由具有A·TCC第PTA-4895號(hào)的?！げ鼐幪?hào)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多核苷酸編碼的重鏈編碼的。在某些具體實(shí)施例中，該抗體包括人類(lèi)重鏈IgG2a恒定區(qū)。在某些具體實(shí)施例中，該抗體包括人類(lèi)輕鏈K恒定區(qū)。在某些具體實(shí)施例中，該抗體包括經(jīng)過(guò)修改的恒定區(qū)，如在免疫學(xué)上為惰性的恒定區(qū)，例如不誘發(fā)補(bǔ)體調(diào)解的溶解，或不刺激抗體-依賴(lài)性細(xì)胞調(diào)解的細(xì)胞毒性(ADCC)。在其他具體實(shí)施例中，按照在Eur.J.1mmunol.(1999)29:2613-2624 ；PCT公開(kāi)第PCT/GB99/01441號(hào)；及/或大不列顛聯(lián)合王國(guó)第9809951.8號(hào)專(zhuān)利申請(qǐng)中的描述來(lái)修改該恒定區(qū)。在另外的具體實(shí)施例中，該抗體包括人類(lèi)重鏈IgG2a恒定區(qū)，該恒定區(qū)包括下列的突變:A330P331至S330S331 (氨基酸編號(hào)參考野外型IgG2a序列)ο Eur.J.1mmunol.(1999)29:2613_2624。另一方面，本發(fā)明提供包括下列任一個(gè)或多個(gè)的多肽(其可以或可以不是抗體):a)在圖1A和IB中示出的抗體E3的一或多個(gè)CDR(s) ；b)得自在圖1A中示出的抗體E3的重鏈的CDR H3 ；c)得自在圖1B中示出的抗體E3的輕鏈的CDR L3 ；d)得自在圖1B中示出的抗體E3的重鏈的三個(gè)⑶Rs ；e)得自在圖1A中示出的抗體E3的重鏈的三個(gè)⑶Rs ；以及f)得自在圖1A和IB中示出的抗體E3的輕鏈的三個(gè)CDRs和得自其重鏈的三個(gè)CDRs。本發(fā)明還提供包括下列任一個(gè)或多個(gè)的多肽(其可以或可以不是抗體):a)衍生自在圖1A和IB中示出的抗體E3的一或多(一、二、三、四、五或六)個(gè)CDR(S) ；b)衍生自得自在圖1A中示出的抗體E3的重鏈的⑶R H3的⑶R ;及/或c)衍生自得自在圖1B中示出的抗體E3的輕鏈的⑶R L3的⑶R。在某些具體實(shí)施例中，⑶Rs可能是Kabat⑶Rs、Chothia⑶Rs，或Kabat和Chothia⑶Rs的組合(在本文中稱(chēng)為"延伸"或"混合"的⑶Rs)。在某些具體實(shí)施例中，多肽(如抗體)與NGF (如人類(lèi)NGF)結(jié)合。在某些具體實(shí)施例中，該多肽包括在本文中描述的任何CDR組態(tài)(包括組合、變體等等)。本發(fā)明一方面提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO:9組成的重鏈可變區(qū)，其中134是S、L、V、A或I ;且以N、T或S取代N35。在本文中為了方便，在提及氨基酸時(shí)，"取代"或"是"意指特定位置可選擇的氨基酸(們)。取代或選擇，顯然可以是在SEQ ID或圖中表示的氨基酸。另一方面，本發(fā)明 提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO:10組成的重鏈可變區(qū)，其中M50是M、1、G、Q、S或L ；A62是A或S ;且L63是L或V。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO:11所組成的重鏈可變區(qū)，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是D、N或G ;且其中YllO是Y、K、S、R或T。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO:11所組成的重鏈可變區(qū)，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO:11所組成的重鏈可變區(qū)，其中 G98 是 G、S、A、C、V、N、D 或 T ;其中 G99 是 G、S、A、C、V、N、D 或 T ;其中 YlOO 是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO:12組成的輕鏈可變區(qū)，其中S26是S或F ；D28是D、S、A或Y ;且H32是H、N或Q。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO:13組成的輕鏈可變區(qū)，其中151是1、T、V或A ;且S56是S或T。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO:14組成的輕鏈可變區(qū)，其中S91是S或E ；K92是K、H、R或S ;且其中Υ96是Y或R。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO:14組成的輕鏈可變區(qū)，其中S91是S或E ；Κ92是任何氨基酸；且其中Υ96是Y或R。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID NO:9中示出的氨基酸序列，其中134是S、L、V、A或I ;且吧5是隊(duì)1'或5。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID NO:10中示出的氨基酸序列，其中M50是M、1、G、Q、S或L ；A62是A或S ;且L63是L或V。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID N0:11中示出的氨基酸序列，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是D、N或G ;且其中YllO是Y、K、S、R或T。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID N0:11中示出的氨基酸序列，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID N0:11中示出的氨基酸序列，其中 G98 是 G、S、A、C、V、N、D 或 T ;其中 G99 是 G、S、A、C、V、N、D 或 T ;其中 Yl00 是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID NO:12中示出的氨基酸序列，其中S26是S或F ；D28是D、S、A或Y ;且H32是H、N或Q。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID NO:13中示出的氨基酸序列，其中151是1、T、V或A;且S56是S或T。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID NO:14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E ；K92是K、H、R或S ;且其中Υ96是Y或R。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID NO:14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E ；Κ92是任何氨基酸；Τ93是任何氨基酸；且其中Υ96是Y或R。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體，包括人類(lèi)化抗體)，其包括具有下述區(qū)域的重鏈可變區(qū):SEQ ID NO:9的CDRl區(qū)，其中134為S、L、V、A或I ;且N35是N、T或S ;SEQ IDNO:10 的 CDR2 區(qū)，其中 M50 是 M、1、G、Q、S 或 L ；A62 是 A 或 S，且 L63 是 L 或 V ;以及 SEQ IDNO:11的CDR3區(qū)，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是D、N或G ;其中YllO是Y、K、S、R或T。在一些具體實(shí)施例中，該重鏈可變區(qū)包括SEQ ID N0:11的CDR3區(qū)，其中YlOO是Y、L或R;其中YlOl是Y或W;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;其中YllO是任何氨基酸。在另外的具體實(shí)施例中，該重鏈可變區(qū)包括SEQ ID N0:11的⑶R3區(qū)，其中G98 是 G、S、A、C、V、N、D 或 T ;其中 G99 是 G、S、A、C、V、N、D 或 T ;其中 YlOO 是 Y、L 或 R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106 是 Y、R、T 或 M;其中 Y107 是 Y 或F ;其中 F108 是F 或 W ;其中 D109 是 S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。在一些具體實(shí)施例中，該多肽(如抗體)還包括抗體輕鏈可變區(qū)。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括具有下述區(qū)域的輕鏈可變區(qū):SEQID NO:12 的 CDRl 區(qū)，其中 S26 是 S 或F ;D28 是D、S、A 或 Y ;且H32 是H、N或 Q ;SEQ ID NO:13的CDR2區(qū)，其中151是1、T、V或A;且S56是S或T;以及SEQ ID NO: 14的CDR3區(qū)，其中S91是S或E ;K92是K、H、R或S ;且其中Y96是Y或R。在一些具體實(shí)施例中，該輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID N0:14的⑶R3區(qū)，其中S91是S或E;K92是任何氨基酸；T93是任何氨基酸；且其中Y96是Y或R。在一些具體實(shí)施例中，該多肽(如抗體)還包括抗體重鏈。
另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括:(a)重鏈可變區(qū)，包括:SEQ ID NO:9的CDRl區(qū)，其中134是S、L、V、A或I ;且吧5是N、T或S ;SEQ ID NO:10的CDR2區(qū)，其中 M50 是M、1、G、Q、S 或 L;A62 是 A或 S，且L63 是L 或 V;以及 SEQ ID NO:11 的 CDR3 區(qū)，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是D、N或G ;其中YllO是Y、K、S、R或T ;以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括:SEQ ID NO:12 的 CDRl 區(qū)，其中 S26 是 S 或 F ;D28 是 D、S、A 或 Y ;且 H32 是 H、N 或 Q ;SEQ ID NO:13 的CDR2區(qū)，其中151是1、T、V或A;且S56是S或T;以及SEQ ID NO: 14的CDR3區(qū)，其中S91是S或E K92是K、H、R或S ;且其中Y96是Y或R。在一些具體實(shí)施例中，該輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO:14的⑶R3區(qū)，其中S91是S或E ；K92是任何氨基酸；Τ93是任何氨基酸；且其中Υ96是Y或R。在一些具體實(shí)施例中，該重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO: 11的⑶R3區(qū)，其中YlOO是Y、L或R;其中YlOl是Y或W;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;其中YllO是任何氨基酸。在其他的具體實(shí)施例中，該重鏈可變區(qū)包括 SEQ ID NO:11 的 CDR3 區(qū)，G98 是 G、S、A、C、V、N、D 或 T;其中 G99 是 G、S、A、C、V、N、D或T ;其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。在一些具體實(shí)施例中，該多肽還包括抗體輕鏈。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體，包括人類(lèi)化抗體)，其包括:在SEQ ID NO:9中示出的氨基酸序列，其中134是S、L、V、A或I ;且吧5是N、T或S ;在SEQ ID NO: 10中示出的氨基酸序列，其中M50是M、1、G、Q、S或L ；A62是A或S，且L63是L或V ;以及在SEQIDNO:11中示出的氨基酸序列，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ; 其中D109是D、N或G ;其中YllO是Y、K、S、R或T。在一些具體實(shí)施例中，該多肽包括在SEQ ID NO: 11中示出的氨基酸序列，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106 是 Y、R、T 或 M ;其中 Y107 是 Y 或 F ;其中 F108 是 F 或 W ;其中 D109 是 S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。在其他的具體實(shí)施例中，該多肽包括在SEQ ID NO:11中示出的氨基酸序列，其中G98是G、S、A、C、V、N、D或T ;其中G99是G、S、A、C、V、N、D或T ;其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。在一些具體實(shí)施例中，該多肽(如抗體)還包括還包括抗體輕鏈可變區(qū)。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括:在SEQ ID N0:12中示出的氨基酸序列，其中S26是S或F ;D28是D、S、A或Y ;且H32是H、N或Q ;在SEQ ID NO:13中示出的氨基酸序列，其中151是1、T、V或A;且S56是S或T;以及在SEQ ID NO: 14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E ；K92是K、H、R或S ;且其中Υ96是Y或R。在一些具體實(shí)施例中，該多肽包括在SEQ ID NO: 14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E ;K92是任何氨基酸；T93是任何氨基酸；且其中Y96是Y或R。在一些具體實(shí)施例中，該多肽(如抗體)還包括還包括抗體重鏈可變區(qū)。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括:(a)在SEQ ID NO:9中示出的氨基酸序列，其中134是S、L、V、A或I ;且吧5是N、T或S ;在SEQ ID NO:10中示出的氨基酸序列，其中M50是M、1、G、Q、S或L;A62是A或S，且L63是L或V;以及在SEQ ID NO:11中示出的氨基酸序列，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是D、N或G ;且其中YllO是Y、K、S、R或T ;以及(b)在SEQ IDNO:12中示出的氨基酸序列，其中S26是S或F ；D28是D、S、A或Y ;且H32是H、N或Q ;在SEQ ID NO: 13中示出的氨基酸序列，其中151是1、T、V或A ;且S56是S或T ;以及在SEQID NO: 14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E ；K92是K、H、R或S ;且其中Υ96是Y或R0在一些具體實(shí)施例中，該多肽包括在SEQ ID Ν0:14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E ；Κ92是任何氨基酸；Τ93是任何氨基酸；且其中Υ96是Y或R。在一些具體實(shí)施例中，該多肽包括在SEQ ID NO: 11中示出的氨基酸序列，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N 、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。在其他的具體實(shí)施例中，該多肽包括在SEQ ID N0:11中示出的氨基酸序列，其中G98是G、S、A、C、V、N、D或T ;其中G99是G、S、A、C、V、N、D或T ;其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。在一些具體實(shí)施例中，該多肽還包括還包括抗體輕鏈可變區(qū)。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括具有下列區(qū)域的重鏈可變區(qū):(a)SEQ ID NO:9 的 CDRl 區(qū)，其中 134 是 S、L、V、A 或 I ;且 N35 以 N、T 或 S 取代；(b) SEQ IDNO:10 的 CDR2 區(qū)，其中 M50 是 1、G、Q、S 或 L ;A62 是 A 或 S，且 L63 是 L 或 V ;以及(c) SEQID NO:11的CDR3區(qū)，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是D、N或G ;其中YllO是Y、K、S、R或T ;其中該抗體與NGF結(jié)
合另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括具有下列區(qū)域的輕鏈可變區(qū):(a)SEQ ID NO:12 的 CDRl 區(qū)，其中 S26 是 S 或F ;D28 是D、S、A或Y ;且H32 是H、N或Q ;(b)SEQ ID NO:13 的 CDR2 區(qū)，其中 151 是 1、T、V 或 A ;且 S56 是 S 或 T ;以及(c) SEQ ID NO:14的⑶R3區(qū)，其中K92是K、H、R或S ;且其中Y96是Y或R ;其中該抗體與NGF結(jié)合。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其包括(a)重鏈可變區(qū)，包括:(i) SEQ IDNO:9 的 CDRl 區(qū)，其中 134 以 S、L、V、A 或 I 取代;且 N35 以 N、T 或 S 取代；(ii) SEQ ID NO:10 的 CDR2 區(qū)，其中 M50 是 1、G、Q、S 或 L ;A62 是 A 或 S，且 L63 是 L 或 V ;和(iii)SEQ IDNO:11的CDR3區(qū)，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是D、N或G ;其中YllO是Y、K、S、R或T ;以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括:(i)SEQ ID NO:12 的 CDRl 區(qū)，其中 S26 是 S 或 F ;D28 是 D、S、A 或 Y ;且 H32 是 Η、N或 Q;(ii)SEQ ID NO: 13 的 CDR2 區(qū)，其中 151 是 1、T、V 或 A ;且 S56 是 S 或 T ;和(iii)SEQID NO:14的CDR3區(qū)，其中S91是S或E ;K92是K、H、R或S ;且其中Υ96是Y或R ;其中該
抗體與NGF結(jié)合。除非另行提到，在一位置的氨基酸選擇(例如取代)與在任何其他位置的氨基酸選擇無(wú)關(guān)。在一些具體實(shí)施例中，多核苷酸(如抗體)與NGF(如人類(lèi)NGF)結(jié)合。在一些具體實(shí)施例中，該多肽包括包括在本文中描述的任何CDR組態(tài)(包括組合、變體等等)。從本文中的說(shuō)明，顯然在本文中可變區(qū)的編號(hào)使用連續(xù)編號(hào)。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解一些現(xiàn)有的抗體編號(hào)系統(tǒng)(如Kabat和Chothia編號(hào))，以及如何將連續(xù)編號(hào)轉(zhuǎn)換成其他的編號(hào)系統(tǒng)，如Kabat編號(hào)或Chothia編號(hào)。另一方面，本發(fā)明提供包括選自SEQ ID NO:46或50的氨基酸序列(如⑶R3序列)的多肽(如抗體)。在另外的具體實(shí)施例中，該多肽還包括還包括一或多個(gè)在SEQ IDNO:3、4、5、6、7和8中示出的氨基酸序列。在另外的具體實(shí)施例中，該多肽還包括還包括一或多個(gè)在SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14和15中示出的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明提供包括選自下列的氨基酸序列(如⑶R區(qū)，如⑶R Hl及/或CDR Η2 區(qū))的多肽(如抗體):(a) SEQ ID NO:28 及 / 或 29 ; (b) SEQ ID NO:30 及 / 或 31 ;
(c)SEQ ID N0:32及 /或 33 ;(d)SEQ ID NO:34 及 / 或 35 ; (e) SEQ ID NO:36 及 / 或 37 ;(f) SEQ ID NO:38及/或39 ;以及(g) SEQ ID N0:40和41。在一些具體實(shí)施例中，該多肽包括選自SEQ ID NO:28、30、32、34、36、38和40的氨基酸序列(如CDR Hl區(qū))。在一些具體實(shí)施例中，該多肽包括選自SEQ ID NO:29、31、33、35、37、39和41的氨基酸序列(如CDRH2區(qū))。在另外的具體實(shí)施例中，該多肽還包括還包括一或多個(gè)在SEQ ID N0:3、4、5、6、7和8中示出的氨基酸序列。在另外的具體實(shí)施例中，該多肽還包括一或多個(gè)在SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14和15中示出的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明提供包括選自下列的氨基酸序列(如⑶R區(qū)，如⑶R LI及/或CDR L2 區(qū))的多肽(如抗體):(a) SEQ ID NO:18 及 / 或 19 ; (b) SEQ ID NO:20 及 / 或 21 ;和(c)SEQ ID N0:22及/或23。在一些具體實(shí)施例中，該多肽包括選自SEQ ID NO:18,20和22的氨基酸序列(如⑶R LI區(qū))。在一些具體實(shí)施例中，該多肽包括選自SEQ ID NO:19、21和23的氨基酸序列(如CDR L2區(qū))。在另外的具體實(shí)施例中，該多肽還包括一或多個(gè)在SEQ ID N0:3、4、5、6、7、8中示出的氨基酸序列。在另外的具體實(shí)施例中，該多肽還包括一或多個(gè)在SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14和15中示出的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明提供包括選自下列的氨基酸序列(如⑶R區(qū)，如⑶R L3及/或CDR H3 區(qū))的多肽(如抗體):(a) SEQ ID NO:51 及 / 或 52 ; (b) SEQ ID NO:55 及 / 或 56 ;
(c)SEQ ID N0:57及 /或 58 ;(d)SEQ ID NO:59 及 / 或 60 ; (e) SEQ ID NO:61 及 / 或 62 ;(f) SEQ ID NO:63及/或64。在一些具體實(shí)施例中，該多肽包括選自SEQ ID NO:51、55、57、59、61和63的氨基酸序列(如⑶R L3區(qū))。在一些具體實(shí)施例中，該多肽包括選自SEQ IDN0:52、56、58、60、62和64的氨基酸序列(如CDR H3區(qū))。在另外的具體實(shí)施例中，該多肽還包括一或多個(gè)在SEQ ID NO:18、19、30和31中示出的氨基酸序列。在另外的具體實(shí)施例中，該多肽還包括一或多個(gè)在SEQ ID N0:3、4、5、6、7和8中示出的氨基酸序列。在另外的具體實(shí)施例中，該多肽還包括一或多個(gè)在SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14和15中示出的氨
基酸序列。另一方面，本發(fā)明提供包括一或多個(gè)在SEQ ID NO:61、63、18、19、30和31中示出的氨基酸序列(如CDR區(qū))的多肽(如抗體)。本發(fā)明一方面提供抗-NGF抗體(如拮抗劑抗體)，其以高親和性與NGF (如人類(lèi)NGF)結(jié)合。在一些具體實(shí)施例中，高親和性是(a)以低于大約2nM(如大約1ηΜ、800ρΜ、600pM、400pM、200pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM 或更低)的 KD，及 / 或比大約6χ1θ 更慢的 kQff 與 NGF 結(jié)合；并 / 或(b)以大約 200pM、150pM、100pM、80pM、60pM、40pM、20pM、IOpM或更低的IC5tl (在大約15pM NGF的存在下)，抑制(降低及/或阻斷)老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的人類(lèi)NGF-依賴(lài)性存活；并/或(c)以大約50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM、2pM、lpM或更低的IC5(I(在大約1.5pM NGF的存在下)，抑制(降低及/或阻斷)老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的人類(lèi)NGF-依賴(lài)性存活；并/或(d)以大約150pM、125pM、100pM、80pM、60pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM或更低的IC5tl (在大約15pM NGF的存在下)，抑制(降低及/或阻斷)老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的大鼠NGF-依賴(lài)性存活；并/或(e)以大約30pM、25pM、20pM、15pM、10pM、5pM、4pM、3pM、2pM、lpM 或更低的 IC5tl(在大約 1.5pM NGF 的存在下)，抑制(降低及/或阻斷)老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的老鼠NGF-依賴(lài)性存活；并/或(f)并以比trkA受體更高的親和性與NGF結(jié)合。另一方面，本發(fā)明提供多肽(如抗體)，其中該多肽(a)以低于大約2nM(如大約111] 、800 ]\1、600 ]\1、400 ]\1、200 ]\1、100 ]\1、90 ]\1、80 ]\1、70 ]\1、60 ]\1、50 ]\1或更低)的 KD，及 / 或比大約θχΙΟ 更慢的koff與NGF(如人類(lèi)`NGF)結(jié)合；并/或(b)以大約200pM、150pM、100pM、80pM、60pM、40pM、20pM、10pM 或更低的 IC5tl(在大約 15pM NGF 的存在下)，抑制老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的人類(lèi)NGF-依賴(lài)性存活；并/或(c)以大約50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM、2pM、lpM或更低的IC5tl (在大約1.5pM NGF的存在下)，抑制老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的人類(lèi)NGF-依賴(lài)性存活；并/或以比trkA受體更高的親和性與NGF結(jié)合。在一些具體實(shí)施例中，該多肽(a)以比大約2nM更低的Kd與NGF結(jié)合；并/或(b)以大約IOOpM或更低的IC5tl抑制老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的人類(lèi)NGF-依賴(lài)性存活，其中在大約15pM NGF的存在下測(cè)量該IC5tl ;并/或(c)以大約IOpM或更低的IC5tl抑制老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的人類(lèi)NGF-依賴(lài)性存活，其中在大約1.5pM NGF的存在下測(cè)量該IC5(I。在一些具體實(shí)施例中，該多肽(a)以比大約IOOpM更低的Kd與NGF結(jié)合；并/或(b)以大約20pM或更低的IC5tl抑制老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的人類(lèi)NGF-依賴(lài)性存活，其中在大約15pM NGF的存在下測(cè)量該IC50 ;并/或(c)以大約2pM或更低的IC5tl抑制老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的人類(lèi)NGF-依賴(lài)性存活，其中在大約1.5pM NGF的存在下測(cè)量該IC5(I。從本文中的說(shuō)明，顯然明確地排除在本發(fā)明之外的是由與老鼠單克隆抗體911的氨基酸序列相同的氨基酸序列所組成的多肽具體實(shí)施例。在圖1A和1B，以及在SEQ ID NO:9-14中，示出Mab 911的衍生⑶R序列。在一些具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供任何上述的多肽或抗體，其中該多肽(如抗體)是經(jīng)過(guò)分離的。在一些具體實(shí)施例中，該多肽(抗體)實(shí)質(zhì)上是經(jīng)過(guò)純化的。在另外的具體實(shí)施例中，該多肽(如抗體)是親和性成熟的。在其他的具體實(shí)施例中，該抗體是拮抗劑抗體。在一些具體實(shí)施例中，該多肽(抗體)包括人類(lèi)框架(framework)序列。在另外的具體實(shí)施例中，該多肽(抗體)包括一或多個(gè)非人類(lèi)框架殘基。在一些具體實(shí)施例中，該多肽(抗體)以2nM或更低的Kd與NGF (如人類(lèi)NGF)結(jié)合。在一些具體實(shí)施例中，相對(duì)于非人類(lèi)氨基酸序列(如可變區(qū)序列，如CDR序列，如框架序列)，該多肽包括一或多個(gè)(如2、
3、4、5、6、7、8或更多個(gè))人類(lèi)氨基酸取代。在一些具體實(shí)施例中，相對(duì)于雙親(parent)多肽氨基酸序列(如抗體911氨基酸序列，如任一或多個(gè)的SEQ ID NO:9-14)，該多肽包括至少1、至少2或更多，如至少3、4、5、6或更多個(gè)氨基酸取代。在一些具體實(shí)施例中，相對(duì)于雙親抗體(如Mab 911)親和性，已經(jīng)改變了(在某些具體實(shí)施例中，增加了)該抗體的結(jié)合親和性。在其他的具體實(shí)施例中，該抗體的結(jié)合親和性比trkA受體對(duì)NGF (如人類(lèi)NGF)的結(jié)合親和性更低。在一些具體實(shí)施例中，該多肽可以是抗體。在一些具體實(shí)施例中，該抗體是人類(lèi)抗體。在其他的具體實(shí)施例中，該抗體是人類(lèi)化抗體。在另外的具體實(shí)施例中，該抗體是單克隆抗體。在一些具體實(shí)施例中，該抗體是親和性成熟的抗體。本發(fā)明提供多核苷酸(包括經(jīng)過(guò)分離的多核苷酸)，包括編碼任何上述具體實(shí)施例的多核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供經(jīng)過(guò)分離的多核苷酸，包括編碼抗體E3(在本發(fā)明中可稱(chēng)為"E3")的片段或區(qū)域的多核苷酸。在一具體實(shí)施例中，該片段是如同在圖1B中示出的抗體E3的輕鏈。在另一具體實(shí)施例中，該片段是如同在圖1A中示出的抗體E3的重鏈。在另一具體實(shí)施例中，該片段含有一或多個(gè)得自抗體E3的輕鏈及/或重鏈的可變區(qū)。在另一具體實(shí)施例中，該片段含有一或多個(gè)得自如同在圖1A和IB中示出的抗體E3的輕鏈及/或重鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)(⑶Rs)。另一方面，本發(fā)明是經(jīng)過(guò)分離的多核苷酸，包括編碼抗體E3的多核苷酸。在一些具體實(shí)施例中，該多核苷酸包括在圖2和3中示出的任一多核苷酸或兩者。另一方面，本發(fā)明是經(jīng)過(guò)分離的多核苷酸，其編碼具有ATCC PTA-4893或ATCCPTA-4894保藏編號(hào)的E3輕鏈。另一方面，本發(fā)明是經(jīng)過(guò)分離的多核苷酸，其編碼具有ATCCPTA-4895保藏編號(hào)的E3重鏈。另一方面，本發(fā)明是經(jīng)過(guò)分離的多核苷酸，包括(a)在具有ATCC PTA-4893或PTA-4894保藏編號(hào)的多核苷酸中編碼的可變區(qū)，以及(b)在具有ATCCPTA-4895保藏編號(hào)的多核苷酸中編碼的可變區(qū)。另一方面，本發(fā)明是經(jīng)過(guò)分離的多核苷酸，包括(a) —或多個(gè)在具有ATCC PTA-4893或PTA-4894保藏編號(hào)的多核苷酸中編碼的⑶R ;及/或(b) —或多個(gè)在具有ATCC PTA-4895保藏編號(hào)的多核苷酸中編碼的⑶R。另一方面，本發(fā)明提供編碼任何在本文中描述的抗體(包括抗體片段)或多肽的多核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供包括任何在本文中公開(kāi)的多核苷酸的載體(包括表達(dá)和選殖載體)和宿主細(xì)胞。從在本文中的說(shuō)明，顯然明確地排除在本發(fā)明之外的是由與老鼠單克隆抗體911的多核苷酸序列相同的多核苷酸序列所組成的多核苷酸具體實(shí)施例。在圖1A和1B，以及在SEQ ID NO:9-14中，示出Mab 911的衍生CDR序列。另一方面，本發(fā)明是包括 編碼E3輕鏈的多核苷酸和編碼E3重鏈的多核苷酸的宿主細(xì)胞，其中該多核苷酸(們)編碼具有ATCC第PTA-4893號(hào)及/或PTA-4894號(hào)保藏編號(hào)的E3輕鏈，且該多核苷酸編碼具有ATCC第PTA-4895號(hào)保藏編號(hào)的E3重鏈。在一些具體實(shí)施例中，該宿主細(xì)胞包括多核苷酸，其包括(a)在具有ATCC第PTA-4893號(hào)或PTA-4894號(hào)保藏編號(hào)的多核苷酸中編碼的可變區(qū)，及/或(b)在具有ATCC第PTA-4895號(hào)保藏編號(hào)的多核苷酸中編碼的可變區(qū)。在一些具體實(shí)施例中，該宿主細(xì)胞包括編碼(a) —或多個(gè)在具有ATCC第PTA-4893號(hào)或PTA-4894號(hào)保藏編號(hào)的多核苷酸中編碼的CDR ;及/或(b) —或多個(gè)在具有ATCC第PTA-4895號(hào)保藏編號(hào)的多核苷酸中編碼的CDR的多核苷酸。在一些具體實(shí)施例中，該宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明是與抗體E3結(jié)合的NGF的復(fù)合物。另一方面，該復(fù)合物是經(jīng)過(guò)分離的。另一方面，該復(fù)合物實(shí)質(zhì)上是經(jīng)過(guò)純化的。另一方面，本發(fā)明是與在本文中描述的抗體或多肽結(jié)合的NGF的復(fù)合物。另一方面，該復(fù)合物是經(jīng)過(guò)分離的。另一方面，該復(fù)合物實(shí)質(zhì)上是經(jīng)過(guò)純化的。另一方面，本發(fā)明是包括在本文中描述的多肽(包括抗體，如抗體E3)或多核苷酸的醫(yī)藥組合物，如包括抗體E3或包括抗體E3的片段的抗體的醫(yī)藥組合物，以及在藥學(xué)上可接受的賦形劑。另一方面，本發(fā)明是產(chǎn)生抗體E3的方法，包括制備包括編碼抗體E3的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，在容許抗體E3產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞或其后代；并純化抗體E3。在一些具體實(shí)施例中，該表達(dá)載體包括在圖2和3中示出的多核苷酸序列之一或兩者。另一方面，本發(fā)明是產(chǎn)生抗體E3的方法，包括使編碼E3輕鏈的多核苷酸和編碼E3重鏈的多核苷酸在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中表達(dá)，其中編碼E3輕鏈的多核苷酸具有ATCC第PTA-4893號(hào)及/或ATCC第PTA-4894號(hào)保藏編號(hào)，且編碼E3重鏈的多核苷酸具有ATCC第PTA-4895號(hào)保藏編號(hào)；通常接著回收及/或分離該抗體。另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生任何在本文中描述的多肽(如抗體)的方法，借著使一或多個(gè)編碼該抗體(其可以單一輕或重鏈分別表達(dá)，或可從一載體中表達(dá)輕鏈和重鏈兩者)的多核苷酸在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中表達(dá)，通常接著回收并/或分離感興趣的抗體或多肽。

另一方面，本發(fā)明是使用在本文中公開(kāi)的任何多肽(包括抗體，如抗體E3)來(lái)拮抗NGF (如人類(lèi)NGF)生物活性的方法。在一具體實(shí)施例中，該方法包括使人類(lèi)神經(jīng)生長(zhǎng)因子與在本文中描述的任何多肽(包括抗體E3)接觸，借此拮抗、降低、阻斷或壓抑NGF活性(如人類(lèi)神經(jīng)生長(zhǎng)因子活性)。另一方面，本發(fā)明是使用在本文中描述的任何多肽(包括抗體，如抗體E3)來(lái)檢測(cè)NGF的方法。借著檢測(cè)在NGF和在本文中描述的任何多肽(如抗體E3)之間的復(fù)合物，來(lái)檢測(cè)NGF的存在。當(dāng)在本文中使用"檢測(cè)"一詞時(shí)，包括有或無(wú)參考對(duì)照組的定性及/或定量檢測(cè)(測(cè)量含量)。另一方面，本發(fā)明是利用給予有效含量的包括抗體E3或在本文中描述的任何多肽(包括抗體)或多核苷酸具體實(shí)施例的組合物，來(lái)治療疼痛的方法。在一些具體實(shí)施例中，該疼痛是手術(shù)后的疼痛。另一方面，本發(fā)明是利用對(duì)個(gè)體給予有效含量的抗-NGF拮抗劑抗體，在該個(gè)體中預(yù)防或治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛的方法。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)顯示抗-NGF拮抗劑抗體能夠抑制或阻斷與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)的疼痛。在一些具體實(shí)施例中，在給予抗-NGF拮抗劑抗體之后大約24小時(shí)內(nèi)減輕了該疼痛。在一些具體實(shí)施例中，在給予抗-NGF拮抗劑抗體之后大約4天內(nèi)減輕了該疼痛。在一些具體實(shí)施例中，在個(gè)體中觀察到改善炎癥狀況的跡象之前，或在沒(méi)有改善的跡象時(shí)，減輕該疼痛。
另一方面，本發(fā)明提供在個(gè)體中減少風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛的發(fā)生、改善風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛、抑制風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛、減輕風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛及/或延遲風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛之發(fā)作、發(fā)展或進(jìn)行的方法，該方法包括對(duì)該個(gè)體給予有效含量的抗-NGF拮抗劑抗體。另一方面，本發(fā)明提供在個(gè)體中治療與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)的炎癥惡病質(zhì)(體重減輕)的方法，包括給予有效含量的抗-NGF拮抗劑抗體。另一方面，本發(fā)明是借著對(duì)個(gè)體給予有效含量的神經(jīng)生長(zhǎng)因子的拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)，在個(gè)體中預(yù)防或治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛的方法。另一方面，本發(fā)明提供在個(gè)體中減少骨關(guān)節(jié)炎疼痛的發(fā)生、改善骨關(guān)節(jié)炎疼痛、抑制骨關(guān)節(jié)炎疼痛、減輕骨關(guān)節(jié)炎疼痛及/或延遲骨關(guān)節(jié)炎疼痛之發(fā)作、發(fā)展或進(jìn)行的方法，該方法包括對(duì)該個(gè)體給予有效含量的NGF抑制劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)。另一方面，本發(fā)明提供在患有骨關(guān)節(jié)炎的個(gè)體中改善物理功能的方法，該方法包括對(duì)該個(gè)體給予有效含量的NGF抑制劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)。

另一方面，本發(fā)明提供在患有骨關(guān)節(jié)炎的個(gè)體中改善僵硬的方法，該方法包括對(duì)該個(gè)體給予有效含量的NGF抑制劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)。在一些具體實(shí)施例中，該個(gè)體為人類(lèi)。在一些具體實(shí)施例中，為了治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛，抗-NGF拮抗劑抗體的給藥頻率是在每天一次和每10周一次之間，或是更低的頻率。另一方面，本發(fā)明提供包括任一或多個(gè)在本文中描述的組合物的試劑盒和組合物。這些試劑盒，通常是在適當(dāng)?shù)陌b中并提供適當(dāng)?shù)恼f(shuō)明書(shū)，適用在本文中描述的任何方法。本發(fā)明也還提供任何適合在本文中描述的任何用途的組合物和試劑盒，無(wú)論是在醫(yī)藥品的用途，及/或用來(lái)制造醫(yī)藥品的前后文中。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1A顯示E3抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(標(biāo)示為"6"和"5+親和性成熟H3")。分別借著加下標(biāo)線的原文和粗斜體的原文來(lái)描述Chothia⑶Rs和Kabat⑶Rs。圖1A也顯示下列重鏈可變區(qū)氨基酸序列的直線排列:(1)老鼠911抗體的⑶Rs Hl (SEQ IDNO:9),H2(SEQ ID NO: 10)及 H3 (SEQ ID NO: 11) ; (2) VH4-59 人類(lèi)生殖種系接受者序列(標(biāo)示為"VH4-59"或"2" ) (SEQ ID NO:69) ； (3)以老鼠抗體911的衍生CDRs移植的接受者序列(標(biāo)示為"CDR移植"或"3" ) (SEQ ID NO:70) ; (4)⑶R移植的接受者序列，包括V71K取代(標(biāo)示為"3+—框架突變"或"4" ) (SEQ ID NO:71) ； (5)含有親和性成熟CDRs Hl和H2的純種系(標(biāo)示為"5"或"4+親和性成熟H1，H2" ) (SEQ ID NO -J2);以及抗體E3 (如上述)(SEQ ID NO:1)。圖1B顯示E3抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(標(biāo)示為"5"或"4+親和性成熟L3")。分別借著加下標(biāo)線的原文和粗斜體的原文來(lái)描述Chothia⑶Rs和Kabat⑶Rs。圖1B也顯示下列輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的直線排列:(I)老鼠911抗體的⑶Rs LI (SEQ IDNO:12)，L2(SEQ ID NO: 13)及L3 (SEQ ID NO: 14) ; (2) 08人類(lèi)生殖種系接受者序列(標(biāo)示為"08"或"2" ) (SEQ ID NO:73) ； (3)以老鼠抗體911的衍生⑶Rs移植的接受者序列(標(biāo)示為"CDR移植"或"3" ) (SEQ ID NO:74) ; (4)CDR移植的接受者序列(標(biāo)示為"3+親和性成熟LI，L2"或"4" ) (SEQ ID NO:75) ； (5)含有親和性成熟CDRs LI和L2的純種系(標(biāo)示為"5"或"4+親和性成熟L3");以及抗體E3(如上述)(SEQ ID NO:2)。
圖2顯示包括編碼抗體E3的重鏈可變區(qū)的多核苷酸序列的多核苷酸序列(SEQ IDNO:76)。圖3顯示包括編碼抗體E3的輕鏈可變區(qū)的多核苷酸序列的多核苷酸序列(SEQ IDNO:77)。圖4是在各種濃度的人類(lèi)和大鼠NGF的存在下，表示E13.5神經(jīng)元的NGF-依賴(lài)性存活的圖表。X軸代表NGF濃度(納克/毫升)且Y軸代表計(jì)算出的神經(jīng)元。圖5為在0.04納克/毫升人類(lèi)NGF (約1.5pM ;在下圖中示出)或0.4納克/毫升人類(lèi)NGF(約15pM ;在上圖中示出)的存在下，比較各種Fabs的NGF阻斷效力的圖表。在各種濃度的Fab E3 ;老鼠911Fab ;和Fab H19-L129與Fab 8L2-6D5中，評(píng)估E13.5老鼠三叉神經(jīng)元的存活。在每個(gè)NGF濃度下，計(jì)算每個(gè)Fab的IC5tl(以pM計(jì))，并在表9中示出。Fab E3在15pM人類(lèi)NGF的存在下以大約21pM的IC50，并在1.5pM人類(lèi)NGF的存在下以大約1.2pM的IC5tl，強(qiáng)有力地阻斷了人類(lèi)NGF-依賴(lài)性的三叉神經(jīng)元存活。Fab 3C和H19-L129也強(qiáng)有力地阻斷了人類(lèi)NGF-依賴(lài)性的三叉神經(jīng)元存活。在兩圖中，X軸代表抗體濃度(nM)且Y軸代表計(jì)算出的神經(jīng)元。1.5pM的NGF約為IC5tl,而15pM則代表NGF的飽和濃度。圖6為在0.04納克/毫升大鼠NGF(約1.5pM ;在下圖中示出)或0.4納克/毫升大鼠NGF(約15pM ;在上圖中示出)的存在下，比較各種Fabs的NGF阻斷效力的圖表。在各種濃度的Fab E3 ;老鼠Fab 911 ;和Fab H19-L129與Fab 8L2-6D5中，按照上述評(píng)估E13.5老鼠三叉神經(jīng)元的存活。在每個(gè)NGF濃度下，計(jì)算每個(gè)Fab的IC5tl (以pM計(jì))，并在表9中示出。Fab E3在15pM大鼠NGF的存在下以大約31.6pM的IC5(I，并在1.5pM大鼠NGF的存在下以大約1.3pM的IC5tl，強(qiáng)有力地阻斷了人類(lèi)NGF-依賴(lài)性的三叉神經(jīng)元存活。Fab 3C和H19-L129也強(qiáng)有力地阻斷了大鼠NGF-依賴(lài)性的三叉神經(jīng)元存活。1.5pM的NGF約為IC5(I，而15pM則代表NGF的飽和濃度。在兩圖中，X軸代表抗體濃度(nM)且Y軸代表計(jì)算出的神經(jīng)元。圖7是表示在手術(shù)后24小時(shí)評(píng)估靜止疼痛，并顯示以0.02毫克/千克、0.1毫克/千克、0.6毫克/千克或I毫克/千克的抗-NGF抗體E3治療降低了疼痛的圖表。"表示與陰性對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P < 0.5)。圖8是表示在手術(shù)后24小時(shí)評(píng)估靜止疼痛，并顯示以0.5毫克/千克的抗-NGF抗體E3治療，當(dāng)在手術(shù)后2小時(shí)注射，顯著(p<0.05)地降低了靜止疼痛的圖表。圖9是顯示人類(lèi)NGF與老鼠抗體911 (Fab)的結(jié)合親和性的BIAcore分析的結(jié)果的圖表。老鼠抗體911以3.7nM的Kd, 8.4xl0^5s^的koff和2.2xl04Ms^的kon與人類(lèi)NGF結(jié)
合
圖10是顯示人類(lèi)NGF與抗體E3 (Fab)(稱(chēng)為"3E Fab")的結(jié)合親和性的BIAcore分析的結(jié)果的圖表。E3抗體以0.07nM的Kd (并以大約6.0xlO^s^1的km和大約4.2xl0^5s^的kf)與人類(lèi)NGF結(jié)合。圖11是表示抗體E3阻斷NGF與其受體trkA和p75的交互作用的圖表，借著在NGF和trkA (以黑色圓形表示)以及NGF和p75(以空心正方形表示)之間檢測(cè)到的結(jié)合百分比來(lái)評(píng)估。X軸代表抗體3E (Fab)的濃度，而Y軸代表NGF結(jié)合(最大值RU的百分比)。增加Fab 3E的濃度，阻斷了 NGF與p75和trkA兩者的交互作用，可借著減少的信號(hào)來(lái)表示(以RU來(lái)測(cè)量)。當(dāng)抗體E3 (Fab)濃度等于NGF濃度時(shí)，沒(méi)有觀察到任何NGF結(jié)合(以信號(hào)為O來(lái)表不)。圖12是表示完整抗體E3和Fab E3的人類(lèi)NGF阻斷能力的圖表。在人類(lèi)NGF和各種濃度的Fab E3及抗體E3的存在下，評(píng)估E13.5老鼠三叉神經(jīng)元的存活。X軸代表NGF結(jié)合位置(nM)，而Y軸代表三叉神經(jīng)(TG)元的標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)數(shù)。當(dāng)將完整抗體和Fab的濃度對(duì)NGF結(jié)合位置的數(shù)目標(biāo)準(zhǔn)化(Fab有一個(gè)結(jié)合位置，而完整抗體有兩個(gè)結(jié)合位置)時(shí)，完整抗體E3和Fab 3E，對(duì)三叉神經(jīng)元的NGF-依賴(lài)性存活顯示出類(lèi)似的抑制程度。圖13是表示在0.4納克/毫升人類(lèi)NGF(飽和條件)的存在下，各種濃度(20、
4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128 和 0.0nM)的抗體 E3 (實(shí)心三角形；稱(chēng)為"3E ")、抗體911 (實(shí)心圓形)和trkA受體免疫粘附素(immunoadhesin)(陰暗的正方形；稱(chēng)為"trkA-Fc ")，抑制E13.5三叉神經(jīng)元的NGF-依賴(lài)性存活的能力的圖表。X軸代表抗體濃度(nM)且Y軸代表計(jì)算出的神經(jīng)元。這些結(jié)果證實(shí)抗體E3阻斷了 NGF，明顯比老鼠單克隆抗-NGF抗體911或trkA免疫黏附素更好。圖14是表示抗-NGF拮抗劑抗體E3(在圖中稱(chēng)為"3E")或Fab 911不能抑制由NT3、NT4/5和MSP促進(jìn)的神經(jīng)元存活的圖表，甚至是高達(dá)200nM的抗體濃度。數(shù)據(jù)代表在培養(yǎng)48小時(shí)之后，相對(duì)于在每個(gè)實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照組中觀察到存活(在飽和NGF濃度的存在下生長(zhǎng)的三叉神經(jīng)元100%存活)的平均存活百分比(土平均值的標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)η =3)。在不加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(稱(chēng)為"對(duì)照組")、400pM NGF (稱(chēng)為"NGF-400pM" )、10nMNT3 (稱(chēng)為"NT3-10nM)或600pM MSP (稱(chēng)為"MSP_600pM")的存在下，使用各種濃度(20nM、2nM或0.2nM)的E3Fab (在圖中稱(chēng)為"3E")和老鼠抗體911Fab。圖15是表示抗-NGF拮抗劑抗體E3 (Fab或完整抗體)(在圖中稱(chēng)為"3E")或老鼠抗體911 (Fab或完整抗體)不能抑制由NT3、NT4/5和MSP促進(jìn)的神經(jīng)元存活的圖表，甚至是高達(dá)200nM的抗體濃度。在不加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(稱(chēng)為"無(wú)因子")、400pM NGF(稱(chēng)為"NGF-400pM" )、IOnM NT3(稱(chēng)為"NT3_10nM)或 600pM MSP (稱(chēng)為"MSP_600pM")的存在下，使用各種濃度(200nM和80nM)的E3Fab和完整抗體，以及老鼠抗體911完整抗體和 Fab0圖16是表示抗-NGF拮抗劑抗體E3或Fab E3不能抑制由BDNF、NT4/5或LIF促進(jìn)的E17結(jié)節(jié)神經(jīng)元存活的圖表。也測(cè)試?yán)鲜罂?NGF拮抗劑抗體911，并觀察到類(lèi)似的結(jié)果。在不加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(稱(chēng)為"無(wú)因子")、400pM BDNF(稱(chēng)為"BDNF_400pM" )、400pMNT4/5(稱(chēng)為"NT4/5-400pM")或 2.5nM LIF(稱(chēng)為"LIF-2.5nM")的存在下，測(cè)試各種濃度(200nM或80nM)的完整抗體E3(在圖中稱(chēng)為"3E" )、Fab E3、完整抗體911或Fab911。圖17是表示抗-NGF拮抗劑抗體E3或Fab E3不能抑制由BDNF、NT4/5或LIF促進(jìn)的E17結(jié)節(jié)神經(jīng)元存活的圖表。在不加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(稱(chēng)為"對(duì)照組")、400pMBDNF(稱(chēng)為"BDNF-400pM" )、400pM NT4/5(稱(chēng)為"NT4/5_400pM")或 2.5nM LIF(稱(chēng)為"LIP-2.5nM")的存在下，測(cè)試各種濃度(200nM.20nM.2nM)的Fab E3(在圖中稱(chēng)為"E3")或 Fab 911。圖18是在第14和19天給予抗-NGF抗體(E3和911)之后，證實(shí)在關(guān)節(jié)炎大鼠(風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模式)中的感受傷害反應(yīng)的圖表。將E3(l毫克/千克，靜脈內(nèi)，第14和19天)、911 (10毫克/千克,靜脈內(nèi)， 第14和19天)或n引哚(n引哚美辛(indomethacin) 3毫克/千克，10天內(nèi)每天口服)給予關(guān)節(jié)炎老鼠。以平均值土sem,按mV計(jì)來(lái)表現(xiàn)發(fā)聲強(qiáng)度值。圖19是在第14和19天給予抗-NGF抗體之后，證實(shí)抗-NGF抗體在關(guān)節(jié)炎大鼠(風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模式)中對(duì)體重的影響的圖表。將E3(l毫克/千克，靜脈內(nèi)，第14和19天)、911(10毫克/千克，靜脈內(nèi)，第14和19天)或吲哚(吲哚美辛3毫克/千克，10天內(nèi)每天口服)給予關(guān)節(jié)炎老鼠。以平均值土sem，按公克計(jì)來(lái)表現(xiàn)體重值。圖20是在第14和18天給予不同劑量的抗-NGF抗體E3 (0.003毫克/千克、0.03毫克/千克、0.3毫克/千克和5毫克/千克)之后，證實(shí)在關(guān)節(jié)炎大鼠(風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模式)中的感受傷害反應(yīng)的圖表。以平均值土sem，按mV計(jì)來(lái)表現(xiàn)發(fā)聲強(qiáng)度值。圖21是在第14和18天給予不同劑量的抗-NGF抗體E3 (0.03毫克/千克、0.3毫克/千克和5毫克/千克)之后，證實(shí)在關(guān)節(jié)炎大鼠(風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模式)中抗-NGF抗體E3對(duì)第14天的體重百分比(對(duì)第14天標(biāo)準(zhǔn)化)的影響的圖表。圖22是在第14和18天給予不同劑量的抗-NGF抗體E3 (0.03毫克/千克、0.3毫克/千克和5毫克/千克)之后，證實(shí)在關(guān)節(jié)炎大鼠(風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模式)中抗-NGF抗體E3對(duì)體重喪失的影響的圖表。將體重值對(duì)第O天標(biāo)準(zhǔn)化。圖23表示E3重鏈可變區(qū)氨基酸序列(圖23A)和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(圖23B)，使用連續(xù)編號(hào)Kabat編號(hào)和Chothia編號(hào)來(lái)編號(hào)。圖24表示在給予抗-NGF抗體E3之后，與在第O天的基準(zhǔn)線相比較，在平均每日疼痛強(qiáng)度上的改變。Y軸代表與在第O天的平均每日疼痛強(qiáng)度相比較，在平均每日疼痛強(qiáng)度(VAS分?jǐn)?shù))上的降低。X軸代表在給予抗-NGF抗體E3之后的天數(shù)。

圖25表示在給予抗-NGF抗體E3之后的平均VAS分?jǐn)?shù)。"SE"意指標(biāo)準(zhǔn)差。圖26表示在給予抗-NGF抗體E3之后從第2到第14天，和從第2到第28天，在總計(jì)疼痛強(qiáng)度差異(SPID)上的最大降低百分比。圖27表示在給予不同劑量(3微克/千克、10微克/千克、30微克/千克、100微克/千克和300微克/千克)的抗-NGF抗體E3之后從第I到第28天，對(duì)WOMAC的最小二乘方平均值(LSM)反應(yīng)、疼痛次量表(subscale)、物理功能次量表和僵硬次量表。"SE"意指標(biāo)準(zhǔn)差。X軸代表所給予的抗-NGF抗體E3的劑量。"*"表示在Dunnett' s檢定之下，與基準(zhǔn)線相比較P < 0.05。
具體實(shí)施例方式在本文中公開(kāi)的本發(fā)明，提供抗-NGF拮抗劑抗體，其以高親和性與NGF (如人類(lèi)NGF)結(jié)合。本發(fā)明還提供衍生自與NGF結(jié)合的E3的抗體和多肽，以及制造和使用這些抗體的方法。在一些具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供人類(lèi)化抗體E3，其與神經(jīng)生長(zhǎng)因子("NGF")結(jié)合，以及制造和使用該抗體的方法。本發(fā)明也還提供與NGF結(jié)合的E3多肽(包括抗體)，以及編碼E3抗體及/或多肽的多核苷酸。在本文中公開(kāi)的本發(fā)明，也提供了利用給予在治療上有效的含量的抗-NGF拮抗劑抗體在個(gè)體中預(yù)防及/或治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛的方法。在本文中公開(kāi)的本發(fā)明，也提供了利用給予在治療上有效的含量的NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)在個(gè)體中預(yù)防及/或治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛的方法。
本發(fā)明還提供調(diào)整抗體的親和性的方法，以及表征CDR區(qū)的特征的方法。通用技術(shù)除非另行指定，本發(fā)明的實(shí)施將使用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生化和免疫學(xué)的傳統(tǒng)技術(shù)，這些均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所擅長(zhǎng)的。在文獻(xiàn)中充分說(shuō)明了這類(lèi)技術(shù)，如 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版(Sambrook等人，1989) Cold Spring Harbor Press ；01igonucleotide Synthesis (M.J.Gait，編輯，1984) ；Methods in Molecular Biology, Humana Press ；Cell Biology:A LaboratoryNotebook (J.E.Cellis 編輯，1998) Academic Press ；Animal Cell Culture (R.1.Freshney編輯，1987) ；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P.Mather 和 P.E.Roberts，
1998)PlenumPress ；Cell and Tissue Culture !Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,和 D.G.Newell,編輯，1993-1998) J.Wiley 和 Sons ;Methods inEnzymology(Academic Press，Inc.) ；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和 C.C.Blackwell 編輯)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M.Miller和 M.P.Calos 編輯，1987) ；Current Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel等人，編輯，1987) ；PCR:The Polymerase Chain Reaction，(Mullis 等人，編輯，1994)；Current Protocols in Immunology (J.E.Coligan 等人，編輯，1991) ；Short Protocolsin Molecular Biology (Wiley and Sons，1999) ； Immunobiology(C.A.Janeway andP.Travers,1997) ；Antibodies(P.Finch,1997) ；Antibodies:a practical approach (D.Catty 編輯，IRL Press，1988-1989) ；Monoclonal antibodies:a practical approach (P.Shepherd 和 C.Dean 編輯，Oxford University Press, 2000) ；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow 和 D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，
1999)；The Antibodies (M.Zanetti 和 J.D.Capra 編輯，Harwood Academic Publishers,1995);以及 Cancer !Principles and Practice of Oncology (V.T.DeVita 等人，編輯，J.B.Lippincott Company,1993)。定 義"抗體"是能夠經(jīng)由至少一個(gè)位于免疫球蛋白分子的可變區(qū)的抗原認(rèn)知位置，與標(biāo)靶(如碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等等)特異性結(jié)合的免疫球蛋白分子。當(dāng)在本文中使用時(shí)，該名詞不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，還包括其片段(如Fab、Fab'、F(ab^ )2、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、包括抗體部分的融合蛋白，以及包括抗原認(rèn)知位置的免疫球蛋白分子的任何其他修改組態(tài)?？贵w包括任何種類(lèi)的抗體，如IgG、IgA或IgM(或其亞類(lèi))，且抗體不一定是任何特殊的種類(lèi)。依據(jù)抗體重鏈的恒定功能部位的氨基酸序列，可將免疫球蛋白分成不同的種類(lèi)。有五大類(lèi)的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，而這些有可能進(jìn)一步細(xì)分成亞類(lèi)(同型物)，例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。分別將與不同種類(lèi)免疫球蛋白相符合的重鏈恒定功能部位稱(chēng)為α、δ、ε、Y和μ。已完全明了不同種類(lèi)的免疫球蛋白的次單元結(jié)構(gòu)和三維組態(tài)。" Fv"是含有完整抗原-認(rèn)知和-結(jié)合位置的抗體片段。在雙鏈Fv物種中，該區(qū)域是由以緊密、非共價(jià)結(jié)合的一重鏈和一輕鏈可變功能部位的二聚體組成。在單鏈Fv物種中，可借著有彈性的肽交聯(lián)劑，共價(jià)連接一重鏈和一輕鏈可變功能部位，使得該輕鏈和重鏈可以類(lèi)似在雙鏈Fv物種中的二聚體結(jié)構(gòu)來(lái)結(jié)合。在該組態(tài)中，每個(gè)可變功能部位的三個(gè)⑶Rs交互作用，將抗原-結(jié)合特異性限定在VH-VL 二聚體的表面上。然而，甚至單一的可變功能部位(或半個(gè)Fv，僅包括對(duì)抗原特異的3個(gè)CDRs)也具有認(rèn)出抗原并與其結(jié)合的能力，雖然通常是以比完整結(jié)合位置更低的親和性。Fab片段也含有輕鏈的恒定功能部位和重鏈的第一個(gè)恒定功能部位(CHl)。FaY片段與Fab片段之差異在于在重鏈CHl功能部位的羧基終端加上數(shù)個(gè)殘基，包括一或多個(gè)得自抗體絞鏈區(qū)的半胱氨酸。"單克隆抗體"意指均一的抗體族群，其中該單克隆抗體是由涉及抗原的選擇性結(jié)合的氨基酸(天然存在或非天然存在的)所組成。單克隆抗體的族群針對(duì)單一的抗原性位置是高度特異性的。"單克隆抗體"一詞不僅包括完整的單克隆抗體和全長(zhǎng)的單克隆抗體，還包括其片段(如Fab、Fabi ,F(ab/ )2、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、包括抗體部分的融合蛋白，以及包括與抗原結(jié)合的特異性和能力所需的抗原認(rèn)知位置的免疫球蛋白分子的任何其他修改組態(tài)。本發(fā)明并非企圖限制關(guān)于抗體的來(lái)源或其制造方式(例如借著融合瘤、嗤囷體選擇、重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等等)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"人類(lèi)抗體"意指抗體具有與由人類(lèi)產(chǎn)生，及/或已經(jīng)使用現(xiàn)有技術(shù)中已知或在本文中公開(kāi)的制造人類(lèi)抗體的任何技術(shù)制造的抗體一致的氨基酸序列。人類(lèi)抗體的定義，包括由至少一個(gè)人類(lèi)重鏈多肽或至少一個(gè)人類(lèi)輕鏈多肽所組成的抗體。這類(lèi)實(shí)例之一，是包括老鼠輕鏈和人類(lèi)重鏈多肽的抗體?？墒褂矛F(xiàn)有技術(shù)中已知的各種技術(shù)產(chǎn)生人類(lèi)抗體。在一具體實(shí)施例中，人類(lèi)抗體選自表達(dá)人類(lèi)抗體的噬菌體庫(kù)(Vaughan等人，1996, Nature Biotechnology, 14:309-314 ；Sheets 等人，1998, PNAS, (USA)95:6157-6162 ;Hoogenboom 和 Winter, 1991, J.Mol.Biol.，227:381 ；Marks 等人，1991，J.Mol.Biol.,222:581)。也可利用將人類(lèi)免疫球蛋白位點(diǎn)導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如其中已經(jīng)使內(nèi)源免疫球蛋白基因部分或全部失活的老鼠中，來(lái)制造人類(lèi)抗體。在美國(guó)專(zhuān)利第5，545，807號(hào)；5，545，806 號(hào)；5，569，825 號(hào)；5，625，126 號(hào)；5，633，425 號(hào)和 5，661，016 號(hào)中公開(kāi)了該方法?；蛘?，可借著永存不死的人類(lèi)B淋巴細(xì)胞來(lái)制備人類(lèi)抗體，其產(chǎn)生針對(duì)標(biāo)靶抗原的抗體(可從個(gè)體中回收這類(lèi)B淋巴細(xì)胞，或可以是已經(jīng)在活體外免疫的)。參見(jiàn)，例如Cole等人，Monoclonal Anti bodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss,第 77 頁(yè)(1985) ；Boemer等人，1991，J.1mmunol.,147(1):86_95 ;以及美國(guó)專(zhuān)利第 5，750，373 號(hào)。"嵌合型抗體"意指其中每個(gè)重和輕鏈的氨基酸序列的一部分均是與在衍生自特定物種的抗體中的相對(duì)應(yīng)序列同源的，或?qū)儆谔囟ǚN類(lèi)，而鏈的剩余斷片是與在其他物種中的相對(duì)應(yīng)序列同源的那些抗體。在這些嵌合型抗體中，輕鏈和重鏈兩者的可變區(qū)通常模仿衍生自一哺乳動(dòng)物物種的抗體的可變區(qū)，而恒定部分則是與抗體中衍生自另一物種的序列同源的。這類(lèi)嵌合形式的一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)是，例如可使用迅速可用的融合瘤或得自非人類(lèi)宿主生物的B細(xì)胞，從目前已知的來(lái)源便利地衍生可變區(qū)，并與衍生自例如人類(lèi)細(xì)胞制備物的恒定區(qū)混合。雖然可變區(qū)具有容易制備的優(yōu)點(diǎn)，但特異性并不受其來(lái)源影響，恒定區(qū)則是人類(lèi)，比得自非人類(lèi)來(lái)源的恒定區(qū)，更不可能在注射該抗體時(shí)從人類(lèi)個(gè)體中誘發(fā)免疫反應(yīng)。然而，該定義并未受限于該特殊實(shí)例。"有功能的Fe區(qū)"具有固有序列Fe區(qū)的至少一種效應(yīng)物功能。代表性的"效應(yīng)物功能"包括Clq結(jié)合；補(bǔ)體-依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC) ；Fc受體結(jié)合；抗體-依賴(lài)性細(xì)胞-調(diào)解的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體；BCR)的下調(diào)(down-regulate)等等。這類(lèi)效應(yīng)物功能通常需要將與結(jié)合功能部位(例如抗體可變功能部位)結(jié)合的Fe區(qū)，并可使用現(xiàn)有技術(shù)中已知用來(lái)評(píng)估這類(lèi)抗體效應(yīng)物功能的各種測(cè)定來(lái)對(duì)其評(píng)估。"固有序列Fe區(qū)"包括與自然發(fā)現(xiàn)的Fe區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。"變種Fe區(qū)"包括與固有序列Fe區(qū)之差異為至少一個(gè)氨基酸修改，但仍保留固有序列Fe區(qū)的至少一個(gè)效應(yīng)物功能的氨基酸序列。變種Fe區(qū)與固有序列Fe區(qū)或與雙親多肽的Fe區(qū)相比較，最好具有至少一個(gè)氨基酸取代，例如從大約I到大約10個(gè)氨基酸取代，且最好是在固有序列Fe區(qū)或在雙親多肽的Fe區(qū)中，具有從大約I到大約5個(gè)氨基酸取代。在本文中，變種Fe區(qū)最好與固有序列Fe區(qū)及/或雙親多肽的Fe區(qū)，將具有至少大約80%序列同一性，且與其最好有至少大約90%序列同一性，更佳的是與其有至少大約95%序列同一性。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"抗體-依賴(lài)性細(xì)胞-調(diào)解的細(xì)胞毒性"和"ADCC"意指細(xì)胞-調(diào)解的反應(yīng)，其中表達(dá)Fe受體(FcRs)(例如自然殺手(NK)細(xì)胞、嗜中性白血球和巨噬細(xì)胞)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別在標(biāo)靶細(xì)胞上已結(jié)合的抗體，隨后引起標(biāo)靶細(xì)胞的溶解?？墒褂没铙w外的ADCC測(cè)定，如在美國(guó)專(zhuān)利第5，500, 362號(hào)或5，821，337號(hào)中描述的，評(píng)估感興趣分子的ADCC活性。適用于這類(lèi)測(cè)定的效應(yīng)物細(xì)胞包括周?chē)簡(jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)和NK細(xì)胞。或者，或另外也可在活體內(nèi)評(píng)估感興趣分子的ADCC活性，例如在動(dòng)物模式中，如在 Clynes 等人，1998，PNAS(USA)，95:652_656 中公開(kāi)的。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"Fe受體"和"FcR"描述與抗體的Fe區(qū)結(jié)合的受體。較佳的FcR是固有序列人類(lèi)FcR。此外，較佳的FcR是與IgG抗體結(jié)合的FcR( Y受體)，并包括FcyR KFcyR II和Fe Y RIII亞類(lèi)的受體，包括對(duì)偶基因變體，以及這些受體的其它接合形式。FcyR II受體包括Fe yR IIA("激活受體")和Fe Y RII B("抑制受體")，其具有類(lèi)似的氨基酸序列，主要的差異為其細(xì)胞質(zhì)功能部位。在Ravetch和Kinet, 1991, Ann.Rev.1mmunol.，9:457_92 ；Capel 等人，1994, Immunomethods, 4:25_34 ；以及 de Haas 等人，1995，J.Lab.Clin.Med. ，126:330_41 中回顧了 FcRs。" FcR"也包括新生兒受體FcRn，其負(fù)責(zé)將成熟IgGs運(yùn)送至胎兒(Guyer等人，1976, J.1mmunol.，117:587 ；以及Kim等人，1994,J.Tmmunol.,24:249)。"補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性"和"CDC"意指在補(bǔ)體存在下的標(biāo)靶溶解。利用補(bǔ)體系統(tǒng)的第一個(gè)補(bǔ)體(Clq)與已與關(guān)聯(lián)抗原復(fù)合的分子(例如抗體)結(jié)合，發(fā)動(dòng)補(bǔ)體激活路徑。欲評(píng)估補(bǔ)體激活作用，可進(jìn)行⑶C測(cè)定,例如像是在Gazzano-Santoro等人，J.1mmunol.Methods, 202: 163 (1996)中的描述。當(dāng)在本文中使用時(shí)，可互換使用的名詞"E3"、" 3E"和"抗體E3"，意指包括分別在圖1A(SEQ ID N0:1)和1B(SEQ ID NO:2)中示出的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的抗體。在圖1A和IB中，以圖解描述抗體E3的⑶R部分(包括Chothia和Kabat⑶Rs)。圖2和3分別顯示編碼重和輕鏈的多核苷酸，包括分別在圖1A和IB中示出的重和輕鏈可變區(qū)。在實(shí)例中說(shuō)明E3的產(chǎn)生及特征。與E3有關(guān)的不同生物功能，包括但不限于與NGF結(jié)合并抑制NGF生物活性及/或由NGF發(fā)送信號(hào)來(lái)調(diào)解之下游路徑(們)的能力；以及抑制老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的NGF-依賴(lài)性存活的能力。如同在本文中討論的，本發(fā)明的抗體可具有這些特征之一或多項(xiàng)。在一些具體實(shí)施例中，"E3" —詞意指由(a)編碼具有ATCC第PTA-4893號(hào)或ATCC第PTA-4894號(hào)保藏編號(hào)的E3輕鏈的多核苷酸，以及(b)編碼具有ATCC第PTA-4895號(hào)保藏編號(hào)的E3重鏈的多核苷酸編碼的免疫球蛋白。當(dāng)在本文中使用時(shí)，抗體的"免疫特異性"結(jié)合意指抗原特異性的結(jié)合交互作用發(fā)生在抗體的抗原結(jié)合位置與由該抗體認(rèn)出的特定抗原之間(即該抗體在ELISA或其他免疫測(cè)定中與該蛋白質(zhì)反應(yīng)，但與無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)沒(méi)有可檢測(cè)到的反應(yīng))。一個(gè)抗原決定位與抗體或多肽"特異性地結(jié)合"或"優(yōu)先結(jié)合"(在本文中可互換使用)，是現(xiàn)有技術(shù)中已熟知的字眼，且判定這類(lèi)特異性或優(yōu)先結(jié)合的方法也是現(xiàn)有技術(shù)中已熟知的。若一分子以比它與其它細(xì)胞或物質(zhì)更頻繁、更迅速，并以更長(zhǎng)的期間及/或更高的親和性與一特定細(xì)胞或物質(zhì)反應(yīng)或結(jié)合，便說(shuō)該分子表現(xiàn)出"特異性地結(jié)合"或"優(yōu)先結(jié)合"。若一抗體以比它與其他物質(zhì)更高的親和性、抗體親抗原性，更迅速及/或以更長(zhǎng)的期間結(jié)合，便說(shuō)該抗體與標(biāo)靶"特異性地結(jié)合"或"優(yōu)先結(jié)合"。例如，與NGF抗原決定位特異性地或優(yōu)先結(jié)合的抗體，是以比它與其他NGF抗原決定位或非NGF抗原決定位更高的親和性、抗體親抗原性，更迅速及/或以更長(zhǎng)的期間與該抗原決定位結(jié)合的抗體。借著閱讀該定義也明了，例如與第一個(gè)標(biāo)靶特異性地或優(yōu)先結(jié)合的抗體(或部分或抗原決定位)，可能是或可能不是特異性地或優(yōu)先與第二個(gè)標(biāo)靶結(jié)合。"特異性地結(jié)合"或"優(yōu)先結(jié)合"不一定需要(雖然它可能包括)獨(dú)占的結(jié)合。通常，但不一定，在提到結(jié)合時(shí)意指優(yōu)先結(jié)合。名詞"多肽"、"低聚肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，意指任何長(zhǎng)度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直線或分支的，其可包括經(jīng)過(guò)修改的氨基酸，且其可被非氨基酸中斷。該名詞也包括已經(jīng)以天然方式或通過(guò)干涉方式修改的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化作用、脂化作用、乙?；饔谩⒘姿峄饔没蛉魏纹渌牟僮骰蛐薷?，如與標(biāo)記組份共軛。在該定義中，也包括例如含有一或多個(gè)氨基酸類(lèi)似物(包括例如非天然氨基酸)的多肽，以及在現(xiàn)有技術(shù)中已知的其他修改。因?yàn)楸景l(fā)明的多肽是以抗體為基礎(chǔ)，該多肽當(dāng)然可以單鏈或結(jié)合鏈的形式存在。"多核苷酸"或"核酸"在本文中可互換使用，意指任何長(zhǎng)度的核苷酸的聚合物，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)修改的核苷酸或堿基，及/或其類(lèi)似物，或任何能夠由DNA或RNA聚合酶并入聚合物內(nèi)的物質(zhì)。多核苷酸可包括經(jīng)修改的核苷酸，如甲基化的核苷酸及其類(lèi)似物。若出現(xiàn)修改，可能在聚合物組裝之前或之后，給予對(duì)該核苷酸結(jié)構(gòu)的修改。可利用非核苷酸組份打斷核苷酸的序列。可在聚合作用之后進(jìn)一步修改多核苷酸，如與標(biāo)記組份共軛。其他類(lèi)型的修改包括，例如"加帽"、以類(lèi)似物取代一或多個(gè)天然存在的核苷酸、核苷酸間的取代，像是例如具有不帶電鍵合(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰氨酸、氨基甲酸酯等等)和帶電荷鍵合(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等等)的那些，含有垂懸部分的那些，像是例如蛋白質(zhì)(例如核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、Ply-L-離氨酸等等)，具有嵌入劑的那些(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等等)，含有螯合劑的那些(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等等)，含有烷化劑的那些，帶有修改鍵合的那些(例如α異頭核酸等等)，以及多核苷酸(們)的未修改形式。此外，任何經(jīng)常出現(xiàn)在糖中的羥基基團(tuán)，也可被例如膦酸鹽基團(tuán)、磷酸鹽基團(tuán)置換，以標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基保護(hù)，或激活，來(lái)制備與其他核苷酸的額外鍵合，或可與固體支撐物共軛。可將5'和3'終端OH磷酸化，或以胺或I至20個(gè)碳原子的有機(jī)加帽基團(tuán)部分取代。也可將其他的羥基衍生成標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基。多核苷酸也可含有核糖或去氧核糖糖的類(lèi)似形式，通常是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，包括例如2' H3-甲基、1 -O-烯丙基、2'-氟-或2' _疊氮-核糖、碳環(huán)糖類(lèi)似物、ct -異頭糖類(lèi)、表異構(gòu)糖類(lèi)，如阿拉伯糖、木糖或來(lái)蘇糖、批喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非環(huán)化類(lèi)似物和非堿基核苷類(lèi)似物，如甲基核糖苷?？衫闷渌B接基來(lái)取代一或多個(gè)磷酸二酯鍵合。這些其它連接基包括，但不限于其中以p(0)s("硫代酯")、P(S)S(" 二硫代酯")、(o)nr2("酰胺化物")> P(O)R, P(O)OR1、⑶或CH2("甲縮醛(formacetal)")置換磷酸鹽的具體實(shí)施例，其中每個(gè)R或!^分別為H或經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基(1-20C)，其可視需要含有(-0-)鍵合、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基。在多核苷酸中并非全部的鍵合都要是相同的。先前的說(shuō)明適用于所有在本文中提及的多核苷酸，包括RNA和DNA。抗體的"可變區(qū)"意指單獨(dú)或混合的抗體輕鏈的可變區(qū)或抗體重鏈的可變區(qū)。重和輕鏈的可變區(qū)分別由四個(gè)框架區(qū)(FR)所組成，由三個(gè)也稱(chēng)為高變區(qū)的互補(bǔ)性決定區(qū)(⑶Rs)連接。在每個(gè)鏈中的⑶Rs都由緊鄰的FRs維持在一起，并與來(lái)自其他鏈的⑶Rs形成抗體的抗原結(jié)合位置。至少有兩種判定CDRs的技術(shù):(I)以交叉-物種序列變異性為基石出的方法(BP Kabat 等人 Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第 5版，1991, National Institutes of Health, Bethesda MD));以及(2)以抗原-抗體復(fù)合物的結(jié)晶學(xué)研究為基礎(chǔ)的方法(Chothia等人(1989)Nature 342:877 ;Al_lazikani等人(1997) J.Molec.Biol.273:927-948))。當(dāng)在本文中使用時(shí)，CDR可以意指以任一方法或兩種方法的組合定義的⑶Rs?？贵w的"恒定區(qū)"意指單獨(dú)或混合的抗體輕鏈的恒定區(qū)或抗體重鏈的恒定區(qū)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"神經(jīng)生長(zhǎng)因子"和"NGF"意指神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其保留至少一部分NGF的生物活性的變體。當(dāng)在本文中使用時(shí)，NGF包括所有哺乳動(dòng)物物種的固有序列NGF，包括人類(lèi)、狗、貓、馬或牛。

" NGF受體"意指與NGF結(jié)合或被NGF激活的多肽。NGF受體包括任何哺乳動(dòng)物物種的TrkA受體和p75受體，包括但不限于人類(lèi)、狗、貓、馬、靈長(zhǎng)類(lèi)或牛。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"抗-N G F拮抗劑抗體"(也可稱(chēng)為"抗-NGF抗體")意指能夠與NGF結(jié)合，并抑制NGF的生物活性及/或借由NGF發(fā)送信號(hào)調(diào)解的下游路徑(們)的抗體?？?NGF拮抗劑抗體包括阻斷、拮抗、壓抑或降低(包括明顯地)NGF生物活性的抗體，包括借由NGF發(fā)送信號(hào)調(diào)解的下游路徑,如受體結(jié)合及/或誘發(fā)對(duì)NGF的細(xì)胞反應(yīng)。為了本發(fā)明的目的，要明確地理解名詞"抗-NGF拮抗劑抗體"包括所有先前確認(rèn)的名詞、標(biāo)題，以及功能狀態(tài)和特征，其中以任何有意義的程度，使NGF本身、NGF生物活性(包括但不限于其調(diào)解任何方面的手術(shù)后疼痛的能力)或生物活性的結(jié)果無(wú)效、減少或中和。在一些具體實(shí)施例中，抗-NGF拮抗劑抗體與NGF結(jié)合并預(yù)防NGF 二聚作用及/或與NGF受體(如p75及/或trkA)結(jié)合。在其他的具體實(shí)施例中，抗-NGF抗體與NGF結(jié)合,并預(yù)防trkA受體二聚作用及/或trkA自我磷酸化作用。在本文中提供抗-NGF拮抗劑抗體的實(shí)例。NGF的"生物活性"通常意指與NGF受體結(jié)合及/或激活NGF受體發(fā)送信號(hào)路徑的能力。生物活性包括，但不限于下列之一或多項(xiàng):與NGF受體(如p75及/或trkA)結(jié)合的能力；提高trkA受體二聚作用及/或自我磷酸化作用的能力；激活NGF受體發(fā)送信號(hào)路徑的能力；在細(xì)胞生理學(xué)上促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖、存活、生長(zhǎng)及其他變化的能力，包括(在神經(jīng)元的案例中，包括周?chē)椭袠猩窠?jīng)元)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)上的變化、突觸生成(synaptogenesis)、突觸功能、在創(chuàng)傷之后的神經(jīng)遞質(zhì)及/或神經(jīng)肽釋放和再生；促進(jìn)老鼠E13.5三叉神經(jīng)元存活的能力；以及調(diào)解疼痛，包括手術(shù)后疼痛的能力。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"實(shí)質(zhì)上純的"意指一物質(zhì)是至少50%純的(即不含污染物)，更優(yōu)選的是至少90%純的，更優(yōu)選的是至少95%純的，更優(yōu)選的是至少98%純的，更優(yōu)選的是至少99%純的。"宿主細(xì)胞"包括個(gè)別的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，其可以是或已經(jīng)是并入多核苷酸插入物的載體的接受者。宿主細(xì)胞包括單一宿主細(xì)胞的子代，且該子代可能因?yàn)樘烊?、偶然或故意的突變作用，與原始的雙親細(xì)胞不一定是完全相同的(在形態(tài)學(xué)或在基因組DNA補(bǔ)體上)。宿主細(xì)胞包括在活體外以本發(fā)明的多核苷酸(們)轉(zhuǎn)移感染的細(xì)胞。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"治療"是獲得有利或想要的臨床結(jié)果的方法。為了本發(fā)明，有利或想要的臨床結(jié)果包括，但不限于下列之一或多項(xiàng):改善或減輕任何方面的疼痛，包括急性、慢性、炎癥性、神經(jīng)病變、手術(shù)后的疼痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛或骨關(guān)節(jié)炎疼痛。為了本發(fā)明，有利或想要的臨床結(jié)果包括，但不限于下列之一或多項(xiàng):減輕嚴(yán)重性，緩和一或多個(gè)與疼痛有關(guān)的癥狀，包括任何方面的疼痛(如縮短疼痛期間、降低疼痛的嚴(yán)重性或感覺(jué))。藥物、化合物或醫(yī)藥組合物的"有效含量"是足以達(dá)成有利或想要的結(jié)果，包括臨床結(jié)果，如減輕 或降低疼痛感覺(jué)的量?？梢砸换蚨啻瓮端?，來(lái)給予有效含量。為了本發(fā)明，有效含量的藥物、化合物或醫(yī)藥組合物是足以治療、改善、降低強(qiáng)度并/或預(yù)防疼痛的量，包括手術(shù)后疼痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛及/或骨關(guān)節(jié)炎疼痛。在一些具體實(shí)施例中，"有效含量"可降低疼痛至靜止(靜止疼痛)或以機(jī)械方式誘導(dǎo)的疼痛(包括在移動(dòng)之后的疼痛)，或兩者，并可在切入、割傷、撕裂或受傷之前、期間或之后，及/或在疼痛刺激之前、期間或之后給藥。就像在臨床狀況中所了解的，藥物、化合物或醫(yī)藥組合物的有效含量，可單獨(dú)達(dá)到，或可并用其他的藥物、化合物或醫(yī)藥組合物一起達(dá)到。因此，可從給予一或多種治療劑的情況來(lái)考量"有效含量"，若與一或多個(gè)其他制劑并用，可能或達(dá)到想要的結(jié)果，便可認(rèn)為以有效含量給予該單一制劑。疼痛的"降低發(fā)生率"意指任何的降低嚴(yán)重性(其可包括減少對(duì)于該狀況經(jīng)常使用的其他藥物及/或療法的需要，及/或減少(例如接觸)用量，包括例如鴉片制劑)、期間，及/或頻率(包括，例如，在個(gè)體中延遲或增加到出現(xiàn)手術(shù)后疼痛的時(shí)間)。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解個(gè)體可能隨著對(duì)治療的反應(yīng)而有所不同，因此，例如"在個(gè)體中降低風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛或骨關(guān)節(jié)炎疼痛的發(fā)生率的方法"，表示以合理的期待為基礎(chǔ)給予抗-NGF拮抗劑抗體，使得這類(lèi)投藥可能得以在特殊個(gè)體中引起這類(lèi)的發(fā)生率降低。"改善"疼痛或一或多個(gè)疼痛的癥狀(如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛或骨關(guān)節(jié)炎疼痛)，意指與未給予抗-NGF拮抗劑抗體相比較,減少或改善一或多個(gè)疼痛的癥狀。"改善"也包括縮短或減少癥狀的期間。"減輕"疼痛或一或多個(gè)疼痛的癥狀(如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛或骨關(guān)節(jié)炎疼痛)，意指在以根據(jù)本發(fā)明的抗-NGF拮抗劑抗體治療的個(gè)體或個(gè)體族群中，減少一或多個(gè)手術(shù)后疼痛的不受歡迎的臨床征候的程度。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"延遲"疼痛的發(fā)展意指延緩、阻止、減慢、妨礙、使穩(wěn)定及/或延后疼痛的進(jìn)行，如手術(shù)后疼痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛或骨關(guān)節(jié)炎疼痛。該延遲可以是不同長(zhǎng)度的時(shí)間，視待治療的疾病及/或個(gè)體的病史而定。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然充分或重大的延遲，事實(shí)上可包含預(yù)防，在這一點(diǎn)上該個(gè)體不發(fā)展出疼痛。"延遲"癥狀發(fā)展的方法就是在與不使用該方法相比較時(shí)，在特定的時(shí)間框架中降低發(fā)展出癥狀的可能性，及/或在特定的時(shí)間框架中降低癥狀之程度的方法。這類(lèi)比較通常是以臨床研究為基礎(chǔ)，使用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)目的實(shí)驗(yàn)者。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"疼痛"意指任何病因?qū)W的疼痛，包括急性和慢性疼痛，以及任何有炎癥組份的疼痛。疼痛的實(shí)例包括手術(shù)后疼痛、操作后疼痛(包括牙齒痛)、偏頭痛、頭痛和三叉神經(jīng)痛、與燒傷、創(chuàng)傷或腎結(jié)石有關(guān)的疼痛、與外傷(包括頭部外傷)有關(guān)的疼痛、神經(jīng)病變的疼痛、與肌肉-骨胳病癥有關(guān)的疼痛，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、脊椎僵直性脊椎炎、血清-陰性(非風(fēng)濕性)關(guān)節(jié)病、非關(guān)節(jié)性風(fēng)濕病和關(guān)節(jié)周?chē)“Y，以及與癌癥有關(guān)的疼痛(包括"突破疼痛"和與癌癥末期有關(guān)的疼痛)、周?chē)窠?jīng)病變和帶狀皰疹后神經(jīng)痛。有炎癥組份的疼痛的實(shí)例(除了上述的那些)，包括風(fēng)濕性疼痛、與粘膜炎有關(guān)的疼痛和經(jīng)痛。"手術(shù)后疼痛"(可互換地稱(chēng)為"切入后"或"受傷后疼痛")意指起因于外傷的疼痛，如個(gè)體組織的割傷、穿刺傷、切入、撕裂或受傷(包括起因于所有手術(shù)程序的那些，無(wú)論是侵入性或非侵入性的)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，手術(shù)后疼痛不包括沒(méi)有外在物理創(chuàng)傷而發(fā)生(出現(xiàn)或發(fā)作)的疼痛。在一些具體實(shí)施例中，手術(shù)后疼痛是內(nèi)在或外在(包括周?chē)?的疼痛，并可能偶爾(有外傷)或故意(有手術(shù)切開(kāi))發(fā)生受傷、割傷、外傷、撕裂或切口。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"疼痛"包括感受傷害和感覺(jué)疼痛，可使用疼痛計(jì)分和現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法，主觀和客觀地評(píng)估疼痛。手術(shù)后疼痛，當(dāng)在本文中使用時(shí)，包括異常性疼痛(即增加對(duì)正常無(wú)害刺激的反應(yīng))和痛覺(jué)過(guò)敏(即增加對(duì)正常有害或討厭刺激的反應(yīng))，其實(shí)際上可依 次為熱或機(jī)械(觸覺(jué))的。在一些具體實(shí)施例中，通過(guò)熱敏感性、機(jī)械敏感性及/或靜止疼痛來(lái)表征疼痛的特征。在一些具體實(shí)施例中，手術(shù)后疼痛包括以機(jī)械方式引起的疼痛或靜止疼痛。在其他的具體實(shí)施例中，手術(shù)后疼痛包括靜止疼痛。該疼痛為主要或次要疼痛，如同現(xiàn)有技術(shù)中已熟知的。"生物試樣"包括各種獲自個(gè)體的試樣類(lèi)型，并可用在診斷或監(jiān)視測(cè)定中。該定義包括血液及其他生物來(lái)源的液體試樣，固體組織試樣,如生檢樣本或從其衍生而來(lái)的組織培養(yǎng)物或細(xì)胞，及其子代。該定義也包括已經(jīng)在其采樣之后以任何方式處理過(guò)的試樣，如利用試劑處理、促溶、增強(qiáng)某些組份，如蛋白質(zhì)或多核苷酸，或?yàn)榱饲衅袢氚牍腆w或固體基質(zhì)內(nèi)。"生物試樣"一詞包括臨床試樣,也包括培養(yǎng)中的細(xì)胞、細(xì)胞上清液、細(xì)胞溶胞產(chǎn)物、血清、血漿、生物液體和組織試樣。"個(gè)體"是脊椎動(dòng)物，最好是哺乳動(dòng)物，更佳的是人類(lèi)。哺乳動(dòng)物包括，但不限于農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物(如牛)、競(jìng)賽動(dòng)物、寵物(如貓、狗和馬)、靈長(zhǎng)類(lèi)、老鼠和大鼠。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"載體"意指構(gòu)筑體，其能夠輸送，且最好能在宿主細(xì)胞中表達(dá)一或多個(gè)感興趣的基因(們)或序列(們)。載體的實(shí)例包括但不限于病毒載體、裸露的DNA或RNA表達(dá)載體、質(zhì)體、粘接質(zhì)體或噬菌體載體、與陽(yáng)離子凝聚劑結(jié)合的DNA或RNA表達(dá)載體、包膠于脂質(zhì)體中的DNA或RNA表達(dá)載體，以及某些真核生物細(xì)胞，如生產(chǎn)者細(xì)胞。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"表達(dá)控制序列"意指指揮核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列。表達(dá)控制序列可以是啟動(dòng)基因，如組成或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)基因，或促進(jìn)子。表達(dá)控制序列以可操作的方式與待轉(zhuǎn)錄的核酸序列連接。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"在藥學(xué)上可接受的載劑"包括任何物質(zhì)，當(dāng)將其與活性成分混合時(shí)，容許該成分保留生物活性，且不與該個(gè)體的免疫系統(tǒng)起反應(yīng)。實(shí)例包括，但不限于任何標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)載劑，如磷酸緩沖鹽水溶液、水、乳劑，如油/水乳劑，以及各種形式的濕潤(rùn)劑。適合氣溶膠或非經(jīng)腸投藥的較佳稀釋劑是磷酸緩沖鹽水或生理(0.9%)鹽水。利用已熟知的傳統(tǒng)方法,來(lái)調(diào)配包括這類(lèi)載劑的組合物(參見(jiàn),例如Remington' sPharmaceutical Sciences,第 18 版，A.Gennaro 編輯，Mack Publishing C0., Easton, PA,1990 ;以及Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing,2000)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"Ktjff"企圖意指抗體從抗體/抗原復(fù)合物中解離的關(guān)閉速率常數(shù)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，"K/企圖意指抗體-抗原交互作用的解離常數(shù)?？贵wE3、E3-衍生抗體、組合物和使用方法E3組合物、E3衍生的組合物，以及制造組合物的方法本發(fā)明包括組合物，含有由E3抗體或多肽組成的醫(yī)藥組合物；以及由編碼E3抗體或多肽的序列組成的多核苷酸。當(dāng)在本文中使用時(shí)，組合物包括一或多個(gè)與NGF結(jié)合的抗體或多肽(可以是或可以不是抗體)，及/或一或多個(gè)多核苷酸，包括編碼一或多個(gè)與NGF結(jié)合的抗體或多肽的序列。這些組合物可還包括適當(dāng)?shù)馁x形劑，如在藥學(xué)上可接受的賦形齊U，包括緩沖溶液，其 為現(xiàn)有技術(shù)中已熟知的。本發(fā)明也包括經(jīng)過(guò)分離的抗體、多肽和多核苷酸具體實(shí)施例。本發(fā)明也包括實(shí)質(zhì)上純的抗體、多肽和多核苷酸具體實(shí)施例。本發(fā)明的抗體和多肽可具有任何(一或多項(xiàng))下列的特征:(a)與NGF結(jié)合的能力；(b)降低及/或抑制NGF生物活性及/或由NGF發(fā)送信號(hào)調(diào)解的下游路徑(們)的能力；(c)降低及/或抑制老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的NGF-依賴(lài)性存活的能力；(d)缺少任何對(duì)NT3、NT4/5及/或BDNF明顯的交叉反應(yīng)性；(e)治療及/或預(yù)防疼痛(包括手術(shù)后疼痛)的能力；(f)增加NGF的清除的能力；(g)降低或抑制trkA受體的激活作用的能力，可使用例如激酶受體激活作用測(cè)定(KIRA)來(lái)檢測(cè)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第6，027，927號(hào))。在下文中概述抗體E3的結(jié)合特性，與雙親老鼠抗-NGF單克隆抗體911相比較，其以高親和性和慢解離動(dòng)力學(xué)與人類(lèi)NGF結(jié)合。E3以比雙親老鼠抗體911更高大約50倍的結(jié)合親和性與人類(lèi)NGF結(jié)合。
抗體kDKoffKon
911 (Fab)3.7ηΜθχΤο^Τ12.2xl04M_1s_1
E3 (Fab)0.07nM< 4x ΙΟ 6xl05M_1s_1E3抗體和相關(guān)抗體也顯示出強(qiáng)有力的拮抗人類(lèi)NGF的能力，可經(jīng)由在活體外的測(cè)定來(lái)評(píng)估(參見(jiàn)實(shí)例2和3)。例如，抗體E3在15pM人類(lèi)NGF的存在下以大約21pM的IC5(I，并在1.5pM人類(lèi)NGF的存在下以大約1.2pM的IC5tl拮抗老鼠E13三叉神經(jīng)元的NGF-依賴(lài)性存活。因此，另一方面，更進(jìn)一步確認(rèn)本發(fā)明的抗體和多肽具有下列特征:(h)以高親和性和低解離動(dòng)力學(xué)與人類(lèi)NGF結(jié)合(在一些具體實(shí)施例中，具有低于大約2nM的KD，及/或比大約δχΙ ΤΥ1更慢的kj，及/或⑴在大約15pM NGF (在一些具體實(shí)施例中，人類(lèi)NGF)下，以大約IOOpM或更低的IC5tl,并/或在大約1.5pM NGF下以大約20pM或更低的IC5tl，抑制(阻斷)老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的NGF依賴(lài)性存活的能力。在一些具體實(shí)施例中，該抗體與人類(lèi)NGF結(jié)合，但不與得自其他脊椎動(dòng)物物種(在一些具體實(shí)施例中為哺乳動(dòng)物)的NGF明顯地結(jié)合。在一些具體實(shí)施例中，該抗體與人類(lèi)NGF,以及一或多個(gè)得自其他哺乳動(dòng)物物種(在一些具體實(shí)施例中為哺乳動(dòng)物)的NGF結(jié)合。在另外的具體實(shí)施例中，該抗體與NGF結(jié)合，但不與其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(如相關(guān)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素，NT3、NT4/5及/或BDNF)產(chǎn)生明顯的交叉反應(yīng)。在一些具體實(shí)施例中，該抗體結(jié)合NGF,以及至少一個(gè)其他的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素。在一些具體實(shí)施例中，該抗體與哺乳動(dòng)物物種的NGF結(jié)合，如馬或狗，但不與得自其他哺乳動(dòng)物物種的NGF明顯地結(jié)合。在一些具體實(shí)施例中，本發(fā)明是包括由多核苷酸編碼的輕鏈的抗體，該多核苷酸是由具有ATCC第PTA-4893號(hào)或ATCC第PTA-4894號(hào)保藏編號(hào)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的。另一方面，本發(fā)明是包括由多核苷酸編碼的重鏈的抗體，該多核苷酸是由具有ATCC第PTA-4895號(hào)保藏編號(hào)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的。本發(fā)明也包括E3的各種調(diào)配物及等同的抗體片段(例如Fab> Fab;、F(ab' ) 2、Fv、Fe等等)、單鏈(ScFv)、其突變體、包括抗體部分的融合蛋白，以及E3的任何其他經(jīng)過(guò)修改的組態(tài)，其包括所需的特異性的抗原(NGF)認(rèn)知位置。E3的等同抗體，包括E3的抗體和多肽片段(其可以是或可以不是抗體)，以及借著上述的任何(一或多項(xiàng))基準(zhǔn)確認(rèn)并表征的包括E3的多肽片段的多肽。因此，本發(fā)明提供任何下列的，或包括任何下列的組合物(包含醫(yī)藥組合物):(a)抗體E3 ； (b)抗體E3的片段或區(qū)域；(c)如圖1B所示的抗體E3的輕鏈；(c)如圖1A所示的抗體E3的重鏈；(d)得自抗體E3的輕鏈及/或重鏈的一或多個(gè)可變區(qū)(們)；(e)在圖1A和IB中示出的抗體E3的一或多個(gè)CDR(S) (—、二、三、四、五或六個(gè)CDRs) ； (f)得自在圖1A中示出的抗體E3的重鏈的⑶R H3 ; (g)得自在圖1B中示出的抗體E3的輕鏈的⑶R L3 ；(h)得自在圖1B中示出的抗體E3的輕鏈的三個(gè)CDRs ;(i)得自在圖1A中示出的抗體E3的重鏈的三個(gè)⑶Rs ； (j)得自在圖1A和IB中示出的抗體E3的輕鏈的三個(gè)⑶Rs和重鏈的三個(gè)CDRs ;以及(k)包括(b)到(j)中任一個(gè)的抗體。從本文的說(shuō)明可以明了，顯然明確地排除由與老鼠單克隆抗體911的氨基酸序列相同的氨基酸序列所組成的多肽具體實(shí)施例。在圖1A和IB中，并在SEQ ID NO:9_14中示出了 Mab 911的衍生⑶R序列。在圖1A和IB中以圖解說(shuō)明抗體E3的⑶R部分(包括Chothia和Kabat⑶Rs)，并由下列的氨基酸序列組成:(a)重鏈CDR 1(" CDRHl " )GFSLIGYDLN(SEQ ID NO:3) ； (b)重鏈 CDR 2(" CDRH2" ) IIffGDGTTDYNSAVKS (SEQ ID NO:4) ； (c)重鏈 CDR 3(" CDR H3")GGYffYATSYYFDY (SEQ ID NO:5) ; (d)輕鏈 CDR 1(" CDR LI" ) RASQSISNNLN (SEQ ID NO:6) ； (e)輕鏈 CDR 2(" CDRL2" ) YTSRFHS(SEQ ID NO:7);和(f)輕鏈 CDR 3(" CDRL3")QQEHTLPYT(SEQ ID NO:8)。CDR區(qū)域的判定為本領(lǐng)域技術(shù)人員已熟知的。在一些具體實(shí)施例中，⑶Rs當(dāng)然可以是Kabat和Chothia⑶R的組合(也稱(chēng)為"組合的⑶Rs"或"衍生的⑶Rs")。在一些具體實(shí)施例中，⑶Rs包括Kabat⑶R。在另外的具體實(shí)施例中，⑶Rs為ChothiaCDRs。 在一些具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括至少一個(gè)⑶R的抗體，該⑶R實(shí)質(zhì)上是與E3的至少一個(gè)⑶R、至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)⑶Rs是同源的(或在一些具體實(shí)施例中，與E3的所有6個(gè)⑶Rs是同源的，或衍生自E3)。其他的具體實(shí)施例包括具有至少2、3、4、5或6個(gè)CDR(s)的抗體，該CDRs實(shí)質(zhì)上是與E3的至少2、3、4、5或6個(gè)CDRs是同源的，或衍生自E3。當(dāng)然為了本發(fā)明，通常保留了結(jié)合特異性及/或全部的活性(可從治療及/或預(yù)防疼痛或抑制E13.5老鼠三叉神經(jīng)元的NGF-依賴(lài)性存活的方面來(lái)看)，雖然與E3比較活性的程度可能有變化(可能更大或更小)。本發(fā)明也提供包括E3的氨基酸序列(在圖1A和IB中所示)的多肽(可以是或可以不是抗體)，其具有下列任一項(xiàng):E3序列的至少5個(gè)連續(xù)的氨基酸、至少8個(gè)連續(xù)的氨基酸、至少大約10個(gè)連續(xù)的氨基酸、至少大約15個(gè)連續(xù)的氨基酸、至少大約20個(gè)連續(xù)的氨基酸、至少大約25個(gè)連續(xù)的氨基酸、至少大約30個(gè)連續(xù)的氨基酸，其中至少3個(gè)氨基酸是得自E3的可變區(qū)，并了解明確地排除由與老鼠單克隆抗體911的氨基酸序列相同的氨基酸序列所組成的具體實(shí)施例。在圖1A和IB中，并在SEQ ID NO:9_14中示出了 Mab 911的衍生CDR序列。在一具體實(shí)施例中，該可變區(qū)得自E3的輕鏈。在另一具體實(shí)施例中，該可變區(qū)得自E3的重鏈。在其他的具體實(shí)施例中，5個(gè)(或更多個(gè))連續(xù)的氨基酸是得自在圖1A和IB中示出的E3的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。在另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括E3的氨基酸序列的多肽，其具有下列任一項(xiàng):E3序列的至少5個(gè)連續(xù)的氨基酸、至少8個(gè)連續(xù)的氨基酸、至少大約10個(gè)連續(xù)的氨基酸、至少大約15個(gè)連續(xù)的氨基酸、至少大約20個(gè)連續(xù)的氨基酸、至少大約25個(gè)連續(xù)的氨基酸、至少大約30個(gè)連續(xù)的氨基酸，其中該E3序列包括下列任一或多項(xiàng)=CDRHl的氨基酸殘基L29、CDRH2的I50、CDRH3的W101，及/或CDRH3的A103 ;及/或CDRLl的氨基酸殘基S28、CDRLl的N32、CDRL2的T51、CDRL3的91E，及/或CDRL3的H92，并了解明確地排除由與老鼠單克隆抗體911的氨基酸序列相同的氨基酸序列所組成的具體實(shí)施例。顯然在本公開(kāi)內(nèi)容中，使用連續(xù)的氨基酸編號(hào)體系來(lái)稱(chēng)呼可變區(qū)中的氨基酸殘基(即在每個(gè)可變區(qū)中的氨基酸殘基均按順序編號(hào))。如同現(xiàn)有技術(shù)中已熟知的，當(dāng)比較兩個(gè)抗體或多肽時(shí)，如E3抗體和E3變體(或懷疑其為E3變體的多肽)，可使用Kabat及/或Chothia編號(hào)系統(tǒng)。在現(xiàn) 有技術(shù)中，例如，若需要在E3和其他多肽之間進(jìn)行比較時(shí)，當(dāng)然知道如何將連續(xù)編號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)镃hothia及/或Kabat編號(hào)。圖23表示使用連續(xù)的Chothia和Kabat編號(hào)，將E3可變區(qū)編號(hào)。此外，為了便于比較，框架殘基通常，但并非總是，具有約略相同的殘基數(shù)目。然而，CDRs的大小可能有變化(即可能插入及/或刪除一或多個(gè)氨基酸殘基)。當(dāng)比較E3抗體和候選的E3變體(例如，在得自候選序列的CDR區(qū)比在與其比對(duì)的抗體E3中的序列更長(zhǎng)的案例中)，可能遵循下列的步驟(雖然在現(xiàn)有技術(shù)中已知其他的方法)。將候選抗體序列與E3抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)對(duì)齊?？捎檬只蚪柚娔X，使用普遍接受的電腦程序來(lái)進(jìn)行排列?？山柚褂脤?duì)大多數(shù)Fab序列而言常見(jiàn)的一些氨基酸殘基，使得排列更為容易。例如，輕鏈和重鏈通常都有兩個(gè)半胱氨酸，通常是在保留位置發(fā)現(xiàn)它們。當(dāng)然候選變體抗體的氨基酸序列可能是更長(zhǎng)(即有插入的氨基酸殘基)或更短的(有刪除的氨基酸殘基)?？蓪埢幪?hào)加上字尾，代表插入額外的殘基，例如殘基34abc。至于候選序列，例如將其與E3序列排成一直線，例如殘基33和35，但在它們之間沒(méi)有殘基與殘基35排在一起，簡(jiǎn)單地不指派該殘基35為一殘基。在其他的方法中，在比較不同長(zhǎng)度的CDRs時(shí)，通常已知可在結(jié)構(gòu)相等的(例如在抗原-抗體復(fù)合物中的相同位置)氨基酸之間進(jìn)行比較。例如Chothia編號(hào)(Al-Lazikani等人,在前)，通常(但并非在所有情況下)在結(jié)構(gòu)正確的位置安排插入和刪除。也可使用X-射線結(jié)晶學(xué)或雙突變環(huán)分析(參見(jiàn)Pons等人(1999)Prot.Sc1.8:958_968)來(lái)推論或證實(shí)結(jié)構(gòu)同等?？?NGF抗體對(duì)NGFQnhNGF)的結(jié)合親和性，可能是大約0.10至大約0.80nM、大約0.15至大約0.75nM，以及大約0.18至大約0.72nM。在一些具體實(shí)施例中，結(jié)合親和性是大約2pM、大約5pM、大約ΙΟρΜ、大約15pM、大約20pM、大約40pM或比大約40pM更高。在一具體實(shí)施例中，結(jié)合親和性是在大約2pM到22pM之間。在其他的具體實(shí)施例中，結(jié)合親和性是低于大約ΙΟηΜ、大約5nM、大約4nM、大約3.5nM、大約3nM、大約2.5nM、大約2nM、大約1.5nM、大約InM、大約900pM、大約800pM、大約700pM、大約600pM、大約500pM、大約400pM、大約300pM、大約200pM、大約150pM、大約ΙΟΟρΜ、大約90pM、大約80pM、大約70pM、大約60pM、大約50pM、大約40pM、大約30pM、大約ΙΟρΜ。在一些具體實(shí)施例中，結(jié)合親和性是大約ΙΟηΜ。在其他的具體實(shí)施例中，結(jié)合親和性是低于大約ΙΟηΜ。在其他的具體實(shí)施例中，結(jié)合親和性是大約0.1nM或大約0.07ηΜ。在其他的具體實(shí)施例中，結(jié)合親和性是低于大約0.1nM或低于大約0.07ηΜ。在其他的具體實(shí)施例中，結(jié)合親和性是大約ΙΟηΜ、大約5ηΜ、大約4ηΜ、大約3.5ηΜ、大約3ηΜ、大約2.5ηΜ、大約2ηΜ、大約1.5ηΜ、大約InM、大約900pM、大約800pM、大約700pM、大約600pM、大約500pM、大約400pM、大約300pM、大約200pM、大約150pM、大約ΙΟΟρΜ、大約90pM、大約80pM、大約70pM、大約60pM、大約50pM、大約40pM、大約30pM、大約IOpM之中任一者至大約2pM、大約5pM、大約ΙΟρΜ、大約15pM、大約20pM或大約40pM之中任一者。在一些具體實(shí)施例中，結(jié)合親和性是大約ΙΟηΜ、大約5ηΜ、大約4ηΜ、大約3.5ηΜ、大約3ηΜ、大約2.5ηΜ、大約2ηΜ、大約1.5ηΜ、大約InM、大約900pM、大約800pM、大約700pM、大約600pM、大約 500pM、大約 400pM、大約 300pM、大約 200pM、大約 150pM、大約 ΙΟΟρΜ、大約 90pM、大約80pM、大約70pM、大約60pM、大約50pM、大約40pM、大約30pM、大約IOpM之中任一者。在另外的具體實(shí)施例中，結(jié)合親和性是大約2pM、大約5pM、大約ΙΟρΜ、大約15pM、大約20pM、大約40pM或比大約40pM更高?？墒褂矛F(xiàn)有技術(shù)中已熟知的方法,判定抗體對(duì)NGF的結(jié)合親和性。一種判定抗體對(duì)NGF的結(jié)合親和性的 方法是借著測(cè)量抗體的單功能Fab片段的親和性，如同在實(shí)例中的描述。欲獲得單功能Fab片段，可利用木瓜酵素切開(kāi)抗體(例如IgG)，或以重組方式表達(dá)?？山柚砻娴入x子體激光共振(BIACore3000TM表面等離子體激光共振(SPR)系統(tǒng)，BIAcore，INC, Piscataway NJ)，按照在實(shí)例中的描述，判定抗體的抗-NGF Fab片段的親和性。該草案適用于判定抗體對(duì)任何物種的NGF的結(jié)合親和性，包括人類(lèi)NGF、其他脊椎動(dòng)物的NGF (在一些具體實(shí)施例中為哺乳動(dòng)物)(如老鼠NGF、大鼠NGF、靈長(zhǎng)類(lèi)NGF)，并適用于其他的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素，如相關(guān)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素NT3、NT4/5，及/或BDNF。在一些具體實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體或肽可(在大約15pM的NGF的存在下)以大約 200pM、150pM、100pM、80pM、60pM、40pM、20pM、10pM 或更低的 IC5tl，抑制(降低及 / 或阻斷)老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的人類(lèi)NGF-依賴(lài)性存活。在一些具體實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體或肽可(在大約 1.5pM 的 NGF 的存在下)以大約 50pM、40pM、30pM、10pM、20pM、10pM、5pM、2pM、lpM或更低的IC5tl，抑制(降低及/或阻斷)老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的人類(lèi)NGF-依賴(lài)性存活。在一些具體實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體或肽可(在大約15pM的NGF的存在下)以大約 150pM、125pM、100pM、80pM、60pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM或更低的 IC5tl，抑制(降低及/或阻斷)老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的大鼠NGF-依賴(lài)性存活。在一些具體實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體或肽可(在大約1.5pM的NGF的存在下)以大約30pM、25pM、20pM、15pM、10pM、5pM、4pM、3pM、2pM、lpM或更低的IC50，抑制(降低及/或阻斷)老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的大鼠NGF-依賴(lài)性存活。測(cè)量老鼠三叉神經(jīng)元的NGF-依賴(lài)性存活的方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，并在實(shí)例2中說(shuō)明。本發(fā)明也提供制造任何這些抗體或多肽的方法?？山柚F(xiàn)有技術(shù)中已知的程序，在實(shí)例中解釋其中一些，來(lái)制造本發(fā)明的抗體?？山柚鞍姿饣蚩贵w的其他作用，借著上述的重組方法(即單一或融合多肽)，或借著化學(xué)合成來(lái)產(chǎn)生多肽。借著化學(xué)合成便利地制造抗體的多肽，尤其是較短的，最多大約50個(gè)氨基酸的多肽。化學(xué)合成的方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，并為市售的。例如，可借著使用固相法的自動(dòng)多肽合成器，產(chǎn)生E3抗體。也參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5，807，715號(hào)、4，816，567號(hào)和6，331，415號(hào)。也可在活體外使用合成蛋白質(zhì)化學(xué)的已知方法，包括涉及交聯(lián)劑的那些，來(lái)制備嵌合型或雜種抗體。例如，可使用二硫交換反應(yīng)，或借著形成硫酯鍵結(jié)，來(lái)建構(gòu)免疫毒素。適合該目的的試劑的實(shí)例包括亞胺硫醇鹽和甲基-4-巰基丁酰亞酰胺鹽。在另一種選擇中，可以重組方式制造抗體，使用現(xiàn)有技術(shù)中已熟知的程序。在一具體實(shí)施例中，將包括編碼抗體E3(在圖1A和IB中示出)的可變和輕鏈區(qū)的序列的多核苷酸選殖到載體內(nèi)，以便在宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)中表達(dá)或繁殖。在另一具體實(shí)施例中，將在圖2和3中示出的多核苷酸序列選殖到一或多個(gè)載體內(nèi)，以便表達(dá)或繁殖?？蓪⒕幋a感興趣的抗體的序列保存在在宿主細(xì)胞中的載體內(nèi)，然后可為了未來(lái)使用將宿主細(xì)胞擴(kuò)大并冷凍。在本文中進(jìn)一步描述了載體(包括表達(dá)載體)和宿主細(xì)胞。已經(jīng)公開(kāi)了在植物或乳汁中以重組方式表達(dá)抗體的方法。參見(jiàn)，例如Peeters等人(2001) Vaccine 19:2756 ；Lonberg, N.和 D.Huszar (1995) Int.Rev.Tmmunol 13:65 ；以及 Pollock 等人(1999)J Immunol Methods 231:147。制造抗體衍生物的方法,例如人類(lèi)化、單鏈等等,為現(xiàn)有技術(shù)中已知的。本發(fā)明也包括本發(fā)明的抗體，如E3的單鏈可變區(qū)片段("scFv")。借著使用短交聯(lián)肽連接輕及/或重鏈可變區(qū)，制造單鏈可變區(qū)片段。Bird等人(1988) Science 242:423-426。交聯(lián)肽的實(shí)例為(GGGGS)3(SEQ ID NO:15)，其在一可變區(qū)的羧基終端和另一可變區(qū)的氨基終端之間架起約 3.5納米的橋。已經(jīng)設(shè)計(jì)并使用其他序列的交聯(lián)劑(Bird等人(1988))。為了額外的功能，如附接藥物或附接固體支撐物，可轉(zhuǎn)而修改交聯(lián)劑?？梢灾亟M或合成方式產(chǎn)生單鏈變體。關(guān)于scFv的合成產(chǎn)生,可使用自動(dòng)合成器。至于scFv的重組產(chǎn)生，可將含有編碼scFv的多核苷酸的適當(dāng)質(zhì)體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)，宿主細(xì)胞可以是真核生物的，如酵母菌、植物、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或原核生物的，如大腸桿菌?？山柚械牟僮鳎缍嗪塑账岬倪B接，制造編碼感興趣的scFv的多核苷酸?？墒褂矛F(xiàn)有技術(shù)中已知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)，分離所得的scFv。也包括其他形式的單鏈抗體,如微型雙功能抗體(diabodies)。微型雙功能抗體是二價(jià)的，雙重特異性的抗體，其中在單一的多肽鏈上表達(dá)VH和VL功能部位，但所使用的交聯(lián)劑太短，以致于不容許在同一鏈上兩個(gè)功能部位之間配對(duì)，借此迫使功能部位與在另一鏈上的互補(bǔ)功能部位配對(duì)，并創(chuàng)造兩個(gè)抗原結(jié)合位置(參見(jiàn)，例如Holliger，P.等人(1993)Proc.Natl.Acad Sc1.USA 90 =6444-6448 ；Poljak, R.J.等人(1994) Structure 2:1121-1123)。抗體可以是雙重特異性的抗體，對(duì)至少兩個(gè)不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。可使用在本文中公開(kāi)的抗體制備雙重特異性的抗體。制造雙重特異性抗體的方法，為現(xiàn)有技術(shù)中已知的(參見(jiàn)，例如Suresh等人，1986,Meyhods in Enzymology 121:210)。在傳統(tǒng)上，雙重特異性抗體的重組產(chǎn)生，是以?xún)蓚€(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共同表達(dá)為基礎(chǔ)，而這兩個(gè)重鏈具有不同的特異性(Millstein和Cuello，1983，Nature 305，537-539)。根據(jù)一制造雙重特異性抗體的方法，將具有想要結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位置)的抗體可變功能部位與免疫球蛋白恒定功能部位序列融合。該融合最好是利用免疫球蛋白重鏈恒定功能部位，包括至少一部分絞鏈、CH2和CH3區(qū)。最好是有第一個(gè)重鏈恒定區(qū)(CHl)，含有輕鏈結(jié)合所需的位置，出現(xiàn)在至少一個(gè)融合中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合，若需要還有免疫球蛋白輕鏈的DNAs，插入分開(kāi)的表達(dá)載體中，并共同轉(zhuǎn)移感染到適當(dāng)?shù)乃拗魃飪?nèi)。這在使用不等比例的三個(gè)多肽鏈來(lái)建構(gòu)，以便提供最佳產(chǎn)量的具體實(shí)施例中，在調(diào)整三個(gè)多肽片段的突變比例上提供了相當(dāng)大的彈性。然而，也有可能在一表達(dá)載體中插入二或全部三個(gè)多肽鏈的密碼序列，此時(shí)以等比例表達(dá)至少兩個(gè)多肽鏈，結(jié)果產(chǎn)生高產(chǎn)量，或此時(shí)該比例并不是特別重要的。在一方法中，雙重特異性抗體由雜種的免疫球蛋白重鏈組成，在一臂上有第一個(gè)結(jié)合特異性，而在另一臂上有雜種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二個(gè)結(jié)合特異性)。該不對(duì)稱(chēng)的結(jié)構(gòu)，僅在雙重特異性分子的一半具有免疫球蛋白輕鏈，使想要的雙重特異性化合物更容易與不想要的免疫球蛋白鏈組合分·開(kāi)。在1994年3月3日發(fā)表的PCT公開(kāi)第WO94/04690號(hào)中描述了該方法。
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包括兩個(gè)共價(jià)連接的抗體的異源共軛抗體，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。已經(jīng)使用這類(lèi)抗體使免疫系統(tǒng)細(xì)胞瞄準(zhǔn)不想要的細(xì)胞(美國(guó)專(zhuān)利第4，676，980號(hào))，并用來(lái)治療HIV感染(PCT申請(qǐng)公開(kāi)第WO 91/00360號(hào)和W092/200373號(hào)；歐洲專(zhuān)利第03089號(hào))?？墒褂萌魏伪憷慕宦?lián)法，制造異源共軛抗體。適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑和技術(shù)是現(xiàn)有技術(shù)中已熟知的，并描述在美國(guó)專(zhuān)利第4，676，980號(hào)中。該抗體可以是人類(lèi)化抗體，例如如同在現(xiàn)有技術(shù)中已知的，并在本文中描述。可按照在1999年11月18日發(fā)表的PCT公開(kāi)第WO 99/58572中描述的，來(lái)修改(修飾)抗體。除了針對(duì)標(biāo)靶分子的結(jié)合功能部位之外，這些抗體包括具有實(shí)質(zhì)上與人類(lèi)免疫球蛋白重鏈的全部或部分恒定功能部位同源的氨基酸序列的效應(yīng)物功能部位。這些抗體能夠與標(biāo)靶分子結(jié)合，不誘發(fā)明顯的補(bǔ)體依賴(lài)性溶解，或細(xì)胞-調(diào)解的標(biāo)靶破壞。效應(yīng)物功能部位最好能夠特異性地結(jié)合FcRn及/或Fe Y RII b。這些通常是以衍生自二或多個(gè)人類(lèi)免疫球蛋白重鏈CH2功能部位的嵌合型功能部位為基礎(chǔ)。最好是在慢性抗體療法中使用以此方式修改的抗體，以避免炎癥和其他對(duì)傳統(tǒng)抗體療法不利的反應(yīng)。本發(fā)明包括對(duì)抗體E3的修改，包括不顯著影響其特性的功能相等的抗體，以及具有提高或降低活性的變體。在現(xiàn)有技術(shù)中，例行地實(shí)行多肽的修改，并在實(shí)例中進(jìn)一步舉例說(shuō)明。修改多肽的實(shí)例包括具有氨基酸殘基的取代(包括保守取代)，一或多個(gè)不會(huì)明顯有害地改變功能活性的氨基酸刪除或添加的多肽，或使用化學(xué)類(lèi)似物。當(dāng)在本文中使用時(shí)，多肽"變體"是與固有蛋白質(zhì)之差異在于一或多個(gè)取代、刪除、添加及/或插入的多肽，使得實(shí)質(zhì)上并未減少該多肽的免疫反應(yīng)性。換句話(huà)說(shuō)，相對(duì)于固有蛋白質(zhì)，可提高或不改變變體特異性地與抗原結(jié)合的能力，或相對(duì)于固有蛋白質(zhì)，可減少至低于50%，較佳的是低于20%。多肽變體最好對(duì)已經(jīng)確認(rèn)的多肽，顯示出至少大約80%，更佳的是至少大約90%，且最佳的是至少大約95 %的同一性(根據(jù)在本文中的描述來(lái)判定)?？山柚鴮⑦m當(dāng)?shù)暮塑账岣淖儗?dǎo)入抗體DNA內(nèi)，或借著肽合成，來(lái)制備抗體的氨基酸序列變體。這類(lèi)變體包括，例如從在本文中描述的SEQID NO:1或2的氨基酸序列中刪除及/或插入及/或取代殘基?？蛇M(jìn)行刪除、插入和取代的任何組合以獲得最終的構(gòu)筑體，其限制條件為最終的構(gòu)筑體具有想要的特征。氨基酸變化也可改變抗體的轉(zhuǎn)譯后加工，如改變糖基化作用的數(shù)目和位置。

一種確認(rèn)抗體的某些殘基或區(qū)域是進(jìn)行誘變或修改的較佳場(chǎng)所的有用方法，叫做"丙氛酸掃描誘變"，并由 Cunningham 和 Wells, 1989，Science, 244:1081-1085 描述了。確認(rèn)一殘基或一群標(biāo)祀殘基(例如帶電荷的殘基，如arg、asp、his、Iys和glu),并以中性或帶負(fù)電的氨基酸(最好是丙氨酸或聚丙氨酸)取代，影響氨基酸與抗原的交互作用。然后借著在取代位置導(dǎo)入更多或其他變體，改進(jìn)那些證實(shí)對(duì)取代有功能敏感性的氨基酸位置。因此，雖然預(yù)先判定導(dǎo)入氨基酸序列變化的位置，仍不必預(yù)先判定突變本身的性質(zhì)。例如，欲分析突變?cè)谔囟ㄎ恢玫男?，在?biāo)靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)突變生成作用，并就想要的活性篩選所表達(dá)的抗體變體。也可使用在本文中描述的庫(kù)掃描突變生成作用，確認(rèn)在抗體中適合突變或修改的位置。氨基酸序列插入包括范圍從一個(gè)殘基到含有一百或更多殘基的多肽的氨基-及/或羧基-終端融合，以及單一或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。終端插入的實(shí)例包括帶有N-終端甲硫胺?；鶜埢目贵w，或與抗原決定位標(biāo)簽融合的抗體?？贵w分子的其他插入變體包括酵素或增加抗體的血清半衰期的多肽與抗體的N-或C-終端融合。取代變體在抗體分子中移除至少一個(gè)氨基酸殘基，并在其位置插入另一個(gè)殘基。取代突變生成作用最感興趣的位置包括高變區(qū)，但也期待FR改變。在表I中，在"保守性取代"項(xiàng)目之下示出保守取代。若這類(lèi)取代結(jié)果改變了生物活性，然后可導(dǎo)入更多實(shí)質(zhì)上的改變，在表I中稱(chēng)為"典型的取代"，或按照下文在提及氨基酸種類(lèi)時(shí)更多的描述，并篩選產(chǎn)物。表1:氨基酸取代
原始?xì)埢Ｊ匦匀〈湫偷娜〈?br> Ala(A)ValVal ；Leu ；Ile
Arg(R)LysLys ；Gln ；Asn
Asn (N)GlnGln ；His ；Asp ；Lys ；Arg
Asp (D)GluGlu ；Asn
Cys(C)SerSer ；Ala
權(quán)利要求
1.一種用于在個(gè)體中治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛的方法，包括給予該個(gè)體有效量的NGF拮抗劑。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中所述個(gè)體是人。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中該NGF拮抗劑是抗-NGF拮抗劑抗體。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體的給藥頻率介于每星期一次到每12個(gè)星期一次。
5.如權(quán)利要求3的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體的給藥頻率為每個(gè)月I次、每?jī)蓚€(gè)月I次、每三個(gè)月I次、每四個(gè)月I次、每五個(gè)月I次或每六個(gè)月I次。
6.如權(quán)利要求3的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以每三個(gè)月I次給予個(gè)體。
7.如權(quán)利要求3的方法，其中在給予單一劑量的抗-NGF拮抗劑抗體后，該疼痛的減輕持續(xù)至少大約7天的期間。
8.如權(quán)利要求3的方法，其中在給予單一劑量的抗-NGF拮抗劑抗體后，該疼痛的減輕持續(xù)至少大約14天的期間。
9.如權(quán)利要求3的方法，其中在給予單一劑量的抗-NGF拮抗劑抗體后，該疼痛的減輕持續(xù)至少大約4周的期間。
10.如權(quán)利要求3的方法，其中在給予單一劑量的抗-NGF拮抗劑抗體后，該疼痛的減輕持續(xù)至少大約12周的期間。
11.如權(quán)利要求3的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以從大約3微克/千克至大約I毫克/千克范圍內(nèi)的劑量使用。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以大約100微克/千克的劑量使用。
13.如權(quán)利要求11的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以大約300微克/千克的劑量使用。
14.如權(quán)利要求3的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以靜脈內(nèi)給藥。
15.如權(quán)利要求3的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以皮下給藥。
16.如權(quán)利要求3的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體是單克隆抗體。
17.如權(quán)利要求3的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體是人類(lèi)化抗體。
18.如權(quán)利要求3 的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體與人類(lèi)NGF結(jié)合。
19.如權(quán)利要求18的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體還與嚙齒類(lèi)NGF結(jié)合。
20.如權(quán)利要求3的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體: (a)以低于大約2nM的Kd與NGF結(jié)合； (b)以大約IOOpM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的人類(lèi)NGF-依賴(lài)性存活，其中該IC50是在大約15pM人類(lèi)NGF的存在下測(cè)量到的；以及 (c)以大約IOpM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的人類(lèi)NGF-依賴(lài)性存活，其中該IC50是在大約1.5pM的NGF的存在下測(cè)量到的。
21.如權(quán)利要求3的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體包括重鏈可變區(qū)，其包括: (a)顯示在SEQID NO:3中的CDRl區(qū)； (b)顯示在SEQID NO:4中的CDR2區(qū)；以及 (c)顯示在SEQID NO:5中的CDR3區(qū)。
22.如權(quán)利要求3的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體包括輕鏈可變區(qū)，其包括: (a)顯示在SEQID NO:6中的CDRl區(qū)； (b)顯示在SEQID NO:7中的CDR2區(qū)；以及 (c)顯示在SEQID NO:8中的CDR3區(qū)。
23.如權(quán)利要求22的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體還包括重鏈可變區(qū)，其包括: (a)顯示在SEQID NO:3中的CDRl區(qū)； (b)顯示在SEQID NO:4中的CDR2區(qū)；以及 (c)顯示在SEQID NO:5中的CDR3區(qū)。
24.如權(quán)利要求23的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體是包括顯示在SEQID NO:1和2中的氨基酸序列的抗體。
25.如權(quán)利要求24的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體是包括顯示在SEQID NO:16和17中的氨基酸序列的抗體。
26.一種用于改善患有骨關(guān)節(jié)炎的個(gè)體的物理功能的方法，包括給予該個(gè)體有效量的NGF拮抗劑。
27.如權(quán)利要求26的方法，其中所述個(gè)體是人。
28.如權(quán)利要求26的方法，其中該NGF拮抗劑是抗-NGF拮抗劑抗體。
29.如權(quán)利要求28的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體的給藥頻率介于每星期一次到每12個(gè)星期一次。
30.如權(quán)利要求28的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體的給藥頻率為每個(gè)月I次、每?jī)蓚€(gè)月I次、每三個(gè)月I次、每四個(gè)月I次、每五個(gè)月I次或每六個(gè)月I次。
31.如權(quán)利要求28的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以每三個(gè)月I次給予個(gè)體。
32.如權(quán)利要求28的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以從大約3微克/千克至大約I毫克/千克范圍內(nèi)的劑量使用。
33.如權(quán)利要求32的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以大約100微克/千克的劑量使用。
34.如權(quán)利要求32的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以大約300微克/千克的劑量使用。
35.如權(quán)利要求28的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以靜脈內(nèi)給藥。
36.如權(quán)利要求28的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以皮下給藥。
37.如權(quán)利要求28的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體是單克隆抗體。
38.如權(quán)利要求28的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體是人類(lèi)化抗體。
39.如權(quán)利要求28的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體與人類(lèi)NGF結(jié)合。
40.如權(quán)利要求39的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體還與嚙齒類(lèi)NGF結(jié)合。
41.如權(quán)利要求28的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體: (a)以低于大約2nM的Kd與NGF結(jié)合； (b)以大約IOOpM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的人類(lèi)NGF-依賴(lài)性存活，其中該IC50是在大約15pM人類(lèi)NGF的存在下測(cè)量到的；以及 (c)以大約IOpM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的人類(lèi)NGF-依賴(lài)性存活，其中該IC50是在大約1.5pM的NGF的存在下測(cè)量到的。
42.如權(quán)利要求28的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體包括重鏈可變區(qū)，其包括: (a)顯示在SEQID NO:3中的CDRl區(qū)； (b)顯示在SEQID NO:4中的CDR2區(qū)；以及 (c)顯示在SEQID NO:5中的CDR3區(qū)。
43.如權(quán)利要求28的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體包括輕鏈可變區(qū)，其包括: (a)顯示在SEQID NO:6中的CDRl區(qū)； (b)顯示在SEQID NO:7中的CDR2區(qū)；以及 (c)顯示在SEQID NO:8中的CDR3區(qū)。
44.如權(quán)利要求43的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體還包括重鏈可變區(qū)，其包括: (a)顯示在SEQID NO:3中的CDRl區(qū)； (b)顯示在SEQID NO:4中的CDR2區(qū)；以及 (c)顯示在SEQID NO:5中的CDR3區(qū)。
45.如權(quán)利要求44的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體是包括顯示在SEQID NO:1和2中的氨基酸序列的抗體。
46.如權(quán)利要求45的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體是包括顯示在SEQID NO: 16和17中的氨基酸序列的抗體。
47.一種用于在患有骨關(guān)節(jié)炎的個(gè)體中改善僵硬的方法，包括給予該個(gè)體有效量的NGF拮抗劑。
48.如權(quán)利要求47的方法，其中所述個(gè)體是人。
49.如權(quán)利要求47的方法，其中該NGF拮抗劑是抗-NGF拮抗劑抗體。
50.如權(quán)利要求49的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體的給藥頻率介于每星期一次到每12個(gè)星期一次。
51.如權(quán)利要求49的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體的給藥頻率為每個(gè)月I次、每?jī)蓚€(gè)月I次、每三個(gè)月I次、每四個(gè)月I次、每五個(gè)月I次或每六個(gè)月I次。
52.如權(quán)利要求49的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以每三個(gè)月I次給予個(gè)體。
53.如權(quán)利要求49的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以從大約3微克/千克至大約I毫克/千克范圍內(nèi)的劑量使用。
54.如權(quán)利 要求53的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以大約100微克/千克的劑量使用。
55.如權(quán)利要求53的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以大約300微克/千克的劑量使用。
56.如權(quán)利要求49的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以靜脈內(nèi)給藥。
57.如權(quán)利要求49的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以皮下給藥。
58.如權(quán)利要求49的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體是單克隆抗體。
59.如權(quán)利要求49的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體是人類(lèi)化抗體。
60.如權(quán)利要求49的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體與人類(lèi)NGF結(jié)合。
61.如權(quán)利要求60的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體還與嚙齒類(lèi)NGF結(jié)合。
62.如權(quán)利要求49的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體: (a)以低于大約2nM的Kd與NGF結(jié)合；(b)以大約IOOpM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的人類(lèi)NGF-依賴(lài)性存活，其中該IC50是在大約15pM人類(lèi)NGF的存在下測(cè)量到的；以及 (c)以大約IOpM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神經(jīng)元的人類(lèi)NGF-依賴(lài)性存活，其中該IC50是在大約1.5pM的NGF的存在下測(cè)量到的。
63.如權(quán)利要求49的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體包括重鏈可變區(qū)，其包括: (a)顯示在SEQID NO:3中的CDRl區(qū)； (b)顯示在SEQID NO:4中的CDR2區(qū)；以及 (c)顯示在SEQID NO:5中的CDR3區(qū)。
64.如權(quán)利要求49的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體包括輕鏈可變區(qū)，其包括: (a)顯示在SEQID NO:6中的CDRl區(qū)； (b)顯示在SEQID NO:7中的CDR2區(qū)；以及 (c)顯示在SEQID NO:8中的CDR3區(qū)。
65.如權(quán)利要求64的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體還包括重鏈可變區(qū)，其包括: (a)顯示在SEQID NO:3中的CDRl區(qū)； (b)顯示在SEQID NO:4中的CDR2區(qū)；以及(c)顯示在SEQID NO:5中的CDR3區(qū)。
66.如權(quán)利要求65的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體是包括顯示在SEQID NO:1和2中的氨基酸序列的抗體。
67.如權(quán)利要求66的方法，其中該抗-NGF拮抗劑抗體是包括顯示在SEQID NO:16和17中的氨基酸序列的抗體。
68.一種試劑盒，其包括有效量的NGF拮抗劑以及為了治療個(gè)體中的骨關(guān)節(jié)炎而將有效量的NGF拮抗劑給予個(gè)體的說(shuō)明書(shū)。
69.如權(quán)利要求68的試劑盒，其中所述個(gè)體是人。
70.如權(quán)利要求68的試劑盒，其中該NGF拮抗劑是抗-NGF拮抗劑抗體。
71.如權(quán)利要求70的試劑盒，其中該抗-NGF拮抗劑抗體的給藥頻率介于每星期一次到每12個(gè)星期一次。
72.如權(quán)利要求70的試劑盒，其中在給予單一劑量的抗-NGF拮抗劑抗體后，疼痛的減輕持續(xù)至少大約7天的期間。
73.—種試劑盒，其包括有效量的NGF拮抗劑以及為了改善患骨關(guān)節(jié)炎個(gè)體的物理功能而將有效量的NGF拮抗劑給予個(gè)體的說(shuō)明書(shū)。
74.如權(quán)利要求73的試劑盒，其中所述個(gè)體是人。
75.如權(quán)利要求73的試劑盒，其中該NGF拮抗劑是抗-NGF拮抗劑抗體。
76.如權(quán)利要求75的試劑盒，其中該抗-NGF拮抗劑抗體的給藥頻率介于每星期一次到每12個(gè)星期一次。
77.如權(quán)利要求75的試劑盒，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以從大約3微克/千克至大約I毫克/千克范圍內(nèi)的劑量使用。
78.—種試劑盒，其包括有效量的NGF拮抗劑以及為了在患骨關(guān)節(jié)炎的個(gè)體中改善僵硬而將有效量的NGF拮抗劑給予個(gè)體的說(shuō)明書(shū)。
79.如權(quán)利要求78的試劑盒，其中所述個(gè)體是人。
80.如權(quán)利要求78的試劑盒，其中該NGF拮抗劑是抗-NGF拮抗劑抗體。
81.如權(quán)利要求80的試劑盒，其中該抗-NGF拮抗劑抗體的給藥頻率介于每星期一次到每12個(gè)星期一次。
82.如權(quán)利要求80的試劑盒，其中該抗-NGF拮抗劑抗體以從大約3微克/千克至大約I毫克/千克范圍內(nèi)的劑量使用。
83.一種用于在個(gè)體中治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛的醫(yī)藥組合物，其包括NGF拮抗劑和在藥學(xué)上可接受的載劑。
84.一種用于在患有骨關(guān)節(jié)炎的個(gè)體中改善物理功能的醫(yī)藥組合物，其包括NGF拮抗劑和在藥學(xué)上可接受的載劑。
85.一種用于在患有骨關(guān)節(jié)炎的個(gè)體中改善僵硬的醫(yī)藥組合物，其包括NGF拮抗劑和在藥學(xué)上可接受的 載劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)給予神經(jīng)生長(zhǎng)因子拮抗劑及其組合物來(lái)治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛的方法。本發(fā)明涉及抗-NGF抗體(如抗-NGF拮抗劑抗體)及編碼該抗體的多核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及這類(lèi)抗體及/或多核苷酸于治療及/或預(yù)防疼痛，包括手術(shù)后疼痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛和骨關(guān)節(jié)炎疼痛的用途。
文檔編號(hào)A61P19/02GK103143016SQ20111043788
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2006年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月11日
發(fā)明者安儂·露森達(dá)爾, 大衛(wèi)·L·謝爾頓, 帕特里夏·安·沃爾卡 申請(qǐng)人:禮納特神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)公司